中华高血压杂志 $ 年 月第 $$ 卷第 期 ).( &.! $ 6 "$$/ " %% 论 著 腺苷对缺血再灌注心肌核转录因子 及基质金属蛋白酶的影响 郭玉军 陈宇 $ 贺晓楠 天津胸科医院 ) )C 天津 $ 吉林大学中日联谊医院心内科 " 首都医科大学附属北京安贞医院急诊危重症中心 摘要 目的 探讨腺苷对缺血再灌注心肌核转录因子 /9 及基质金属蛋白酶 77 的影响 方法 健康大耳白兔 只 随机分为 组 缺血再灌注组 拮抗剂组 缺血后处理组 及腺苷治疗组 建立在体兔心肌缺血再灌注模型 应用免疫组化检测 /9 用末端标记法 <C/ 染色检测心肌细胞凋亡数量 应用酶谱法测定 77 $ 77 2 的活性及表达 结果 缺血后处理组和腺苷治疗组与缺血再灌注组 拮抗剂组比较 /9 的表达降低 缺血后处理组 $ % 2 腺苷治疗组 $ $ 比缺血再灌注组 2 拮抗剂组 2 均 ( 心肌凋亡指数降低 缺血后处理组 $ 腺苷治疗组 比缺血再灌注组 拮抗剂组 2 $ 均 ( 77 2 光密度较低 ( 缺血后处理组和腺苷治疗组的上述指标差异无统计学意义 各组间 77 $ 77 酶原 $ & 77$ 表达水平差异无统计学意义 ( 结论 腺苷可以抑制缺血再灌注心肌的炎症反应 细胞凋亡及 77 的活化 从而对缺血再灌注损伤的心肌有保护作用 关键词 腺苷 缺血后处理 缺血再灌注损伤 基质金属蛋白酶 ( ( * (/ ( (/ / 8C?!,! )(/?!( "!" 6%- 3!",!, &!! +, * <!* # * # -!# & & #& # & /9 * & & 77 # & &! #&*!" - & : & & * + * +&! # #& &! + # * + ** & * "0 && * #&* # #& &! : * # - /9 :!& *! # & # <*< * **C< # * +<C/ * # - 77 $ *77 2 + 5 +& "< * & # ++&!: & * & *! + : 0/ 60". / ) & * # * + ** +&! # #& &! * + +&! & /9 * #& * + # # * + $ % 2 * & * $ $ - # #& &! 2 + 2 ( * # * #& * + # # * + $ * & * - # #& &! + 2 $ ( * # * 77 2:!# : &: ( "< & : & * & # & * : # * ++&! * * +&! ( "< & : & * & # # * 77 $ * & 77 $ + +&!( "0 / 0* # &- #&* & &!,!& *& # #&*! + * # - 77 " " # 0* # * + # & &!,!& 7 & & 急性心肌梗死患者急诊经皮冠状动脉介入治疗使闭塞的冠状动脉再通后有 的患者可能发生 基金项目 北京市博士后科研活动经费资助基金 $ $>> 通信作者 贺晓楠 * 2% $%"# 无复流或慢血流现象 不能实现心肌组织的有效灌注 因此 减少再灌注损伤成为国内外研究比较活跃的领 域 国内外动物实验证实 腺苷在心肌缺血再灌注 $ 损伤中具有保护作用 关于腺苷对缺血再灌注心 肌影响的分子机制尚不十分明确 > 等发现缺
