复旦学报 医学版 6 7 对干燥综合征 小鼠泪腺分泌功能的干预研究 马晓昀 何琳萍 上海市长宁区光华中西医结合医院眼科 上海 摘要 目的 观察干燥综合征 小鼠泪腺组织注射 丝裂原活化激酶 " "" "*7 通路抑制剂 - 后对小鼠干眼的改善情况 以探索今后临床治疗 干眼的新方法 方法 选用 只雌性 -2- 小鼠 周龄 和 只雌性,2 小鼠 周龄 将 -2- 小鼠随机分为空白对照组和不同作用时间的实验组,2 小鼠分为空白对照组和不同浓度 - 注射组 3 "" 法检测 2 对 -2- 小鼠泪腺作用不同时间后 * *7 的表达 不同浓度 - 对,2 小鼠泪腺组织注射 天后检测酚红棉丝试验 泪膜破裂时间 - 荧光素染色情况 光谱分析法检测注射前后泪腺组织乙酰胆碱和去甲肾上腺素表达量 并进行组织病理学检查 结果 随着 -2- 小鼠泪腺在 2 2 中孵育时间延长 * *7 的表达量逐渐增加 空白对照组,2 小鼠泪液分泌功能低下 泪膜破裂时间短 角膜荧光素染色评分高 经 - 注射后 泪液分泌逐渐增加 泪膜破裂时间延长 角膜荧光素染色范围显著缩小 泪腺组织乙酰胆碱和去甲肾上腺素分泌量较空白对照组显著增多 病理切片显示 与空白对照组相比 - 注射组淋巴细胞浸润程度显著减轻 结论 2 下游 *7 通路激活在 小鼠干眼的发病中有重要作用 阻断 *7 通路对 小鼠干眼有一定疗效 关键词 干燥综合征 干眼 2 信号转导通路 小鼠 中图分类号, 文献标志码 "6 7 " <* "" # ; 2, * * * 2 "# "" " " " """ " *- " # " -2-,2 " "" # * *7-2-"" 2 """" 3 "" ",2 ""# -" " " " # " "" " " "# #,2" "2 "# # * *7-2-" " 上海市自然科学基金项目, "#
复旦学报 医学版 年 月 "# 2 *# " "" " ",2 " " -" # ""## " "# " 2 " " "# " " -" "# " " *7 "# "" - *7 "#" " " 2"" "# : "*-"" 2 6 年国际干眼病专题研究会赋予干眼病的 新定义强调了炎症在干眼病发病中的重要作用 研究资料表明 干眼病患病率为 目前临床上对于干眼病主要是对症治疗 如人工泪液 泪小点栓等 但不能从根本病因和发病机制上使此病得到治疗 干燥综合征 是水样 液缺乏型干眼病的首要病因 泪液分泌减少 的原因并不十分明确 最近的研究发现 患者泪液分泌的减少不仅是由于炎症反应破坏了过多泪腺组织导致泪液分泌不足 还与神经递质 的释放障碍有关 促炎因子 2 2 肿瘤坏死因子 " " 等所起的重要作用有关 一些研究表明 2 及 能减少乙酰胆碱和去甲肾上腺素等神经递质的 释放 从而阻碍了神经调控的泪液分泌 造成泪液分泌缺乏 促进水样液缺乏型干眼症的发生 其中 2 阻碍神经递质的释放作用十分重 要 但到目前为止 2 阻碍 型干眼患者泪腺组织神经递质释放的信号通路及其机制并不明确 2 与之受体结合后有众多信号转导通路介导生物效应的发生 如丝裂原活化激酶 """ "*7 通路 蛋白激酶 "*7 通路 * 7 通路等 有学者发现 2 通过 *7 通路阻碍 海马齿状回突触传递功能 在以上国内外学者研究基础之上 我们推测 *7 通路在介导 2 抑制泪腺组织神经递质释放中或许存在作用 