中国畜牧兽医 " 猪 鸡源分离粪肠球菌的核糖体分型及耐药性分析 钱晓璐 商 军 田 恺 张浩然 上海市兽药饲料检测所 上海 摘 要 对上海地区 个规模化养猪场和 个规模化养鸡场分离鉴定的 株粪肠球菌 采用微量肉汤稀释法对 种抗菌药物进行药敏试验 采用 * & % & 微生物基因指纹鉴定系统检测分离菌株的基因指纹图谱 分别检测分离菌株中的核糖体型和耐药性 结果表明 在 株粪肠球菌中 以上为多重耐药菌株 有 株猪源粪肠球菌对万古霉素耐药 其中有 株表现为对万古霉素高度耐药 " 且对链霉素和庆大霉素同时表现为高度耐药 " 从耐药表型和核糖体分型共同分析粪肠球菌的耐药性 发现多重耐药性严重 同一核糖体型菌株的耐药表型并非完全一致 关键词 粪肠球菌 耐药性 核糖体分型 药敏试验中图分类号? 文献标识码 ( 文章编号 %* (" * % % ' ' %" ' ( ' ( E' ( ( & '* ' ' *"%' % %"% %&"%"%&& % %& %& &"& "?% & ' %&%&% %% %&"%&% &'%%&" %" &% & % &%* & % & & & % & %%? & % &% % %&&'" & & % " '%&'"& % %%& &%%%& %?%& %&"& & % %%' "%& " & % % "% %% " & % %%"%%&% "? & '% % % '%&'"& % &''%& % % % %% &%%%& %%? " %&& % &"%" %& ' %%% % 粪肠球菌是一种重要的机会致病菌 在自然界中广泛分布 常栖居于人和动物的肠道中 粪肠球菌可导致人和动物多个脏器的感染 包括尿路感染 皮肤软组织感染 盆腔感染 腹腔感染 伤口感染 菌 血症 心内膜炎和脑膜炎 随着兽医临床上抗菌药物被广泛应用 导致粪肠球菌耐药菌株不断出现 甚至对多种抗菌药物同时耐药的多重耐药菌株也屡见不鲜 耐药细菌的感染常使经验性治疗难以奏效 近年来 猪 鸡感染粪肠球菌发病和死亡的报道越来 越多 对动物和人的健康造成严重威胁 给兽医临床抗感染治疗带来极大的挑战 粪肠球菌是表示抗菌药物耐药性水平的一种革兰氏阳性指示菌 因 收稿日期 基金项目 上海市科技兴农重点攻关项目 沪农科攻字 第 号 作者简介 钱晓璐 女 浙江海宁人 硕士 助理畜牧师 研究方向 动物源细菌耐药性 通信作者 商 军 男 浙江绍兴人 高级兽医师 研究方向 兽药饲料检测方法及动物源细菌耐药性
期 钱晓璐等 猪 鸡源分离粪肠球菌的核糖体分型及耐药性分析 此有必要对猪 鸡源分离粪肠球菌的耐药性情况进行分析和研究 微生物基因指纹鉴定系统 * & % & & & % & %% 是基于仪器分析的自动化核糖体分型方法 此方法克服了常见分型操作步骤繁琐 耗时较长的缺点 可用于细菌的鉴定与分型研究 核糖体分型 & & % &* 是针对核糖体 9 ( 操纵子基因的保守序列设计探针 探针与膜上的 9 ( 片段进行杂交 产生的特异性 9 ( 指纹图反映了菌株基因组遗传学特征 对于粪肠球菌来说 * 分型利用 * 酶切对菌株进行准确的鉴定与溯源 在分析亲缘关系时 根据带型直观地反映菌株的基因突变位点等方面具有独特的优势 将分型与药敏试验结果进行联合分析 通过建立的基因指纹图谱库可以发现耐药株在基因指纹图谱上存在的差异 以便研究它们在致病因子和耐药性等方面的异同 本研究对上海地区的 个规模化猪场和 个规模化鸡场分离得到的 株粪肠球菌进行了 * 基因指纹图谱的测定和 类 种抗菌药物的耐药性检测 材料与方法 材料?? 