荧光染色骨髓间充质干细胞及苦碟子的血管介入治疗骨折不愈合 的实验研究 1 研究内容本研究利用实验动物模拟骨折不愈合动物模型, 采取血管介入治疗的方法, 通过血管直接给予相关生物制剂来对内固定后的骨折不愈合进行治疗, 分析介入疗法给药对骨折不愈合的疗效, 同时通过荧光示踪方法, 寻找血管介入治疗给药后药物在骨折端聚合的证据, 从而探寻新的给药方式对骨折是否有促进作用 最后综合分析实验结果, 力求探索介入疗法及骨折端血管直接药物注入对骨折不愈合进行治疗的可操作性及实际效果, 从而指导临床工作 申请人在临床上遇到较多骨折切复内固定术后因各种原因致内固定材料断裂而发生原骨折端的再骨折, 或者其他原因造成的临床骨折不愈合, 需进行二次手术治疗 目前再手术治疗方案多以更换内固定材料及植骨为主 二次手术对患者自身造成创伤较大, 并且造成骨折端的延迟愈合甚至不愈合, 同时也妨碍了患者进行早期的功能锻炼, 往往不能被患者乐意接受 研究者的长期目标在于探索介入治疗及血管注入疗法对骨折不愈合的实际临床指导意义 争取在较长一段时间内实现该疗法的临床实际应用 预期目标 : 将通过动物实验探索血管注入治疗对骨折不愈合的实际操作可能性, 通过血管直接注入骨髓间充质干细胞及苦碟子, 观察该方案的 BMSC 及苦碟子的治疗效果 进行统计学分析, 得出血管介
入疗法对治疗实验动物骨折骨不连的实际效果, 从而可以进一步探索血管介入疗法能否应用于临床, 实现创伤小, 效果好的新型治疗方法, 为患者提供更加优质有效的治疗方案 如能申报成功, 将进一步研究 BMSC 剂量 其他扩血管药物对治疗骨折不愈合的作用效果, 探究最佳的治疗方案 本项目的申请是长期目标中非常重要的基础部分, 之后的发展思路需要在此工作基础上再创新 血管注入疗法具有很好的发展前景, 若能广泛应用于临床治疗, 将无疑可以开辟一条治疗骨折不愈合的新途径 本项目旨在解决临床上关于骨不连治疗方案选择的问题, 特色在于以下几点 首先干细胞及苦碟子的研究是近几年较为热门的课题, 而本次实验应用 BMSC 及苦碟子治疗实验动物股骨骨不连为将来 BMSC 苦碟子在骨科临床应用打下的基础 其次现关于干细胞对于促进骨折愈合的研究多为通过手术在骨折端周围注入干细胞及相关的促进干细胞生长的药物, 使干细胞在骨折端直接分化成相应部位的骨细胞, 促进骨小梁的生长, 进而促进骨折的延迟愈合及不愈合, 并且已有研究表明 BMSC 确实对骨折愈合具有促进作用 同时, 苦碟子的扩张冠状动脉 外周血管 增加血流量 降低血管阻力 抑制血栓形成等药理学作用已经得到证实, 并且已经广泛应用于心内科 呼吸科 内分泌科 眼科等各个学科领域 而本实验考虑到骨折延迟愈合或不愈合多为血管营养不足造成, 故通过将干细胞与介入治疗相结合, 通过股动脉直接往骨折端注入 BMSC 及苦碟子, 使得干细胞在骨折端分化 相对于自体植骨及手术移植干细胞等治疗骨折不愈合的方法, 本
次研究的创新在于可直接通过体外股动脉置管, 具有创伤小, 易于被患者接受等优点, 若实验证实血管注入疗法确有效果, 则该技术具有良好的应用前景 目前还未见过相关的类似研究 2 研究方法和技术路线本课题共分三个部分 : 第一部分 : 股骨骨折不愈合动物模型的建立 : 骨折内固定手术在无菌环境下完成, 操作过程遵循外科无菌原则 选取实验动物 ( 实验兔 ( 清洁级 ), 性别 体重 生理状况基本相近 ) 及内固定材料 ( 髓内固定 ), 麻醉后,PVP 碘消毒左后肢后开始手术 术中暴露股骨后用锯条或电钻锯断股骨, 造成横行骨折, 再将骨折端切除 0.5 厘米造成骨质缺损不愈合模型, 然后置入髓内钉固定 在同侧进行股动脉插管, 体外股动脉留置导管 手术缝合后摄 X 片确认骨折位置及骨折断端情况, 再通过股动脉置管注入造影剂, 确认骨折端的血管通畅情况 手术后, 常规饲养, 术后前三天注射抗生素预防感染 培养骨髓间充质干细胞 模型经过相关验证后进入下一研究步骤 第二部分 : 介入疗法模型建立 : 将 20 只实验兔进行分组, 具体如下 : 第 1 组 : 对照组,5 只兔子仅经骨折后手术内固定处理, 不做其他处理 ; 第 2 组 :5 只兔子经手术内固定处理后, 通过股动脉置管注射 BMSC 溶液 (0.5ml/5mg) 及苦碟子注射液 (0.5ml/kg), 术后一周再次注射 BMSC 溶液 (0.5ml/5mg) 及苦碟子注射液 (0.5ml/kg); 第 3 组 :5 只兔子经手术内固定处理后, 通过皮肤穿刺直接在骨折端注射 BMSC(0.5ml/5mg) 及苦碟子注射液 (0.5ml/kg), 术后一周再