%%$ 中华高血压杂志 $ 年 月第 $$ 卷第 期 ).( &.! $ 6 "$$/ " 血再灌注早期反复进行短暂的缺血再灌注之后 可明显减轻再灌注损伤 进而提出缺氧后处理概念 更具有临床可行性 本研究旨在通过腺苷治疗兔心肌梗死再灌注模型 探讨腺苷对缺血再灌注后心肌保护作用的分子机制及其与缺血后处理的关系 材料与方法 材料 实验动物 月龄的 只健康大耳白兔 体质量 $ $ + 吉林大学动物中心提供 合格证号 ) ; 吉 $ 只白兔在建模中发生心室颤动死亡 存活率为 2 2 药物及主要试剂与仪器 腺苷 沈阳诺康医药有限公司 苯基茶碱 + 公司产 抗兔核转录因子!# & & #& # & /9 % 浓缩型免疫组化染色试剂盒 北京博奥森生物 末端标记法 <*< * **C< # * +<C/ 细胞凋亡检测试剂盒 南京凯基生物. 0 自动凝胶图像分析仪 上海培清 方法 $ 建立模型 $ 的乌拉坦 + + + 经耳缘静脉注射麻醉后固定 用肝素钠 + 抗凝 分离颈动脉 %9 导管经颈动脉插入左心室 连接四导生理记录仪 监测左心室内压 心电图导联线与兔四肢相连接入心电放大器 记录标准 导联心电图 气管切开 连接动物呼吸机 潮气量 $ 频率 次 于胸骨左缘 肋间开胸 用丝线结扎左冠状动脉前降支 用内径为 的硅胶管套线 束紧后在贴紧硅胶管的上端用止血钳夹紧线 造成心肌缺血 心电图出现明显的 < 段抬高 每次都由同一人完成这一操作步骤 放松止血钳 去掉硅胶管 抽出结扎 % 线 原来结扎血管再通 缺血再灌注模型建立 $ $ 分组 将存活 只白兔按体质量编号后 按随机数字表随机分为 组 每组 只 缺血再灌注组 缺血 再灌注 $ 拮抗剂组 缺血前静脉滴注 静滴 非特异性腺苷受体拮抗剂 苯基茶碱 + + 持续 余下步骤同缺血后处 理组 缺血后处理组 缺血 再灌注 $ 缺血 $ 再灌注 缺血 $ 再灌注 缺血 $ 再灌注 缺血 $ 然后再灌注 2 腺苷治疗组 缺血 再灌注 $ 缺血再灌注即刻静滴腺苷 内滴完 拮抗剂组缺血前静滴 苯基茶碱 其余组缺血前静滴生理盐水 作为平衡缺血再灌注组 腺苷治疗组缺血再灌注即刻静滴腺苷 其余组缺血再灌注即刻静滴生理盐水 作为平衡缺血再灌注组 $ 指标检测 $ 免疫组化检测 /9 取梗死的心肌组织石蜡切片 免疫组织化学方法检测 /9 操作按说明书进行 分析每张石蜡切片随机选取 个高倍视野 共计数 个细胞 然后计算胞核阳性的细胞数占细胞总数的百分比作为细胞表达 $ $<C/ 染色检测心肌细胞凋亡数量 计算凋亡指数 <C/ 染色方法检测心肌组织石蜡切片中的凋亡细胞的数量 操作按说明书进行 分析每张切片随机选取 个高倍视野 共计数 $ 个细胞 然后计算胞核阳性的凋亡细胞数占所数细胞总数的百分比作为心肌细胞凋亡指数 $ 酶谱法测定基质金属蛋白酶 & & 77 $ 77 2 的表达 观察缺血再灌注即刻应用腺苷对兔缺血再灌注后心肌的影响 聚丙烯酰胺凝胶中含有 + 明胶 应用同等量蛋白 + 在蛋白电泳运行后 用 $ 三硝基甲苯 清洗 $ 然后把胶放入含有 的三羟甲基氨基甲烷盐酸溶液 ( 值 氯化钙和 聚氧乙烯月桂醚的溶液中 在 G 孵育箱中过夜 然后用考马斯亮蓝 8$ 染色 将电泳凝胶放在. 0 自动凝胶图像分析仪中进行照相处理 在聚丙烯酰氨凝胶电泳胶中 77 的蛋白结构不发生变化且在胶中显示白色区带 根据分子量可判定 77 酶原 & 77 和 77 计算机根据目的条带的亮度和面积自动读取并记录每条带的密度的相对定量值 统计学方法 所有试验数据由 $ 统计分析软件处理 计量资料用均数 标准差 9 表示 多组间比较采用单因素方差分析 组间两两比较采用 /;7 检验 以 ( 为差异有统计学意义 结 果 心肌组织 #$* 的活化及免疫组化检测 与缺血再灌注组 拮抗剂组比较 缺血后处理组和腺苷治疗组 /9 的表达降低 缺血后处理组 $ % 2 腺苷治疗组 $ $ 比缺血再灌注组 2 拮抗剂组 2 均 ( 见图 +, 检测心肌凋亡 与缺血再灌注组 拮抗剂组比较 缺血后处理组和腺苷治疗组心肌凋亡指数降低 缺血后处理组 $ 腺苷治疗组 比缺血再灌注组 拮抗剂组 2 $ 均 ( 见图 $
