第 卷第 期 年 月 西安交通大学学报 医学版!"#$## %&'& & 临床研究 冠心病患者外周血人枯草溶菌素转化酶 基因 位点的多态性及其临床意义 张明明 刘 欣 高 伟 张翠改 赵 培 于悦卿 吴惠珍 李亚丽 $ 河北省人民医院 检验科 超声科 体检中心 药学部 $ 生殖遗传科 河北石家庄 $$ 摘要 目的 探讨外周血人枯草溶菌素转化酶 %&'% 基因 多态性与不同类型冠心病之间的关系及临床意义 方法 选取 年 月 年 月年在我院就诊的不同类型冠心病患者 $ 例作为病例组 按照解剖及病理生理变化分为心绞痛 心肌梗死 无症状心肌缺血 缺血性心肌病 猝死 $ 组 同期健康体检者 例为对照组 应用聚合酶链反应 &'( 结合 )*+ 直接测序技术 对所有入选者 &'% 基因,- 多态位点进行分型 多因素 回归分析 &'% 基因 多态位点与不同类型冠心病的相关性 同时检测研究对象的血脂及 &'. % 水平 结果 病例组血清 &'%,',-/)/' 阳性家族史的比例高于对照组 0)/' 低于对照组 均 $ 病例组中猝死组各指标变化最明显 无症状心肌缺血组变化最小 病例组中,,-, 基因型和, 等位基因频率分别为 11 和 1 明显高于对照组 111 均 病例组中猝死组,,-, 的基因型频率, 等位基因频率最高 无症状心肌缺血组最低 $ 回归分析发现 &'% 基因,- 多态位点,, 基因型与冠心病的严重程度有关 值为 %$1 为 $$$ 结论 &'% 基因,- 位点基因突变与冠心病严重程度有关 关键词 人枯草溶菌素转化酶 % 基因 基因多态性 冠心病 血脂中图分类号 (($ 文献标志码 + $!"#$! %&'%"%! #%(!!%(!#%#!%"#%# 0+*-!.! /2 3! -+4 5# 0+*-'".6 0+4&# 72 7"#.8! 52 0".9#! /76.: $ )#6;#!#6:/6;6;)#6;#!2:;6"!&6:6!6! '#!#;)#6;#!&6;6$)#6;#!(#;"! -#!# 0##&;!6:&#:#06:69"6!$$'!6 )*'+,)&+#"##%# ()$*% +# "&,#"$+# "+ # #& +"""$- #"# #"# ###" " """ ##"#"#&.# "#&()/ #-" +"#0# " +" %# ()$*%&1#+"-+ %# ()$*%"# "&##()$*% ""++ "&()$*%)"1.1)" #+# # +.1) ++#&$&""""-# +"##+ # #"#-+"+ 收稿日期 %$ 修回日期 基金资助 河北省科技支撑项目 '&. $"- $##"# (2#-(#'&. 通信作者 张明明 &3%&# 优先出版 &#&#"&%%&/&&%&&
$$ 西安交通大学学报 医学版 第 卷 #&0# " # +&4&4 "&4 # +#+# # &4&4 "&4 &&0# "+""""- "+ 0# "+" # #"#- &$&/1# +"%#()$*%+" # "<&%$4 &$$&$&& % #()$*%-" # "& -. /,' #- % # " -"" 遗传因素 不良生活习惯 肥胖 高血压等均与冠心病有关. 我们前期研究发现 人枯草溶菌素转化酶 % ;;#!!#;6#":!=#!#%&'% $ 突变可影响胆固醇代谢 促进动脉粥样硬化 研究显示 &'% 第 外显子 - 突变与冠心病的发生与. 治疗有关 但目前有关 &'% 基因 与冠心病病情的关系尚未见报道 本研究选取了不同类型的冠心病患者及健康体检者 检测 &'% 基因 突变在入组者中的分布差异以及 &'% 血清浓度的变化 探讨了该基因突变与冠心病的关系 资料与方法 一般资料 选取 在我院门诊及住院的冠心病患者 $ 例为病例组 所有患者均有发作性胸痛等症状 心电图显示, 段改变及, 波异常 不典型患者结合动态心电图 冠状动脉 ', 或冠状动脉造影等检查 由我院心内科医生确定冠心病类型 病例组男 人 女 人 男性年龄 岁 平均年龄 %>% 岁 女性年龄 % 岁 平均年龄 $>%% 岁 按解剖及病理生理变 % 化将病例组患者分为心绞痛 心肌梗死 无症状心肌缺血 缺血性心肌病 猝死 $ 组 各组的性别年龄分布见表 同时选取 例同期健康体检者为对照组 病例组与对照组性别 年龄比较差异无统计学意义 $ 排除肝炎 肝硬化 肾炎 肾病综合征 肾功能不全 先心病等疾病 所有入选者均签署知情同意书 由河北省人民医院伦理委员会批准 标本采集 取入选者空腹静脉血 / 其中 / 放入 ),+. 