國立中山大學學位論文典藏.PDF

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1 國 立 中 山 大 學 海 洋 生 物 科 技 暨 資 源 學 系 博 士 論 文 建 立 禽 畜 水 產 品 中 之 喹 諾 酮 類 藥 物 分 析 方 法 及 恩 氟 喹 諾 酮 羧 酸 在 吳 郭 魚 中 藥 物 動 力 學 之 研 究 Simultaneous Determination of Quinolones in Marine and Livestock Products and Pharmacokinetics of Enrofloxacin in Tilapia 研 究 生 : 張 菊 香 撰 指 導 教 授 : 王 維 賢 中 華 民 國 九 十 八 年 七 月 1

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4 謝 誌 隨 著 論 文 的 如 期 完 成 和 付 梓, 四 年 來 於 辦 公 室 學 校 穿 梭 往 返 的 忙 碌 生 涯 也 即 將 劃 下 美 麗 的 句 點 首 先 要 衷 心 感 謝 恩 師 王 維 賢 教 授 的 悉 心 指 導 與 鼓 勵, 也 適 時 在 關 鍵 之 處 給 我 提 點, 使 我 終 能 完 成 學 業 拓 展 我 的 學 術 視 野, 同 時 感 謝 師 母 平 時 的 關 懷 與 鼓 勵 論 文 審 查 期 間 承 蒙 陳 景 川 教 授 郭 茂 松 教 授 陳 一 鳴 教 授 與 蔡 清 恩 教 授 於 百 忙 之 中 撥 冗 費 心 斧 正, 並 惠 賜 諸 多 寶 貴 意 見, 使 本 論 文 更 加 豐 富 與 完 整, 學 生 受 惠 良 多, 謹 致 以 最 誠 摯 之 謝 忱 特 別 要 感 謝 的 是 蔡 清 恩 老 師 引 領 我 進 入 藥 物 動 力 學 專 業 領 域, 不 斷 地 予 以 指 導 啟 迪, 每 每 討 論 耗 時 費 力, 著 實 讓 我 銘 感 五 內 此 外 感 謝 蔡 師 母 亮 諧 於 吳 郭 魚 飼 養 及 給 藥 期 間 不 辭 辛 勞 協 助 完 成 試 驗, 感 謝 學 弟 妹 們 : 仲 偉 秉 彰 禹 潔 楊 平 於 研 究 期 間 一 路 走 來 之 協 助 與 照 顧, 王 耀 宏 老 師 對 論 文 提 供 寶 貴 的 意 見 有 助 於 本 論 文 之 完 成, 特 此 一 併 致 謝 遙 想 在 職 進 修 過 程 中, 感 謝 吳 分 局 長 明 德 廖 課 長 永 瑛 及 四 課 的 同 事 在 公 務 上 不 時 地 給 予 我 支 持 與 鼓 勵, 讓 我 能 兼 顧 學 業 與 公 務 在 我 一 路 辛 勤 走 來, 感 謝 的 人 很 多 : 家 翁 羅 海 賢 將 軍 的 鼓 勵 與 包 容 居 首 功, 外 子 俊 良 默 默 呵 護 暐 知 張 知 的 成 長, 使 我 在 衝 刺 學 業 認 真 於 工 作 崗 位 上 無 後 顧 之 憂, 母 親 大 人 的 關 懷 及 宅 急 便 的 愛 心 食 物 最 後, 僅 以 此 論 文 獻 給 我 最 親 愛 的 家 人 與 關 心 我 的 長 官 及 同 事, 感 謝 你 們 的 包 容 與 愛 護, 願 與 你 們 分 享 這 份 榮 耀 菊 香 謹 誌

5 摘 要 本 研 究 分 為 三 個 章 節 探 討 : 第 一 部 份 是 建 立 液 相 層 析 螢 光 檢 測 方 法 同 步 分 析 雞 肉 豬 肉 魚 及 蝦 中 11 種 喹 諾 酮 類 抗 菌 劑 殘 留 (marbofloxacin norfloxacin ciprofloxacin lomefloxcain danofloxacin enrofloxacin sarafloxacin difloxacin oxolinic acid nalidixic acid flumequine) 樣 品 以 0.3% 偏 磷 酸 : 氰 甲 烷 (1:1, v/v) 萃 取, 經 減 壓 濃 縮 去 除 氰 甲 烷 後 注 入 HLB 固 相 萃 取 匣 淨 化 液 相 層 析 分 析 條 件 使 用 以 symmetry column C18 (250 x 4.5 mm i.d., 5 μm) 管 柱 分 離, 配 合 三 段 式 程 式 螢 光 偵 檢 器 偵 測, 移 動 相 由 0.1 % 甲 酸 水 溶 液 及 氰 甲 烷 組 成 進 行 梯 度 沖 堤 空 白 肌 肉 組 織 添 加 3 種 濃 度 (25 50 及 250 ng/g; 除 了 danofloxacin 添 加 濃 度 為 6.25, 12.5 及 62.5 ng/g) 建 立 線 性 偵 測 極 限 定 量 極 限 精 密 度 及 精 確 度 之 確 效 試 驗 11 種 喹 諾 酮 抗 菌 劑 之 添 加 試 驗 之 平 均 回 收 率 為 71.7 至 105.3%, 定 量 極 限 為 5.0 至 28.0 ng/g 結 果 顯 示 本 方 法 簡 單 快 速 靈 敏 且 適 合 例 行 性 分 析 工 作 第 二 部 份 是 建 立 液 相 層 析 - 電 噴 灑 - 串 聯 式 質 譜 儀 方 法 檢 測 牛 奶 雞 肉 豬 肉 魚 及 蝦 中 18 種 喹 諾 酮 抗 菌 劑 殘 留, 此 方 法 能 篩 檢 及 確 認 包 括 12 種 兩 性 的 喹 諾 酮 抗 菌 劑 (marbofloxacin norfloxacin enrofloxacin ciprofloxacin desethylene ciprofloxacin lomefloxacin danofloxacin sarfloxacin difloxacin ofloxacin orbifloxacin enoxacin) 及 6 種 酸 性 的 喹 諾 酮 抗 菌 劑 (oxolinic acid nalidixic acid flumequine cinoxacin piromidic acid pipemidic acid) 樣 品 之 萃 取 液 為 含 1% 甲 酸 之 氰 甲 烷 溶 液, 經 減 壓 濃 縮 後 以 10% 氰 甲 烷 定 容, 再 以 正 己 烷 去 脂 高 效 能 液 相 層 析 分 析 條 件 為 XDB C8 (150 x 4.6 mm, 5μm) 分 離 管 柱, 移 動 相 由 20 mm 甲 酸 銨 0.1% 甲 酸 水 溶 液 及 氰 甲 烷 組 成 進 行 梯 度 沖 堤, 質 譜 儀 使 用 正 離 子 多 重 反 應 (MRM) 模 式 CCα 及 CCβ 之 測 定 乃 參 考 歐 盟 2002/657/EC 指 令 及 ISO 號 標 準, 使 用 禁 用 物 質 之 模 式 本 實 驗 條 件 下 所 測 得 之 CCα 範 圍 為 0.18 至 0.68 I

6 ng/g,ccβ 範 圍 為 0.24 至 0.96 ng/g 第 三 部 份 是 研 究 吳 郭 魚 體 內 恩 氟 喹 諾 酮 羧 酸 (enrofloxacin;enr) 及 其 代 謝 物 (ciprofloxacin;cip 及 des-cip) 藥 物 動 力 學, 吳 郭 魚 以 口 服 血 管 給 藥 單 一 劑 量 分 別 為 10 及 2.5 mg/kg 魚 重, 給 藥 後 定 時 採 樣 ( 小 時 採 樣 ), 每 一 採 樣 點 採 4 隻 魚 體, 使 用 LC/MS/MS 分 析 其 全 血 及 主 要 臟 器 組 織 ( 肝 腎 胆 汁 及 肌 肉 ) 中 ENR 及 其 代 謝 物 (CIP, des-cip) 殘 留 量,LOQ 為 0.01 μg/g 口 服 及 血 管 兩 種 給 藥 途 徑 後, 吳 郭 魚 的 藥 物 動 力 學 過 程 符 合 一 級 吸 收 二 室 性 開 放 模 式 血 管 給 ENR 藥 的 主 要 藥 物 動 力 學 參 數 為 : 血 中 濃 度 - 時 間 曲 線 下 面 積 (AUC) 消 除 半 衰 期 (t 1/2β ) 最 高 血 中 濃 度 (C max ) 清 除 率 (Cl tot ) 及 表 現 分 佈 容 積 (V dss ) 分 別 為 ± μg.h/ml ± h 4.70 ± 0.36 μg/ml ± L/h/kg ± L/kg 口 服 給 ENR 藥 的 主 要 藥 物 動 力 學 參 數 為 : AUC 消 除 半 衰 期 最 高 血 中 濃 度 出 現 的 時 間 點 (T max ) 最 高 血 中 濃 度 (C max ) 分 別 為 ± μg.h/ml ± h 0.601±0.06h ± μg/ ml 口 服 給 ENR 藥 後 可 在 肝 腎 及 胆 汁 中 測 到 CIP(ENR 的 活 性 代 謝 物 ) 而 des-cip(cip 的 主 要 代 謝 物 ) 僅 在 口 服 給 ENR 藥 後 第 120 ~168 h 的 膽 汁 中 測 到 0.01 ~0.03 μg/ g ENR 及 其 代 謝 物 在 吳 郭 魚 體 內 為 典 型 的 腸 肝 循 環 且 會 大 量 累 積 在 胆 汁 中 這 現 象 可 以 解 釋 吳 郭 魚 在 口 服 ENR 後 到 第 7 天 血 液 及 肌 肉 尚 維 持 在 高 濃 度 的 原 因 中 文 關 鍵 字 : 喹 諾 酮 類 抗 菌 劑 ; 殘 留 ; 液 相 層 析 儀 螢 光 分 析 ; 液 相 層 析 串 聯 式 質 譜 儀 ; 吳 郭 魚 ; 藥 物 動 力 學 II

7 Abstract The study felld into three sections. The first section that a liquid chromatography method with fluorescence detection was developed for simultaneous determination of 11 quinolones (QNs; marbofloxacin, norfloxacin, ciprofloxacin, lomefloxacin, danofloxacin, enrofloxacin, sarafloxacin, difloxacin, oxolinic acid, nalidixic acid and flumequine) in chicken, pork, fish and shrimp. The analytes were extracted with 0.3% metaphosphoric acid: acetonitrile (1:1, v/v), followed by a HLB cartridge clean-up procedure. The HPLC separation was carried out on a symmetry column C18 (250 mm x 4.5 mm i.d., 5 μm) with linear gradient elution of 0.1% formic acid: acetonitrile as mobile phase and programmable fluorescence detection. The method was validated by spiking blank animals tissues at three different levels (25, 50 and 250 ng/g; except 6.25, 12.5 and 62.5 ng/g for DAN) and linearity, detection limit, quantification limit, precision and accuracy were checked. Mean recoveries of 11 QNs from edible animal tissues were %. The limits of quantification in different muscle tissues ranged from 5.0 to 28.0 ng/g. The results showed it was simple, rapid, sensitive and suitable for routine test. The second section that a LC-ESI-MS/MS method was developed for determining 18 (fluoro)quinolone (QNs) residues in milk, chicken, pork, fish and shrimp. This method is capable of screening and confirming the presence of 12 amphoteric QNs (marbofloxacin, norfloxacin, enrofloxacin, ciprofloxacin, desethylene ciprofloxacin, lomefloxacin, danofloxacin, sarfloxacin, difloxacin, ofloxacin, orbifloxacin and enoxacin) and 6 acidic QNs (oxolinic acid, nalidixic acid, flumequine, cinoxacin, piromidic acid and pipemidic acid). The drugs were extracted from matrix using acetonitrile with 1% formic acid, diluted in 10% acetonitrile and defatted by extraction with hexane. The LC separation was conducted on a XDB C8 (150 x 4.6 mm, 5μm) column with gradient elution of 20 mm ammonium formate with 0.1% formic acid acetonitrile as the mobile phase. Mass spectral acquisition was completed in the positive ion mode by applying multiple reaction mode (MRM). The decision limit (CCα) and detection capability (CCβ) stated in the Decision No. 2002/657/EC and the ISO III

8 standard No.11843, has been calculated in the case of the nonauthorized substance. The values of CCα ranged from 0.18 to 0.68 ng/g and CCβ ranged from 0.24 to 0.96 ng/g under specified conditions. The third section that the pharmacokinetics of ENR and its active metabolite (CIP and des-cip) were estimated in tilapia after intravenous (i.v.) and oral (p.o.) administration of a single dose of 2.5 and 10 mg/kg body weigh, respectively. At prefixed time points, from 0.25 h to 7 days after administration, whole blood and main tissue (liver, kidney, bile and muscle) from 4 individuals in each were collected. The concentration of ENR and its active metabolites in the main tissue were simultaneously detected by LC/MS/MS method. Limited of quantitation (LOQ) of this method were 0.01μg/g. Pharmacokinetic parameters from both routes were described to have a two- compartment open model with first-order elimination. After i.v. administration, the area under the drug concentration-time (AUC), elimination half-life (t 1/2β ), maximum plasma concentration (C max ), total body clearance (Cl tot ) and apparent volume of distribution at steady-state (V ss ) of ENR were ± μg.h/ml, ± h, 4.70 ± 0.36 μg/ml, ± 4.24 L/h/kg, 1105 ± L/kg,respectively. After oral administration, the AUC, t 1/2β, T max, C max of ENR were ± 76.19μg.h/mL, ± h, 0.601±0.06h, 9.75 ± 0.46μg/mL, respectively. After p.o. administration, CIP could be detected in liver, kidney and bile. Regarding des-cip, the main active metabolite of CIP, could be detected in 120~168 h bile among tissue. ENR and CIP had significance enterohepatic cycle in Tilapia and easily accumulated in bile. It seems reasonable to explain the phenomenon of ENR and CIP maintenance of high concentration in blood and muscle during the test time. Keywords:: quinolones; residue; HPLC-FLD; LC/MS/MS; tilapia; pharmacokinetics IV

9 目 錄 頁 次 摘 要...Ⅰ Abstract.. Ⅲ 目 錄...Ⅴ 表 目 錄...Ⅶ 圖 目 錄...Ⅸ 第 一 章 前 言 第 一 節 引 言. 1 第 二 節 喹 諾 酮 類 藥 物 的 特 性 及 其 用..3 第 三 節 喹 諾 酮 類 藥 物 殘 留 問 題 第 四 節 喹 諾 酮 類 藥 物 殘 留 檢 測.. 18 第 五 節 喹 諾 酮 類 藥 物 於 水 生 生 物 之 藥 物 動 力 學 研 究.. 25 第 六 節 吳 郭 魚 之 簡 介 第 二 章 高 效 能 液 相 層 析 螢 光 法 分 析 喹 諾 酮 類 殘 留 之 研 究 37 第 一 節 引 言 第 二 節 儀 器 材 料 及 方 法 第 三 節 結 果 第 四 節 討 論 第 三 章 LC-ESI/MS/MS 分 析 喹 諾 酮 類 抗 菌 劑 殘 留 之 研 究.. 58 第 一 節 引 言 第 二 節 儀 器 材 料 及 方 法 第 三 節 結 果.. 65 第 四 節 討 論 V

10 第 四 章 恩 氟 喹 諾 酮 羧 酸 及 其 代 謝 物 在 吳 郭 魚 體 內 的 藥 物 動 力 學 之 研 究 79 第 一 節 引 言 第 二 節 儀 器 材 料 及 方 法 第 三 節 結 果 第 四 節 討 論 103 第 五 章 總 結..105 參 考 文 獻 109 附 錄 一 圖 1~ 附 錄 二 個 人 簡 歷 137 VI

11 表 目 錄 頁 次 表 1-1 台 灣 日 本 歐 盟 之 喹 諾 酮 類 藥 最 大 殘 留 容 許 量 (MRL)...15 表 1-2 喹 諾 酮 類 合 成 抗 菌 劑 殘 留 分 析 方 法.23 表 1-3 氟 滅 菌 使 用 規 範.27 表 1-4 歐 索 磷 酸 用 規 範.28 表 1-5 吳 郭 魚 特 性.36 表 2-1 分 析 11 種 QNs 移 動 相 之 梯 度 設 定 42 表 2-2 螢 光 偵 測 器 激 發 / 放 射 波 長 設 定...42 表 種 喹 諾 酮 類 抗 菌 劑 其 紫 外 光 及 螢 光 最 佳 偵 測 波 長 44 表 2-4 比 較 3 種 萃 取 方 法 之 回 收 率 46 表 種 喹 諾 酮 類 抗 菌 劑 標 準 曲 線 之 線 性 方 程 式 及 相 關 係 數..46 表 2-6 添 加 組 織 ( 豬 肉 雞 肉 魚 及 蝦 )11 種 喹 諾 酮 類 抗 菌 劑 之 回 收 率...49 表 2-7 添 加 喹 酮 類 抗 菌 劑 之 精 密 度 確 效 試 驗.50 表 2-8 添 加 喹 酮 類 抗 菌 劑 於 魚 肉 之 LOD 及 LOQ..51 表 2-9 烏 骨 雞 肉 中 ENR 及 CIP 殘 留..51 表 3-1 分 析 18 種 QNs 移 動 相 之 梯 度 設 定 表 3-2 最 佳 化 二 次 質 譜 MRM 之 參 數 設 定.64 表 3-3 相 對 離 子 強 度 之 最 大 可 容 許 範 圍.68 表 種 喹 諾 酮 抗 菌 劑 的 質 譜 碎 片 相 對 離 子 強 度 比 68 表 種 QNs 於 吳 郭 魚 ( 魚 片 ) 之 基 質 效 應 與 絕 對 回 收 率...72 表 種 QNs 於 牛 奶 魚 蝦 豬 肉 雞 肉 之 CCα 及 CCβ 值 73 表 3-7 LC-ESI /MS/MS 及 HPLC-FLD 方 法 檢 測 FAPAS 能 力 試 驗 結 果 73 表 4-1 分 析 ENR CIP 及 des-cip 藥 物 移 動 相 之 梯 度 設 定 82 表 4-2 最 佳 化 二 次 質 譜 MRM 之 參 數 設 定.82 表 種 喹 諾 酮 類 抗 菌 劑 標 準 曲 線 之 線 性 方 程 式 及 相 關 係 數..90 表 4-4 全 血 添 加 ENR CIP des-cip 回 收 率 及 方 法 精 密 度.90 表 4-5 魚 肉 添 加 ENR CIP des-cip 回 收 率 及 精 密 度.90 VII

12 表 4-6 口 服 給 藥 後 血 腎 肝 胆 汁 及 肉 中 ENR 的 濃 度 92 表 4-7 口 服 給 藥 後 血 腎 肝 胆 汁 及 肉 中 CIP 的 濃 度..92 表 4-8 血 管 注 射 血 腎 肝 胆 汁 及 肉 中 ENR 的 濃 度 93 表 4-9 血 管 注 射 ENR 血 腎 肝 胆 汁 及 肉 中 CIP 濃 度 93 表 4-10 口 服 給 藥 ENR 在 各 組 織 中 CIP 轉 換 率 94 表 4-11 血 管 注 射 ENR 在 各 組 織 中 CIP 轉 換 率.94 表 4-12 口 服 給 藥 ENR 在 吳 郭 魚 體 內 的 藥 物 動 力 學 參 數 102 表 4-13 血 管 注 射 給 藥 ENR 在 吳 郭 魚 體 內 的 藥 物 動 力 學 參 數 102 VIII

13 圖 目 錄 圖 種 喹 諾 酮 類 藥 物 結 構 式..8 頁 次 圖 1-2 喹 諾 酮 類 藥 物 污 染 環 境 可 能 之 途 徑..17 圖 種 喹 諾 酮 類 抗 菌 劑 HPLC 層 析 圖..44 圖 2-2 HPLC 層 析 圖 (A) 空 白 魚 肉 (B) 魚 肉 添 加 250 ng/g 喹 酮 類 抗 菌 劑. 48 圖 2-3 白 蝦 殘 留 CIP (21 ng/g) 及 ENR (368 ng/g) HPLC 層 析 圖 圖 2-4 烏 骨 雞 殘 留 CIP (16 ng/g) 及 ENR (428 ng/g) HPLC 層 析 圖 圖 2-5 烏 骨 雞 肉 LC-MS/MS 層 析 圖 53 圖 3-1 Norfloxacin 之 二 級 質 譜 圖 及 質 譜 碎 片 可 能 之 裂 解 途 徑..67 圖 3-2 NAL 於 吳 郭 魚 之 基 質 效 應...69 圖 3-3 能 力 試 驗 魚 肉 樣 品 OXO 及 FLU 之 LC/MS/MS 離 子 層 析 圖 74 圖 4-1 吳 郭 魚 以 尾 部 血 管 進 行 注 射 給 藥...85 圖 4-2 吳 郭 魚 以 塑 膠 軟 管 口 服 投 藥...85 圖 4-3 吳 郭 魚 採 樣 組 織 ( 肌 肉 肝 臟 胆 汁 及 腎 臟 )...86 圖 4-4 口 服 第 5 天 膽 汁 ENR CIP 及 des-cip 之 LC/MS/MS 層 析 圖..97 圖 4-5 吳 郭 魚 口 服 給 藥 (0 至 24 小 時 ) 各 組 織 中 ENR 濃 度 變 化..98 圖 4-6 吳 郭 魚 口 服 給 藥 (0 至 168 小 時 ) 各 組 織 中 ENR 濃 度 變 化 98 圖 4-7 吳 郭 魚 血 管 給 藥 (0 至 24 小 時 ) 各 組 織 中 ENR 濃 度 變 化..99 圖 4-8 血 管 給 藥 後 (0 至 168 小 時 ) 組 織 中 ENR 濃 度 變 化 99 圖 4-9 吳 郭 魚 血 管 給 藥 ENR 後 血 藥 濃 度 變 化 IX

