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棒涯安
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1 255 药物研究国产盐酸左氧氟沙星滴眼液杂质谱分析田洪斌, 杨柏涛 1, 王明翠 ( 吉林省食品药品检验所, 长春 ; 1 吉林迈丰生物药业有限公司 ) 摘要 : 目的优化盐酸左氧氟沙星滴眼液现行标准中有关物质的测定方法, 并对国产盐酸左氧氟沙星滴眼液样品的杂质谱进行分析, 从有关物质方面对质量进行评价方法采用优化的 HPLC 方法对杂质进行定量分析, 采用 HPLC-MS 分析未知杂质的归属与来源结果定量分析表明 65 批样品单个最大杂质在 0.2% 以下, 总杂质在 0.37% 以下, 最主要的杂质为杂质 E ( 去甲基物 ), 来源为原料带入结论国产盐酸左氧氟沙星滴眼液整体杂质控制水平良好, 符合药典及现行标准相关要求关键词 : 盐酸左氧氟沙星滴眼液 ; 杂质谱分析 ; 高效液相色谱 ; 液质联用中图分类号 :R917 文献标识码 :A 文章编号 : (2014) AnalysisofImpuritySpectrumofDomesticLevofloxacinHydrochlorideEyeDrops TianHongbin,YangBaitao 1 and Wang Mingcui(JilinInstituteforFoodandDrugControl,Changchun ; 1 Jilin MaifengBio-PharmaceuticalCo.,Ltd.) ABSTRACT: ObjectiveTooptimizetheassay methodofrelatedsubstancesofdomesticlevofloxacin hydrochlorideeyedropsdescribedinthecurrentstandard,analyzeimpurityspectrum andevaluatethe qualityfromtheaspectofrelatedsubstances. MethodsTheoptimizedmethodofHPLCwasusedforthe quantitativeanalysisofimpurities.thesourceofunknownimpuritieswasresearchedwith HPLC-MS. ResultsThequantitativeanalysisindicatedthecontentofmaximum singleimpurity wasbelow 0.2%, the totalimpurity was below 0.37%. The primary impurity was impurity E (demethylation compound) from raw materials. Conclusion Overal, the impurities in domestic levofloxacin hydrochlorideeyedropswerewelcontroledandmetrequirementsofthechinesepharmacopeiaandthe currentstandard. KEY WORDS: levofloxacinhydrochlorideeyedrops;impurityspectrum;hplc;hplc-ms 盐酸左氧氟沙星滴眼液主要用于治疗敏感细菌引起的细菌性结膜炎细菌性角膜炎, 主要成分为左氧氟沙星盐酸盐一水合物左氧氟沙星属第三代氟喹诺酮类抗菌药, 由日本第一制药株式会社于 1994 年研制成功并在日本上市, 目前已在 80 