抗凝管 混匀后? 保存 用于提取基因组 )*+$ / 放入促凝管中静置!;!@ 离心 $! 分离血清 检测血脂水平 &'% 浓度 血清血脂水平的测定 以 A#=6! +2$ 全自动生化分析仪测定血清中总胆固醇,' 甘油三酯,- 高密度脂蛋白 0)/' 低密度脂蛋白 /)/' 的水平 表 不同类型冠心病患者的性别和年龄情况,6 -#!#;6!6#!#;#!6#! ;!6; #6;#6# 男 性别 女 年龄 > 岁 心绞痛组 % $>% 心肌梗死组 $> 无症状心肌缺血组 $>% 缺血性心肌病组 $ $$>% 猝死组 $>% $ %$ % 01 血清 &' 水平的检测 选用 &'%0"6! /+ 试剂盒 %,++!6 公司 美国 严格按照说明书的要求操作 血清标本 B 预稀释备用 板内变异系数 %1 板间变异系数 1 加标回收率 %1 检测范围!/ 最低检出线 $!/ 用稀释液稀释标准品 绘制标准曲线 全自动酶标仪 $! 处读数 0&' 基因 位点多态性分析 00 提取基因组 )*+),+. 抗凝血 / 按照,+*6-#! )*+ = 血液 细胞 组织基因组 )*+ 提取试剂盒 离心柱型 )& 说明书提取基因组 )*+ &'( 扩增目的基因片段 应用生物学软件 &;#; 设计引物 &'% 基因引物上游 $C. +++----+-'+--,','''.C 引物下游 $C.-'. ''-''',''',''-''',''-.C 反应体系 @ &'( 缓冲液 $/': $ :// :/*,&2,&B,,&<B%$/ :/ 上下游引物 $/$2 4):"&")*+ 聚合酶 日本,474A4 公司 /2 不耐热的尿嘧啶 )*+ 糖基化酶 2*- 罗氏 / 目标 )*+$ / 加无菌水至 $/ 应用 6#;:#; ;6#! &'( 分析仪 德国 #!; 公司 扩增 扩增条件? 孵育! 裂解 ".)*+ 然后在 %$?! 初始变性 随后进行 $ 个循环 %$?$%?
期 张明明 刘 欣 高 伟 等 冠心病患者外周血人枯草溶菌素转化酶 % 基因 位点的多态性及其临床意义 $$?? 孵育! 扩增产物通过 $/ 例组 &'%,',-/)/' 的水平 阳性家族史的琼脂糖凝胶电泳进行验证 比例均高于对照组 而 0)/' 的水平低于对照组 差 核苷酸序列分析 应用美国 +A3/ 全异有统计学意义 $ 病例组中猝死组 &'. 自动 )*+ 测序仪测定目标基因的序列 正反两方向 %,',-/)/' 的水平及阳性家族史的比例高测序 测定结果用 )*++* 软件 %% 与于其他 种类型冠心病组 而 0)/' 的水平低于其他 -#!A6!=A/))AD 数据库中保存的 &'% 基 种类型冠心病组 差异有统计学意义 $ 心因序列进行比对 根据测序结果与基因库中公布的肌梗死组和缺血性心肌病组的 &'%,',- 基因序列的差异确定突变位点 /)/' 水平及阳性家族史的比例高于心绞痛及无症 统计学处理 采用 & 软件进行统计学状心肌缺血组 0)/' 水平低于心绞痛及无症状心分析 计量资料以 > 表示 组间比较采用方差分肌缺血组 差异有统计学意义 $ 但心肌梗析 两两比较采用 *. 