14 圖 4-10 以 WinNonlin 預 測 吳 郭 魚 血 管 給 藥 ENR 後 在 血 液 內 的 分 佈..101 圖 4-11 以 WinNonlin 預 測 吳 郭 魚 口 服 給 藥 ENR 後 在 血 液 內 的 分 佈..101 X

15 第 一 章 前 言 第 一 節 引 言 隨 著 國 人 生 活 水 準 提 高, 水 產 品 需 求 量 亦 逐 漸 增 加, 且 對 於 水 產 品 的 食 用 安 全 觀 念 也 愈 來 愈 重 視, 畜 禽 水 產 品 中 藥 物 殘 留 已 成 為 全 世 界 注 目 的 問 題, 此 外 加 入 世 界 貿 易 組 織 (World Trade Organization, WTO) 後, 已 遭 遇 外 國 畜 禽 水 產 品 輸 入 我 國 大 量 販 售, 然 而 在 眾 多 良 莠 不 齊 的 外 來 畜 禽 水 產 品 中, 如 何 兼 顧 產 品 生 鮮 度 與 檢 測 時 效 性, 又 不 讓 有 藥 物 殘 留 污 染 之 劣 質 品 魚 目 混 珠 通 關, 藥 物 殘 留 的 檢 驗 為 一 把 關 的 門 檻, 可 將 藥 物 污 染 之 家 禽 產 品 擋 於 國 門 外, 需 建 立 一 套 健 全 之 藥 物 檢 驗 方 法, 方 可 對 進 口 家 禽 及 水 產 品 把 關, 進 而 保 障 國 民 健 康 及 國 產 優 良 家 禽 及 水 產 品 的 銷 售 而 台 灣 每 年 養 殖 水 產 品 出 口 量 約 10 餘 萬 公 噸, 出 口 價 值 約 100 億 元 ( 農 委 會 漁 業 署, 民 國 91 年 年 報 ) 是 相 當 重 要 的 外 銷 產 業 ; 此 外 歐 美 日 本 等 國 家 對 動 物 用 藥 殘 留 檢 測 標 準 嚴 苛, 在 水 產 品 出 口 前 需 有 效 建 立 檢 驗 監 控 制 度, 一 旦 被 輸 入 國 檢 測 出 過 量 或 不 當 的 藥 物 殘 留, 不 只 是 面 臨 退 運 或 銷 毀 之 財 物 損 失, 更 會 賠 上 國 家 長 久 以 來 努 力 經 營 之 良 好 形 象, 造 成 國 內 水 產 養 殖 魚 類 外 銷 障 礙 為 了 提 昇 檢 測 效 益 應 需 不 斷 研 究 更 準 確 更 有 效 的 殘 留 檢 測 方 法, 而 發 展 多 重 殘 留 檢 測 分 析 是 目 前 趨 勢 本 研 究 主 要 目 的 研 發 靈 敏 度 高 準 確 且 快 速 之 HPLC-FLD 喹 諾 酮 類 抗 菌 劑 (Quinolones, QNs) 殘 留 多 重 分 析 方 法 適 用 於 實 驗 室 例 行 篩 檢 工 作, 檢 測 項 目 及 靈 敏 度 可 涵 蓋 歐 盟 美 國 日 本 及 台 灣 的 殘 留 標 準, 建 立 之 分 析 方 法 可 提 供 國 內 檢 測 實 驗 室 檢 測 QNs 殘 留 方 法 之 參 考 近 年 來 由 於 檢 驗 儀 器 不 斷 推 陳 出 新, 歐 盟 美 國 日 本 先 進 國 家 使 1

16 用 液 相 層 析 串 聯 式 質 譜 儀 (LC-MS/MS) 檢 測 動 物 用 藥 殘 留 之 研 究 相 當 多, 而 國 內 尚 處 於 萌 芽 階 段, 建 立 LC-MS/MS 標 準 檢 驗 方 法 很 有 限, 此 外 HPLC-FLD 檢 測 有 共 析 (co-elute) 問 題, 檢 出 喹 諾 酮 類 抗 菌 劑 QNs 殘 留 需 用 其 它 方 法 確 認, 而 目 前 確 認 食 品 中 喹 諾 酮 類 抗 菌 劑 殘 留 最 佳 利 器 是 LC/MS/MS 方 法 ; 其 方 法 靈 敏 度 高 選 擇 性 高, 使 用 簡 單 有 機 溶 劑 萃 取 及 去 脂 步 驟, 建 立 簡 單 及 有 效 之 液 相 層 析 - 電 噴 灑 - 串 聯 式 質 譜 儀 方 法 檢 測 不 同 生 物 基 質 18 種 喹 諾 酮 抗 菌 劑 殘 留, 參 考 ISO 標 準 No 及 歐 盟 2002/657/EC 指 令 建 立 LC/MS/MS 方 法 確 效 (CCα, CCβ, LOD, LOQ, 選 擇 性 ); 並 使 用 建 立 HPLC-FLD 及 LC/MS/MS 方 法 進 行 實 驗 室 間 能 力 試 驗 (FAPAS test) 驗 證 建 立 方 法 之 正 確 性 國 內 水 產 動 物 藥 物 動 力 學 研 究 少 見, 研 究 的 藥 物 及 物 種 有 限, 且 常 侷 限 於 探 討 停 藥 期 半 衰 期 藥 物 動 力 學 研 究 在 水 產 動 物 疾 病 防 治 中, 具 有 十 分 重 要 的 理 論 意 義 和 實 用 價 值 本 研 究 在 建 立 完 整 分 析 方 法, 使 用 口 服 及 血 管 注 射 方 式 給 藥, 除 了 瞭 解 藥 物 代 謝 模 式 外, 進 而 探 討 enrofloxacin 及 其 代 謝 物 (ciprofloxacin des-ciprofloxacin ) 在 吳 郭 魚 體 內 的 分 佈 及 相 關 藥 物 動 力 學 參 數, 並 與 文 獻 中 不 同 水 產 動 物 做 比 較, 建 立 完 整 水 產 動 物 藥 物 動 力 學 研 究 模 式, 提 供 國 內 研 究 單 位 參 考 2

17 第 二 節 喹 諾 酮 類 藥 物 的 特 性 及 其 應 用 一 喹 諾 酮 類 藥 物 的 分 類 結 構 喹 諾 酮 類 (quinolones, QNs) 藥 物 是 近 20 年 來 迅 速 發 展 重 要 的 合 成 抗 菌 劑, 是 繼 磺 胺 劑 (sulfa drugs) 類 藥 物 之 後 在 合 成 抗 菌 劑 方 面 重 要 的 突 破, 廣 泛 地 使 用 於 人 類 與 畜 牧 水 產 養 殖 的 疾 病 治 療, 在 化 學 結 構 上 屬 吡 酮 酸 衍 生 物 (pyridonecarboxylic acid, PCAs), 俗 稱 喹 諾 酮 類 QNs 均 含 有 吡 酮 酸 (1,4 二 氫 4 氧 吡 啶 3 羧 酸 ) 基 本 結 構, 圖 1-1 為 常 用 的 18 種 喹 諾 酮 類 藥 物 結 構 式 最 早 使 用 於 醫 療 上 的 第 一 代 QNs 是 萘 啶 酸 (nalidixic acid, NAL), 於 1962 年 美 國 Sterling Wintrop 研 究 所 的 Lesher 等 將 抗 瘧 疾 藥 氯 喹 (chloroquine) 加 以 修 飾 而 來, 之 後 又 相 繼 合 成 許 多 類 似 化 合 物 : 歐 索 林 酸 (oxolinic acid, OXO) 吡 咯 酸 (piromidic acid, PIR) (cinoxacin, CIN) 等 稱 為 第 一 代 QNs 由 於 第 一 代 QNs 其 抗 菌 作 用 範 圍 狹 窄 只 能 對 抗 革 蘭 氏 陰 性 腸 內 菌 半 衰 期 短 副 作 用 大 細 菌 易 產 生 耐 藥 性, 此 類 藥 物 僅 限 於 治 療 泌 尿 道 感 染, 目 前 已 很 少 使 用 氟 喹 諾 酮 類 (fluoroquinolones, FQNs) 共 同 特 點 是 喹 啉 環 ( 萘 啶 環 ) 的 C-6 位 上 有 氟 (fluorine),c-7 位 上 piperazine 基 或 吡 咯 基 第 一 個 FQs 應 用 在 臨 床 治 療 的 是 Ito 等 (1980) 合 成 的 諾 氟 喹 啉 羧 酸 (norfloxacin, NOR) ( 中 國 大 陸 稱 為 諾 氟 沙 星 ), 其 抗 菌 效 果 勝 過 第 一 代 QNs 百 倍 以 上, 美 國 專 門 負 責 藥 物 命 名 的 機 構 規 定 QNs 非 專 利 名 稱 藥 名 均 稱 為 xacin( 沙 星 ) ( 李 等, 2002), 這 些 帶 有 氟 基 的 第 二 代 QNs 還 包 括 環 丙 沙 星 (ciprofloxacin, CIP) 恩 氟 喹 啉 羧 酸 ( 恩 諾 沙 星 ) (enrofloxacin, ENR) marbofloxacin (MAR) danofloxacin (DAN) 及 ofloxacin (OFL) 等, 抗 菌 活 性 比 第 一 代 QNs 更 好 且 對 於 治 療 腸 內 菌 (Enterbacteriaceae) 其 它 革 蘭 氏 陰 性 菌 例 如 :Pseudomonas aeruginosa 以 3

18 及 一 些 革 蘭 氏 陽 性 球 菌 感 染 有 良 好 效 果, 同 時 增 加 口 服 藥 物 的 吸 收 組 織 分 佈 性 以 及 較 長 體 內 半 衰 期, 此 外 對 治 療 生 物 體 之 中 樞 神 經 毒 性 減 弱 (Ball et al., 2002) 接 著 開 發 第 三 代 QNs 包 括 orbifloxacin (ORB) levofloxacin sparfloxacin 及 grepafloxacin 等 藥 物, 更 顯 著 強 化 對 革 蘭 氏 陽 性 菌 的 活 性,levofloxacin 為 OFL 的 左 旋 異 構 物, 此 結 構 上 的 差 異 使 levofloxacin 較 OFL 有 更 廣 更 強 的 殺 菌 力 (Ambrose et al., 1997) 而 第 四 代 QNs 包 括 trovafloxacin gatifloxacin moxifloxacin 及 gemifloxacin 除 了 保 有 第 三 代 QNs 的 優 點 外, 同 時 增 加 對 抗 厭 氧 菌 的 效 果 (Owens et al., 2002 ) 大 多 數 原 形 藥 物 經 生 物 體 內 代 謝 後, 其 代 謝 產 物 的 抗 菌 活 性 一 般 較 原 形 藥 物 大 大 降 低, 但 CIP NOR 及 SAR 均 為 代 謝 產 物 卻 仍 俱 有 良 好 抗 菌 活 性, 故 CIP NOR 及 Sarfloxacin (SAR) 均 開 發 為 藥 效 佳 之 氟 喹 諾 酮 類 藥 品 原 形 藥 物 與 代 謝 物 :1.ENR 為 原 形 藥 物,ENR 脫 乙 烷 基 產 物 為 CIP, 而 CIP 脫 烷 基 產 物 為 des-cip,2. pefloxacin (PEF) 為 原 形 藥 物,PEF 脫 甲 烷 基 產 物 為 NOR,3. Difloxacin (DIF) 為 原 形 藥 物,DIF 脫 甲 烷 基 產 物 為 SAR QNs 僅 在 C-3 位 有 羧 基 稱 為 酸 性 QNs (OXO, NAL, FLU, CIN, PIR 及 PIP); 同 時 俱 有 C-3 位 有 羧 基 及 C-7 連 接 piperazinyl 等 含 氮 鹼 基 稱 為 兩 性 QNs (amphoteric QNs), 如 MAR, NOR, ENR, CIP, des- CIP, LOM, DAN, SAR, DIF, OFL, ORB 及 ENO 二 QNs 藥 物 的 作 用 機 轉 QNs 主 要 作 用 機 轉 是 藉 由 與 DNA 螺 旋 酶 (DNA gyrase) 或 topoisomerase IV 之 結 合, 進 而 抑 制 細 菌 DNA 之 合 成 DNA 螺 旋 酶 亦 稱 拓 樸 異 構 酶 Π (Topoisomerase Π, Topo Π) 是 由 兩 個 次 單 元 (A B) 組 成 的 4

19 四 聚 體 (A 2 B 2 ) A B 次 單 元 分 別 是 由 gyr A 及 gyr B 染 色 體 基 因 轉 譯 成 A 次 單 元 具 有 切 斷 雙 股 DNA 的 功 能, 使 DNA 發 生 超 螺 旋 (supercoiling) 環 化 打 結 或 解 結 等 (Gellert,1977) B 次 單 元 具 有 ATP 酶 活 性, 催 化 水 解 ATP 而 釋 出 能 量 提 供 DNA 切 斷 和 重 新 連 接 所 需 之 能 量 故 DNA 螺 旋 酶 參 與 DNA 複 製 起 始 鏈 的 延 長 及 終 止 的 全 部 過 程, 任 何 使 Topo Π 活 性 改 變 的 因 素 對 細 菌 均 是 致 命 (Norris,1988) Topo Ⅳ 由 兩 個 次 單 元 (C E) 組 成 的 四 聚 體 (C 2 E 2 ) C E 次 單 元 分 別 是 由 par C 及 par E 染 色 體 基 因 轉 譯 成, 新 一 代 FQs 可 抑 制 Topo Ⅳ 活 性 (Zechiedrich et al., 1995) DNA gyrase 與 革 蘭 氏 陰 性 菌 有 關, 而 topoisomerase IV 與 G(+) 有 關, 不 同 的 QNs 對 DNA gyrase 及 topoisomerase IV 之 親 和 力 不 同, 因 此 可 解 釋 不 同 的 QNs 對 革 蘭 氏 陽 性 菌 及 陰 性 菌 抗 菌 範 圍 之 差 異 決 定 QNs 藥 效 的 關 鍵 因 素 :1.QNs 與 細 菌 DNA 螺 旋 酶 的 結 合 力, 2.QNs 對 組 織 的 通 透 性 (QNs 必 須 進 入 細 菌 內 部 才 能 發 揮 藥 效 ) 4-quinolone 母 核 :C-3 羧 基 C-4 羰 基 是 QNs 與 細 菌 螺 旋 酶 結 合 的 基 團, C-6 位 上 有 氟 可 增 強 QNs 與 細 菌 螺 旋 酶 的 結 合 力 及 對 細 胞 的 滲 透 性 C-7 位 上 piperazinyl 鹼 性 且 有 適 當 水 溶 性 的 基 團 有 利 於 提 高 抗 菌 活 性 和 改 善 藥 物 動 力 學 性 質 新 喹 諾 酮 類 藥 物 進 入 細 菌 體 內 的 量 較 NAL 多 倍, 這 也 證 明 了 新 喹 諾 酮 類 藥 物 對 細 菌 體 內 通 透 性 優 良 ( 李 等, 2002) 自 1990 年 ENR 對 於 魚 病 治 療 漸 漸 受 到 注 目 由 於 ENR 在 體 內 體 外 對 於 養 殖 場 及 水 族 箱 觀 賞 魚 之 細 菌 性 疾 病 感 染 均 有 效, 包 括 鲑 產 氣 單 胞 菌 (Aeromonas salmonicida), 弧 鰻 菌 (Vibro angiillarum), 鳟 魚 紅 嘴 病 耶 氏 桿 菌 (Yersinia ruckeri), 鮭 魚 腎 菌 (Renibacterium salmonicida ) Pastyeurella piscida; 然 而 ENR 尚 未 核 准 於 水 產 養 殖 (Rocca et al., 2004) 5

20 三 QNs 藥 物 的 毒 性 QNs 藥 物 的 毒 性 (Berino et al, 2000):1. 藥 物 之 間 的 結 合 : 抗 酸 藥 ( 氫 氣 化 鋁 氫 氣 化 鎂 ) 中 含 Mg 2+ Al 3+ 易 與 QNs 形 成 螯 合 物, 會 降 低 QNs 吸 收,2. 光 敏 性 (photosensitivity),3. 消 化 道 不 適 ( 腹 痛 下 瀉 ), 在 尿 中 形 成 結 晶 產 生 抗 藥 性 菌 株 四 抗 藥 性 的 問 題 目 前 QNs 殘 留 最 受 關 注 的 危 害 是 動 物 的 抗 藥 性 菌 株, 可 經 由 產 品 的 運 輸 交 易 的 過 程 或 人 與 動 物 的 移 動 而 導 致 抗 藥 性 菌 株 傳 播 抗 藥 性 菌 株 (resistance clones) 的 產 生, 是 因 為 人 們 使 用 這 些 能 對 抗 微 生 物 的 抗 生 素 藥 物 時, 在 殺 死 特 定 微 生 物 的 同 時, 也 保 留 了 一 些 突 變 種, 而 這 些 突 變 種 菌 株 即 使 有 藥 物 存 在 時 亦 能 殘 留 下 來, 並 且 繼 續 繁 殖 ; 而 當 人 們 使 用 抗 生 素 藥 物 達 到 濫 用 的 地 步 時, 這 些 能 抗 藥 的 菌 株 就 更 能 被 選 擇 出 來 並 加 以 繁 殖 增 生, 造 成 抗 藥 性 菌 株 大 幅 增 加, 不 僅 擾 亂 了 生 物 界 的 恆 定, 也 使 得 嚴 重 感 染 的 病 人 之 治 療 更 加 困 難 抗 藥 性 的 機 轉 : 細 菌 體 對 FQNs 產 生 抗 藥 性 的 機 轉 有 兩 種 方 式 第 一 種 方 式 是 利 用 染 色 體 突 變 製 造 出 變 異 的 DNA-gyrase 或 Topo IV, 使 得 FQNs 與 gyr A 或 Par C 親 合 力 降 低, 以 減 低 FQNs 對 DNA 重 新 密 合 (resealed) 動 作 的 阻 礙 能 力 (Katsuda et al., 2004) 第 二 種 方 式 是 利 用 主 動 排 出 藥 物 (active efflux) 將 藥 物 排 出 細 胞 外, 以 減 少 FQNs 蓄 積 在 細 菌 細 胞 內 的 濃 度 對 抗 藥 性 較 嚴 重 的 人 畜 共 通 細 菌 (Zoonotic bacteria) 有 沙 門 氏 菌 (Salmonella) 彎 曲 桿 菌 (Campylobacter) 和 腸 球 菌 (Enterococcus) 等 之 細 菌 公 共 衛 生 學 家 均 嚴 密 監 測 Charles (2005) 指 出 家 禽 業 使 用 抗 生 素 提 高 了 導 致 人 類 感 染 食 源 性 病 菌 的 耐 藥 性, 其 中 6

21 彎 曲 桿 菌 普 遍 存 在 於 雞 肉 中 的 病 原 體, 由 於 食 用 未 煮 熟 的 雞 肉, 每 年 有 100 多 萬 美 國 人 發 生 由 彎 曲 桿 菌 污 染 而 導 致 的 食 物 中 毒 耐 藥 性 彎 曲 桿 菌 正 日 益 威 脅 公 眾 的 健 康, 尤 其 是 對 老 年 人 和 免 疫 力 低 的 病 人 監 測 食 品 中 氟 喹 諾 酮 耐 藥 菌 株 的 流 行 率 和 來 源 非 常 重 要 由 於 ENR 會 造 成 彎 曲 桿 菌 對 FQNs 有 抗 藥 性 的 危 害, 美 國 FDA (U.S.A., FDA, 2005) 撤 銷 ENR 使 用 於 家 禽 之 許 可 證 Delsol 等 人 (2009) 指 出 濫 用 ENR 會 造 成 彎 曲 桿 菌 對 FQNs 有 抗 藥 性 的 危 害 7