多个国家和地区获准上市左氧氟沙星为氧氟沙星的左旋光学异构体, 其抗菌作用约为氧氟沙星的 2 倍, 它的主要作用机制为抑制细菌 DNA 旋转酶的活性, 阻碍细菌 DNA 复制, 具有抗菌谱广抗菌作 [1] 用强的特点, 左氧氟沙星在房水中的浓度大于其他喹诺酮类药物, 是目前公认的疗效显著的眼科抗 [2] 菌药, 在临床上得到了广泛应用盐酸左氧氟沙星滴眼液现有批准文号 8 个, 生产企业 7 家, 现行质量标准有 6 个, 暂未收入中国药典 1 杂质分析方法 1.1 HPLC 杂质定量分析仪器与试剂 Agilent1200DAD 高效液相色谱仪,METTLER AG135 电子天平左氧氟沙星对照品 ( 批号 : ) 杂质 A 对照品 ( 批号 : ) 杂质 E 对照品 ( 批号 : ) 杂质 B 对照品 ( 批号 : ), 均为中国食品药品检定研究院提供杂质 F 对照品 ( 批号 :1-JGC-39-5, 作者简介 : 田洪斌, 主管药师 ; 研究方向 : 药品质量控制 ; [email protected]

2 256 中国药事 2014 年第 28 卷第 3 期加拿大 TRC 公司 ) 乙腈甲醇为色谱纯, 水为超纯水, 其他试剂均为分析纯色谱条件与系统适用性试验色谱柱为 AglientTC-C18 (4.6mm 250mm, 5μm); 流动相 A: 醋酸铵高氯酸钠溶液 ( 取醋酸铵 4.0g 和高氯酸钠 7.0g, 加水 1300mL 使溶解, 用磷酸调节 ph 值为 2.2), 流动相 B: 乙腈, 按表 1 程序进行线性梯度洗脱 ; 检测波长为 294nm 和 238nm, 柱温为 40, 流速为 1mL min -1 表 1 梯度洗脱程序时间 (min) 流动相 A(%) 流动相 B(%) 测定法精密量取本品适量, 用 0.1mol L -1 盐酸溶液稀释制成每 1mL 中含左氧氟沙星 1.2mg 的溶液, 作为供试品溶液 ; 精密量取适量, 用 0.1mol L -1 盐酸溶液稀释制成每 1mL 中含 2.4μg 的溶液, 作为对照溶液另精密称取杂质 A 对照品 18mg, 置 100mL 量瓶中, 加 6mol L -1 氨溶液 1mL 与水适量使溶解, 用水稀释至刻度, 摇匀, 精密量取 2mL, 置 100 ml 量瓶中, 用水稀释至刻度, 摇匀, 作为杂质 A 的对照品溶液照高效液相色谱法 ( 中国药典 2010 年版二部附录 ⅤD) 测定取对照溶液 10μL, 注入液相色谱仪, 以 294nm 为检测波长, 调节检测灵敏度, 使主成分色谱峰峰高约为满量程的 20%; 精密量取供试品溶液对照溶液和杂质 A 对照品溶液各 10μL, 分别注入液相色谱仪, 以 294nm 和 238nm 为检测波长, 记录色谱图 1.2 右旋异构体定量分析仪器与试剂 Agilent 1200 DAD 高效液相色谱仪, METTLER AG135 电子天平左氧氟沙星对照品 ( 批号 : ) 氧氟沙星对照品 ( 批号 : ), 均为中国食品药品检定研究院提供甲醇为色谱纯, 水为超纯水, 其他试剂均为分析纯色谱条件与系统适用性试验色谱柱为 AglientTC-C18 (4.6 mm 250 mm, 5μm); 流动相为醋酸铵硫酸铜 L- 异亮氨酸溶液 (8.5g L -1 醋酸铵,1.25g L -1 五水硫酸铜,1.3g L -1 L- 异亮氨酸 )- 甲醇 (7.. 