主要仪器 * & % & 微生物基因指纹鉴定系统 * & % & 系统 * 试剂套装 * & % & 系统样品制备包等均购自美国杜邦公司 '& 软件购自丹麦 ( % 公司 % 全自动微生物分析系统及配套 细菌鉴定卡 比浊仪均购自法国生物梅里埃公司 生化培养箱购自日本 >B 公司 生物安全柜购自美国 & 公司 %%& 全自动菌液接种仪购自美国赛默飞公司?? 主要试剂 普通营养肉汤及营养琼脂均购自北京陆桥技术有限责任公司 肠球菌显色营养琼脂购自美国 9 公司 药敏板测试盒 含有青霉素 庆大霉素 链霉素 红霉素 泰乐菌素 林可霉素 呋喃妥因 氯霉素 环丙沙星 四环素 万古霉素 利福平共 种抗菌药物的冻干型 孔细菌定量药敏测试盒 肉汤管均购自天津市金章科技发展有限公司? 无菌氯化钠溶液 自制?? 菌株来源 粪肠球菌 年 月 年月从上海地区某区县的 个规模化养猪场和 个规模化养鸡场中分离 质控菌株粪肠球菌 ( 美国标准菌种保藏中心 方法?? 采样 以灭菌棉拭子采集猪肛门和鸡泄殖腔样品 置入运送培养基中 保存时间不超过 每个养殖场每个月采集 份拭子样本 共 份样本?? 粪肠球菌分离与纯化 取拭子样品用接种棒直接接种于已制备好的肠球菌显色琼脂平板上 培养 挑取黑色带光泽的可疑菌落于肠球菌显色琼脂平板上纯化 代 纯化后可疑菌落接种营养琼脂平板纯化 培养?? 粪肠球菌鉴定??? 全自动微生物生化鉴定 对分离到的菌株用 % 全自动微生物鉴定系统选择革兰氏阳性鉴定卡片???* & % & 系统鉴定 采用 * & % & 微生物基因指纹鉴定系统 通过 * 内切酶酶切 得到微生物 9 ( 杂交指纹图谱 与仪器提供的标准数据库比较 得到菌株的最近似鉴定结果?? 粪肠球菌基因指纹图谱的测定 取分离粪肠球菌的纯培养物 提取 9 ( 后 选择 * 内切酶试剂盒 用 * & % & 微生物基因指纹鉴定系统进行基因指纹图谱的测定 显影后指纹图谱中条带的数量 位置和颜色深浅度 利用数据分析软件 '& 进行分析 构建基于 * & % & 方法的基因分型同源性关系图?? 药敏试验 按照美国临床检验标准委员会 推荐的相关规定进行试验操作和药敏结 果判定 菌液制备 直接从过夜不超过 培养的平板上挑取 个纯新鲜菌落 均匀悬浮于装有? 无菌氯化钠溶液的细菌稀释管中 再将该菌液调整于? 麦氏浓度 使菌液的细菌含量 @ 菌液接种 在生物安全柜内使用微量移液器从 肉汤管中吸取 加入 孔细菌定量药敏测试盒中空白对照孔内 再吸取已比浊好的菌液 加入到 肉汤管中 混匀 装于全自动菌液接种仪上 接种于含不同药物浓度的 孔细菌定量药敏测试盒中 孵育 生化培养箱中培养 按同法做 粪肠球菌 ( 的质量控制 符合表 规定方可读取最低抑菌浓度 结果观察 在衬有黑色底板的光线下 用肉眼观察 凡细菌生长的小孔中 呈弥散状浑浊或小孔底部有圆形或网状沉淀 在无细菌生长的孔内所含最低抗菌药物浓度即为 结果处理 对所测得的
