分子生物学 第三章生物信息的传递 ( 上 ) 从 DNA 到 RNA 第一节 RNA 的结构 分类和功能第二节 RNA 转录的基本过程第三节转录机器的主要成分 RNA 聚合酶第四节启动子与转录起始 夏玉琼 2012-09-10
2 RNA 转录概述 模板链或反义链 :mrna 合成的模板 编码链或意义链 : 和 mrna 序列相同 mrna 合成方向 5 3
3 目录 RNA 的结构 分类和功能 RNA 的结构特点 RNA 在细胞中的分布 RNA 的功能 RNA 转录的基本过程转录机器的主要成分 RNA 聚合酶启动子与转录起始
4 RNA 的结构特点 RNA 含有核糖和嘧啶, 通常是单链线性分子 RNA 链自身折叠形成局部双螺旋 发夹结构 凸结构 环结构 A-U,C-G,G-U 双螺旋 RNA 小沟宽而浅, 没有序列特异性信息 ; 大沟狭且深, 不适合与蛋白质作用 RNA 可折叠形成复杂的三级结构
5 RNA 在细胞中的分布 编码 RNA(2%) 细胞内总 RNA 非编码 RNA(98%) 所有生物 仅真核生物 仅细菌 前 mrna(hnrna) 非编码 RNA 前 rrna 前 trna snrna snorna scrna tmrna mrna rrna trna
6 RNA 的功能 信息分子 贮藏和转移遗传信息 功能分子 作为蛋白质合成的主要参与者部分 RNA 作为核酶在细胞中催化反应参与基因的表达调控某些病毒中, 是遗传物质
7 目录 RNA 的结构 分类和功能 RNA 转录的基本过程 模板识别转录起始转录延伸转录终止 转录机器的主要成分 RNA 聚合酶启动子与转录起始
8 模板识别 RNA 聚合酶 模板识别是指 RNA 聚合酶与启动子 DNA 双链相互作用并与之结合的过程启动子是基因转录起始所必需的一段 DNA 序列, 是基因表达的上游顺式作用元件之一
9 模板识别 RNA 聚合酶 转录调控因子 真核生物 :RNA 聚合酶不能识别启动子区, 需要转录调控因子按特定顺序结合于启动子上,RNA 聚合酶才能与之结合形成转录起始前复合物
10 转录起始 RNA polymerase 生 引物 : 不需要 转录起始 :RNA 链上第一个核苷酸键的产
11 转录起始的 3 个阶段 1 2 3 聚合酶与 DNA 结合 DNA 开始解链 转录起始 1. 聚合酶和启动子结合成封闭复合物 2. 封闭复合物变成开放复合物 3. 开放复合物结合新生 RNA 新生 RNA 链
12 转录起始 σ 因子被释放 重新开始 : 新生的 RNA 链与 DNA 结合不牢固, 容易从 DNA 链上掉下来导致转录重新开始成功 : 成功合成 9 个以上核苷酸离开启动子区,RNA 聚合酶释放 σ 因子, 转录就进入正常的延伸阶段启动子的强弱 : 通过启动子时间越短, 基因转录起始的频率越高, 启动子越强
13 转录起始中的概念 聚合酶全酶 负责启动子的选择和转录的开始 聚合酶全酶中的核心酶 负责 RNA 的延伸 真核生物 RNA 聚合酶转录因子 TF
14 转录延伸 转录延伸 :RNA 聚合酶离开启动子后, 核心酶 ( 部分的 RNA 聚合酶 ) 沿模板 DNA 链移动并使新生 RNA 链不断伸长的过程
15 转录延伸的解释 DNA 循环假说 :RNA 聚合酶 -DNA-RNA 转录复合物模型连接区是属于 RNA 聚合酶的 α- 螺旋结构连接区笔直时, 有空间给 NTP 连接区弯曲时, 无空间给 NTP 连接区螺旋 ( 笔直 ) 底物结合区 连接区螺旋 ( 弯曲 )