中华高血压杂志!6#/% 年 0 月第 66 卷第 0 期!A, * ;F@>9: 8 = :;1"F3 + +466G240 >6#/%"T2 0 77" 0 注! GW *L!核转录因子 *L*箭头所指棕色颗粒代表 GW *L 核定位的心肌细胞"蓝色颗粒代表正常心肌细胞* 图 6! 心肌组织 GW *L 的活化及免疫组化检测#o6##$ 注! `gg&[!末端标记法*箭头所指棕色颗粒代表凋亡的心肌细胞"蓝色颗粒代表正常心肌细胞* 图 7!`gG&[ 法检测细胞凋亡#o6##$ % (!EE/ 6 %( EE/ 6 "的表达水平!缺血后处理组和 腺苷治疗组的 UUJ P 光密度低于缺血再 灌 注 组 和 拮 抗剂 组 (缺 血 后 处 理 组 # 7/6!]/$76$+腺 苷 治 疗 组 # 7#%6]/%$"$比 缺 血 再 灌 注 组 # //$7!]66/P$+拮 抗
%% 中华高血压杂志 $ 年 月第 $$ 卷第 期 ).( &.! $ 6 "$$/ " 剂组 2 2 均 ( 各组间 77 $ & 77 $ 表达水平差异无统计学意义 ( 见图 注 77 基质金属蛋白酶 &77 $ 基质金属蛋白酶酶原 $ 图 & 明胶酶法检测 77 $ 77 2 的表达水平 讨 论既往研究显示腺苷具有 扩张冠状动脉 增加氧气供给 减少氧气消耗 抑制内皮素释放 抑制血小板聚集 减轻再灌注心脏的钙超载 减少脂肪分解和减轻中性粒细胞的激活 进而使超氧阴离子等氧自由基产生 减少 从而保护了缺血再灌注损伤的心肌 目前缺血后处理已经成为关注的热点 研究表明缺血后处理对于冠状动脉介入 冠状动脉搭桥 器官移植及周围血管 再血管化更具有临床可行性 能够保护内皮血管功能 有研究表明 心肌缺血再灌注早期就可出现心肌炎性反应 且与多种含有 位点的基因过度表达有关 提示 /9 是急性炎症发生发展的关键环节 参 2 与缺血再灌注损伤的病理生理过程 本实验通过在体兔缺血再灌注模型 发现心肌缺血再灌流早期可激活 /9 引起炎症反应 缺血再灌注即刻应用腺苷可以抑制 /9 的活性 抑制炎症反应 在实验中发现缺血后处理也具有同样的结果 证明缺血后处理和腺苷治疗可抑制 /9 从而抑制炎症反应 减少缺血再灌注损伤 缺血后处理和腺苷治疗组的实验结果差异无统计学意义 同时 试验结果表明缺血后处理对心肌缺血再灌注损伤的保护作用能够被非特异性腺苷受体拮抗剂 苯基茶碱所阻断 证实腺苷 腺苷受体途径是缺血后处理的重要途径之一 心肌是发生缺血再灌注损伤的最常见组织 而且对心肌缺血再灌注早期的研究与心肌细胞凋亡密不可 2 分 本研究通过 <C/ 法原位检测 1/0 断裂片 段技术检测凋亡细胞 结果显示 缺血再灌注即刻应用腺苷治疗组和缺血后处理组 细胞凋亡指数较缺血再灌注组和拮抗剂组降低 ( 证实了腺苷和缺血后处理的抗细胞凋亡作用 亦间接证实了腺苷通过抗细胞凋亡而发挥保护缺血再灌注的心肌 减少心肌细胞损伤作用 同时 统计学研究表明 缺血后处理组和腺苷治疗组差异无统计学意义 证明了应用药物腺苷治疗缺血再灌注损伤的疗效等同于缺血后处理 77 是一类生物活性依赖于锌离子 有降解细胞外基质能力的内肽酶家族 77 参与细胞外基质重构需要几天至几周时间 但是 77 $ 77 2 可在 数秒至数小时内参与缺血再灌注过程 本研究观察各组缺血再灌注心肌的 77 $ 和 77 2 的表达与活性 结果显示 腺苷治疗组和缺血后处理组的 77 2 光密度明显低于缺血再灌注组和拮抗剂组 ( 腺苷治疗组和缺血后处理组 77 $ 表达与缺血再灌注组差异无统计学意义 研究结果表明 