中 国 畜 牧 兽 医 卷 结果进行统计学处理 得出 测定结果按 标准规定的临界值 判定为敏感 中介 和耐药 * 药敏试验结果的临界值判定值和质控范围见表 表 粪肠球菌对 种抗菌药物药敏试验的临界值判定值和质控范围 " * """% " *% % % ' '" * 抗菌药物 判定标准 &% & 的质控要求 '%%&& '&% ( %&"% 敏感 中介 耐药 目标值 参考范围 ' % % &% * % %* &" % ' * && " 青霉素 庆大霉素 % 链霉素 %&% 红霉素 &% & 泰乐菌素 林可霉素 呋喃妥因 %& '& % 氯霉素 & % 环丙沙星 & ; 四环素 %& 万古霉素 利福平 * 结果与分析 细菌分离与鉴定 对 份样本按?? 的方法进行分离与纯化后 采用全自动微生物生化鉴定法进行鉴定 分别鉴定出猪源粪肠球菌 株 鸡源粪肠球菌 株 对上述鉴定出的 株猪 鸡源粪肠球菌采用 * & % & 微生物基因指纹鉴定系统进行鉴定 用 * 酶切系统 得到杂交图谱 通过软件生成 * & % & 图谱模式 并与系统数据库中已知的标准图谱对比 鉴定菌株 试验结果表明 全自动微生物生化鉴定法与 * & % & 微生物基因指纹鉴定系统鉴定法的结果一致 均为粪肠球菌 典型的生化鉴定结果见表 核糖体分型结果 根据 * & % & 微生物基因指纹鉴定系统测定的鉴定图谱对分离的粪肠球菌进行基因分型 利用数据分析软件 '& 进行分析 将相似度 者归为同一型 构建基于 * & % & 方法的基因分型同源性关系图 结果表明 株猪源粪肠球菌相似度为? 株鸡源粪肠球菌的相似度为? 以 相似度为标准 猪源粪肠球菌分为 个型 鸡源粪肠球菌分为 个型 图 根据核糖体分型结果 初步建立了 猪 鸡源粪肠球菌核糖体分型数据库 药敏试验结果对从两个养殖场分离鉴定出的 株猪 鸡源粪肠球菌 按?? 所述对 大类 种抗菌药物进行药敏试验 结果表明 分离鉴定出的猪 鸡源粪肠球菌对林可霉素 红霉素 青霉素 泰乐菌素和四环素的耐药性最强 耐药率均大于 其次是利福平 耐药率大于 而对氯霉素 环丙沙星 庆大霉素和链霉素的耐药率 猪源粪肠球菌要明显高于鸡源粪肠球菌 对呋喃妥因 猪 鸡源粪肠球菌均较为敏感 图 这与 与 结果 表 相一致 两个养殖场的猪 鸡源粪肠球菌的多重耐药现象严重 以上的为多重耐药菌株 即对 类或 类以上的抗菌药物耐药 在所测定的 大类 种抗菌药物中 以上的菌株对 类及 类以上的抗菌药物耐药 以上的菌株对类及类以上的药物耐药 图 此外 有 株猪源粪肠球菌对万古霉素耐药 其中有 株表现为对万古霉素高度耐药 " 且对链霉素和庆大霉素同时表现为高度耐药 " 另猪源粪肠球菌高水平庆大霉素 " 和 或 链霉素 " 耐药检出比例较高 且猪 鸡源粪肠球菌对庆大霉素和链霉素同时耐药的有 株
期 %G 钱晓璐等猪&鸡源分离粪肠球菌的核糖体分型及耐药性分析 表 粪肠球菌的全自动微生物鉴定的生化鉴定结果 FB? L ; * 9E 9 J B 项目 N 苦杏仁苷 @`f 磷脂酰磷脂酶 CRRC 结果 B 9 项目 N 结果 B 9 尿素酶 IBD W半乳糖 "P@ W木糖 "Uf 精氨酸双水解酶 %@WE% W核糖 "BJ 乳酸盐产碱 @? W半乳糖苷酶 JP@ ' 葡萄糖苷酶 @PI 环式糊精 CWDU 乳糖 @C O乙酰W葡萄糖胺 O@P W麦芽糖 "`@ 天冬氨酸芳胺酶 @@ 甘露糖苷酶 @`@O W甘露醇 "`@O W甘露糖 "`OD 磷酸酶 REb> 