16 转录延伸的解释 DNA 循环假说 : 示意图 1. 连接区螺旋笔直 ( 黄 色 ), 给 NTP 留位置 进入活性位点 ;RNA 连接区螺旋 ( 笔直 ) 合成 ; 底物 2. 杂合链左移 1bp, 让新 1. 合成 RNA 模板链在活性位点, 3 同时, 连接区螺旋变 连接区螺旋 ( 笔直 ) 成弯折状态 ( 绿色 ) 2. 杂合链左移一个 bp 3. 当连接区螺旋从弯折 变成笔直时, 重新开 连接区螺旋 ( 弯折 ) 启空位点 与转录起始复合物相比, 延伸复合物极为稳定, 可长时间与 DNA 模板结合
17 转录终止 RNA 聚合酶不再聚合 转录终止 RNA-DNA 杂合物分离 转录泡瓦解 DNA 恢复双链 RNA 聚合酶和 RNA 链释放
18 转录终止的分类 根据体外 RNA 聚合酶是否需要辅助因子参与才能终止 RNA 的延伸, 大肠杆菌的终止子分为 : 不依赖于 ρ 因子的终止依赖于 ρ 因子的终止
19 不依赖于 ρ 因子的终止 : 内在终止子 1) 二重对称序列 : 富含 GC 碱基的二重对称区, 形成发卡 2) 寡 U:4~8 个 A 的序列,mRNA 有 polyu, 形成不稳定的 ru da 结构 两者共同作用使得 RNA 从三元复合物中解离出来
20 依赖于 ρ 因子的终止 ρ 因子的结构 六个相同亚基构成的六聚体, 具有 NTP 酶和解螺旋酶活性 穷追 模型 先附在 RNA5 端, 再追 RNA 聚合酶 ; 当 RNA 聚合酶在终止子处暂停时, 该因子追上并取代 RNA 聚合酶, 导致 RNA 的释放和转录复合物的解体
21 抗终止 破坏终止位点 RNA 的茎环结构 转录和翻译偶联当氨基酸浓度较低时, 核糖体滞留在串联密码子上, 导致 mrna 不能形成茎环结构 依赖于蛋白质因子的转录抗终止 λ- 噬菌体中的 N 蛋白具有转录抗终止作用
22 N 蛋白引起的转录抗终止 1. N 蛋白识别 A 区和对称二重序列转录形成的茎环结构并与之结合 2. NusA 蛋白与 RNA 聚合酶和 N 蛋白结合, 当其它三种蛋白 (NusB, S10, 2.5E4) 都结合到 Nut 位点时, 形成蛋白复合物 ; 该复合物通过与 NusA 蛋白和 RNA 聚合酶结合, 改变 RNA 聚合酶的构象, 使其对终止信号不敏感
23 目录 RNA 的结构 分类和功能 RNA 转录的基本过程转录机器的主要成分 RNA 聚合酶 原核生物 RNA 聚合酶真核生物 RNA 聚合酶 启动子与转录起始
24 原核生物 RNA 聚合酶 核心酶 : 催化延伸过程 σ 因子 : 辨认起始点 全酶 :Mw 465 000 α 亚基 : 核心酶组装, 启动子识别 β 和 β 亚基 : 催化中心 σ 因子 : 增加聚合酶对启动子的亲和力, 降低其对非专一位点的亲和力
25 原核生物 RNA 聚合酶 不同的 σ 因子识别不同启动子 因子 基因 功能 -35 区 间隔 (bp) -10 区 σ 70 rpod 广泛 TTGACA 16~18 TATAAT σ 32 rpoh 热休克 TCTCNCCCTT GAA 13~15 CCCCAT NTA σ 54 rpon 氮代谢 CTGGNA 6 TTGCA 稳定的 RNA 聚合酶 -DNA-RNA 三元复合物 : 核苷酸合成 6-9 个随后 σ 因子的释放, 转录从起始到延伸阶段
26 真核生物 RNA 聚合酶 酶细胞内定位转录产物相对活性对 α- 鹅膏覃碱 RNA 聚合酶 I 核仁 45S rrna 5S rrna 以外的各种 rrna RNA 聚合酶 II 核质 hnrna mrna RNA 聚合酶 III 核质 trna trna 5S rrna snrna 50~70% 不敏感 20~40% 敏感 约 10% 不一定敏感, 存在物种特异性