22 F O N COOH Flumequine (FLU) 氟 滅 菌 C 14 H 12 NFO 3 分 子 量 O O O N COOH Oxolinic acid (OXO) 歐 索 林 酸 C 13 H 11 NO 5 分 子 量 O COOH H 3 C N N C 2 H 5 Nalidixic acid (NAL) 奈 啶 酸 C 12 H 12 N 2 O 3 分 子 量 圖 種 喹 諾 酮 類 藥 物 結 構 式 8

23 O O O N N COOH Cinoxacin (CIN) C 12 H 10 N 2 O 5 分 子 量 N O COOH N N N Piromidic acid (PIR) 吡 咯 酸 C 14 H 16 N 4 O 3 分 子 量 N O COOH N N HN Pipemidic acid (PIP) C 14 H 17 N 5 O 3 分 子 量 N 續 圖 種 喹 諾 酮 類 藥 物 結 構 式 9

24 F O COOH N N N Enrofloxacin (ENR) 恩 氟 喹 林 羧 酸 C 19 H 22 FN 3 O 3 分 子 量 F O COOH HN N N Ciprofloxacin (CIP) C 17 H 18 FN 3 O 3 分 子 量 F O COOH H 2 N HN N Desethylene ciprofloxacin (des-cip) C 15 H 16 FN 3 O 3 分 子 量 續 圖 種 喹 諾 酮 類 藥 物 結 構 式 10

25 F O COOH HN N N F Sarafloxacin (SAR) C 20 H 17 F 2 N 3 O 3 分 子 量 F O COOH N N N F Difloxacin (DIF) C 21 H 19 F 2 N 3 O 3 分 子 量 F O COOH N N N Danofloxacin (DAN) 大 安 氟 喹 林 羧 酸 C 19 H 20 FN 3 O 3 分 子 量 續 圖 種 喹 諾 酮 類 藥 物 結 構 式 11

26 F O COOH N N HN Norfloxacin (NOR) C 16 H 18 FN 3 O 3 分 子 量 F O COOH N N N O N Marbofloxacin (MAR) C 17 H 19 FN 4 O 4 分 子 量 F F O COOH HN N F N Orbifloxacin (ORB) C 19 H 20 F 3 N 3 O 3 分 子 量 續 圖 種 喹 諾 酮 類 藥 物 結 構 式 12

27 F O COOH HN N F N Lomefloxacin (LOM) C 17 H 19 F 2 N 3 O 3 分 子 量 F O COOH N N N HN Enoxacin (ENO) C 15 H 17 FN 4 O 3 分 子 量 F O COOH N N O N Ofloxacin (OFL) C 18 H 20 FN 3 O 4 分 子 量 361,14 續 圖 種 喹 諾 酮 類 藥 物 結 構 式 13

28 第 三 節 喹 諾 酮 類 藥 物 殘 留 問 題 由 於 少 數 畜 牧 業 者 用 藥 觀 念 不 正 確 或 未 遵 守 停 藥 期, 近 年 來 藥 物 殘 留 事 件 層 出 不 窮, 藥 物 殘 留 問 題 已 漸 受 全 世 界 及 國 人 的 重 視 世 界 各 國 對 食 品 中 動 物 用 藥 殘 留 均 訂 定 最 大 殘 留 容 許 量 (maximum residue limits, MRLs) 或 稱 允 許 殘 留 量 (tolerance level) MRLs: 指 允 許 在 食 品 中 藥 物 或 其 它 化 學 物 質 殘 留 的 最 高 量, 是 國 家 公 布 的 強 制 性 標 準, 決 定 了 公 眾 消 費 的 安 全 性 和 動 物 用 藥 的 停 藥 期, 其 重 要 性 是 顯 而 易 見 的, 故 世 界 各 國 對 於 禽 畜 水 產 品 訂 出 嚴 格 的 殘 留 容 許 標 準, 畜 禽 水 產 品 中 所 殘 留 之 藥 物 的 量, 如 低 於 設 定 之 殘 留 容 許 量, 即 表 示 消 費 此 種 畜 禽 水 產 品 是 無 礙 人 體 健 康 且 是 安 全 的 然 而, 其 殘 留 量 如 超 過 法 定 容 許 量 者, 不 但 違 法 且 有 礙 安 全, 且 須 銷 毀 不 得 銷 售 喹 諾 酮 類 藥 物 (QNs) 抗 菌 範 圍 廣 高 效 能 低 毒 性 組 織 穿 透 強 及 價 格 低 廉 等 特 性, 廣 泛 使 用 於 防 治 家 畜 及 水 產 養 殖 業 治 療 細 菌 性 感 染, 然 而 該 類 藥 物 長 期 和 廣 泛 使 用, 衍 生 出 家 畜 禽 水 產 品 藥 物 殘 留 及 產 生 抗 藥 性 問 題, 不 但 對 人 類 健 康 帶 來 極 大 危 害, 也 影 響 相 關 產 業 的 發 展, 因 此 台 灣 歐 盟 日 本 等 國 家 均 對 QNs 藥 物 嚴 格 限 制 使 用 甚 至 禁 止 使 用, 並 對 QNs 藥 物 制 定 出 MRLs, 表 1-1 台 灣 ( 衛 生 署, 2008) 日 本 (Japan, 2008) 歐 盟 (EU 2377/1990, 2008) 之 喹 諾 酮 類 藥 物 MRLs, 組 織 中 QNs 藥 物 殘 留 物 主 要 是 原 形 藥 物, 故 一 般 選 擇 以 原 形 藥 物 作 標 的 殘 留, 多 數 QNs 藥 物 之 代 謝 物 代 謝 很 快, 排 泄 物 中 主 要 是 脫 甲 基 產 物 ENR 的 主 要 代 謝 物 為 CIP(ENR 脫 烷 基 ) 仍 具 有 較 強 之 生 物 活 性, 應 列 入 總 殘 留 量, 故 歐 盟 日 本 的 標 的 殘 留 物 為 ENR 及 CIP 總 合 14

29 表 1-1 台 灣 日 本 歐 盟 之 喹 諾 酮 類 藥 最 大 殘 留 容 許 量 (MRL)(ppm) 藥 物 禽 畜 種 類 台 灣 日 本 歐 盟 NAL 牛 肉 魚 肉 牛 肉 FLU 豬 肉 綿 羊 雞 肉 OXO NOR DAN ENR 與 CIP 之 總 合 牛 肉 豬 肉 雞 肉 魚 肉 牛 肉 雞 肉 牛 肉 雞 肉 豬 肉 牛 奶 牛 肉 雞 肉 豬 肉 牛 奶 OFL 雞 肉 MAR 牛 肉 豬 肉 牛 奶 雞 肉 SAR 火 雞 鮭 魚 牛 肉 雞 肉 ORB 豬 肉 牛 奶 牛 肉 雞 肉 DIF 豬 肉 魚 肉 - : 為 未 訂 容 許 量

30 每 年 有 數 噸 醫 療 用 藥 使 用 於 診 斷 治 療 預 防 疾 病 (Andreu et al,2007), 造 成 醫 藥 及 動 物 用 藥 持 續 釋 入 環 境 中, 透 過 途 徑 為 製 造 過 程 丟 棄 不 要 或 過 期 產 品 及 排 泄 物 很 多 物 質 或 它 們 的 生 物 活 性 代 謝 物 最 後 進 入 泥 土 及 水 域 環 境 ( 有 些 未 代 謝 或 具 有 活 性 的 代 謝 藥 物 進 入 污 水 處 理 場 不 會 消 失, 甚 至 於 抗 菌 活 性 會 被 濃 縮 ), 因 其 具 有 的 物 理 或 化 學 性 質 會 累 積 進 而 危 害 陸 生 生 物 或 水 產 動 物, 在 這 些 有 害 反 應 中 以 細 菌 持 續 產 生 抗 藥 性 最 為 被 關 注, 其 原 因 是 畜 牧 場 及 水 產 養 殖 場 大 規 模 使 用 抗 生 素 及 持 續 增 加 使 用 水 產 養 殖 常 用 投 藥 途 徑 包 括 投 予 含 喹 諾 酮 類 藥 物 (QNs) 飼 料 顆 粒 方 式 或 藥 浴 之 方 式, 但 剩 餘 未 被 魚 吃 的 餌 料 及 含 藥 排 泄 物 與 魚 糞 便 混 合 到 達 底 泥 後 藥 物, 約 有 70-80% 藥 物 最 後 會 進 入 環 境 中, 此 外 養 殖 池 水 中 未 分 解 之 殘 留 藥 物 也 可 能 會 經 由 鰓 部 吸 收 而 增 加 體 內 藥 物 蓄 積 量 長 期 濫 用 QNs 之 養 殖 池 水 與 底 泥 均 會 受 QNs 藥 物 污 染, 除 了 殘 留 在 食 品 也 會 經 由 家 庭 及 醫 院 廢 棄 物 人 及 動 物 排 泄 物 養 殖 池 水 及 底 泥 污 染, 經 由 地 表 水 河 水 污 泥 等 途 徑 進 入 造 成 飲 用 水 殘 留 問 題 ( 圖 1-2) 16

31 圖 1-2 喹 諾 酮 類 藥 物 污 染 環 境 可 能 之 途 徑 (Andreu et al,2007) 17

32 第 四 節 喹 諾 酮 類 藥 物 殘 留 檢 測 一 喹 諾 酮 類 藥 物 殘 留 檢 測 方 法 喹 諾 酮 類 藥 物 (QNs) 殘 留 直 接 危 害 人 體 健 康, 近 年 來 畜 禽 水 產 品 中 藥 物 殘 留 問 題 倍 受 矚 目, 美 國 日 本 台 灣 歐 盟 等 國 家 均 嚴 格 監 控 QNs 殘 留 並 發 展 檢 測 方 法 檢 測 QNs 在 動 物 性 食 品 中 的 殘 留, 必 須 選 擇 特 異 性 強 靈 敏 度 高 高 效 及 快 速 的 檢 驗 方 法 常 使 用 之 QNs 殘 留 檢 測 方 法 有 微 生 物 分 析 法 酵 素 免 疫 分 析 方 法 高 效 毛 細 管 電 泳 法 高 效 液 相 層 析 法 及 液 相 層 析 串 聯 式 質 譜 儀 法 1. 微 生 物 分 析 法 (Microbiological assays) 微 生 物 法 適 用 於 禽 畜 組 織 中 殘 留 的 抗 菌 藥 物 之 初 步 篩 檢, 但 由 於 缺 乏 特 異 性 及 較 難 定 量, 檢 出 抗 生 物 質 陽 性 樣 品 需 再 使 用 其 它 方 法 確 認 及 定 量 Okerman 等 (1988) 使 用 改 良 式 歐 洲 四 個 平 板 法 (four plate test) 檢 測 市 售 肉 中 殘 留 ENR 及 CIP 之 殘 留 Althaus 等 (2008) 採 用 6 種 培 養 基 發 展 檢 測 牛 奶 中 抗 菌 劑 殘 留 之 多 重 分 析 方 法, 其 中 使 用 Escherichia coli CECT 4201(ATCC 11303) 檢 測 QNs 殘 留 2. 酵 素 免 疫 分 析 方 法 (Enzyme-linked immunosorbent assay;elisa) ELISA 方 法 比 微 生 物 分 析 法 靈 敏 簡 便 快 速 不 需 昂 貴 儀 器 設 備, 可 做 為 多 件 檢 體 快 速 篩 檢, 惟 試 劑 套 組 費 用 較 高 且 試 劑 有 效 期 限 約 半 年 由 於 QNs 主 要 結 構 部 分 相 同 或 相 近, 某 一 QN 抗 體 與 其 它 QNs 存 在 一 定 的 交 叉 反 應 (cross-reactivity) 也 無 法 確 認 QNs 殘 留 種 類, 檢 出 陽 性 樣 品 需 再 使 用 其 它 方 法 確 認 及 定 量 Scortichini 等 人 (2008) 使 用 5101FLUM1p 及 5101FLUQG1p 兩 組 ELISA 試 劑 檢 測 蛋 禽 肉 及 飼 料 中 QNs 殘 留,ELISA 試 劑 對 QNs 交 叉 反 應 分 別 為 (FLU:100% CIP:124% NOR:100% ENR:92% ENO 及 OXO:57% MAR: 18

33 16% SAR:4% DIF:1%) 3. 毛 細 管 電 泳 (Capillary electrophoresis;cze) CE 也 屬 於 高 效 液 相 層 析 的 一 種, 主 要 是 利 用 粒 子 會 受 到 電 場 作 用 而 移 動, 利 用 電 位 的 差 異 來 分 離 藥 物 以 毛 細 管 介 質 作 固 定 相, 將 待 測 樣 品 置 於 V 之 電 位 差 作 用 下, 藉 由 樣 品 內 各 物 質 電 荷 質 量 比 不 同 而 產 生 不 同 的 移 動 速 率 CE 具 有 操 作 簡 單 分 析 快 速 分 離 效 率 高 之 優 點, 與 HPLC 方 法 比 較, 進 樣 之 注 射 量 較 少, 儀 器 感 度 較 HPLC 差 Hernadez 等 人 (2000) 使 用 C18 管 柱 以 固 相 萃 取 法 淨 化, 配 合 Capillary zone electrophoresis (CZE) 檢 測 10 種 QNs 藥 物, 在 豬 血 漿 樣 品 偵 測 極 限 為 1.1 到 2.4 ppm Hernadez 等 (2004) 使 用 C18 管 柱 以 固 相 萃 取 法 淨 化, 配 合 CZE 檢 測 雞 肉 中 8 種 QNs 藥 物, 其 中 CIP 及 SAR 波 峰 會 重 疊 (overlapped peak) 無 法 有 效 分 離 4. 高 效 液 相 層 析 法 (HPLC) QNs 具 有 強 的 紫 外 光 吸 收 (UV) 和 螢 光 (FLD) 性 質, 故 分 析 QNs 以 HPLC 最 常 搭 配 檢 測 器 為 UV 或 FLD 18 種 QNs 之 LOD 均 在 10 ng/g 以 下, 能 滿 足 多 數 QNs 檢 測 需 求, 層 析 圖 基 線 (base line) 穩 定, 干 擾 較 UV 少, 靈 敏 度 較 UV 檢 測 法 高 倍 而 由 於 第 一 代 QNs 與 氟 喹 諾 酮 類 抗 菌 劑 (FQNs) 在 紫 外 光 光 譜 或 螢 光 光 譜 上 有 些 差 異, 因 此 很 多 文 獻 將 第 一 代 QNs 與 FQNs 分 開 進 行 檢 測 (Sue et al., 2002) 一 般 FQNs (Pecorelli et al., 2003;Zhao et al., 2007) 採 用 λex( 激 發 波 長 )= 280 ~ 297 nm,λem( 放 射 波 長 )= 450 ~ 510 nm, 其 它 QNs (OXO NAL FLU) 則 採 用 λex= 320 nm,λem= 365 ~ 445 nm,pir 的 螢 光 強 度 較 弱, 多 採 用 UV 280 nm 檢 測 ;FQNs 使 用 280 nm 偵 測,OXO NAL FLU 則 採 用 255 nm 偵 測 19

34 由 於 QNs 為 兩 性 化 合 物, 同 時 具 有 酸 性 基 (COOH 基 ) 及 鹼 性 基 (piperazine), 逆 相 HPLC 方 法 操 作 簡 單, 為 殘 留 QNs 檢 測 主 要 的 分 析 方 法 常 使 用 C18 管 柱 分 析, 早 期 發 展 之 C18 管 柱 固 定 相 表 面 殘 存 大 量 矽 醇 基 呈 游 離 態 與 QNs 結 構 之 -NH 或 -COOH 基 結 合, 造 成 peak 拖 尾 或 滯 留 時 間 不 穩 定 或 過 長 為 了 解 決 上 述 問 題, 最 佳 化 移 動 相 組 成 是 最 方 便 的 方 法 這 些 方 法 包 括 :1. 調 整 有 機 溶 劑 ( 甲 醇 氰 甲 烷 ) 之 比 例, 2. 加 入 三 甲 胺 調 整 ph( 離 子 抑 制 )3. 加 入 離 子 對 試 劑 (ion pair reagon 如 : 1-heptane sulfonic acid 及 sodium dodecyl sulfate ) 目 前 有 許 多 C18 管 柱 在 表 面 結 構 已 改 良 可 用 簡 單 移 動 相 (0.01% 甲 酸 溶 於 水 氰 甲 烷 ) 即 可 達 到 非 常 好 之 分 離 效 果 Turiel 等 人 (2003) 使 用 C18 styrenedivinylbenzene(sdb) C18 cation -exchange SDB-cation -exchange 固 相 萃 取 方 法 檢 測 地 表 水 中 QNs 藥 物 殘 留, 所 使 用 之 移 動 相 為 0.01% 甲 酸 溶 於 水 與 氰 甲 烷, HPLC-UV nm 檢 測 9 種 QNs 藥 物 (ENO NOR CIP DAN ENR CIN OXO FLU NAA) 殘 留 Pecorelli 等 人 (2003) 建 立 飼 料 中 13 種 QNs 藥 物 殘 留 檢 測 方 法, 樣 品 以 0.2% 偏 磷 酸 / 氰 甲 烷 (7:3) ph 2.6 萃 取, 選 用 HPLC UV 278 nm 檢 測 或 FLD 278/446 nm 檢 測 10 種 QNs (PIP rufloxacin ENO OFL NOR CIP DAN ENR DIF CIN) 320/365 nm 檢 測 3 種 QNs (OXO NAL FLU) 5. 液 相 層 析 串 聯 式 質 譜 儀 (Liquid chromatography /tandem mass spectrometry ;LC/MS/MS) LC/MS/MS 選 擇 性 和 靈 敏 度 最 佳, 即 使 滯 留 時 間 相 同 但 質 荷 比 m/z 不 同 亦 可 分 離 HPLC 雖 分 離 效 果 佳, 但 FQNs 有 許 多 結 構 非 常 接 近, 即 使 調 整 至 最 佳 化 分 離 條 件 亦 無 法 用 滯 留 時 間 (retention time;rt) 20

35 分 離, 在 QNs 殘 留 確 認 分 析 方 法 中 LC/MS/MS 是 5 種 分 析 方 法 中 最 理 想 之 方 法 Hermo 等 人 (2006) 建 立 豬 肉 中 QNs 殘 留 的 多 重 分 析 方 法, 比 較 LC/MS 方 法 之 LOQ(quantification limit; 定 量 偵 測 極 限 ) 比 HPLC -UV 方 法 低 倍,LC/MS/MS 方 法 之 LOQ 比 HPLC-UV 方 法 低 35 倍 二 喹 諾 酮 類 藥 物 殘 留 樣 品 前 處 理 動 物 用 藥 殘 留 分 析 的 複 雜 性 主 要 原 因 是 :1. 生 物 樣 品 基 質 的 複 雜 性, 須 去 除 基 質 中 油 脂 蛋 白 質 碳 水 化 合 物 及 有 機 酸 等 物 質,2. 待 測 成 分 的 濃 度 很 低 ( 低 於 百 萬 分 之 一 ) 分 離 和 檢 測 是 設 計 殘 留 分 析 方 法 的 兩 個 主 要 步 驟 Posyniak 等 人 (2001) 以 雞 肉 添 加 FQNs 探 討 用 水 溶 液 - 溶 劑 蛋 白 分 解 酵 素 (protease) 水 解 超 音 波 及 固 相 萃 取 (C8 C18 或 SDB1) 等 步 驟 除 去 雜 質 之 效 應 首 先 用 5% 三 氯 醋 酸 (TCA) 不 同 比 例 5% TCA 及 氰 甲 烷 萃 取 液 試 驗, 水 溶 液 - 溶 劑 萃 取 以 5% TCA: 氰 甲 烷 (8:2) 回 收 率 最 佳, 選 用 5% TCA: 氰 甲 烷 (8:2) 萃 取 再 以 固 相 萃 取 SDB1 淨 化 回 收 率 最 高 1. 萃 取 溶 劑 QNs 殘 留 分 析 方 法 絕 大 多 數 樣 品 使 用 酸 化 或 鹼 化 溶 劑 萃 取 ( 表 1-2), 如 氰 甲 烷 - 氫 氧 化 氨 溶 液 氰 甲 烷 - 偏 磷 酸 溶 液 甲 醇 - 乙 酸 溶 液 乙 醇 - 乙 酸 溶 液 等, 由 於 QNs 與 蛋 白 質 結 合 較 緊 密, 上 述 之 萃 取 溶 劑 對 QNs 俱 有 較 高 的 溶 解 性, 兼 有 良 好 的 組 織 滲 透 性 去 蛋 白 質 和 釋 放 藥 物 的 作 用 ; 萃 取 溶 劑 中 有 機 溶 劑 ( 甲 醇 氰 甲 烷 ) 的 含 量 和 ph 影 響 萃 取 效 率 及 雜 質 的 共 萃 取, 提 高 有 機 溶 劑 比 率 和 酸 度 則 QNs 回 收 率 增 加, 但 同 時 萃 取 雜 質 增 加 ( 李 等, 2002) 21