本课题拟观察 *7 通路抑制剂 - 对 小鼠泪腺组织干预后小鼠干眼的改善情况 以探索今后临床治疗 干眼的可能的新方法 材料和方法 动物品系选择 只雌性 -2- 小鼠 周龄 和 只雌性,2 小鼠 周龄 * 级 购自上海斯莱克实验动物中心 将 -2- 小鼠随机分为空白对照组和不同作用时间的实验组,2 小鼠分为空白对照组和不同浓度 - 注射组 试剂 乙酰胆碱 2 试剂盒 - 重组鼠 2 " 7,- 缓冲液 美国 公司 * *7 抗体 美国 公司 去甲肾上腺 2 试剂盒 美国 公司 :"# 法检测 对 小鼠泪腺作用后 67 的表达 将 -2- 小鼠随机分为空白对照组和不同作用时间实验组 组 摘出 -2- 小鼠泪腺 在含 2 2 的 7,- 缓冲液中孵育 和 采用 3 "" 法检测空白对照组和 个孵育时间点的泪腺组织中 * *7 的表达量 具体步骤如下 切碎小鼠泪腺 在 7,- 缓冲液 中孵育 实验组另加 2 2 添加 2 的 * 2 葡萄糖 - 和 型胶原 2 用直径逐渐减小的吸管尖端小心吸取泪腺组织 尼龙网过滤 离心 含 - 的 7,- 液漂洗 离心 为去除淋巴细胞 泪腺腺泡组织被依次置于 浓度的聚蔗糖中 再将组织置于新鲜 7,- 缓冲液 含 - 内 随后在 2 的 2 甲烷盐酸盐 中匀质化 冰浴 *- 漂洗 次 冰浴裂解液裂解细胞 下 离心 取出一定量裂解物和上样缓冲液混合 煮沸
马晓昀 等 - 对干燥综合征 小鼠泪腺分泌功能的干预研究 按 - 蛋白质定量试剂盒操作说明操作 测定样品浓度 2 聚丙烯酰胺凝胶分离 电转至醋酸纤维素膜 * *7 抗体检测 用辣根过氧化物酶标记的羊抗兔 为二抗 增强型发光底物显影 6 7 泪腺组织注射 微量注射器向小鼠一侧泪腺注射 2 不同浓度的 - 2 2 每日注射 次 连续 天 对侧泪腺不注射 对照组注射等量生理盐水 每日注射 次 连续 天 # 小鼠酚红棉丝试验 泪膜破裂试验 荧光素染色等干眼检查 酚红棉丝试验 在裂隙灯显微镜下 用显微手术颞将酚红棉丝一端置于外眦附近结膜穹窿 后测量变色的棉丝长度 泪膜破裂时间及荧光素染色 用毛细管将 2 荧光素液滴入下部结膜囊内 观察泪膜破裂时间 染色后 在裂隙灯显微镜钴蓝光下观察 角膜划分为 个区域 按照 级的标准分级系统进行染色评分 级 无染色 级 以内被染色 级 以内被染色 级 以内被染色 级 大于 被染色 # 小鼠泪腺组织注射 6 7 后乙酰胆碱和去甲肾上腺素表达量的检测 将不同剂量 -2 2 分别注入小鼠泪腺组织 往空白对照组的小鼠泪腺中注射等量生理盐水 摘除泪腺 光谱分析法检测泪腺组织乙酰胆碱和去甲肾上腺素的表达 使用乙酰胆碱和去甲肾上腺素试剂盒进行测定 将 2 介质和组织匀浆加入 孔板 实验中使用乙酰胆碱和去甲 肾上腺素标准曲线 每孔中加入 2 检测缓冲液 2 甲烷盐酸盐 其中含 2, 试剂 2 辣根过氧化物酶 2 乙酰胆碱酯酶 孵育后 在荧光微板读数器中使用 波长读取吸光度 值 经软件换算得出乙酰胆碱和去甲肾上腺素的浓度 病理学检查 不同剂量 - 2 2 泪腺组织注射后病理学检查 天后取出小鼠泪腺 无甲醇的甲醛溶液固定 *- 溶液 2 2 7 2 * 27 * 下漂洗 #*- 漂洗后 乙醇脱水 树脂 "2 2 浸润包埋 切片 烘干 苏木精 伊红 染色 显微镜下观察泪腺组织 统计方法 采用 * 