27 RNA 及 α- 鹅膏覃碱的概念 rrna ribosomal RNA, 核糖体 RNA rrna 和蛋白质组成核糖体, 是蛋白质合成的场所 hnrna heterogenous nuclear RNA, 核不均一 RNA mrna 的前体 trna transfer RNA, 转运 RNA α- 鹅膏覃碱 高浓度时可抑制动物细胞 ( 昆虫除外 ) 的转录
28 α- 鹅膏覃碱 (α-amanitin) 绿帽菌 鬼笔鹅膏 蒜叶菌 高把菌 毒伞 二环八肽抑制 RNAII 聚合酶不抑制原核生物 RNA 聚合酶 http://en.wikipedia.org/wiki/file:alpha-amanitin_structure.png http://www.jxda.gov.cn/browfood.asp?id=2774
29 沉降系数 S 的概念 用离心法时, 大分子沉降速度的量度, 等于每单位离心场的速度 S=v/ω 2 r S, 沉降系数 ;ω 是离心转子的角速度 ( 弧度 / 秒 );r 是到旋转中心的距离 ;v 是沉降速度 沉降系数通常为 (1~200) 10-13 秒,10-13 这个因子叫做沉降单位 S, 即 1S=10-13 秒, 血红蛋白 大多数蛋白质和核酸 核糖体及其亚基 多核糖体 4S 4~40S 30~80S >100S
30 真核生物 RNA 聚合酶 RNA 聚合酶 I RNA 聚合酶 II RNA 聚合酶 III RPA 1 RPB 1 RPC 1 RPA 2 RPB 2 RPC 2 RPC 5 RPB 3 RPC 5 与 β, β 同源与 α 同源与 ω 同源 分子量 RPC 9 RPB 11 RPC 9 RPB 6 RPB 6 RPB 6 其它 9 个亚基其它 7 个亚基其它 11 个亚基 聚合酶中有两个分子量超过 10 5 的大亚基同种生物三类聚合酶 共享 小亚基
31 真核生物 RNA 聚合酶 原核生物和真核生物的 RNA 聚合酶结构形状都像 蟹爪
32 目录 RNA 的结构 分类和功能 RNA 转录的基本过程转录机器的主要成分 RNA 聚合酶启动子与转录起始 启动子的基本结构启动子区的识别 RNA 聚合酶与启动子区的结合 -10 区与 -35 区的最佳间距增强子及其功能真核生物启动子对转录的影像转录的抑制
33 关于转录的一些概念 转录单位 一段从启动子开始到终止子结束的 DNA 序列 转录起点 与新生 RNA 链第一个核苷酸对应 DNA 链上的碱基, 为 +1 上游序列 转录起点前面,5 末端的序列 下游序列 转录起点后面,3 末端的序列 序列的书写方向 从左到右, 从上游到下游,5-3
34 启动子区的结构 Pribnow 的实验 实验得到的被保 护的 DNA 片段 区 -10 区,Pribnow 区,TATA -35 区共同序列为 TTGACA
35 真核生物基因的启动子区 类似 Pribnow 区的 Hogness 区也称 TATA 区, 重复序列为 TATAAA, 在 -25~-30bp 类似 -35 区的 CAAT 区, 重复序列为 CCAAT, 在 -70~-78bp
36 启动子区的识别 : 氢键互补学说 启动子功能受 DNA 序列和构象影响氢键互补学说 酶分子特定空间构象的氢键给体和受体 DNA 双螺旋大沟或小沟内的氢键给体和受体 氢键给体 氢键受体
37 RNA 聚合酶和启动子区的结合 TFIIA TFIID TFIID 转录起始点 TFIID 复合物通过其 TBP 单元结合到 TATA 区上 TFIIA 帮助稳定 TFIID TFIIH TFIIA TFIIH TFIIB TFIIB 和 TFIIH 加入 羧端尾巴 TFIIE TFIIF 伴随了 TFIIE 和 TFIIF 的 RNA 聚合酶 II 结合 http://users.ugent.be/~efouquae/artikels/augustus%202004/artikels%20promoter%20juli%202004 /Developmental%20Biology%20Online%20Promoter%20Structure.htm