检验 计数资料以频数和百分死组和缺血性心肌病组之间各指标差异无统计学意比表示 组间比较采用 检验 采用多因素 回义 $ 心绞痛组 &'%,',-/)/' 的归分析 &'% 基因 突变和不同类型冠心病之间水平及阳性家族史的比例高于无症状心肌缺血组 的关系 以 $ 为差异有统计学意义 0)/' 的水平低于无症状心肌缺血组 差异有统计 结 果学意义 $ 饮酒史及吸烟史各组间差异无统计学意义 $ 表 0 两组血清血脂水平和 &' 浓度的比较 病 表 不同类型冠心病组和对照组血脂水平及 &' 浓度的比较,6/##:#;":6!&'%!#;#! ;!6;#6;#6#6!!;:;" 例数 &'% >!/,',- 0)/' /)/' >:/ >:/ >:/ >:/ 冠心病家族史 1 吸烟 1 饮酒 1 病例组 $ >% > $> > >% % 心绞痛组 %> > $%> >$ %> % $% 心肌梗死组 $ >% $> >$ > > %$ % 无症状心肌缺血组 >$ $> $> %> > $% %% %%% 缺血性心肌病组 >$ $> > $> >% % $% 猝死组 $>$ $> %> >% %> $ 对照组 > %>$ > > > $$ %% $$ % % $ %$ 与对照组比较 $ 与猝死组比较 $ 与心肌梗死组和缺血性心肌病组比较 $ 与无症状心肌缺血组比较 $ 表中 &'%,',-/)/' 的统计值为 值 冠心病家族史 吸烟及饮酒率的统计值为 值 0&' 基因第 外显子 位点多态性直共有 种基因型,, 突变纯合子 -, 突变杂合接测序结果 &'( 产物纯化后双向测序结果显示 子 -- 野生型 图 &'% 基因 位点存在两种等位基因 - 和, 图 &' 基因 位点多态性基因的表达情况 ;#!:":;&'%#!#
$$ 西安交通大学学报 医学版 第 卷 0&' 基因 位点多态性基因型和等位基因频率的分布 病例组中,,-, 的基因型频率高于对照组 病例组中, 等位基因的频率高于对照组 病例组中猝死组,, -, 的基因型和, 等位基因的频率高于其他 种类型冠心病组 $ 心肌梗死组和缺血性心肌 病组的,,-, 的基因型和, 等位基因的频率高于心绞痛及无症状心肌缺血组 $ 但心肌梗死组和缺血性心肌病组之间差异无统计学意义 $ 心绞痛组,,-, 的基因型和, 等位基因的频率高于无症状心肌缺血组 $ 表 表 不同类型冠心病组和对照组 &' 基因 位点多态性基因型和等位基因频率分布比较,6-#!#6!6:#:#:":;&'%#!#!#;#! ;!6;#6;#6#6!!;:;" 例数 基因型 1 -- -,,, 等位基因 1 -, 病例组 $ %% $% 心绞痛 %%$ $ $% % 心肌梗死 $ $ %% $ $$% 无症状心肌缺血 $ $ % % 缺血性心肌病 $% % $ $ 猝死 $ % $ % 对照组 % 病例组 对照组 % $% 与对照组比较 $ 与猝死组比较 $ 与心肌梗死组和缺血性心肌病组比较 $ 与无症状心肌缺血组比较 $ 01 多因素 回归分析结果 以冠心病 无 < 有 < 为因变量 以性别 男 < 女 < 年龄 <$<$<< <,',-/)/'0)/'&'%&'% 基因 基因型 --<-,<,,< 为自变量 进行 回归分析 结果显示基因型 尤其是,, 基因型与冠心病严重程度关系密切 是冠心病严重程度的独立危险因素 值为 %$1 为 $$$ 表 表 1 冠心病危险因素多因素 回归分析结果,6(#":;#;#!6!6:;=6; ; ;!6;#6;#6# 变量! "#$% %& %$1 性别 $ $ % $% 年龄 % % %%,',- % % % $%$ /)/' % 0)/' % $ $ % $ %$% &'% $ % $ -* -* %$ % -* % $ $$$ 讨 论 本研究发现 病例组阳性家族史的比例明显高于对照组 证实遗传因素是引发冠心病的重要原因 同 时 病例组中,',-/)/' 的水平明显高于对照组 0)/' 明显低于对照组 说明血脂水平的异常对冠心病的发生发展有促进作用 将病例组按不同类型分组后发现猝死组的阳性家族史比例以及,',-/)/' 的水平明显高于其余 组 0)/' 明显低于其余 组 急性心梗组和缺血性心肌病组的阳性家族史比例和,',-/)/' 的水平明显升高 0)/' 明显降低 上述血脂指标按病情轻重程度呈现有规律性的变化 说明遗传因素是冠心病发生发展的重要因素 已有研究证实冠心病患者血浆 &'% 的水平. 