在缺血再灌注的早期可以看到 77 2 的酶表达量及酶活性增高 缺血后处理组与缺血再灌注组 77 $ 差异无统计学意义 77 2 减少 ( 不同 77 活化的差异性可能与缺血的严重程度有关 与 $ 既往结果一致 本研究结果表明 腺苷可以适度地干预 /9 的活化 将会对缺血性心肌损伤的治疗产生积极的作用 /9 是重要的核转录因子 激活后可诱导多种下游靶基因表达 77 2 是其中重要的一种 /9 进入核内启动 77 2 的 3/0 转 录 依据上述结果可以推测 腺苷可能通过作用于 77 2 基因的转录因子 /9 产生对 77 2 基因的转录和表达的抑制作用 从而抑制了缺血再灌注早期的炎症反应 保护心肌 因此对于探讨缺血再灌注即刻应用腺苷对缺血再灌注损伤保护的作用机制有着极其重要的意义 本研究证实了腺苷可以抑制缺血再灌注心肌的炎症反应 细胞凋亡及 77 的活化 从而对缺血再灌注损伤的心肌有保护作用 鉴于国内外对此研究甚少 此项研究有望成为崭新的课题 本主题国内外已有的结论 腺苷作为一种心肌保护药物已经被广泛研究 国内外动物实验及临床试验证实腺苷在心肌缺血再灌注损伤中具有保护作用 在动物再灌注模型上腺苷可以缩小梗死面积 改善左心室功能以及增加冠状动脉血流 本文特色与见解 腺苷和缺血后处理可以抑制 /9 的活性 抑制炎症反应
中华高血压杂志 $ 年 月第 $$ 卷第 期 ).( &.! $ 6 "$$/ " %% 参考文献的保护作用." 第四军医大学学报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沈炳玲 秦毅 颜利求 " 锌对家兔心肌缺血 再灌注损伤的保护作 & 2 /9." * - & # 用." 中国危重病急救医学 $ %2%% " $ $%$$" 陶凌 李源 高峰 等 " 缺血后处理对急性心肌缺血再灌注兔心脏收稿日期 $ $ 责任编辑 罗冬梅 简 讯 凝血因子.$ 激肽调节慢性肾脏病患者高血压 刘莉 译 叶鹏 摘 审校 研究表明 输注激活的凝血因子 #+! # & 9 可增加 & : / &: / 大鼠外周血管阻力 & & & # < 3 和平均动脉压 & & &!& 70 而在血浆激肽原缺乏的 & : / &: ; /; 大鼠中则无此作用 接受常规血液透析 # - * )(1 的终末期肾脏病合并高血压患者 9 浓度增加 转为夜间血液透析 #!& * /(1 后可降低 < 3 和 70 目的 该研究旨在确定血浆 9 胰舒血管素 激肽轴在慢性肾脏病 # & # * * );1 导致的高血压中的作用 方法 研究人员获取 例 )(1 患者进行 $ 月 /(1 前后血浆 9 和血液动力学资料 测定行 % 肾切除术的患高血压和尿毒症的 / /; 大鼠在急性 9 抑制前后心脏和全身的血流动力学情况 结果 与对照组相比 )(1 患者 9 浓度增加 倍 ( 转为 /(1 后 70 变化值和 < 3 变化值均与 9 变化值相关 在大鼠实验中 所有行肾切除术大鼠血浆 9 浓度较假手术组高 倍 均 ( 但行肾切除术的 / 大鼠 %70 比 $ (+ (+ ( 和 < 3$ $ 比 $ $C ( 水平较行肾切除术的 /; 大鼠 高 仅在行肾切除术的 / 大鼠中 发现 9 与 70 相关 且血浆儿茶酚胺较假手术组增加 ( 9 抑制剂输入降低 70 $ (+ 和 < 3 C 均 ( 并可减少一半的儿茶酚胺 ( 在行肾切除术的 /; 大鼠中未发现上述改变 结论 9 激肽轴可调节血管收缩 对 / 大鼠 );1 所致高血压作用显著 这种机制可能在 );1 患者中也存在 + &+! )) )<? # (9 &. " % " $ $ $ "