38 RNA 聚合酶和启动子区的结合 TFIIH TFIIB RNA 聚合酶 II 羧端尾巴 CTD TFIIB TFIIE TFIIF 伴随了 TFIIE 和 TFIIF 的 RNA 聚合酶 II 结合 TFIIH 将 CTD 磷酸化 CTD CTD 磷酸化后 RNA 聚合酶 II 才能移动 TFIIH RNA 转录 http://users.ugent.be/~efouquae/artikels/augustus%202004/artikels%20promoter%20juli%202004 /Developmental%20Biology%20Online%20Promoter%20Structure.htm
39-10 区和 -35 区的最佳间距 16~19bp 增减 1bp 会使两者产生的超螺旋的夹角变化 36 o 细菌中的启动子突变 下降突变 : 转录水平下降的突变,e.g.-10 区的 TATAAT 变成 AATAAT 上升突变 : 转录水平提高的突变,e.g.-10 区的 TATAAT 变成 TATATT
40 增强子及其功能
41 增强子及其功能 功能 : 强化转录的开始特点 远距离效应相距 >10kb 也能发挥作用无方向性可以位于靶基因的上游 下游或内部顺式调节只调节同一条染色体上的靶基因无物种和基因的特异性具有组织特异性需要特定的蛋白质因子参与有相位性与 DNA 构象有关有的增强子可以对外部信号产生反应
42 真核生物启动子对转录的影响 TATA 区 -25~-35bp CAAT 区 -70~-80bp GC 区 -80~-110bp 真核生物启动区相对于原核的区别 启动区的范围更大 上游启动子元件 UPE 或上游激活序列 UAS 结合位点更多除了对应的 TATA 区和 CAAT 区, 还有 GC 区和增强子区 TATA 区确定起始位点 CAAT 区和 GC 区控制转录起始频率不是所有的启动子区都含有这三种序列
43 转录的抑制 DNA 模板功能抑制剂 与 DNA 结合抑制模板的功能 RNA 聚合酶抑制剂 与 RNA 聚合酶结合, 抑制其活力
44 DNA 模板功能抑制剂 放线菌素 D 与 DNA 形成非共价复合物, 抑制其作为模板的功能 1mM 即可有效抑制转录过程, 抗菌 抗癌 烷化剂 如氮芥, 磺酸酯, 氮丙啶等, 使 DNA 发生交联, 抑制其模板功能, 致癌如环磷酰胺, 能选择地杀伤肿瘤细胞, 治疗恶性肿瘤 嵌入染料 嵌入 DNA 相邻碱基对之间, 使得 DNA 复制中缺失或增加一个核苷酸如 EB, 与核酸结合后抑制其复制和转录
45 RNA 聚合酶抑制物 利福霉素 强烈抑制革兰阳性菌和结核杆菌, 抗菌 利迪链霉素 与细菌 RNA 聚合酶的 β 亚基结合, 抑制转录的起始 α- 鹅膏覃碱 抑制真核生物 RNA 聚合酶
46 小结 转录的过程 : 模板识别 转录起始 转录延伸 转录终止重要概念 : 启动子,-10 区,-35 区,TATA 区,CAAT 区,GC 区,RNA 聚合酶的结构, σ 因子, 增强子
47 思考题 大肠杆菌的 RNA 聚合酶有哪些组成部分? 各个亚基的作用如何? 什么是 Pribnow box? 又名? 起什么作用?
48 下次课的内容 第三章 DNA 转录成 RNA 原核和真核生物转录产物比较原核和真核生物 mrna 的特征比较真核生物 RNA 的转录后加工 RNA 的编辑 再编码及化学修饰