36 2. 淨 化 方 法 使 用 酸 化 溶 劑 或 鹼 化 溶 劑 萃 取 並 經 適 當 稀 釋 後, 可 直 接 用 固 相 萃 取 管 柱 (SPE) C18 HLB 或 陽 離 子 交 換 ( 如 SCX 苯 磺 酸 基 PRS 丙 磺 酸 基 ) 進 行 純 化 濃 縮 後, 獲 得 較 少 干 擾 之 主 要 分 析 藥 物 之 樣 品 液 供 分 析 Bailac 等 人 (2004) 建 立 HPLC-UV 方 法 檢 測 雞 肉 中 7 種 QNs 殘 留, 採 用 NOR 當 內 標, 比 較 3 種 固 相 萃 取 (HLB MAX SDB-RPS) 及 直 接 萃 取 法 之 最 低 偵 測 極 限 (LOQ) 及 回 收 率,3 種 固 相 萃 取 回 收 率 66 ~ 91%( 除 了 CIP 選 用 MAX 回 收 率 只 有 25%) LOQ 5~ 10 ng/g, 直 接 萃 取 法 回 收 率 42-80% LOQ 10 ~ 30 ng/g ; 使 用 HLB 固 相 萃 取 在 HPLC 層 析 圖 中 DAN 有 不 純 物 共 析 問 題 Mazaruela 等 (2004) 建 立 HPLC-UV 及 HPLC-FLD 方 法 檢 測 牛 奶 中 5 種 FQNs 殘 留, 比 較 2 種 固 相 萃 取 (Strata X Strata Screen A) 回 收 率, Strata X 不 論 萃 取 液 ph 值 改 變 回 收 率 為 %,Strata Screen A 為 混 合 型 疏 水 性 - 陰 離 子 型 固 相 萃 取 ph 值 9.0 回 收 率 最 佳 為 86 ~106% 22

37 表 1-2 喹 諾 酮 類 合 成 抗 菌 劑 殘 留 分 析 方 法 樣 品 種 類 萃 取 淨 化 方 法 分 析 條 件 偵 測 條 件 回 收 率 LODs % μg/kg HPLC: 家 禽 豬 肉 0.3% 偏 磷 酸 : 氰 甲 烷 SPE ENV+ 分 別 以 水 1 % 甲 酸 : 甲 醇 及 正 己 烷 水 清 洗, 使 用 2 %TFA: 氰 甲 烷 (25:75) 沖 堤 雞 肉 二 氯 甲 烷 再 以 1M 氫 氧 化 鈉 萃 取 後 磷 酸 中 和,SPE C18 4%TFA: 氰 甲 烷 (25:75) 沖 堤 雞 肉 二 氯 甲 烷 再 以 1M NaOH 萃 取 磷 酸 中 和, SDB-PRS 4%TFA: 氰 甲 烷 (25:75) 沖 堤 豬 腎 動 物 組 織 豬 腎 蛋 動 物 組 織 蛋 雞 肉 蝦 肉 豬 肉 動 物 組 織 魚 肉 氰 甲 烷 ph 4.0 1M 鹽 酸 1M 鹽 酸 磷 酸 緩 衝 液 ph % 偏 磷 酸 : 氰 甲 烷 (1:10) SDB-RPS 甲 醇 :1M 氨 水 (75:25) 沖 堤 C18 1mM 磷 酸 鉀 : 甲 醇 (1:1) 沖 堤 C18 1 mm 磷 酸 鉀 : 甲 醇 (1:1) 沖 堤 HLB 甲 醇 :10% 氨 水 (19:1) 沖 堤 C18 甲 醇 : 磷 緩 衝 液 (7:3) XDB-C8 (10mM 檸 檬 酸 氰 甲 烷 ph 4.5 ) LC/MS XDB-C8 (20 mm 醋 酸 銨 氰 甲 烷 ) 毛 細 管 電 泳 fused silica capillary 總 長 47cm 50 mm 磷 酸 緩 衝 液 ph 8.4 XDB-C8 (10 mm 檸 檬 酸 氰 甲 烷 ph 4.5 ) C18 0.1% 甲 酸 氰 甲 烷 C 磷 酸 ph 3.5: 甲 醇 (85:15) 沖 堤 C18 0.1M 磷 酸 緩 衝 液 加 三 乙 胺 氰 甲 烷 C % 甲 酸 氰 甲 烷 C18 氰 甲 烷 磷 緩 緩 液 含 SDS UV 250/280 nm MS ESI (+) SIM mode MS QqQ ESI (+) MRM UV nm UV 250/280 nm MS QqQ SRM UV 280 nm UV 280 nm <0.2 參 考 文 獻 Clemente (2006) Hermo (2006) Beltran (2004) Bailac (2004) Toussaint (2005) Gigosos (2000) Gigosos (2003) FLD Zhao (2007) UV FLD Su (2003) 23

38 續 表 1-2 樣 品 種 類 萃 取 淨 化 方 法 分 析 條 件 偵 測 條 件 回 收 率 % 動 物 組 織 5% TCA C18 牛 奶 0.1% 甲 酸 魚 氰 甲 烷 蛋 牛 奶 牛 奶 TFA 沉 澱 蛋 白 質 NH4Cl 緩 衝 液 ph 9 Strata X Screen A 甲 醇 含 4% 磷 酸 沖 堤 Strata X ENV+ MAX 1% TFA: 甲 醇 (25:75) 沖 堤 AQUA TM C18 25 mm 磷 酸 緩 衝 液 氰 甲 烷 LODs μg/kg 參 考 文 獻 FLD Verdon (2005) UV 280 nm FLD 280/440 UV 250/280 FLD MS ESI (+) SIM mode Marazuela (2004) <1 Hermo (2008) 蛋 魚 肉 2% 醋 酸 溶 於 氰 甲 烷 0.1N 氫 氣 化 鈉 0.2 g 氯 化 鈉 HLB 甲 醇 : 氰 甲 烷 (8:2) 沖 堤 HLB 含 1% TFA 之 氰 甲 烷 XTerra MS C18 1% 甲 酸 氰 甲 烷 C18 0.2% 甲 酸 氰 甲 烷 甲 醇 MS QqQ ESI (+) MRM MS QqQ ESI (+) MRM 內 標 : LOM NOR MS QqQ ESI (+) MRM Durden (2007) Samanidou (2008) Oasis HLB(Hydrophilic-Lipophilic Balance):copolymer of N-vinylpyrrolidone and divinylbenzene Oasis MAX: mixed-mode polymeric sorbent with strong anion-exchange quaternary amine group in the surface of the copolymer ( 混 合 型 疏 水 性 - 強 陰 離 子 交 換 ) SDB-RPS : poly(styrene-divinylbenzene) copolymer sorbent that plays slight cation- exchange interation due to sulphonic group ( 陽 離 子 交 換 ) Strata X: modified strene-divinylbenzene Strata Screen A : mixed- anion-exchange/c8 sorbent 24

39 第 五 節 喹 諾 酮 類 藥 物 於 水 產 動 物 之 藥 物 動 力 學 研 究 一 水 產 養 殖 投 藥 途 徑 房 等 人 (2004) 及 Samuelsen 等 人 (2006) 比 較 藥 浴 法 肌 肉 注 射 法 口 服 法 血 管 注 射 法 等 不 同 投 藥 途 徑 在 水 產 動 物 藥 物 動 力 學 研 究 中 的 優 缺 點 給 藥 途 徑 不 同 會 影 響 藥 物 的 吸 收 速 度 吸 收 量 血 管 注 射 法 之 給 藥 途 徑 藥 物 直 接 通 過 血 液 循 環 進 入 分 佈 相, 沒 有 吸 收 過 程 而 以 藥 浴 法 肌 肉 注 射 法 及 口 服 法 等 方 式 給 藥, 藥 物 需 通 過 吸 收 過 程 才 能 進 入 血 液 循 環, 有 些 通 過 胃 腸 道 吸 收 的 藥 物 會 產 生 首 途 效 應 (first-pass effect) 1. 藥 浴 法 (bath treatment) 藥 浴 係 將 指 定 之 藥 品, 添 加 於 養 殖 池 或 容 器 內 之 水 中 以 浸 泡 投 藥, 藥 浴 適 於 容 易 得 弧 菌 病 鰓 病 及 寄 生 蟲 病 的 稚 魚 值 得 注 意 : 喹 諾 酮 類 藥 物 會 與 海 水 中 陽 離 子 結 合 因 而 降 低 魚 體 吸 收 速 度 不 同 藥 物 即 使 藥 浴 濃 度 相 同 但 在 不 同 組 織 中 的 濃 度 中 的 濃 度 相 差 很 大, 藥 浴 時 需 考 慮 於 水 產 動 物 在 不 同 組 織 對 藥 物 的 吸 收 率 及 在 體 內 的 殘 留 情 況 2. 肌 肉 注 射 法 (intramuscular injection) 是 通 過 毛 細 血 管 壁 被 吸 收, 具 有 給 藥 量 準 確 吸 收 迅 速 療 效 可 靠 等 特 點 此 外, 藥 物 的 水 溶 性 血 液 循 環 速 度 及 注 射 部 位 毛 細 血 管 分 佈 量 均 會 影 響 藥 物 吸 收 速 率 Nouws 等 人 (1988) 以 鯉 魚 及 虹 鳟 進 行 肌 肉 注 射 CIP 劑 量 15 mg/kg,1 小 時 血 中 濃 度 達 到 最 高, 分 別 為 3.49 和 2.37 μg/ml; 房 等 人 (2003) 以 對 蝦 進 行 肌 肉 注 射 NOR 劑 量 10 mg/kg,2 分 鐘 血 中 濃 度 達 到 最 高 25

40 3. 口 服 法 (oral administration) 經 口 係 將 指 定 之 藥 品, 添 加 混 合 或 浸 潤 於 水 產 飼 料 中 或 以 其 他 方 式 經 口 投 藥 口 服 法 分 為 投 餵 法 與 口 灌 法, 純 藥 液 給 藥 與 藥 餌 給 藥 之 藥 物 動 力 學 並 不 相 同, 甚 至 藥 物 使 用 不 同 的 載 體 (carrier) 進 行 給 藥 其 藥 物 動 力 學 也 不 相 同 藥 物 經 口 服 後 通 過 吸 收 進 入 淋 巴 和 血 液, 有 些 藥 物 成 分 會 在 消 化 道 被 破 壞, 有 些 不 能 被 消 化 道 吸 收, 有 些 還 可 能 會 與 飼 料 中 的 某 些 成 分 起 拮 抗 作 用, 都 會 影 響 藥 物 的 療 效 楊 等 人 (2003) 比 較 不 同 口 服 方 式 CIP 的 生 物 利 用 率, 口 服 CIP 水 溶 液 的 生 物 利 用 率 為 %, 口 服 CIP 飼 料 糊 的 生 物 利 用 率 為 6.22 % 投 餵 法 ( 飼 料 添 加 劑 ) 給 藥 方 式 最 貼 近 現 場 水 產 動 物 治 療 方 式, 投 餵 法 給 藥 之 藥 物 動 力 學 最 貼 近 體 內 吸 收 分 佈 代 謝 和 排 泄 過 程 ; 當 水 產 動 物 患 病, 食 慾 下 降 甚 至 不 攝 食 時, 口 服 法 就 不 能 實 施, 且 該 法 不 可 避 免 在 水 中 有 部 分 的 溶 失 口 灌 法 是 強 制 性 口 服 法, 其 操 作 方 法 為 使 用 麻 醉 劑 (MS-222 benzocaine 等 ) 將 魚 麻 醉 ( 避 免 傷 害 魚 ), 用 塑 膠 導 管 將 調 製 好 的 藥 液 或 藥 餌 灌 入 魚 的 胃 或 腸 道, 可 以 確 保 定 時 給 藥 及 給 藥 量 口 灌 法 的 缺 點 為 :1. 有 時 會 出 現 藥 物 回 吐 現 象,2. 使 用 麻 醉 劑 可 能 會 降 低 藥 物 的 吸 收, 影 響 藥 物 動 力 學 4. 血 管 注 射 法 血 管 注 射 法 是 研 究 藥 物 動 力 學 最 多 的 方 法, 常 用 於 評 價 一 種 藥 物 劑 型 的 生 物 利 用 率 水 產 動 物 血 管 注 射 法 包 括 動 脈 注 射 (intraarterial administration) 靜 脈 注 射 (intra-venous administration) 血 管 內 給 藥 (intra-vascular administration) 血 管 注 射 法 較 費 時 適 用 於 高 單 價 之 魚 種 26

41 二 喹 諾 酮 類 抗 菌 劑 的 施 用 方 式 由 於 抗 藥 或 耐 藥 性 微 生 物 的 廣 泛 性 出 現, 對 環 境 產 生 衝 擊 以 及 在 水 產 養 殖 生 物 體 內 藥 物 殘 留 等, 使 得 施 用 FQNs 藥 物 處 理 養 殖 生 物 疾 病 相 關 問 題 日 漸 不 被 鼓 勵 或 禁 止 美 國 於 2005 年 撤 銷 ENR 治 療 家 禽 疾 病 使 用 執 照, 農 委 會 於 民 94 國 年 公 告 停 止 製 造 及 輸 入 口 服 液 劑 及 飲 水 散 劑 劑 型 之 FQNs 類 動 物 藥 品 的 措 施,ENR 則 僅 准 以 注 射 方 式 治 療 對 微 生 物 引 起 的 感 染 ( 農 委 會 動 植 物 防 疫 檢 疫 局,2006) 為 防 止 藥 物 的 濫 用 及 加 強 管 理, 農 委 會 於 民 國 85 年 即 公 告 喹 諾 酮 類 抗 菌 劑 為 毒 劇 藥 品 品 目 ( 農 業 委 員 會,1996) 之 一, 另 依 據 農 委 會 公 告 之 動 物 用 藥 品 使 用 手 冊 ( 農 委 會 動 植 物 防 疫 檢 疫 局,2006) 規 定 可 使 用 於 動 物 之 喹 諾 酮 類 抗 菌 劑 品 項 DAN ENR FLU NAL OFL OXO; 水 產 動 物 用 藥 使 用 規 範 只 有 允 許 使 用 包 含 氟 滅 菌 及 歐 索 林 酸 等 15 種 藥 物, 其 使 用 規 範 列 於 表 1-3 及 表 1-4, 使 用 對 象 用 途 用 法 用 量 停 藥 期 及 使 用 上 應 注 意 事 項 1. 氟 滅 菌 (flumequine) 使 用 規 範 性 狀 : 白 色 微 細 結 晶 性 粉 末, 無 臭 而 帶 有 微 苦, 不 溶 於 水, 溶 於 氯 仿 及 乙 醇 作 用 : 對 於 革 蘭 陰 性 菌 具 有 抗 菌 作 用 魚 病 上 主 要 用 於 巴 斯 德 桿 菌 運 動 性 產 氣 單 胞 菌 愛 德 華 氏 菌 感 染 之 治 療 注 意 事 項 : 本 劑 不 可 連 續 使 用 7 日 以 上 表 1-3 氟 滅 菌 使 用 規 範 對 象 水 產 動 物 投 藥 途 徑 劑 量 或 濃 度 及 用 法 用 途 吳 郭 魚 經 口 20mg/kg/ 日, 連 續 使 用 3~5 日 鰻 魚 經 口 20mg/kg/ 日, 連 續 投 藥 3~5 日 停 藥 期 ( 日 ) 治 療 對 本 劑 具 有 感 受 性 巴 斯 8 德 桿 菌 或 親 水 性 產 氣 單 胞 菌 群 或 螢 光 假 單 胞 菌 或 愛 德 華 氏 菌 之 感 染 治 療 對 本 劑 具 有 感 受 性 親 水 性 產 氣 單 胞 菌 群 或 螢 光 假 單 胞 菌 或 愛 德 華 氏 菌 之 感 染 20 27

42 2. 歐 索 磷 酸 (oxolinic acid) 使 用 規 範 性 狀 : 白 色 至 帶 白 色 柱 狀 結 晶 或 結 晶 性 粉 末, 無 味, 無 臭 易 溶 於 蟻 酸, 可 溶 於 鹼 性 水, 幾 乎 不 溶 於 水 及 其 他 有 機 溶 劑 作 用 : 對 革 蘭 陰 性 菌 有 抗 菌 作 用 魚 病 上 主 要 用 於 運 動 性 產 氣 單 胞 菌 愛 德 華 氏 菌 弧 菌 或 巴 斯 德 桿 菌 感 染 之 治 療 注 意 事 項 : 本 劑 不 可 連 續 使 用 7 日 以 上 表 1-4 歐 索 磷 酸 使 用 規 範 對 象 水 產 動 物 投 藥 途 徑 劑 量 或 濃 度 及 用 法 用 途 停 藥 期 ( 日 ) 吳 郭 魚 經 口 30mg/kg/ 日, 連 續 治 療 對 本 劑 具 有 感 受 性 親 水 16 投 藥 3~5 日 性 產 氣 單 胞 菌 群 或 螢 光 假 單 胞 菌 或 愛 德 華 氏 菌 或 巴 斯 德 桿 菌 之 感 染 鯉 魚 經 口 30mg/kg/ 日, 連 續 治 療 對 本 劑 具 有 感 受 性 親 水 16 投 藥 3~5 日 性 產 氣 單 胞 菌 群 或 螢 光 假 單 胞 菌 或 愛 德 華 氏 菌 之 感 染 鯽 魚 經 口 30mg/kg/ 日, 連 續 治 療 對 本 劑 具 有 感 受 性 親 水 16 投 藥 3~5 日 性 產 氣 單 胞 菌 群 或 螢 光 假 單 胞 菌 或 愛 德 華 氏 菌 之 感 染 草 魚 經 口 30mg/kg/ 日, 連 續 治 療 對 本 劑 具 有 感 受 性 親 水 16 投 藥 3~5 日 性 產 氣 單 胞 菌 群 或 螢 光 假 單 胞 菌 或 愛 德 華 氏 菌 之 感 染 大 頭 鰱 經 口 30mg/kg/ 日, 連 續 治 療 對 本 劑 具 有 感 受 性 親 水 16 投 藥 3~5 日 性 產 氣 單 胞 菌 群 或 螢 光 假 單 胞 菌 或 愛 德 華 氏 菌 之 感 染 鰻 魚 經 口 20mg/kg/ 日, 連 續 治 療 對 本 劑 具 有 感 受 性 親 水 25 投 藥 3~5 日 性 產 氣 單 胞 菌 群 或 螢 光 假 單 藥 浴 5 ppm, 連 續 藥 浴 3~胞 菌 或 鰻 敗 血 症 假 單 胞 菌 或 5 日 愛 德 華 氏 菌 之 感 染 淡 水 鲶 經 口 30mg/kg/ 日, 連 續 治 療 對 本 劑 具 有 感 受 性 親 水 16 投 藥 3~5 日 性 產 氣 單 胞 菌 群 或 螢 光 假 單 胞 菌 或 愛 德 華 氏 菌 之 感 染 虹 鱒 經 口 20mg/kg/ 日, 連 續 治 療 對 本 劑 具 有 感 受 性 鮭 屬 21 投 藥 3~5 日 產 氣 單 胞 菌 或 弧 菌 之 感 染 香 魚 經 口 20mg/kg/ 日, 連 續 治 療 對 本 劑 具 有 感 受 性 親 水 14 投 藥 3~5 日 性 產 氣 單 胞 菌 群 或 螢 光 假 單 藥 浴 10 ppm, 連 續 藥 浴 3 胞 菌 或 弧 菌 之 感 染 ~5 日 虱 目 魚 經 口 20mg/kg/ 日, 連 續 治 療 對 本 劑 具 有 感 受 性 弧 菌 14 投 藥 3~5 日 之 感 染 草 蝦 經 口 50mg/kg/ 日, 連 續 治 療 對 本 劑 具 有 感 受 性 親 水 30 投 藥 3~5 日 性 產 氣 單 胞 菌 群 或 假 單 胞 菌 或 弧 菌 之 感 染 斑 節 蝦 經 口 50mg/kg/ 日, 連 續 治 療 對 本 劑 具 有 感 受 性 親 水 30 投 藥 3~5 日 性 產 氣 單 胞 菌 群 或 假 單 胞 菌 或 弧 菌 之 感 染 28