软件进行统计分析 所有实验均重复 遍 数据表示为 - 方差分析检测各组之间差异 组间两两比较采用最小显著性差异法 2 法 为差异有统计学意义 结 果 对 小鼠泪腺作用后 67 的表达 -2- 小鼠泪腺在 2 2 中孵育 和 后 * *7 的表达量逐渐增加 表明 *7 通路被激活 *7 通路是 2 发挥生物活性的下游通路 图 图 小鼠泪腺在 中孵育不同时间后 67 的表达情况 -* 67 # #*"" " # 小鼠酚红棉丝试验 泪膜破裂时间 荧光素染色等干眼检查 将不同浓度的 * *7 抑制剂 - 注射进,2 小鼠泪腺后 对实验组和对照组进行一系列干眼检查 结果显示 对照组小鼠泪液分泌功能 低下 泪膜破裂时间短 角膜荧光素染色评分高 经 - 注射后 泪液分泌逐渐增加 泪膜破裂时间延长 角膜荧光素染色范围显著缩小 表 # 小鼠泪腺组织注射 6 7 后乙酰胆碱和去甲肾上腺素的表达情况 实验组小鼠泪腺
复旦学报医学版""# 年 月# " 组织乙酰胆碱和去甲肾上腺素分泌量较空白对照组 生物活性#恢复泪腺组织神经递质的表达#从而进一 显著增多表 "#表 明,E"" 能 够 阻 断?P7 # 的 步增加泪液分泌量 表 MH 小鼠酚红棉丝试验泪膜破裂时间和荧光素染色检查结果 >8M=< < 8?3 2 @J>" 3 2-2 B 3 E,",,E"" 3 "2 6L8 3 "2 " B # # 88" #; *,"; *# ;,"; * ;,"; *; #,"; #; EI " ; *,"; *# ;,"; ;,"; ; #,2 " 8 - = ;,"; ; ","; ; ","; #;,"; ; P 8 *" P P "8 *" ; 88 *" #; #,"; * K # # @ ; 3 "2 A>MJA#P,H "; "#; 表 NH 小鼠泪腺组织乙酰胆碱和去甲肾上腺素的表达情况 >8N7 < < 2 B 3, >" 8 A - " = 3 "2 " ##; *,*; > 2 2 238P" #;,##;,E"" 3 "2 P 8 " P P "8 " ; 88 " #;,; ## #*; ",*; * #*;,; #*; ",; E," K #*;,; "; #**;,; * #; # # @ ; 3 "2 A>MJA#P,H "; "#; 不同剂量 @NOT[UO 泪 腺 组 织 注 射 后 病 理 学 检 查 不 同 浓 度,E"" 泪 腺 组 织 注 射 天 后#取 相比#,E"" 注射组淋巴细胞浸润程度显著减轻 图 E"#表明,E"" 抑制了 *DP 2小鼠泪腺 下泪腺#做病理切片及 @6 染色#对照组泪腺组织切 组织的炎症反应 片可见较多淋巴细 胞 浸 润聚 集 图 A"#与 对 照 组 图 NH 小鼠泪腺组织注射 W 天后病理切片 IK 染色YMOO" E 2 B < < -H 2 ; < ; <3 @NOT[UO < 2 \, BYMOO" BN B, 6 8 3 # 8 BE, 3 "2# K K# K AP 3 N" =82 = 88 2 K 88 # 3 G" 2 "# 3G # ;E = =P 8 3 # 8,E"" 3 "2# 88 # # 3 =; 碱和去甲肾上腺素"释放的信号通路#以该通路为靶 讨 论 点#探 索 信 号 转 导 蛋 白 抑 制 剂 对,, 型 干 眼 可 能 