次注射 BMSC(0.5ml/5mg) 及苦碟子注射液 (0.5ml/kg); 第 4 组 :5 只兔子经手术内固定处理后, 通过股动脉置管注射同第 2 组注射总剂量相同量的生理盐水, 术后一周再次注射同等量的生理盐水 术后常规饲养后 8 周摄 X 片, 处死动物后取骨折端股骨, 做组织学检测 注射用 BMSC 溶液及苦碟子注射液内均采用荧光染色, 取标本后骨折端组织观察染色情况来判断是否有干细胞在骨折端起作用 第三部分 : 实验数据统计学分析 : 将实验所得数据做统计学的分析,P<0.05 有统计学意义 实验统计分计量和计数资料的收集, 包括各种力学结果, 计量资料应用 ANOVA one-way 先行方差齐性检验, 如果方差不齐则行秩和检验, 计数资料的统计采用 CHI-Square, 所有统计结果均用 SPSS16.0 统计软件包进行 关键技术 :1.BMSC 培养及荧光染色技术 ;2. 股动脉体外置管, 导管内直接注入治疗药物 进度安排 : 2016-01~2016-12 前期准备包括临床资料观察和相关信息获 得 2017-01~2017-12 股骨骨不连动物模型以及介入疗法模型建 立, 同时准备开始分组实验 2018-01~2018-12 完成分组实验, 结果观察以及统计分析 撰写论文及课题评审
实验线路简图 清洁级实验动物兔 20 只 第一组 :5 只兔子骨折内固定处理后不做处理 第二组 :5 只兔子骨折内固定处理后, 通过股动脉置管注射 BMSC 溶液 ( 0.5ml/5mg) 及苦碟子注射液 (0.5ml/kg), 术后一周再次注射 BMSC 溶液 (0.5ml/5mg) 及苦碟子注射液 (0.5ml/kg) 第三组 :5 只兔子骨折内固定处理后, 通过皮肤穿刺直接在骨折端注射 BMSC 溶液 (0.5ml/5mg) 及苦碟子注射液 (0.5ml/kg), 术后一周再次注射 BMSC 溶液 (0.5ml/5mg) 及苦碟子注射液 (0.5ml/kg) 第四组 :5 只兔子骨折内固定处理后, 通过股动脉置管注射同第 2 组注射总剂量相同量的生理盐水, 术后一周再次注射同等量生理盐水 术后常规饲养后 8 周摄 X 片, 处死动物后取骨折端股骨, 做组织学检测 收集实验数据, 做统计学分析 得出结论 小结 讨论
本科研采用动物实验方法初步探究血管注入疗法的可行性及治疗效果, 为新疗法进入临床打好基础 本课题组成员有较为丰富的实验动物与动物实验的工作经验, 已取得实验动物与动物实验资格证, 为课题研究在技术方面提供了保障 同时, 该实验设计充分体现了随机对照的原则 课题负责人具有多年的临床经验, 对于骨折不愈合有较为深刻的认识 以上几点都是本课题能顺利进行的保证 3 研究结果通过动物实验建立骨折不愈合的实验动物模型, 探讨骨髓间充质干细胞及苦碟子的血管注入治疗对实验动物骨折不愈合的治疗效果 再将所得的实验数据进行统计学处理后分析血管介入疗法对治疗实验动物骨折骨不连的实际应用价值, 从而为该疗法应用于临床诊疗奠定基础 预期产生专业论文 1-2 篇, 另初步拟定该方法的总体研究方向, 在未来较长一段时间内, 探究 BMSC 及苦碟子的最佳治疗剂量, 同时进一步探究联合其他扩血管药物的效果, 制定最佳的药物组合 如有可能, 在一定的研究基础上, 在确保安全的前提下, 在临床上能有所实践, 观察临床实际效果 本项目的申请是长期目标中非常重要的一部分, 之后的发展思路需要在此工作基础上再创新 显然, 血管注入疗法具有很好的发展前景, 本项目的研究若能取得成功, 未来将有可能应用于临床实践, 这对患者来说无疑是一个不错的治疗方法 本人多年的工作经历中遇到的骨折不愈合病例不可谓少见, 而目前的手术治疗和非手术治疗方法都有程度的发展, 特别是非手术治疗
更容易被患者接受 但根据本人对国内外文献的复习, 在众多的非手术治疗方法中, 还未有效果显著同时技术相对成熟的疗法 而本次欲探究的微创血管介入疗法有望能成为骨折不愈合患者的新福音 如在将来能应用于临床, 相信会被广大患者接受