43 續 表 1-4 對 象 水 產 動 物 投 藥 途 徑 劑 量 或 濃 度 及 用 法 用 途 停 藥 期 ( 日 ) 經 口 50mg/kg/ 日, 連 續 治 療 對 本 劑 具 有 感 受 性 親 水 30 長 腳 大 蝦 投 藥 3~5 日 性 產 氣 單 胞 菌 群 或 假 單 胞 菌 或 弧 菌 之 感 染 蛙 經 口 30mg/kg/ 日, 連 續 治 療 對 本 劑 具 有 感 受 性 親 水 16 投 藥 3~5 日 性 產 氣 單 胞 菌 群 或 螢 光 假 單 胞 菌 或 弧 菌 或 產 黃 色 素 菌 屬 之 感 染 鱉 經 口 30mg/kg/ 日, 連 續 治 療 對 本 劑 具 有 感 受 性 親 水 16 投 藥 3~5 日 性 產 氣 單 胞 菌 群 或 螢 光 假 單 胞 菌 或 弧 菌 之 感 染 三 水 產 動 物 藥 物 動 力 學 及 分 析 模 式 藥 物 動 力 學 (pharmacokinetics) 或 稱 藥 物 動 態 學, 藥 物 在 經 由 不 同 方 式 投 予 動 物 後, 其 血 中 或 體 內 藥 物 濃 度 的 變 化, 會 因 藥 物 在 進 入 體 內 後 與 血 漿 蛋 白 結 合 能 力 的 不 同 與 動 物 種 類 而 有 所 差 異, 運 用 數 學 原 理 和 方 法 闡 述 藥 物 在 生 物 體 內 量 的 變 化 規 律 ( 吸 收 分 佈 代 謝 與 排 泄 的 情 形 ) 藥 物 動 力 學 研 究 在 水 產 動 物 疾 病 防 治 提 供 實 用 價 值, 可 作 為 制 定 用 藥 方 案 確 定 給 藥 劑 量 用 藥 週 期 與 停 藥 期 提 供 科 學 依 據 目 前 研 究 水 產 動 物 藥 物 動 力 學 模 式 為 房 室 模 式, 房 室 模 式 是 把 藥 物 在 體 內 的 藥 物 動 力 學 狀 況 按 轉 換 速 度 不 同 分 成 若 干 個 分 室 (compartment), 但 不 具 有 解 剖 生 理 學 之 意 義 房 室 模 式 可 再 被 分 為 單 室 模 式 (one- compartment model) 二 室 模 式 (two- compartment model) 與 多 室 模 式 (multi- compartment model) 單 室 模 式 中 血 漿 內 藥 物 排 除 曲 線 為 一 級 指 數 排 除 速 率 排 除, 將 全 身 視 為 同 一 個 房 室, 藥 物 能 快 速 分 佈 所 有 組 織 內 並 達 到 平 衡 二 室 模 式 其 藥 物 曲 線 為 雙 指 數 衰 減, 藥 物 分 別 分 佈 進 入 中 央 室 (central compartment) 與 周 邊 室 (peripheral compartment) 兩 個 房 室, 中 央 室 ( 第 一 室 ) 包 括 血 液 細 胞 外 液 肝 與 腎 等 高 血 流 灌 注 組 29

44 織, 藥 物 在 中 央 室 分 佈 快 速 均 勻 ; 周 邊 室 又 稱 第 二 室, 代 表 藥 物 平 衡 較 慢 的 組 織 ( 肌 肉 與 脂 肪 ), 藥 物 在 體 內 出 現 分 佈 相 (distribution, phase Ι,α phase) 與 排 除 相 (elimination, phaseⅡ,β phase), 可 視 為 二 個 一 級 指 數 速 率 過 程 的 總 和 ( 呂 等,1995) 非 室 性 模 式 (noncompartment) 是 假 設 無 數 個 周 邊 腔 室 和 中 央 腔 室 所 組 成, 藥 物 可 在 中 央 腔 室 和 周 邊 腔 室 以 不 同 的 速 率 來 回 移 動 非 室 室 模 式 分 析 較 為 簡 便, 不 需 要 進 行 隔 室 設 定, 同 樣 能 描 述 藥 物 在 生 物 體 內 吸 收 分 佈 消 除 等, 但 因 能 提 供 藥 物 動 力 學 參 數 較 少, 可 用 來 評 估 :1. 生 體 可 利 用 率,2. 清 除 率,3. 擬 似 分 布 體 積,4. 藥 物 半 衰 期,5. 藥 物 與 代 謝 物 平 均 穩 定 濃 度 及 所 需 時 間, 故 在 目 前 水 產 動 物 毒 理 學 中 應 用 較 少 ( 房 等,2004) 此 外 還 有 生 理 藥 物 動 力 學 模 式 (physiologically based pharmacokinetics, PBPK), 也 稱 血 流 或 灌 流 模 式, 是 最 理 想 的 藥 物 動 力 學 模 式, 可 以 完 全 表 達 最 真 實 的 藥 物 代 謝 情 況, 但 需 要 關 於 生 物 體 完 整 之 生 理 學 資 料, 如 組 織 容 積 藥 物 在 血 液 和 組 織 的 分 配 係 數 和 擴 散 係 數 等 PBPK 模 式 最 大 優 點 是 可 提 供 動 物 類 比 法 的 可 能 性, 可 將 既 有 某 一 藥 物 之 模 式 透 過 合 理 的 參 數 設 定 推 論 至 其 它 條 件 或 其 它 種 類 動 物 ( 房 等,2004) 四 一 般 常 用 藥 物 動 力 學 參 數 A: 吸 收 相 的 零 時 截 距 B: 排 除 相 的 零 時 截 距 分 室 1: 中 央 室 分 室 2: 周 邊 室 或 組 織 室 K01: 藥 物 在 中 央 室 之 吸 收 速 率 常 數 K10: 藥 物 在 中 央 室 之 排 除 速 率 常 數 K12: 藥 物 從 中 央 室 向 周 邊 室 移 動 之 速 率 常 數 30

45 K21: 藥 物 從 周 邊 室 向 中 央 室 移 動 之 速 率 常 數 α: 藥 物 之 分 佈 速 率 常 數 β: 藥 物 之 末 端 排 除 速 率 常 數 C max (maximum concentration): 血 中 藥 物 最 高 濃 度 T max (time to maximum concentration): 達 血 中 藥 物 最 高 濃 度 之 時 間 t 1/2α (distribution half life): 藥 物 分 佈 半 衰 期 t 1/2α = 0.693/α t 1/2β (elimination half life): 藥 物 排 除 半 衰 期 t 1/2β =0.693/β AUC (aera under curve): 血 中 藥 物 濃 度 對 時 間 曲 線 下 面 積 Cl tot (total body clearance): 整 體 藥 物 清 除 率 ( 生 物 體 消 除 器 官 在 單 位 時 間 內 清 除 藥 物 的 血 漿 容 積 ) V dss (volume of distribution): 體 內 藥 物 分 佈 達 穩 定 狀 態 之 分 佈 體 積 MRT (mean residence time) 平 均 滯 留 時 間 : 所 有 藥 物 分 子 在 體 內 滯 留 之 平 均 時 間 Fabs 絕 對 可 用 率 ( absolute availability): Fabs %= ( AUCoral / AUC i.v x t 1/2 i.v / t 1/2 oral ) 100 五 治 療 策 略 治 療 策 略 的 擬 定 著 重 於 發 揮 最 大 的 藥 效 及 產 生 抗 藥 性 的 風 險 最 低, 選 擇 適 當 投 藥 方 式 及 施 用 正 確 的 劑 量 重 要 參 考 依 據 是 藥 物 動 力 學 的 研 究 結 合 敏 感 性 試 驗 (susceptibility) Shojaee 等 (2000) 研 究 使 用 抗 菌 劑 治 療 動 物 之 最 大 效 應 之 治 療 策 略 為 AUIC 值 ( AUC/MIC ) 需 大 於 100 以 及 Cmax/ MIC 值 需 大 於 8 細 菌 敏 感 性 試 驗 主 要 是 檢 測 最 低 抑 菌 濃 度 (minimum inhibitory concentration;mic),dalsgaad 等 人 (1991) 分 離 最 容 易 感 染 魚 隻 的 菌 株 並 檢 測 ENR 之 MIC 值 μg/ml 鳟 魚 紅 嘴 病 耶 氏 桿 菌 (Yersinia 31

46 ruckeri) 0.032μg/mL 鰻 弧 菌 (Vibrio anguillarum) 0.012μg/mL 鲑 產 氣 單 胞 器 菌 (Aeromonas salmonicida ), 即 使 對 最 不 敏 感 的 鏈 球 菌 株 (Streptococcus spp.) 其 MIC 值 也 在 μg/ml 六 影 響 水 產 動 物 藥 物 動 力 學 的 因 素 許 多 因 素 會 影 響 藥 物 在 動 物 體 內 之 動 力 學, 包 括 種 屬 差 異 性 別 健 康 狀 況 溫 度 鹽 度 給 藥 途 徑 等 都 會 產 生 不 同 的 藥 物 動 力 學 分 佈 1. 種 屬 差 異 Barron 等 人 (1988) 認 為 不 同 種 類 水 產 動 物 之 間 藥 物 動 力 學 參 數 的 差 異 可 能 是 解 剖 學 上 的 體 積 差 異 藥 物 與 血 漿 蛋 白 及 組 織 結 合 的 差 異 所 致 Hansen 等 人 (2000) 同 時 以 靜 脈 注 射 口 服 與 藥 浴 10 mg/kg BW 之 FLU 發 現 鱈 魚 (Gadus morhua) 與 梳 隆 頭 魚 (Ctenolabrus rupestris) 之 生 物 可 利 用 率 分 別 為 65% 41% 楊 等 (2003) 列 出 CIP 在 不 同 動 物 之 t 1/2β 消 除 半 衰 期 ( 鯉 魚 :16.47 h 中 華 絨 毛 蟹 :40.34 h 鼠 :3.30 h 兔 1.63 h 狗 : 2.56 h 豬 :3.15 h 馬 :2.63 h 牛 :2.44 h 山 羊 :1.46 h 綿 羊 :1.20 h 雞 :9.01 h ), 該 藥 物 在 不 同 動 物 體 內 消 除 半 衰 期 的 差 異 的 原 因 可 能 是 : 不 同 動 物 對 藥 物 進 行 排 泄 的 機 制 不 同, 如 中 華 絨 毛 蟹 是 無 脊 椎 動 物, 主 要 是 通 過 觸 角 腺 和 肝 胰 腺 對 藥 物 進 行 降 解 或 排 泄, 而 魚 類 是 通 過 腎 臟 和 呼 吸 器 官 ( 鰓 鰓 上 腺 肺 等 ) 進 行 擴 散 消 除, 哺 乳 動 物 還 可 通 過 腎 臟 的 主 動 運 輸 予 以 消 除 經 濟 水 產 養 殖 動 物 有 蝦 類 ( 對 蝦 斑 節 蝦 ) 蟹 類 ( 中 華 絨 毛 蟹 ) 魚 類 ( 鯉 科 魚 鱸 形 目 鯛 科 等 ) 以 及 爬 行 類 ( 鱉 ), 不 可 貿 然 將 某 一 種 藥 物 在 一 種 水 產 動 物 的 藥 物 動 力 學 結 果 應 用 於 不 同 種 水 產 動 物 2. 性 別 性 別 差 異 對 藥 物 動 力 學 影 響 的 研 究 較 少 Poher 等 人 (1998) 研 究 鰈 魚 32

47 (Scophthalmus americanus) 單 劑 量 口 服 OXO 的 藥 物 動 力 學 時 發 現 性 別 對 OXO 藥 物 動 力 學 過 程 沒 有 影 響 3. 健 康 狀 況 研 究 水 產 動 物 的 藥 物 動 力 學, 絕 大 多 數 是 選 用 健 康 活 潑 的 動 物 進 行, 然 而 在 水 產 動 物 用 藥 施 用 對 象 多 為 染 病 的 個 體, 理 論 上 研 究 感 染 疾 病 的 生 物 的 藥 物 動 力 學 最 為 真 實, 但 實 際 操 作 上 較 困 難 Uno(1996) 研 究 健 康 的 香 魚 及 感 染 弧 菌 的 香 魚 之 羥 四 環 素 (OTC) 藥 物 動 力 和 生 物 利 用 率, 兩 組 魚 的 消 除 半 衰 期 相 近, 但 生 物 利 用 有 明 顯 差 別, 可 能 是 健 康 狀 況 較 差 時 影 響 了 藥 物 的 分 佈 與 血 漿 蛋 白 的 結 合 率 及 代 謝 藥 物 之 酵 素 的 活 性 4. 溫 度 水 溫 在 水 產 動 物 是 影 響 藥 物 動 力 學 的 重 要 因 素, 由 於 魚 體 會 隨 著 環 境 溫 度 變 化 而 改 變 體 溫, 水 溫 低 水 產 動 物 體 內 酵 素 活 性 較 低, 藥 物 需 要 更 長 的 時 間 來 排 除 虹 鳟 透 過 飼 料 投 予 10 mg/kg. BW 之 ENR 後 (Lucchetti et al., 2004) 在 12~13.25 的 水 溫 下, 經 過 日 ( 每 日 水 均 溫 日 數 ), 可 食 部 位 殘 留 ENR 濃 度 仍 達 170 μg/kg, 仍 高 於 EU 最 高 容 許 量 100 μg/kg, 因 此 Lucchetti 建 議 要 將 停 藥 期 延 長, 最 好 可 到 日 以 上 5. 鹽 度 鹽 度 對 藥 動 學 的 影 響 在 不 同 的 水 產 動 物 中 結 果 不 同 房 等 人 (2006) 研 究 鹽 度 1 和 15 下 進 行 南 美 白 對 蝦 肌 肉 注 射 NOR 劑 量 10 mg/kg BW 藥 物 動 力 學 研 究, 消 除 半 衰 期 分 別 為 4.21 h 和 1.14 h Ishida (1992) 研 究 海 水 虹 鳟 和 淡 水 虹 鳟 口 服 OXO 40 mg/kg BW, 在 24 小 時 後 OXO 在 海 水 虹 鳟 的 消 除 速 率 明 顯 大 於 淡 水 虹 鳟 七 受 試 藥 物 目 前 研 究 喹 諾 酮 類 藥 物 於 水 產 動 物 之 藥 物 動 力 學 有 OXO( 梁 33

48 等,2006;Ishida, 1992; Samuelsen et al., 2000) FLU (Plakas et al., 2000) ENR(Bowser et al., 1992 ; Intorre et al., 2000; Lucchetti et al., 2004; Stoffregen et al., 1997 ;Fang et al., 2007 ) CIP(Guo et al., 2005; 楊 等, 2003) SAR(Martinsen et al., 1995) DIF(Ding et al 2006) NOR ( 房 等, 2003; 房 等, 2006; Wang et al., 2008 ) 等 藥 物 梁 等 人 (2006) 研 究 單 次 血 管 注 射 10 mg/kg BW 之 OXO FLU, 在 鰻 魚 (Muanesox cinereus) 體 內 代 謝 過 程 為 一 級 代 謝 二 室 模 型, 兩 種 藥 物 在 鰻 魚 體 內 都 有 很 強 的 首 途 效 應, 易 在 胆 汁 中 累 積 Martinsen 等 人 (1955) 同 時 比 較 四 種 QNs 包 含 OXO FLU NER SAR 單 一 劑 量 各 自 投 予 大 西 洋 鮭 (Atlantic salmon) 後 之 變 化, 在 10 的 飼 養 環 境 下, 四 種 藥 物 的 生 物 利 用 率 分 別 為 與 2.2% 表 示 在 大 西 洋 鮭 體 內 FLU 與 NER 藥 物 動 力 學 分 佈 比 OXO 或 SAR 藥 物 好 Intorre 等 人 (2000) 研 究 鱸 魚 (Dicentrarchus labrax)enr 之 藥 物 動 力 學, 比 較 口 服 5 mg/kg b.w 及 藥 浴 (5 10 或 50 ppm 進 行 4 8 小 時 ), 研 究 顯 示 口 服 吸 收 較 慢 (C max =1.39 ± 0.67 μg/ml 在 8 小 時 ) 且 消 除 也 較 慢 (t 1/ 2 為 25 小 時 ),CIP(ENR 主 要 代 謝 物 ) 在 肝 臟 中 常 檢 測 到, 在 血 清 中 偶 而 會 檢 出 但 不 會 在 肌 肉 中 出 現, 所 以 ENR 在 鱸 魚 體 內 代 謝 成 CIP 的 轉 換 程 度 較 低 Wu 等 人 (2006) Tang 等 人 (2006) 均 利 用 肌 肉 注 射 給 予 中 華 絨 毛 蟹 ENR, 前 者 給 予 10 或 20 mg/kg BW, 後 者 劑 量 為 5 mg/kg b.w, 兩 者 均 可 發 現 ENR 及 其 代 謝 物 (CIP) 在 鰓 肌 肉 肝 胰 腺 與 性 腺 各 組 織 中 殘 留, 血 淋 巴 液 中 ENR 之 代 謝 屬 於 二 室 開 放 模 式, 組 織 中 藥 物 分 佈 均 以 肝 胰 腺 之 含 量 最 高, 然 而 Wu 等 人 (2006) 認 為 雖 然 CIP 可 在 所 有 組 織 中 被 檢 測 出, 但 因 其 濃 度 甚 低, 無 法 單 室 或 二 室 模 式 解 釋 血 淋 巴 液 中 藥 物 動 力 學 分 佈 34

49 第 六 節 吳 郭 魚 之 簡 介 吳 郭 魚 (Tilapia) 原 產 於 非 洲, 全 世 界 共 有 100 多 種 吳 振 輝 及 郭 啟 彰 兩 位 先 生 於 1946 年 從 新 加 坡 引 進 俗 稱 土 種 吳 郭 魚 (Oreochromis mossambica), 又 稱 南 洋 鯽 仔 黑 鯽 仔 在 台 灣 為 了 紀 念 兩 位 先 生 引 進 的 功 勞, 特 別 取 其 姓 氏 來 命 名 為 吳 郭 魚 ; 在 中 國 大 陸 其 中 文 名 羅 非 魚 ( 源 自 其 原 產 地 尼 羅 河 非 洲 ); 在 香 港 因 形 狀 和 肉 質 像 鯽 魚 而 叫 非 洲 鯽 吳 郭 魚 由 於 它 具 有 生 長 快 繁 殖 快 食 性 雜 適 應 性 強 等 特 點, 現 在 是 世 界 水 產 業 的 重 點 研 究 培 養 的 淡 水 養 殖 魚 類, 且 被 譽 為 未 來 動 物 性 蛋 白 質 的 主 要 來 源 之 一 台 灣 目 前 主 要 是 莫 三 鼻 口 孵 魚 雌 魚 (Oreochromis mossambicus) 尼 羅 口 孵 魚 雄 魚 (Oreochromis niloticus) 兩 種 魚 的 雜 交 種, 改 良 種 吳 郭 魚 俗 稱 福 壽 魚, 當 初 所 引 進 的 吳 郭 魚 目 前 已 被 淘 汰 台 灣 目 前 主 要 的 養 殖 地 區 分 布 在 嘉 南 平 原 一 帶, 以 2001 年 為 例, 台 南 縣 生 產 超 過 24,000 噸 的 吳 郭 魚, 創 造 超 過 7 億 的 產 值, 位 居 第 二 的 嘉 義 地 區 也 有 18,000 噸, 超 過 4 億 的 產 值, 佔 了 台 灣 吳 郭 魚 產 量 ㄧ 半 以 上 生 產 量 從 1953 年 的 6,301 公 噸 逐 年 增 加, 尤 其 是 1973 年 到 1982 年 呈 現 快 速 上 升 的 趨 勢,1993 年 的 57,570 公 噸 達 到 一 個 高 峰 後 便 開 始 走 下 坡 (1973 年 到 1982 年 生 產 過 剩, 魚 價 暴 跌, 對 吳 郭 魚 養 殖 業 者 造 成 衝 擊 ), 至 2000 年 為 50,000 公 噸, 年 間 穩 定 成 長, 約 有 超 過 8 萬 公 噸 的 產 量 ( 農 委 會 漁 業 署 - 漁 業 統 計 民 國 年 報 ) 近 年 來, 吳 郭 魚 漸 漸 受 到 消 費 者 的 青 睞, 市 場 接 受 度 也 逐 漸 增 加, 台 灣 吳 郭 魚 目 前 以 外 銷 為 主, 在 產 業 界 的 努 力 之 下, 美 國 歐 洲 沙 烏 地 阿 拉 伯 韓 國 加 拿 大 及 日 本 等 國 外 市 場 陸 續 被 開 發 建 立, 特 別 是 美 國 市 場, 開 創 出 吳 郭 魚 另 一 片 天 空 從 民 國 六 十 年 以 後, 價 格 皆 穩 定 地 成 長, 在 2000 年 時, 我 國 輸 歐 盟 水 產 品 被 驗 出 氯 黴 素 及 硝 基 夫 喃 代 謝 物 35