升高 本研究冠心病组 &'% 的水平高于对照组 与报道相符 将病例组按不同类型分组后发现 &'% 水平在猝死组 心肌梗死组 缺血性心肌病组 心绞痛组 无症状心肌缺血组依次降低 认为 &'% 的水平可以作为评估冠心病类型的一项新指标 &'% 基因位于 全长 个碱基 编码 个外显子 位点位于 &'% 基因的第 外显子 位于 &'% 蛋白催化域的编码区 该位点发生突变 对 &'% 的催化功能有直接影响 我们前期研究发现高胆固醇血症患者 &'% 基因的 突变 证实该突变是引起高胆固醇血 $ 症的原因之一 由于高胆固醇血症是冠心病的重要危险因素 而该位点与冠心病发病之间是否有关尚未见报道 本研究结果显示 病例组中,,-, 的基因型频率均明显高于对照组, 等位基因的频率也高
期 张明明 刘 欣 高 伟 等 冠心病患者外周血人枯草溶菌素转化酶 % 基因 位点的多态性及其临床意义 $$ 于对照组 将病例组按不同类型分组后发现 猝死组,,-, 的基因型频率和, 等位基因频率最高 其次为心肌梗死组和缺血性心肌病组 心绞痛组 结果表明 &'% 基因突变可能与冠心病的病情有关 为判断 &'% 基因 突变在冠心病中的意义 进一步行多因素 / 回归分析 结果显示,, 基因型与冠心病的发生发展关系密切 是冠心病的独立危险因素 从以上研究结果我们认为血清 &'% 水平与冠心病的不同分型有关 检测冠心病患者的 &'% 水平可能有益于冠心病类型的诊断 同时 我们发现不同类型冠心病患者血脂水平有与 &'% 类似的变化趋势 推测这些指标间可能存在相互调控作用 但尚需深入的研究予以证实 对 &'% 基因 位点突变检测的结果证实该位点突变与冠心病有关 我们认为对冠心病患者进行本位点的突变检测可以协助诊断及病情评价 推测 &'% 基因 位点突变可能是导致冠心病的因素之一 对体检者进行该突变检测可能发现冠心病的高危人群 从而可以采取措施进行预防 总之 本研究提示 &'% 基因 突变与冠心病的发生发展密切相关 是引发冠心病的重要危险因素之一 检测该基因突变可能对预测冠心病风险及病情分析有益 但具体机制还有待大规模 多中心研究予以证实 参考文献 56'56711%(&6#-+ -#-" # "))& )3($$$& 586'!68&" )8(6 "# "" )&$$$& )61,56' )&7- "- "+# "# ")&)" $$%& 57')57' &)-"# ""# "6 -"##"!)& /$ & $ 宋光耀 张明明 孙海娟 等 & 高胆固醇血症患者枯草溶菌素转化酶 % 基因突变研究 & 中国动脉硬化杂志 $& 3!)3'1,6'$&3 ()$*%+# " "# )&6(#!"%& 6..3 1 &/-+# 3()$*%"# "6 &)3!"$ $$& $1!6'66//6 8/6931$&3#3 ()$*%" # ""###&! '#$$$& % 葛均波 徐永健 & 内科学!& 第 版 北京 人民卫生出版社 &,6'$)3' 585675'&) ()$*%).+ # &3 /!" (#$# $%& '75367/$6/6!&) # #-% +# "&6 )" $%& 编辑 邱 芬 西安交通大学学报 医学版 医苑雅兴 栏目征稿启事 为了更好地服务于医苑的朋友们 增进彼此的交流 展示广大医学科技工作者的精神风貌 人文修养和艺术才华 同时丰富活泼学报的版面 减少转页带来的阅读不便 本刊拟增设 医苑雅兴 栏目 特向各位约稿 栏目内容及体裁 书法 绘画 诗歌 辞赋等 投稿信箱 "#66:"#"! 投稿地址 西安市雁塔西路 号 西安交通大学学报 医学版 编辑部邮 编 特别事项 书法 绘画作品需同时提供原稿和电子版 并注明 医苑雅兴 栏目 注明作者的相关信息 如 单位 学科 职务 职称等 垂询电话 %$$ %$$