3), 检测波长为 294nm, 柱温为测定法精密量取本品适量, 用流动相定量稀释制成每 1mL 中约含 1 mg 的溶液, 作为供试品溶液 ; 精密量取供试品溶液适量, 加流动相定量稀释成每 1mL 中含 10μg 的溶液, 作为对照溶液取对照溶液 20μL, 注入液相色谱仪, 调节检测灵敏度, 使主成分色谱峰的峰高约为满量程的 25%; 再精密量取供试品溶液和对照溶液各 20μL, 分别注入液相色谱仪, 记录色谱图 1.3 HPLC-MS 杂质归属分析仪器 WATERSACQUITY UPLC-QuatroPremier XE 超高效液相色谱 - 串联质谱仪 ;BRUKER maxis4g 超高分辨飞行时间质谱仪 HPLC 条件色谱柱 :ACQUITY UPLCBEHC18 (100mm 2.1mm,1.7μm); 流动相 A: 甲醇, 流动相 B: 水 (0.5% 甲酸,5% 甲醇 ), 梯度洗脱程序见表 2; 柱温 :40 ; 流速 :0.25mL min -1 表 2 梯度洗脱程序时间 (min) 流动相 A(%) 流动相 B(%) 串联质谱条件离子化模式 : 电喷雾正离子模式 ; 去簇电压 : 3kV; 锥孔电压 10 V; 离子源温度 :110 ; 脱溶剂温度 :380 ; 锥孔反吹气流量 :80L h -1 ; 脱溶剂气流量 :600L h 高分辨飞行时间质谱条件离子源类型 : 电喷雾离子源 ; 离子极性 : 正离子 ; 喷雾装置 :0.3Bar; 聚焦 : 未激活 ; 毛细管装置 :4500V; 干燥加热器装置 :200 ; 扫描初

3 257 始值 :50m/z; 末端抵消装置 :-500V; 干燥气设置 :4.0L min -1 ; 扫描终止值 :1000m/z; 切换阀装置 : 废弃 2 杂质分析结果 2.1 定量分析结果 1 杂质 A 含量 :65 批盐酸左氧氟沙星滴眼液样品中, 仅有 5 批样品检出杂质 A, 且含量均在 0.03% 以下, 远小于中国药典 2010 年版中对盐酸左氧氟沙星原料的限度规定 (0.3%) 杂质 A 即为左氧氟酸, 为左氧氟沙星的合成前体, 结果表明盐酸左氧氟沙星原料中杂质 A 的控制水平良好 2 单个最大杂质 :65 批样品中, 单个最大杂质含量为 0.02%~0.20%, 均在 0.2% 以下, 符合中国药典 2010 年版中盐酸左氧氟沙星原料有关物质中规定的单个杂质限度为 0.2%, 表明盐酸左氧氟沙星滴眼液的杂质控制水平良好见图 1 图 2 总杂质含量统计图 3 右旋异构体含量统计图 1 最大杂质含量统计 3 总杂质 :65 批样品中, 总杂质含量为 0.04% ~ 0.37%, 所有抽验样品总杂质均在 0.37% 以下, 符合中国药典 2010 年版盐酸左氧氟沙星原料有关物质中规定的总杂质限度 0.5%, 表明样品整体杂质控制水平良好见图 2 4 右旋异构体含量 :65 批样品中, 右旋异构体含量为 0.17% ~0.69%, 所有抽验样品右旋异构体均符合 1.0% 的限度规定, 表明各企业按照现行标准对样品右旋异构体的控制较好, 不同原料来源对右旋异构体影响较大见图杂质归属分析采用上述 HPLC 方法测定 65 批样品的有关物质, 结果除杂质 A 外, 共检出 9 种其他杂质, 其中含量超过 0.1% 的主要杂质有 4 种, 分别为杂质 E 与 3 种未知杂质 ( 杂质 1 2 3); 含量均在 0.1% 以下的微量杂质有 5 种, 分别为杂质 D 杂质 F 与 3 种未知杂质 ( 杂质 4 5 6), 杂质 D 与 3 种未知杂质均来源于原料, 结构稳定, 杂质 F 为样品氧化产生, 表明各企业对样品氧化的保护比较严格杂质 E ( 去甲基物 ) 为所有企业共有, 大部分样品中, 杂质 E 含量在 0.1% ~0.2% 之间, 主要来源于原料, 为合成路线中甲基哌嗪的杂质哌嗪与氧氟酸反应产生破坏性试验表明, 杂质 E 在光照条件下有少量增加, 各企业样品与原料的对比表明制剂及贮藏运输未造成杂质 E 的增加杂质 1 为所有企业共有, 各企业间含量差异较大破坏性试验表明, 该杂质在光照条件下大量增加, 经质谱分析, [M+H] + = , 分子式 C16H17FN3O4, 推测结构为二胺衍生物, 结构式见图 4 该杂质在原料原料贮藏与运输制剂制剂贮藏与运输整个周期中均有可能增加, 提示各企业在样品的光照保护上存在差异