存 在的治疗作用#为干眼病的发病机制提供理论基础# 目前临床上从病因角度治疗干眼症的手段较 为临床治疗,, 型干 眼 症 新 通 道 的 开 发 奠 定 实 验 基 少#虽然有环孢素滴 眼 液 或 激 素 类 滴 眼 液 的 免 疫 抑 础目前国内外尚未见报道 制治疗#但存在长期使用使眼表防御屏障受损继发 感染的风险#且此 类 药 物 本 身 也 会 影 响 泪 腺 的 分 泌 *DP 小鼠 随 着 年 龄 增 长 自 发 形 成 自 身 免 2 * # 疫性疾病 #伴淋巴细胞增 生自 身 抗 体 形 成眼 表 功能本课题中#我 们 研 究 促 炎 因 子?P7 # 阻 碍,, 炎症泪 腺 炎 症#因 而 被 广 泛 用 作,, 的 动 物 模 型 小鼠模型泪腺组织 中 神 经 末 梢 的 神 经 递 质 乙 酰 胆 在 *DP 小鼠泪腺组织中可以检测到大量?P7 # 2
马晓昀 等 - 对干燥综合征 小鼠泪腺分泌功能的干预研究 蛋白 并随着鼠龄增长而增多 本研究中 我们选取 -2- 小鼠和,2 小鼠 动物模型 为实验动物 检测 2 对 -2- 小鼠泪腺组织作用后 * *7 的表达情况 -2- 小鼠不存在泪腺组织炎症 选择此小鼠作为 2 作用的对象可以真实反映 *7 通路与 2 作用的关联性 发现随着 2 作用时间的延长 * *7 的表达逐渐增加 表明 2 通过激活 *7 通路对泪腺组织发挥作用 在后续实验中 我们向,2 小鼠泪腺组织注射 *7 通路抑制剂 - 观察,2 小鼠泪腺组织中乙酰胆碱和去甲肾上腺素的表达情况的变化 观察 *7 抑制剂 - 对泪腺组织中神经递质的释放改善作用 发现 - 注射 天后,2 小鼠泪腺组织中乙酰胆碱和去甲肾上腺素表达较 *- 注射组 空白对照组 明显上升 表明 - 能够拮抗炎症导致的神经递质表达抑制 我们还对比了注射前后干眼相关检查指标的改善情况以及泪腺组织病理学检查的变化 酚红棉丝试验 泪膜破裂时间 荧光素染色在实验组的检测情况均较对照组有所改良 但 - 的这种效应并未表现出明显的浓度依赖性 从病理切片中可以看到 对照组的泪腺组织中有较多淋巴细胞浸润 聚集 以及腺上皮增生等慢性炎症的表现 - 注射组淋巴细胞浸润程度显著减轻 未看到淋巴细胞聚集区 在形态学上验证了 - 抑制泪腺组织炎症的作用 本研究探索了 *7 通路在 2 阻碍泪腺组织神经末梢神经递质释放中的作用 观察了信号转导蛋白抑制剂 - 对泪腺细胞分泌功能的影响及泪腺组织中神经递质的释放改善作用 通过研究 - 对 型干眼症 动物模型 的疗效 从信号转导通路入手 探索了信号转导蛋白抑制剂 - 对 型干眼症的疗效 从病因和发病机制角度开启了治疗 型干眼症的新思路 参 考 文 献 2 - - """ " """ 3#,* * ""#3 # " "# """ 3#,* * 3# 27 72 " " " "" " * " -# "# *,*"# * " -," ""# " "# * * # "# "" "" "# ""7 # 7 2 " ", 3 - # " * "" " "# "" " # " " # # " " " #,,-, " " "# " " "# " #, 3 2# " " " " "" # "# " " " * -, # " " - *", "", 3 -, # " " - 收稿日期 编辑 张秀峰