甲基J W葡萄糖吡喃苷 `J"P 支链淀粉 RI 亮氨酸芳胺酶 9@ @ 脯氨酸芳胺酶 R 葡萄糖苷酸酶 JPIB ' 半乳糖苷酶 @P@ 焦谷氨酸芳胺酶 R @ W棉子糖 "B@Q 水杨素 >@ 蔗糖 >@C W葡萄糖苷酸酶 JPIB ' 丙氨酸芳胺酶 @ @ W海藻糖 "?BD 奥普托欣耐受 br?b 多粘菌素 J 耐受 RbfJ W山梨醇 ">bb (' LOC生长 OC(' 杆菌肽耐受 J@C 新生霉素耐受 Obab 阳性 阴性 R ; O ; 图 猪源粪肠球菌基因指纹图谱及相似性分析图 EJ B L ; * 9E 9
%& 中国畜牧兽医 * 卷 图 鸡源粪肠球菌基因指纹图谱及相似性分析图 EJ B L ; * 9E 9 L 9 %林可霉素 红霉素 *青霉素 泰乐 菌 素 四 环 素 (利 福 平 氯 霉 素 环 丙 沙 星 G庆 大 霉 素 %&链 霉 素 %%万古霉素 %呋喃妥因 % N D M N * J_?? ( B N CM N C Y G P N %& > N %% a N % O 9 图 & 猪鸡源粪肠球菌对 种抗菌药物的耐药率 E& B ; * 9E 9 L 9
期 %% 钱晓璐等猪&鸡源分离粪肠球菌的核糖体分型及耐药性分析 表 &%" 株粪肠球菌对 种抗菌药物的体外抗菌活性检测结果 FB &A B B %"; * 9E 9 B `C& " N% `CG& " N% 抗菌药物 猪源 鸡源 猪源 鸡源 " N " NM " N " NM @ N 林可霉素 N % % % % 红霉素 D M N 泰乐菌素? % % % % ( ( ( ( 四环素? 氯霉素 CM N % % % % * ( * 青霉素 J_ ( * ( ( 链霉素 > N % %% & % 利福平 B N 环丙沙星 C Y %( * % 庆大霉素 P N 呋喃妥因 O 9 ( %% & % * %( * %( 万古霉素 a N % %&* 类 & 类 *& 类 &( 类 & 类 (& 类 &G 类 % * N N * N ( N N ( N G N 图 % 猪鸡源粪肠球菌对 种抗菌药物的多重耐药率 E%N B ; * 9E 9 L 9 显高于鸡源粪肠球 菌这 可 能 与 抗 菌 药 物 的 使 用 情 & 讨 论 况具有一定关系对 庆 大 霉 素 和 链 霉 素 同 时 耐 药 的 近年 来随 着 肠 球 菌 属 对 抗 菌 药 物 耐 药 性 的 逐 菌株占 cl 其中有 株猪 源 粪 肠 球 菌 对 万 古 霉 渐上升又 出现 了耐万 古 霉素肠球菌" abd和 高水 素耐药且对链霉素 和 庆 大 霉 素 同 时 表 现 为 高 度 耐 平氨基糖苷类 耐 药 "E@B给 兽 医 临 床 治 疗 带 来 药'对检出万古霉素耐药猪场进行抗菌药物使用情 了困难 * %% %* '对两个养殖场分离的 & 株猪&鸡源粪 况调查表明该养殖 场 没 有 使 用 过 万 古 霉 素 等 糖 肽 肠球菌药敏试验结 果 也 表 明 了 较 为 严 重 的 耐 药 性 类抗生素这就需要 对 分 离 到 的 万 古 霉 素 耐 药 菌 株 除了对呋喃妥因和 万 古 霉 素 较 为 敏 感 外对 林 可 霉 进行进一步研 究' 据 李 娟 等 *报 道医 院 内 长 期 使 