50 殘 留, 暫 停 出 口 至 歐 洲 國 家, 產 量 不 進 反 退, 所 幸 經 過 各 界 努 力, 挽 回 頹 勢 近 年 來 由 於 中 國 大 陸 越 南 等 各 國 開 始 投 入 吳 郭 魚 養 殖, 競 爭 激 烈 波 動 較 大, 如 何 維 持 外 銷 競 爭 優 勢 價 格 已 漸 趨 穩 定, 則 有 賴 於 漁 業 署 漁 民 外 銷 漁 產 加 工 廠 的 努 力 表 1-5 吳 郭 魚 特 性 中 文 名 英 文 名 俗 名 分 類 體 態 食 性 習 性 棲 息 環 境 繁 殖 方 式 吳 郭 魚 Tilapia 南 洋 鯽 仔 福 壽 魚 姬 鯛 潮 鯛 聖 彼 得 魚 台 灣 鯛 屬 於 鱸 型 目 (Perciformes) 慈 鯛 科 (Cichlidae) 體 長 通 常 是 15~30 公 分 左 右, 體 側 扁 胸 鰭 腹 鰭 尾 鰭 都 很 大, 尾 鰭 呈 圓 形 無 分 叉, 背 鰭 有 硬 棘 15~17, 軟 條 10~12, 腹 鰭 1 棘 5 軟 條 ; 臀 鰭 3 硬 棘 10 軟 條 ; 胸 鰭 13 軟 條, 各 鰭 之 硬 棘 均 十 分 銳 利 吳 郭 魚 是 屬 於 雜 食 性 的, 它 的 食 物 包 括 : 水 棲 昆 蟲 有 機 物 碎 屑 浮 游 生 物 人 工 飼 料 大 型 植 物 莖 葉 及 藻 類 吳 郭 魚 原 產 於 非 洲, 性 不 耐 寒, 對 低 溫 抵 抗 力 弱, 一 般 而 言, 水 溫 在 10 以 下 即 易 凍 傷 死 亡 能 耐 高 鹽 度, 在 鹽 度 高 達 的 海 水 中 和 淡 水 中 均 能 正 常 生 活, 是 一 種 廣 鹽 性 的 魚 類 河 川 及 河 口 附 近 的 海 水 域 池 塘 湖 泊 等 繁 殖 期 會 在 池 底 挖 碟 形 的 巢 來 產 卵, 雌 魚 會 利 用 口 孵 卵, 並 照 顧 小 魚 到 可 以 獨 立 生 活 為 止 36

51 第 二 章 液 相 層 析 螢 光 法 分 析 喹 諾 酮 類 殘 留 之 研 究 第 一 節 引 言 喹 諾 酮 類 抗 菌 劑 (QNs) 為 目 前 廣 泛 使 用 於 家 畜 禽 與 水 產 養 殖 業, 若 業 者 用 藥 不 當, 如 : 未 遵 守 藥 品 停 藥 期 或 任 意 將 原 料 直 接 添 加 於 飼 料 或 飲 水 中, 造 成 上 市 販 售 的 畜 禽 水 產 品 藥 物 殘 留 問 題, 因 此 也 成 為 美 國 歐 盟 日 本 及 中 華 民 國 等 國 家 實 施 嚴 格 監 控 的 藥 物 對 象 殘 留 的 監 控 計 畫 包 括 制 定 MRL 和 設 計 殘 留 分 析 方 法, 先 進 國 家 均 發 展 高 效 快 速 靈 敏 及 準 確 的 多 重 殘 留 分 析 方 法, HPLC 方 法 俱 有 上 述 特 性, 目 前 仍 是 多 數 實 驗 室 檢 測 QNs 殘 留 最 常 用 的 方 法 檢 視 國 內 公 告 方 法 : 動 物 用 藥 殘 留 標 準 檢 驗 方 法 -Quinolone 類 多 重 殘 留 分 析 檢 測 7 種 QNs (OXO NAL FLU PIR DAN ENR SAR) 需 同 時 使 用 UV 及 FLD 偵 測 儀 ( 行 政 院 衛 生 署, 2002), 移 動 相 中 需 加 入 SDS( 對 偶 離 子 試 劑 ); 另 一 公 告 方 法 為 檢 測 3 種 QNs (DAN NOR ENR) ( 中 華 民 國 國 家 標 準, 2002), 目 前 公 告 方 法 項 目 及 偵 測 極 限 不 足 以 因 應 進 口 食 品 及 輸 出 水 產 品 檢 測 需 求 參 考 國 內 外 文 獻 中 QNs 之 UV 及 FLD 偵 測 條 件, 找 出 最 佳 化 之 層 析 條 件 結 合 最 有 效 的 樣 品 前 處 理 方 法 去 除 基 質 干 擾, 進 行 方 法 確 效 ( 回 收 率 精 密 度 偵 測 極 限 ), 研 發 敏 感 性 高 準 確 且 快 速 之 HPLC-FLD 多 重 分 析 方 法 檢 測 雞 肉 豬 肉 魚 及 蝦 等 禽 畜 水 產 品 中 喹 諾 酮 類 抗 菌 劑 殘 留 37

52 第 二 節 儀 器 材 料 及 方 法 一 藥 品 及 儀 器 設 備 1. 儀 器 設 備 振 盪 器 ( 型 號 KM, 廠 牌 IWAKI); 離 心 機 ( 型 號 himac CF 16RX, 廠 牌 Hitachi Koki) ;12 孔 吹 氮 氣 蒸 發 裝 置 ( 型 號 MG-2000, 廠 牌 EYELY ) ; 真 空 固 相 萃 取 裝 置 (manifold); 液 相 層 析 儀 為 安 捷 倫 110 系 列, 配 合 安 捷 倫 Q1312A 螢 光 檢 出 器, 數 據 處 理 為 Chemstation for LC 3D Res.A (847) 執 行 ; 層 析 管 柱 Symmetry C18 (250 mm x 4.5 mm, 5μm) 購 自 Waters 2. 藥 品 及 溶 液 配 製 本 實 驗 所 使 用 之 藥 品 皆 為 試 藥 級 以 上 的 藥 劑, 其 中 Norfloxacin (NOR, 100.0%), difloxacin (DIF, 100.0%), oxolinic acid (OXO, 100.0%), nalidixic acid (NAL, 100.0%), flumequine (FLU, %) 及 lomefloxacin (LOM, 100.0%) 購 自 Sigma ;Marbofloxacin (MAR, 99.8%), ciprofloxacin (CIP, 100.0%), danofloxacin (DAN, 98.4%), sarafloxacin HCl (SAR, 99.7%) 及 difloxacin HCl (DIF, 98.4%) 購 自 RDH. Enrofloxacin (ENR, 98%) 購 自 Fluka, 氫 氧 化 鈉 (NaOH) 及 偏 磷 酸 (metaphosphoric acid ) 為 試 藥 特 級 購 自 Nacalai Tesque; 甲 酸 (formic acid) 甲 醇 (methanol) 及 氰 甲 烷 (acetonitrile) 為 HPLC 級 購 自 J.T. Backer; 固 相 萃 取 匣 (solid-phase extraction cartridge, SPE) OASIS HLB (3 ml, 60 mg) 購 自 Waters ; 超 純 水 由 Milli-Q system (Millipore, Bedford, MA) 製 造 38

53 二 分 析 樣 品 採 樣 3 隻 烏 骨 雞 購 自 屏 東 市 超 級 市 場 ;2 隻 烏 骨 雞 由 屏 東 縣 潮 州 鎮 養 雞 場 取 得 ; 25 件 魚 及 15 件 蝦 由 2006 年 檢 驗 進 口 及 出 口 水 產 品 ( 經 濟 部 標 準 檢 驗 局 抽 樣 ), 所 有 分 析 樣 品 均 保 存 在 -20 三 溶 液 配 製 11 種 QNs 標 準 品 以 50% 氰 甲 烷 ( 含 2% 0.1 N 氫 氧 化 鈉 溶 液 ) 配 製 成 200μg/mL 濃 度 (stock solution: 儲 備 溶 液 ), 以 10% 氰 甲 烷 稀 釋 配 製 成 10μg/mL 混 合 標 準 品, 再 以 10% 氰 甲 烷 做 系 列 稀 釋 25 ~ 1000 ng/ml (DAN 濃 度 6.25 至 250 ng/ml) 試 驗 用 標 準 溶 液 (working solution), 標 準 品 溶 液 以 褐 色 定 容 瓶 4 至 少 可 保 存 3 個 月 四 準 確 度 (accuracy) 及 精 密 度 (precision) 之 分 析 添 加 回 收 率 試 驗 : 精 秤 已 均 質 之 空 白 樣 品 添 加 標 準 品 最 終 濃 度 為 及 250 ng/g (DAN 濃 度 為 及 62.5 ng/g), 每 一 濃 度 均 做 4 重 覆 試 驗, 計 算 回 收 率, 作 為 評 估 本 方 法 準 確 度 之 依 據 為 了 了 解 每 次 配 製 的 藥 品 和 儀 器 之 精 密 度 以 確 保 實 驗 有 良 好 再 現 性, 以 吳 郭 魚 片 添 加 及 250 ng/g ( 除 了 DAN 添 加 12.5 ng/g) 進 行 回 收 率 試 驗, 進 行 日 內 精 密 度 (intra-day) 及 日 間 精 密 度 (inter-day) 測 試 日 內 精 密 度 : 吳 郭 魚 片 於 當 次 添 加 3 種 不 同 濃 度 之 QNs 標 準 品 進 行 試 驗, 重 複 檢 測 4 次 計 算 平 均 值 及 標 準 偏 差 ; 日 間 精 密 度 : 連 續 3 天, 分 別 檢 測 添 加 3 種 不 同 濃 度 之 QNs 標 準 (4 重 複 檢 測 ), 計 算 3 天 試 驗 之 平 均 值 及 標 準 偏 差 39

54 五 偵 測 極 限 測 定 空 白 魚 肉 添 加 低 濃 度 15 ng/g ( 七 重 覆 試 驗 ), 最 低 偵 測 極 限 ( the limit of detection;lod) 及 定 量 偵 測 極 限 (the limit of quantification ;LOQ ) 分 別 為 3 倍 標 準 偏 差 (SD) 及 10 倍 標 準 偏 差, 計 算 方 式 參 考 Verdon 等 人 (2005) 之 方 法. 六 樣 品 製 備 樣 品 解 凍 後 細 切 以 均 質 機 均 質, 精 稱 2.0 g 放 置 於 50 ml 塑 膠 離 心 管, 添 加 試 驗 則 加 入 標 準 品, 於 室 溫 靜 置 15 分 鐘 加 入 20 ml 樣 品 萃 取 液 (0.3% 偏 磷 酸 metaphosphoric: 氰 甲 烷, 1:1,v/v) 以 振 盪 器 高 速 振 盪 萃 取 10 分 鐘 後 再 以 6000 rpm 離 心 10 min 將 上 層 液 倒 入 250 ml 濃 縮 瓶 40 減 壓 濃 縮 去 除 氰 甲 烷, 萃 取 液 經 濾 紙 (ADVANTEC 5A) 過 濾, 以 避 免 萃 取 液 進 入 HLB 後 堵 塞 注 入 預 先 以 甲 醇 3 ml 再 以 去 離 子 水 3 ml 潤 洗 之 HLB, 調 整 真 空 固 相 萃 取 裝 置 流 速 至 每 秒 一 滴 ( 每 滴 體 積 約 0.04 ml) 棄 流 出 液, 以 3 ml 水 流 後 4 ml 甲 醇 沖 堤, 沖 提 液 於 40 氮 氣 濃 縮 並 以 10% 氰 甲 烷 ( 含 0.1% 甲 酸 ) 定 容 至 1 ml, 檢 液 以 0.45 μm Nylon 濾 膜 過 濾 後 注 入 HPLC 分 析 七 HPLC 分 析 條 件 逆 相 層 析 管 柱 為 Symmetry C18 (250 mm x 4.5 mm i.d., 5 μm; Waters) 柱 溫 35, 移 動 相 組 成 : 溶 液 A (0.1% formic acid 溶 液, ph 2.5) 溶 液 B ( 氰 甲 烷 ), 流 速 1.0 ml /min, 表 2-1 移 動 相 之 梯 度 設 定 : 平 衡 (post time)10 分 鐘, 注 入 量 50 ml 表 2-2 螢 光 偵 測 器 激 發 λex / 放 射 λem 波 長 設 定 40

55 八 鑑 別 試 驗 及 含 量 測 定 精 確 量 取 適 量 之 檢 液 及 標 準 溶 液, 分 別 注 入 高 效 液 相 層 析 儀 中, 就 檢 液 與 標 準 溶 液 所 得 波 峰 之 滯 留 時 間 比 較 鑑 別 之 檢 體 中 每 種 quinolone 含 量 (ppb) = (C x V)/ W x R C: 由 標 準 曲 線 求 得 檢 液 中 每 種 QN 之 濃 度 (ng/ml) V: 檢 體 最 後 經 淨 化 定 容 之 體 積 (ml) W: 取 樣 分 析 檢 體 之 重 量 (g) R: 回 收 率 41

56 表 2-1 分 析 11 種 QNs 移 動 相 之 梯 度 設 定 時 間 ( 分 鐘 ) 溶 液 A (%) 溶 液 B(%) 表 2-2 螢 光 偵 測 器 激 發 / 放 射 波 長 設 定 時 間 ( 分 鐘 ) λex (nm) λem (nm) 測 定 MAR NOR, CIP, LOM, DAN,ENR SAR, DIF OXO, NAL, FLU 42

57 第 三 節 結 果 一 HPLC 方 法 最 佳 化 條 件 本 研 究 探 討 14 種 QNs (MAR, NOR, OFL, CIP, LOM, DAN, ENR, ORB, SAR, DIF, OXO, NAL, FLU 及 piromidic acid (PIR) 經 紫 外 光 及 螢 光 掃 瞄 結 果 其 最 佳 偵 測 波 長 如 表 2-3, 除 了 PIR 需 使 用 UV 280 nm 測 定 外, 其 餘 13 種 QNs 以 FLD 檢 測 均 有 良 好 的 感 度,FLD 偵 測 極 限 均 可 在 10 ng/g 以 下, 能 滿 足 多 數 QNs 檢 測 需 求, 層 析 圖 基 線 穩 定 且 干 擾 較 UV 少, 靈 敏 度 較 UV 檢 測 法 高 倍 FLD 檢 測 感 度 差 異 很 大 其 中 以 DAN 感 度 最 好,DAN 感 度 是 PIR 的 40 倍, 而 DAN 的 感 度 是 OXO 的 10 倍 本 試 驗 可 同 步 分 析 8 種 FQs (MAR, NOR, CIP, LOM, DAN, ENR, SAR 與 DIF) 及 3 種 酸 性 QNs (NAL, FLU 與 OXO) 本 實 驗 螢 光 波 長 分 3 階 段 設 定 :Ex 297 nm/em 515 nm 測 定 MAR,Ex 280 nm/em 450 nm 測 定 其 它 FQs (NOR, CIP, LOM, DAN, ENR, SAR 及 DIF), Ex 320 nm/em 365 nm 測 定 OXO, NAL 及 FLU 選 用 簡 單 方 便 配 製 的 0.1% 甲 酸 及 氰 甲 烷 移 動 相 組 成 梯 度 沖 堤, 最 佳 化 HPLC 移 動 相 之 梯 度 條 件 如 表 2-1 及 3 段 式 螢 光 偵 測 器 設 定 如 表 2-2 比 較 3 種 廠 牌 Cosmosil 5 C18 AR (Nacalai Tesque) Luna 5 μ C18 (Phenomenex) 及 Symmetry C18 (Waters) 層 析 管 柱, 以 Symmetry C 18 對 分 離 QNs 極 性 化 合 解 析 度 最 佳 由 於 FQ 結 構 式 相 近 故 在 HPLC 分 析 時 滯 留 時 間 (retention time) 非 常 接 近, 時 常 有 共 析 (co-elution) 現 象 在 本 實 驗 條 件 下, 雖 然 OFL 及 ORB 也 可 使 用 Ex 280 nm/em 450 nm 偵 測, 但 OFL 與 NOR 由 於 滯 留 時 間 非 常 接 近 無 法 有 效 分 離,ORB 與 ENR 也 有 相 同 情 形 圖 2-1 為 11 種 QNs 之 層 析 圖, 結 果 顯 示 11 種 QNs 有 良 好 分 離 解 析 43

58 表 種 喹 諾 酮 類 抗 菌 劑 其 紫 外 光 及 螢 光 最 佳 偵 測 波 長 Quinolone UV FLD nm ( λex /λem ) nm MAR / 515 NOR / 450 OFL / 450 CIP / 450 LOM / 450 DAN / 450 ENR / 450 ORB / 450 SAR / 450 DIF / 450 OXO / 365 NAL / 365 FLU / 365 PIR / 450 圖 種 喹 諾 酮 類 抗 菌 劑 HPLC 層 析 圖 ( 標 準 品 濃 度 500 ng/ml 除 了 DAN 為 125 ng/ml, 注 射 量 50 μl ) 44

59 二 樣 品 製 備 方 法 探 討 使 用 吳 郭 魚 片 添 加 50 ng/g( 除 了 DAN 添 加 12.5 ng/g) 進 行 回 收 率 試 驗, 比 較 3 種 萃 取 液 :A 萃 取 液 為 0.3% 偏 磷 酸 溶 液 : 氰 甲 烷 (1:1, v/v),b 萃 取 液 為 0.3% 偏 磷 酸 溶 液,C 萃 取 液 為 0.1 M ph 7.0 磷 酸 緩 衝 液, 結 果 如 表 2-4 顯 示 0.3% 偏 磷 酸 溶 液 : 氰 甲 烷 (1:1, v/v) 之 萃 取 液 有 最 高 回 收 率, 推 論 原 因 為 偏 磷 酸 及 氰 甲 烷 溶 液 對 沉 澱 蛋 白 質 有 最 佳 效 果, 使 用 0.1 M ph 7.0 磷 酸 緩 衝 液 (Zhao et al., 2007) 中 性 磷 酸 緩 衝 液 萃 取, 樣 品 萃 取 液 即 使 再 經 rpm 高 速 離 心 過 濾 亦 無 法 有 效 沉 澱 蛋 白 質 此 外 本 研 究 發 現 秤 取 樣 品 2 克 樣 品 回 收 率 比 5 克 樣 品 回 收 率 佳, 原 因 是 對 HLB (60 mg) 而 言 5 克 樣 品 萃 取 液 會 造 成 過 飽 和 超 過 負 載 (overloading) 三 方 法 確 效 製 備 混 合 11 種 QNs 標 準 品 濃 度 25, 50, 100, 250, 500 及 1000 ng/ml ( 除 了 DAN 濃 度 為 6.25,12.5, 25, 62.5, 125 及 250 ng/ml), 每 一 標 準 品 濃 度 對 應 面 積 繪 製 檢 量 線,11 種 QNs 檢 量 線 如 表 2-5, 每 一 種 QNs 線 性 相 關 係 數 r 2 均 大 於 豬 肉 雞 肉 魚 肉 及 蝦 肉 添 加 11 種 QNs 濃 度 25, 50 及 250 ng/g ( 除 了 DAN 濃 度 為 6.25, 12.5 及 62.5 ng/g ) 之 回 收 率 如 表 2-6, 豬 肉 平 均 回 收 率 為 71.7 ~100.3 % 相 對 標 準 偏 差 (RSD) 1.5~4.2 %, 雞 肉 平 均 回 收 率 為 74.2 ~105.0 % 標 準 偏 差 (RSD) 1.8 ~4.5 %, 魚 肉 平 均 回 收 率 為 73.5~105.3 % 標 準 偏 差 (RSD) 2.5 ~4.2 %, 蝦 肉 平 均 回 收 率 為 76.5 ~105.1 % 相 對 標 準 偏 差 (RSD) 1.8 ~4.2 % 方 法 精 密 (precision) 分 析, 本 研 究 使 用 吳 郭 魚 片 添 加 及 250 ng/g ( 除 了 DAN 添 加 12.5 ng/g) 進 行 回 收 率 試 驗, 進 行 日 內 精 密 度 (intra-day) 及 日 間 精 密 度 (inter-day) 測 試 表 2-7 結 果 顯 示 日 內 精 密 度 之 45

60 表 2-4 比 較 3 種 萃 取 方 法 之 回 收 率 ( 魚 片 添 加 50 ng/g. 喹 諾 酮 類 抗 菌 劑, 除 了 DAN 添 加 12.5 ng/g )( n=3) Quinolone A B C 回 收 率 (%) 回 收 率 (%) 回 收 率 (%) MAR NOR CIP LOM DAN ENR SAR DIF OXO NAL FLU A: 0.3% metaphosphoric acid : acetontrite (1:1, v/v) B : 0.3% metaphosphoric acid C : 0.1M phosphoric acid buffer (ph 7.0) 表 種 喹 諾 酮 類 抗 菌 劑 標 準 曲 線 之 線 性 方 程 式 及 相 關 係 數 Quinolone 滯 留 濃 度 範 圍 線 性 方 程 式 correlation 時 間 (ng/ml) coefficient 分 鐘 MAR Y=0.1151X NOR Y= X CIP Y= X LOM Y= X DAN Y=9.5647X ENR Y=2.1165X SAR Y=0.7549X DIF Y=1.5588X OXO Y=0.2009X NAL Y=0.1288X FLU Y=0.2598X