4 258 中国药事 2014 年第 28 卷第 3 期图 4 杂质 1 结构式杂质 2 为一家企业特有杂质, 含量在 0.1%~ 0.2% 之间, 在原料及辅料中均未检出该杂质经试验, 按处方量配制仅含盐酸左氧氟沙星磷酸氢二钠三氯叔丁醇的样品在 100 加热 2h 以上会产生该杂质, 但加大任意反应物的量, 该杂质均不再增加 ; 在 0.1mol L -1 盐酸溶液中或氢氧化钠溶液中加热后该杂质消失根据其质谱分析结果及反应特性, 分析杂质 2 结构可能如图 5, 该物质包含酸酐结构, 在水溶液中不稳定, 极易水解, 只能够微量存在良好, 单个最大杂质在 0.2% 以下, 总杂质在 0.37% 以下, 最主要的杂质为杂质 E ( 去甲基物 ), 来源为原料带入含量超过 0.1% 的主要杂质有 4 种, 分别为原料带入的杂质 E 光照降解产生的二胺衍生物含有酸酐结构的杂质 2 与未能推测出结构的杂质 3 3 讨论 3.1 国产盐酸左氧氟沙星滴眼液杂质水平及质控标准评价对盐酸左氧氟沙星滴眼液有关物质的定量分析表明, 国产盐酸左氧氟沙星滴眼液杂质控制水平良好, 符合药典相关要求, 但现行标准方法系统适用性要求低, 色谱条件较差, 测定结果存在一定误差, 且无法检测左氧氟沙星原料中的主要杂质 - 杂质 A, 因此建议尽快提高现行标准 3.2 国内外左氧氟沙星有关物质检测方法比较 [3-4] [5] [6] 对中美日 WHO 左氧氟沙星标准中有关物质检测方法进行方法学验证, 结果中国药典 2010 年版方法检测杂质谱与灵敏度均高于国外药典及现行标准方法, 因此采用该方法进行杂质检测不同方法的样品检测结果见表 3, 色谱图见图 6~ 图 9 图 5 杂质 2 结构式表 3 不同方法测定的有关物质检测结果 ( 总杂质 ) % 序号现行标准 CHP2010 WHO USP34/JP16 杂质 3 为所有企业共有, 来源于原料, 各企业间含量差异较大经质谱分析, [M + H] + = , 且分子中不含有特殊同位素峰的元素, 如 Cl 等, 可能含有 2 个 COOH 基团, 整体分子骨架结构比较稳定由于分子量较大, 碎片过多, 未能推测出其结构 2.3 结论国产盐酸左氧氟沙星滴眼液整体杂质控制水平注 :1USP34/JP16 测定结果中不包括右旋异构体 2 以上 1~7 号分别为不同企业样品图 6 CHP2010 方法测定的有关物质色谱图

5 259 图 7 USP34 方法测定的有关物质色谱图图 8 WHO 国际标准方法测定的有关物质色谱图图 9 现行标准方法测定的有关物质色谱图参考文献 : [1] 王维剑. 左氧氟沙星的有关物质研究进展 [J]. 中国抗生素杂志,2010,35 (11): [2] 袁堃. 左氧氟沙星眼用制剂研究进展 [J]. 武警医学院学报,2008,17 (11): [3] 中国药典 [S]. 二部,2010: [4] 中国药典 2010 年版第一增补本 [S].2010: [5] USP34 [S].2011: [6] JP16 [S].2010: ( 修回日期编辑王雅雯 )

不同基源石斛属植物不同来源商品石斛

不同基源石斛属植物不同来源商品石斛徐蓓杨莉陈崇崇王峥涛徐珞珊建立黄草类石斛的薄层色谱定性鉴别方法采用薄层色谱法考察不同基源石斛及商品药材中专属性成分联苄类化合物毛兰素石斛酚杓唇石斛素和三羟基甲氧基联苄的薄层色谱行为对石斛药材进行定性鉴别通过种不同基源的石斛及批商品石斛的薄层色谱鉴别证明此方法专属性强操作简单重复性好为石斛的鉴别提供了一种准确有效的新方法本方法可用于黄草类石斛的鉴别为中药石斛的质量标准研究提供科学依据