素&红霉素&青霉素&泰乐菌素&四环素和利福平的耐 用第 * 代头孢类抗菌药物可以显著增加临床分离细 药率均大于 &L 且对 * 类或 * 类 以 上 抗 菌 药 物 耐 菌对万古霉素的耐药率'而兽医专用第 * 代头孢类 药的多重耐 药 菌 株 占 &L 以 上对 氯 霉 素&环 丙 沙 抗菌药物头孢噻呋 在 兽 医 临 床 目 前 大 量 使 用这 是 星&庆大霉素和链霉素的耐药率猪源粪肠球菌要明 否对万古霉素的耐药率产生影响以及该影响有多大
中 国 畜 牧 兽 医 卷 都是下一步需要深入研究的课题 以酶切图谱显示的 * & % & 同源性分析 可以在仪器数据库中比较相近图谱达到微生物鉴定目的 并根据酶切图谱的距离计算微生物亲缘关系的远近 虽然同样是针对核糖体 9 ( 序列 但相比 &* ( 基因要丰富很多 它还包括 &* ( &* ( 基因以及这些基因间的间隔序列 但由于这些数据不是同一批次进行的电泳分析 图谱存在相对位移偏差 将分类阈值放宽至 可具有较 好的分型效果 对于 株耐万古霉素的猪源粪肠球菌 菌株编号 按分类阈值标准判断 和 为同一型 为另一型 从耐药表型看 与 耐药表型不同 对庆大霉素和链霉素同时高水平耐药 均对庆大霉素和链霉素敏感 而 与 和 耐药表型不同 核糖体分型结果表明 同一型菌株的耐药表型并非完全一致 结 论本研究建立了基因指纹图谱库 发现耐药株在基因指纹图谱上存在着差异 利用图谱库对基因型与耐药性的变化进行动态分析与研究 可为细菌耐药性的监测及科学制定抗菌感染的防制方案提供必要的理论依据 参考文献 齐亚银 张 莉 王静梅 等 动物源粪肠球菌对 种抗生素耐药表型及耐药基因检测 E 中国兽医学报 李 娟 李文红 韩 雪 等 肠球菌属临床分布特征与耐药性分析 E 中华医院感染学杂志 朱 阵 曹明泽 张吉丽 等 细菌耐药性研究进展 E 中国畜牧兽医 刘 佳 陈 霞 赵爱兰 等 河南省某地区健康人源及动物源肠球菌种属分布及耐药性差异研究 E 中国畜牧兽医 刘燕霏 杨建德 赵瑞利 粪肠球菌动物致病的研究进 展 E 家畜生态学报 王送林 李芸芳 刘秋菊 等 湖南省猪源粪肠球菌耐药性分析 E 中国动物传染病学报 9 && (' % & % & %& % % %& % & "' %E " &%& % &%%'% & & % & &( %& ' % %% "% %& %'% &%& % & %%'% &%& % &%%'% 9 % ' %%% "&% & '% %& &% & & % & & ( %&("% &%& % &%%'% &%& % &%%'% % & 9'% ( %& ' %% % &% &%& ( & &%& % &%%'% 董 栋 商 军 钱晓璐 等 猪源粪肠球菌的基因型及耐药性分析 E 中国兽药杂志 郑远鹏 动物源性高水平庆大霉素耐药肠球菌流行病学研究 9 福州 福建农林大学 尹 兵 动物源和水源肠球菌万古霉素耐药表型基因型检测及同源性研究 9 福州 福建农林大学 " ' %'&%" % % &%% "'%&& & 9 (E " 范一灵 蒋 波 房 蕊 等 药品无菌检查中微生物污染的鉴定和污染溯源分析 E 药物分析杂志 杨 燕 冯 震 鲍 英 等 全自动基因指纹分析仪 * & % & 在药品中大肠埃希菌的鉴定分析中的应用 E 中国抗生素杂志 责任编辑 秦 彤