61 平 均 RSD 小 於 5% 而 連 續 3 天 之 平 均 RSD 小 於 10%, 證 明 本 方 法 之 精 密 性 可 以 接 受 依 FDA 生 物 分 析 確 效 試 驗 指 引 (US FDA, 2005) 指 出 重 覆 性 及 再 現 性 係 數 均 要 小 於 15% 表 2-8 結 果 顯 示 11 種 QNs 方 法 偵 測 極 限 (LODs) 1.5 至 8.7 ng/g, 定 量 方 法 偵 測 極 限 (LOQs) 5.0 至 28.0 ng/g 由 圖 2-2 空 白 魚 肉 之 層 析 圖 顯 示 沒 有 任 何 干 擾 物 質, 依 此 方 法 以 巨 環 纇 抗 生 素 青 黴 素 磺 胺 劑 分 析 均 不 會 干 擾 四 檢 測 實 際 樣 品 殘 留 使 用 本 方 法 檢 測 45 件 樣 品 QNs 殘 留 結 果 有 2 件 烏 骨 雞 及 1 件 白 蝦 (Penaeus vannamei) 殘 留 ENR 及 CIP (ENR 主 要 代 謝 物 ),HPLC 層 析 圖 如 圖 2-3 及 2-4 在 本 實 驗 室 所 有 陽 性 樣 品 必 須 進 行 雙 重 覆 試 驗 並 且 以 液 相 層 析 串 聯 式 質 譜 儀 LC-MS/MS 再 次 確 認,ENR 使 用 母 離 子 (precursor ion) 為 m/z 360 而 子 離 子 (daughter ion) 為 m/z 316 及 342 ;CIP 使 用 母 離 子 為 m/z 332 而 子 離 子 為 m/z 314 及 288, 圖 2-5 為 陽 性 烏 骨 雞 樣 品 LC-MS/MS 層 析 圖 表 2-9 烏 骨 雞 於 不 同 組 織 ( 血 清 肌 肉 脂 肪 表 皮 肝 及 肺 ) 中 之 ENR 及 CIP, 在 肺 臟 組 織 ENR 殘 留 量 高 達 1900 ng/g, 在 烏 骨 雞 組 織 中 最 高, 其 次 表 皮 殘 留 1210 ng/g 肌 肉 殘 留 428 ng/g ;CIP (ENR 之 代 謝 物 ) 除 了 在 脂 肪 組 織 檢 測 不 到 其 餘 組 織 殘 留 量 為 ng/g 47

62 圖 2-2 HPLC 層 析 圖 (A) 空 白 魚 肉 (B) 魚 肉 添 加 250 ng/g( 除 了 DAN 添 加 62.5 ng/g) 喹 酮 類 抗 菌 劑 48

63 表 2-6 添 加 組 織 ( 豬 肉 雞 肉 魚 及 蝦 )11 種 喹 諾 酮 類 抗 菌 劑 之 回 收 率 組 織 Quinolone 回 收 率 (%) 25 ng/g 50 ng/g 250 ng/g MAR 84.2 (2.8) a 84.2 (2.8) 84.2 (2.8) NOR 98.3 (4.2) 98.6 (3.5) (3.0) CIP 71.7 (3.2) 73.2 (3.0) 78.7 (2.8) LOM 77.8 (2.5) 78.9 (2.0) 80.2 (1.5) DAN b 81.0 (3.8) 81.5 (3.2) 83.1 (2.8) 豬 肉 ENR 79.7 (3.6) 80.1 (3.1) 82.6 (2.6) SAR 74.0 (3.0) 75.6 (3.0) 78.3 (3.0) DIF 79.8 (3.5) 80.3 (3.4) 82.6 (3.0) OXO 77.2 (2.7) 77.6 (2.8) 78.4 (2.3) NAL 81.6 (3.5) 82.3 (3.0) 81.6 (2.6) FLU 81.2 (3.6) 81.0 (3.3) 82.3 (3.1) MAR 91.6 (3.2) 90.8 (3.2) 92.3 (3.2) NOR (3.0) (2.8) (2.0) CIP 74.2 (3.7) 76.1 (3.1) 76.8 (3.0) LOM 84.4 (3.1) 83.7 (3.1) 86.3 (2.8) DAN b 86.4 (3.4) 86.2 (2.8) 88.5 (1.8) 雞 肉 ENR 85.3 (3.1) 88.1 (3.0) 88.5 (2.7) SAR 75.2 (3.5) 78.1 (2.9) 79.2 (2.1) DIF 82.4 (2.6) 83.6 (2.2) 85.1 (2.3) OXO 84.4 (4.5) 82.8 (3.6) 85.1 (3.2) NAL 92.3(4.1) 90.5 (3.8) 91.2 (3.5) FLU 80.9(3.2) 81.5 (3.3) 82.0 (3.0) MAR 92.2 (4.1) 90.6 (3.8) 93.8 (3.2) NOR (4.2) (3.8) (3.9) CIP 73.5 (3.4) 76.3 (3.0) 78.0 (3.1) LOM 84.6 (3.2) 85.4 (3.5) 85.1 (3.0) DAN b 84.9 (3.5) 86.2 (3.0) 87.9 (2.6) 魚 片 ENR 80.5 (3.8) 82.5 (3.5) 83.5 (3.0) SAR 76.2 (2.8) 76.8 (2.6) 78.2 (2.5) DIF 87.2 (3.5) 86.2 (3.3) 88.3 (3.0) OXO 87.3 (3.8) 88.3 (3.0) 89.3 (2.8) NAL 89.1 (3.6) 89.5 (3.5) 90.1 (3.0) FLU 84.8 (3.1) 85.2 (3.2) 89.3 (2.8) MAR 85.8 (2.1) 87.3 (2.3) 89.9 (2.0) NOR (3.2) (3.0) (2.6) CIP 76.5 (1.8) 77.3 (2.0) 79.3 (2.1) LOM 83.8 (3.8) 85.0 (3.2) 88.6 (2.8) DAN b 87.9 (3.2) 88.3 (2.6) 89.6 (2.1) 蝦 ENR 85.5 (4.1) 85.6 (3.8) 86.8 (3.2) SAR 79.8 (3.4) 81.2 (3.0) 81.0 (3.1) DIF 88.5 (3.0) 89.2 (2.8) 87.6 (3.1) OXO 87.5 (3.8) 85.4 (3.2) 86.9 (2.8) NAL 83.2 (4.0) 84.8 (3.6) 89.6 (3.1) FLU 83.5 (4.2) 85.4 (3.8 ) 90.1 (3.2) a: 相 對 標 準 偏 差 (n=4) b: DAN 添 加 濃 度 為 6.25, 12.5 and 62.5 ng/g 49

64 表 2-7 添 加 喹 酮 類 抗 菌 劑 之 精 密 度 確 效 試 驗 a Quinolone 添 加 濃 度 回 收 率 RSD a (%) (ng/g) (%) Intra-day Inter-day MAR NOR CIP LOM DAN ENR SAR DIF OXO NAL FLU 相 對 標 準 偏 差 ( intra-day, n=4; inter-day, n=12) 50

65 表 2-8 添 加 喹 諾 酮 類 抗 菌 劑 於 雞 肉 及 魚 肉 之 LOD 及 LOQ. 雞 肉 魚 片 Quinolone LOD (ng/g) LOQ (ng/g) LOD (ng/g) LOQ (ng/g) MAR NOR CIP LOM DAN ENR SAR DIF OXO NAL FLU 表 2-9 烏 骨 雞 組 織 中 ENR 及 CIP 殘 留 (n=2) 組 織 ENR CIP ng/g ng/g 血 清 肌 肉 油 脂 220 ND 皮 肝 腎 肺 ND : 未 檢 出 51

66 圖 2-3 白 蝦 殘 留 CIP (21 ng/g) 及 ENR (368 ng/g) 之 HPLC 層 析 圖 圖 2-4 烏 骨 雞 殘 留 CIP (16 ng/g) 及 ENR (428 ng/g) 之 HPLC 層 析 圖 52

67 圖 2-5 烏 骨 雞 肉 LC-MS/MS 層 析 圖, 結 合 母 離 子 - 子 離 子 質 譜 層 析 圖 (ENR: m/z , 342) 及 CIP(m/z , 288),LC-MS/MS 操 作 模 式 為 正 電 噴 灑 之 MRM 模 式,HPLC 分 離 管 柱 Zorbax XDB-C8 (5 μm, 150 mm x 4.6 mm), 移 動 相 組 成 : 移 動 相 A (20 Mm 甲 酸 銨 含 0.1% 甲 酸 ) 移 動 相 B( 氰 甲 烷 ), 移 動 相 B 梯 度 5 95 %, 流 速 0.7 ml/min. 53

68 第 四 節 討 論 一 標 準 品 與 溶 液 配 製 ENR OXO 在 弱 鹼 溶 液 溶 解 度 最 好,Zhao 等 (2007) 及 Verdon 等 (2005) 將 QNs 溶 解 於 甲 醇 - 稀 氫 氧 化 鈉 溶 液, 考 量 本 研 究 使 用 的 移 動 相 及 萃 取 液, 選 用 以 50% 氰 甲 烷 含 2% 0.1 N 氫 氧 化 鈉 溶 液 配 製 成 200 μg/ml 濃 度 ( 儲 備 溶 液 ) 由 於 FQNs (MAR NOR ENR CIP) 為 極 性 化 合 物 在 HPLC 管 柱 中 受 到 溶 劑 影 響 很 大, 本 研 究 發 現 標 準 品 及 樣 品 定 容 液 其 氰 甲 烷 濃 度 高 於 20% 以 上 之 FQNs(MAR NOR ENR CIP) 之 層 析 圖 會 有 拖 尾 現 象, 為 了 使 QNs 在 HPLC 有 良 好 分 離 解 析, 定 容 液 建 議 使 用 10% 氰 甲 烷 ( 含 0.1% 甲 酸 ) 二 HPLC 方 法 最 佳 化 條 件 分 析 QNs 殘 留 HPLC 使 用 的 檢 測 器 不 外 乎 以 紫 外 光 檢 測 器 (UV) 或 螢 光 檢 測 器 (FLD), 而 由 於 第 一 代 QNs 與 FQNs 在 紫 外 光 光 譜 或 螢 光 光 譜 上 有 些 差 異, 因 此 很 多 文 獻 將 第 一 代 QNs 與 FQNs 分 開 進 行 檢 測 (Sue et al., 2002) 本 研 究 探 討 14 種 QNs 紫 外 光 及 螢 光 之 其 最 佳 偵 測 波 長, 除 了 PIR 需 使 用 UV 280 nm 測 定 外, 其 餘 13 種 QNs 以 FLD 檢 測 均 有 良 好 的 感 度,FLD 偵 測 極 限 均 可 在 10 ng/g 以 下, 能 滿 足 多 數 QNs 檢 測 需 求, 由 於 PIR 在 FLD 感 度 差, 故 本 研 究 於 建 立 多 重 分 析 方 法 未 將 PIR 納 入 Zhao 等 人 (2007) 以 磷 酸 緩 衝 液 (0.01M, ph 7.0) 萃 取 豬 肉 雞 肉 蝦 等 樣 品, 採 用 HLB 固 相 萃 取 方 法 淨 化, 所 使 用 之 移 動 相 (0.02% 甲 酸 溶 於 水 氰 甲 烷 ) 梯 度 沖 堤,FLD 偵 測 採 3 段 式 程 式 切 換 ( 激 發 / 放 射 ) 波 長,297/515 nm 檢 測 MAR 280/450 nm 檢 測 (NOR CIP LOM DAN ENR SAR DIF) 320/365 nm 檢 測 (OXO FLU) Verdon 等 人 (2005) 54

69 以 5% 三 氯 醋 酸 萃 取 牛 奶 豬 肉 豬 腎 豬 肝 魚 及 雞 蛋 等 樣 品, 使 用 之 移 動 相 (0.1% 甲 酸 溶 於 水 氰 甲 烷 ) 梯 度 沖 堤, 也 採 用 3 段 式 ( 激 發 / 放 射 ) 波 長,294/514 nm 檢 測 MAR 328/425 nm 檢 測 (NOR CIP DAN ENR SAR DIF) 312/366 nm 檢 測 (OXO NAL FLU), 故 本 研 究 檢 測 QNs 選 用 FLD 偵 測 器 波 長 與 Zhao 等 (2007) 及 Verdon 等 (2005) 一 致 由 於 QNs 為 兩 性 化 合 物, 同 時 具 有 酸 性 基 (COOH 基 ) 及 鹼 性 基 (piperazine), 移 動 相 之 ph 對 QNs 的 分 離 與 保 留 影 響 很 大, 早 期 分 析 QNs 藥 物 HPLC 在 移 動 相 中 添 加 適 當 對 應 的 酸 鹼 對 偶 離 子 試 劑 (ionpair reagent) 針 對 酸 分 析 化 合 物, 可 選 用 常 用 的 鹼 對 偶 離 子 試 劑 : 如 tetra-n-butyl ammonium bomide (Horie et al., 1987) 及 tetra- butyl -ammonium iodide(anadon et al., 1992); 針 對 鹼 基 可 選 用 常 用 的 酸 對 偶 離 子 試 劑 :1-heptane sulfonic acid 及 sodium dodecyl sulfate ( 何 等,1999;Horie et al.,1995; Su et al., 2003), 目 前 HPLC 應 用 趨 勢 為 儘 量 避 免 使 用 酸 或 鹼 對 偶 離 子 試 劑, 參 考 Zhao 等 人 (2007) 及 Verdon 等 人 (2005) 之 移 動 相 條 件, 故 本 研 究 選 用 簡 單 方 便 配 製 的 0.1% 甲 酸 及 氰 甲 烷 移 動 相 組 成 進 行 梯 度 沖 堤 三 樣 品 製 備 方 法 探 討 有 關 QNs 類 抗 菌 劑 從 水 雞 蛋 牛 奶 豬 肉 雞 肉 內 臟 魚 及 蝦 等 不 同 生 物 基 質 萃 取 之 報 告 相 當 的 多, 大 多 數 方 法 會 使 用 水 溶 液 或 有 機 溶 劑 從 生 物 基 質 中 萃 取 藥 物, 文 獻 中 常 用 萃 取 液 ( 表 1-2) 有 : 氰 甲 烷 1 M 鹽 酸 溶 液 5% 三 氯 醋 酸 溶 液 酸 化 甲 醇 ph 7.4 磷 酸 緩 衝 液 三 氯 醋 酸 : 氰 甲 烷 ( 偏 磷 酸 : 氰 甲 烷 ) 等 溶 液 Pecorelli 等 人 (2003) 建 立 飼 料 中 13 種 QNs 藥 物 殘 留 檢 測 方 法, 樣 品 以 0.2% 偏 磷 酸 / 氰 甲 烷 (7:3) ph 2.6 萃 取 ;Su 等 人 (2003) 以 0.3% 偏 磷 酸 溶 液 : 氰 甲 烷 (1:10) 萃 取 樣 55

70 品 樣 品 經 萃 取 步 驟 後 以 固 相 萃 取 (SPE) 達 到 濃 縮 淨 化 的 目 的 常 用 SPE 型 態 有 : 疏 水 性 (C18 HLB SDB ENV+isolute) 陽 離 子 交 換 型 (PRS) 以 及 混 合 型 固 相 萃 取 匣 (MPC SDB-PRS) 參 考 文 獻 中 使 用 的 萃 取 方 法 找 出 最 環 保 ( 使 用 最 少 量 有 機 溶 劑 萃 取 ) 最 有 效 去 除 基 質 干 擾 回 收 率 最 佳 之 樣 品 製 備 方 法 結 果 顯 示 0.3% 偏 磷 酸 溶 液 : 氰 甲 烷 (1:1, v/v) 之 萃 取 液 有 最 高 回 收 率 ; 而 0.3% 偏 磷 酸 之 萃 取 液 對 較 偏 極 性 之 FQNs 回 收 率 為 71.5~90.3%, 顯 示 回 收 率 甚 佳,0.3% 偏 磷 酸 之 萃 取 液 對 酸 性 QNs (NAL, FLU, OXO) 回 收 率 為 65.3~72.0%, 回 收 率 較 差, 萃 取 酸 性 QNs 需 使 用 有 機 溶 劑 及 鹼 中 (Andresen et al., 1990, Hormazabal et al., 1994), 因 此 對 於 同 時 萃 取 酸 性 QNs 及 FQNs 使 用 0.3% 偏 磷 酸 及 氰 甲 烷 溶 液 (1:1) 對 沉 澱 蛋 白 質 及 萃 取 QNs 有 最 佳 效 果 四 方 法 確 效 LOD 反 映 了 分 析 方 法 整 體 靈 敏 度 效 能 指 標,LOQ 反 映 了 方 法 在 低 濃 度 端 分 析 結 果 的 可 靠 性 表 2-8 添 加 QNs 於 魚 肉 及 雞 肉 之 LODs 為 1.5 ~8.7 ng/g,loqs 為 5.0 ~28.0 ng/g, 其 分 析 結 果 與 Verdon 等 (2005) 檢 測 不 同 生 物 基 質 10 種 QNs 之 LODs (4 ~11 ng/g) LOQs (13 ~36 ng/g) 結 果 類 似 五 檢 測 實 際 樣 品 結 果 與 衛 生 署 歷 年 調 查 報 告 之 比 較 表 2-9 烏 骨 雞 於 不 同 組 織 ( 血 清 肌 肉 脂 肪 表 皮 肝 及 肺 ) 中 之 ENR 及 CIP, 在 肺 臟 組 織 ENR 殘 留 量 高 達 1.9μg/g, 在 烏 骨 雞 組 織 中 最 高, 此 結 果 尚 未 在 其 它 文 獻 中 發 現 ENR 在 臟 器 ( 肌 肉 表 皮 及 肝 ) 組 織 殘 留 量 與 Su et al (2003) 結 果 類 似, 在 市 售 36 件 水 產 品 中, 僅 有 1 件 香 魚 檢 出 ENR,12 件 烏 骨 雞 中 高 達 6 件 檢 出 ENR 及 CIP 此 外 94 年 度 56

71 衛 生 署 針 對 市 售 禽 畜 水 產 品 中 QNs 類 動 物 用 藥 殘 留 進 行 調 查 ( 周 珮 如 等,2006), 烏 骨 雞 肉 12 件 烏 骨 雞 內 臟 4 件 香 魚 及 鰻 魚 等 魚 類 39 件, 結 果 5 件 烏 骨 雞 肉 1 件 烏 骨 雞 內 臟 及 1 件 香 魚 檢 出 不 得 殘 留 之 ENR 0.01~0.04μg/g 衛 生 署 96 年 3 月 至 7 月 間 抽 樣 禽 畜 產 品 及 其 加 工 品 水 產 品 共 62 件 ( 王 等,2008), 其 中 4 件 烏 骨 雞 肉 檢 體 中 檢 出 ENR 濃 度 範 圍 為 0.007~0.267 μg/g 從 衛 生 署 歷 年 市 購 樣 品 調 查 報 告 顯 示, 家 禽 類 產 品 仍 存 在 ENR 殘 留 問 題 六 風 險 評 估 聯 合 國 食 品 添 加 物 專 家 委 員 會 (Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives, JECFA) 評 估 ENR 每 日 安 全 攝 取 量 (acceptable daily intake, ADI) 為 2 μg/kg (JEFCA, 1997), 以 成 人 體 重 60 公 斤 換 算, 每 日 可 接 受 攝 取 量 上 限 為 120 μg, 本 報 告 檢 出 烏 骨 雞 肌 肉 殘 留 量 為 μg/g, 假 設 每 日 食 用 量 為 100 g 計 算, 每 日 攝 入 ENR 為 42.8 μg, 為 每 日 可 接 受 攝 取 量 的 35.7 %, 不 至 於 對 民 眾 健 康 產 生 影 響 57

72 第 三 章 LC-ESI/MS/MS 分 析 喹 諾 酮 類 抗 菌 劑 殘 留 之 研 究 第 一 節 引 言 HPLC-FLD 需 使 用 繁 複 的 萃 取 步 驟 ( 液 液 萃 取 固 相 萃 取 ) 才 能 有 效 去 除 干 擾 物 質, 此 外 HPLC-FLD 有 共 析 作 用, 即 使 檢 體 滯 留 時 間 與 標 準 品 相 同, 但 無 法 有 效 判 定, 需 使 用 質 譜 儀 進 一 步 確 認 液 相 層 析 - 電 噴 灑 - 串 聯 式 質 譜 儀 (LC-ESI/MS/MS) 通 過 多 重 反 應 監 測 模 式 (multiple reactions monitoring, MRM), 可 有 效 減 少 背 景 干 擾 及 提 高 靈 敏 度, 是 動 物 性 食 品 中 喹 諾 酮 類 抗 菌 劑 (QNs) 殘 留 檢 測 首 選 的 方 法 本 研 究 採 用 簡 單 及 有 效 之 液 - 液 萃 取 法 結 合 LC-ESI/MS/MS 檢 測 牛 奶 雞 肉 豬 肉 魚 及 蝦 18 種 QNs 殘 留, 此 方 法 能 快 速 準 確 檢 測 包 括 12 種 兩 性 的 QNs (MAR NOR ENR CIP des-cip LOM DAN SAR DIF OFL ORB ENO) 及 6 種 酸 性 的 QNs (OXO NAL FLU CIN PIR PIP) CCα 及 CCβ 之 測 定 係 參 考 歐 盟 2002/657/EC 指 令 及 ISO 號 標 準, 使 用 禁 用 物 質 之 模 式, 建 立 牛 奶 雞 肉 豬 肉 魚 及 蝦 的 確 效 資 料 藉 由 LC-ESI/MS/MS 探 討 QNs 的 碰 撞 裂 解 途 徑 及 在 吳 郭 魚 肉 之 基 值 效 應 (matrix effect) 及 絕 對 回 收 率 58

73 第 二 節 儀 器 材 料 及 方 法 一 藥 品 及 儀 器 設 備 1. 藥 品 及 溶 液 配 製 1.1 藥 品 : 本 實 驗 所 使 用 之 藥 品 皆 為 試 藥 級 以 上 的 藥 劑 其 中 enoxacin(eno, 100%) cinoxacin (CIN, 100%) ofloxacin (OFL, 99%) pipemidic acid (PIP, >99%) piromidic acid (PIR, 99%) Norfloxacin (NOR, 100 %) difloxacin (DIF, 100 %) oxolinic acid (OXO, 99.9%) nalidixic acid (NAL, 100% ) flumequine (FLU, %) 及 lomefloxacin (LOM, 100%) 購 自 Sigma ;Marbofloxacin (MAR, 99.8%) ciprofloxacin (CIP,100.0%) danofloxacin (DAN, 98.4%) sarafloxacin HCl (SAR, 99.7%) 及 difloxacin HCl (DIF, 98.4%) 購 自 RDH;enrofloxacin (ENR, 98%) 購 自 Fluka; desethylene ciprofloxacin HCl (des-cip, 98%) 購 自 Toronto Research; 氫 氧 化 鈉 (NaOH) 為 試 藥 特 級 購 自 Nacalai Tesque; 甲 酸 (formic acid) 甲 醇 (methanol ) 及 氰 甲 烷 (acetonitrile) 為 HPLC 級 購 自 J.T. Backer; 超 純 水 由 Milli-Q system (Millipore, Bedford, MA) 製 造 1.2 溶 液 配 製 : 定 容 液 配 製 :10% 氰 甲 烷 含 (0.1% 甲 酸 ) 溶 液 標 準 品 配 製 : 18 種 QNs 標 準 品 以 50% 氰 甲 烷 含 (2% 0.1 N 氫 氧 化 鈉 溶 液 ) 配 製 成 200 μg/ml 濃 度 (stock solution: 儲 備 溶 液 ), 以 10% 氰 甲 烷 稀 釋 配 製 成 10μg/mL 混 合 標 準 品, 再 以 10% 氰 甲 烷 含 (0.1% 甲 酸 ) 做 系 列 稀 釋 至 0.25 ~10 ng/ml 試 驗 用 標 準 品 (working solution), 標 準 品 溶 液 以 褐 色 定 容 瓶 4 至 少 可 保 存 3 個 月 59

74 2. 儀 器 設 備 及 條 件 2.1 儀 器 設 備 : 振 盪 器 ( 型 號 KM, 廠 牌 IWAKI); 離 心 機 ( 型 號 himac CF 16RX, 廠 牌 Hitachi Koki) ; 真 空 減 壓 濃 縮 機 ( 廠 牌 Büchi); 漩 渦 式 震 盪 器 (Vortex Genie 2) 2.2 液 相 層 析 儀 及 質 譜 條 件 : 液 相 層 析 儀 為 安 捷 倫 110 系 列 含 四 元 幫 浦 (G1311A) 脫 氣 裝 置 (G1322A) 及 自 動 注 射 (G1313A); 三 段 式 四 極 柱 質 譜 儀 (API 4000 triple quadrupole mass spectrometer), 搭 配 電 灑 離 子 源 (Electrospray ionization, ESI) 購 自 Applied Biosystems/ MDS Sciex, 數 據 處 理 為 Analyst 1.4 執 行 ; 層 析 管 柱 Zorbax Eclipse XDB-C8 (150 x 4.6 mm, 5μm) 購 自 安 捷 倫 移 動 相 組 成 : 溶 液 A 為 去 離 子 水 ( 含 20 mm 甲 酸 銨 0.1% 甲 酸 ), 溶 液 B 為 氰 甲 烷 ( 含 0.1% 甲 酸 ) 依 表 3-1 移 動 相 之 梯 度 設 定 混 合 作 為 移 動 相 溶 液, 移 動 相 流 速 :0.7 ml/min, 注 入 體 積 : 20 μl 為 了 建 立 最 佳 化 多 重 反 應 監 測 模 式 (MRM) 條 件, 利 用 注 射 幫 浦 (syringe pump) 以 流 速 0.01 ml /min 直 接 進 樣 方 式, 分 別 注 入 溶 於 50% 氰 甲 溶 液 之 0.5 μg/ml QN 標 準 溶 液, 觀 察 母 離 子 (precursor ion,q1) 二 次 子 代 掃 描 質 譜 碎 片, 尋 找 最 佳 化 之 質 譜 儀 分 析 參 數 (Q1 Q3 DP CE CXP) 質 譜 儀 分 析 條 件 : 離 子 源 : 電 灑 離 子 化 正 離 子 掃 瞄 碰 撞 氣 體 (CAD):7 氣 簾 氣 體 (CUR):12 60

75 電 灑 游 離 電 壓 (IS):5500V 離 子 源 溫 度 :500 掃 描 時 間 (dwell time):80 ms MRM 模 式 之 離 子 對 去 簇 電 壓 (declustering potential;dp) 碰 撞 能 (collision energy;ce) 設 定 條 件 如 表 3-2 二 樣 品 的 萃 取 及 淨 化 : 解 凍 後 稱 取 2.0 g 放 置 於 50 ml 塑 膠 離 心 管, 加 入 20 ml 氰 甲 烷 及 0.2 ml 甲 酸 以 振 盪 器 高 速 振 盪 萃 取 1 分 鐘 後, 再 加 入 約 2 g 無 水 硫 酸 鈉 振 盪 萃 取 10 分 鐘 並 以 (6000 rpm, 10 min, 4 ) 離 心 將 上 層 液 經 濾 紙 過 濾 倒 入 250 ml 濃 縮 瓶,40 減 壓 濃 縮 乾, 以 2 ml 定 容 液 溶 解 後 移 至 15 ml 玻 璃 試 管, 加 入 4 ml 正 己 烷 震 盪 30 秒, 以 (4000 rpm, 10 min, 4 ) 離 心, 用 玻 璃 滴 管 取 下 層 液 以 0.22 μm Nylon 濾 膜 過 濾 三 基 質 效 應 (matrix effect) 與 絕 對 回 收 率 (absolute recovery) 1. 基 值 效 應 與 絕 對 回 收 率 實 驗 模 式 參 考 Durden 等 人 (2005) 方 法, 分 別 以 下 列 方 式 建 立 檢 量 線 : 1.1 標 準 品 之 檢 量 線 ( standard calibration curve;scc):qns 標 準 品 以 定 容 液 配 製 ng/ml 1.2 萃 取 前 添 加 之 檢 量 線 (method matched calibration curve;mmcc): 分 別 精 確 秤 定 空 白 吳 郭 魚 片 2.0 克 添 加 QNs 標 準 品 成 最 終 添 加 濃 度 為 ng/ ml, 再 依 2.2 樣 品 的 萃 取 及 淨 化 步 驟 處 理 1.3 空 白 基 值 萃 取 後 添 加 之 檢 量 線 (matrix calibration curves; MCC): 取 空 白 吳 郭 魚 片 萃 取 液 添 加 QNs 標 準 品 成 最 終 添 加 濃 度 為 ng/ ml 61

76 2. 基 質 效 應 及 絕 對 回 收 率 計 算 公 式 如 下 : 基 質 效 應 = MCC 之 斜 率 /SCC 之 斜 率 絕 對 回 收 率 = MMCC 之 斜 率 /SCC 之 斜 率 四 決 策 極 限 (decision limit;ccα) 及 偵 測 能 力 (detection capability ;CCβ) 之 測 定 1.CCα( 稱 α-error) 即 偽 陽 性,α=1% 即 無 值 樣 品 落 在 CCα 的 可 能 性 只 有 1%, 對 於 樣 品 合 格 率 有 99 %, 偽 陽 機 率 1 % 2.CCβ 測 量 最 低 可 測 濃 度, 有 95 % 信 心 度 確 定 其 為 真 的 存 在, 偽 陰 (false negative) 機 率 5 %, 在 CCβ 有 值 樣 品 變 無 值 樣 品 的 可 能 性 有 5 % 3. 樣 品 添 加 試 驗 : 空 白 樣 品 ( 牛 奶 雞 肉 豬 肉 魚 及 蝦 ) 2.0 g 放 置 於 50 ml 塑 膠 離 心 管, 添 加 QNs 標 準 品 使 最 終 濃 度 為 (0.25, 0.5, 1.0, 2.5 及 5.0 ng/g), 每 一 分 析 濃 度 進 行 4 重 覆 分 析 4.CCα 及 CCβ 計 算 : 係 依 據 ISO case 1 及 2002/657/EC 禁 用 物 質 模 式 (α= 1 %, 99% 信 心 水 平 ;β=5 %, 95% 信 心 水 平 ) 濃 度 水 平 I ( 3) 重 覆 測 量 次 數 J ( 2) 每 個 樣 品 重 覆 次 數 K ( 初 篩 K=1, 確 認 K=2) 62

77 63 CCα 及 CCβ 計 算 公 式 如 下 : b a Y CC b a Y CC X Xi X J I K S t a Y X Xi X J I K S t a Y n a bxi Yi S a bx y d c d c / ) ( / ) ( ) ( ) ( ) ( % % 2 = = = = = + = β α

78 表 3-1 分 析 18 種 QNs 移 動 相 之 梯 度 設 定 Time (min) A (%) B (%) 表 3-2. 最 佳 化 二 次 質 譜 MRM 之 參 數 設 定 Quinolone 滯 留 時 間 母 離 子 定 量 離 子 定 性 離 子 ( 分 ) (m/z) m/z CE DP m/z CE DP NAL (22) (36) 63 FLU (25) (46) 56 OXO (24) (42) 55 CIN (22) (31) 29 PIR (26) (41) 65 PIP (26) (31) 75 des-cip (24) (36) 60 NOR (32) (24) 70 ENO (28) (31) 50 CIP (27) (24) 70 LOM (24) (32) 70 DAN (31) (25) 81 ENR (29) (29) 73 OFL (28) (36) 52 MAR (22) (28) 61 SAR (31) (27) 71 ORB (25) (32) 79 DIF (30) (28) 63 DP: 去 簇 電 壓 (declustering potential) CE: 碰 撞 能 (collision energy) 64

79 第 三 節 結 果 一 質 譜 測 定 圖 3-1 為 Norfloxacin 之 二 級 質 譜 圖 及 質 譜 碎 片 可 能 之 裂 解 途 徑, 當 碰 撞 能 量 (CE) 較 低 時 (CE= 20 V), 二 級 質 譜 的 基 峰 (base peak) 是 分 子 離 子 峰 MH + (m/z 320.3), 隨 著 碰 撞 能 量 不 斷 加 大 (CE= 25~32 V), 分 子 離 子 峰 (m/z 320.3) 的 強 度 逐 漸 下 降, 而 二 級 質 譜 的 總 強 度 達 到 最 高, 其 主 要 的 碰 撞 裂 解 子 離 子 包 括 m/z 推 測 NOR 分 子 碰 撞 斷 裂 過 程,m/z 302 是 NOR 的 脫 水 峰 MH-18 + m/z 276 是 NOR 藥 物 分 子 的 脫 羧 峰 MH-44 +,m/z 256 MH-64 + 應 是 NOR 脫 羧 後 再 丟 失 HF 分 子 產 生 的 帶 電 離 子 MH-CO 2 -HF + m/z 分 別 是 NOR 脫 羧 後 piperazinyl 環 斷 裂 發 生 結 構 重 排 失 去 C 2 H 5 N 的 離 子 產 物 MH-CO 2 -C 2 H 5 N + 及 MH-CO 2 -C 2 H 5 N-14 + ESI(+)/MS/MS 質 譜 中 最 常 見 的 質 譜 碎 片 是 脫 水 峰 MH-18 +, 而 脫 羧 峰 MH-44 + 是 QNs 分 子 含 有 羧 基 基 團 的 特 徵, 脫 羧 後 piperazinyl 環 斷 裂 重 排 的 產 物 離 子 更 是 FQNs 特 有 的 表 徵 碎 片 18 種 QNs 每 種 藥 物 分 別 取 兩 組 離 子 對, 強 度 較 高 作 為 定 量 (quantitation) 離 子, 另 一 組 離 子 對 用 來 定 性 (confirmation) 離 子 ( 如 表 3-2 所 示 ) QNs 分 子 的 定 量 離 子 最 常 見 的 脫 水 峰 MH-18 + 及 脫 羧 峰 MH-44 + ; 定 量 離 子 解 離 MH + MH-H 2 O + ( 脫 水 峰 ) 有 NAL, FLU, OXO, CIN, PIR, PIP, des-cip, NOR, ENO, CIP, DAN, ENR, SAR 及 DIF 定 量 離 子 解 離 MH + MH-CO 2 + ( 脫 羧 峰 ) 有 LOM, OFL, MAR 及 ORB 表 3-2 發 現 FLU 與 OXO 因 分 子 量 相 同 其 母 離 子 均 為 m/z 262, 且 擁 有 相 同 子 離 子 MH + MH-H 2 O + ( 脫 水 峰 ) m/z 244, 然 而 FLU 與 OXO 之 滯 留 時 間 不 同 另 一 個 子 離 子 也 不 相 同 的 表 徵 可 65

80 確 認 :OXO 子 離 子 m/z 216 MH + MH-OCH 2 O + (m/z ) FLU 子 離 子 m/z 202 MH + MH-OC 3 H 8 + (m/z ); 在 LC-ESI/MS/MS 以 MRM 模 式 測 定 可 由 滯 留 時 間 相 同 定 性 及 定 量 離 子 及 相 對 離 子 強 度 做 為 確 認 的 資 訊, 附 錄 一 圖 1~18 為 18 種 喹 諾 酮 類 抗 菌 劑 二 級 質 譜 碎 片 及 定 量 定 性 離 子 層 析 圖 二 相 對 離 子 強 度 (relative ion intensities;ion ratio) 容 許 範 圍 質 譜 分 析 中 同 一 分 析 物 的 質 譜 碎 片 離 子 間 的 相 對 離 子 強 度 是 對 分 析 物 定 性 確 認 的 重 要 依 據 相 對 離 子 強 度 = 以 定 性 離 子 (confirmation) 之 偵 測 強 度 (intensity) / 定 量 離 子 (quantitation) 之 偵 測 強 度 對 於 動 物 源 食 品 (producing animal food) 的 藥 物 殘 留 檢 驗, 歐 盟 (2002/657/EC) 規 定 了 樣 品 中 的 分 析 物 的 質 譜 碎 片 離 子 間 相 對 強 度 比 同 一 批 次 檢 驗 的 標 準 品 ( 溶 液 ) 的 質 譜 碎 片 離 子 間 相 對 強 度 的 相 對 偏 差 ( 見 表 3-3) 表 3-4 添 加 回 收 試 驗 的 不 同 生 物 基 質 ( 豬 肉 雞 肉 魚 蝦 及 牛 奶 )18 種 QNs 個 別 的 相 對 離 子 強 度 均 符 合 歐 盟 規 範 三 基 質 效 應 (matrix effect) 與 絕 對 回 收 率 (absolute recovery) NAL 於 吳 郭 魚 之 基 質 效 應 如 圖 3-2, 標 準 品 溶 液 檢 量 線 (SCC) 斜 率 為 空 白 吳 郭 魚 基 質 萃 取 後 添 加 液 檢 量 線 (MCC) 斜 率 為 空 白 吳 郭 魚 基 質 萃 取 前 添 加 檢 量 線 (MMCC) 斜 率 為 ; NAL 於 吳 郭 魚 基 質 效 應 為 / = 124.7% NAL 於 吳 郭 魚 之 絕 對 回 收 率 為 / = 95.8% 18 種 QNs 於 吳 郭 魚 之 基 質 效 應 與 絕 對 回 收 率 如 表 3-5,18 種 QNs 基 值 效 應 中 有 增 強 (enhances) 反 應 從 7.0 % (PIP) 至 高 達 49.3 % (ENO), 而 抑 制 反 應 有 2.2% (ENR) 至 19.9% (ORB) 每 種 QN 藥 物 於 不 同 生 物 基 質 及 不 同 萃 取 步 驟 差 異 很 66

81 圖 3-1. NOR 之 二 級 質 譜 圖 及 質 譜 碎 片 可 能 之 裂 解 途 徑 67

82 表 3-3 相 對 離 子 強 度 之 最 大 可 容 許 範 圍 相 對 離 子 強 度 (%) 容 許 範 圍 >50 20~50 10~20 10 ±20 ±25 ±30 ±50 表 種 喹 諾 酮 抗 菌 劑 的 質 譜 碎 片 相 對 離 子 強 度 比 Quinolone 相 對 離 子 強 度 * standard a range b Fish Shrimp Pork Chicken Milk NAL FLU OXO CIN PIR PIP des-cip NOR ENO CIP LOM DAN ENR OFL MAR SAR ORB DIF * 相 對 離 子 強 度 : 定 性 離 子 面 積 / 定 量 離 子 面 積 a: 標 準 品 之 相 對 離 子 強 度 b: 依 據 歐 盟 指 令 2002/657/EC 容 許 範 圍 68

83 Conc. Calculated (ppb) y = x R 2 = y = x R 2 = y = x R 2 = SCC MCC MMCC Conc. added (ppb) 圖 3-2 NAL 於 吳 郭 魚 之 基 質 效 應 69

84 大, 本 研 究 使 用 的 吳 郭 魚 也 無 法 代 表 鰻 魚 或 鱸 魚 的 基 質 由 表 3-5 基 質 效 應 與 絕 對 回 收 率 推 論 兩 者 之 差 值 ( 基 值 效 應 - 絕 對 回 收 率 ) 可 反 映 萃 取 步 驟 造 成 的 流 失, 經 由 萃 取 步 驟 造 成 的 流 失 從 3.6 % (DIF)~54.2 % (ENO) 四 CCα 及 CCβ 本 研 究 CCα 及 CCβ 計 算 係 依 據 ISO case 1 及 2002/657/EC 禁 用 物 質 (A 類 物 質 ) 模 式 (α= 1%,β=5 %), 標 準 品 添 加 於 不 同 基 質 ( 牛 奶 魚 蝦 豬 肉 雞 肉 ) 中 進 行 萃 取 建 立 檢 量 線, 表 3.6 為 18 種 QNs 於 牛 奶 魚 蝦 豬 肉 雞 肉 之 CCα 及 CCβ 值 CCα 值 0.18 至 0.68 ng/g; CCβ 值 0.24 至 0.96 ng/g, 本 研 究 建 立 之 確 效 CCα 及 CCβ 值 均 小 於 1.0 ppb, 偵 測 極 限 均 可 滿 足 日 本 台 灣 歐 盟 之 殘 留 標 準 在 禁 用 物 質 模 式 CCα 及 CCβ 值 可 分 別 等 同 LOD( 定 性 最 低 偵 測 極 限 ) 及 LOQ( 定 量 最 低 偵 測 極 限 ) 值 依 據 台 灣 的 MRLs 有 4 種 QNs (OXO, FLU, SAR 及 DAN) 有 容 許 量 屬 B 類 物 質, 依 2002/657/EC 只 需 建 立 CCα 值 (α= 5 %), 檢 量 線 濃 度 範 圍 1/2 MRL 至 2x MRL ( 以 FLU 為 例, 魚 豬 雞 羊 之 MRL 為 50 ng/g 其 檢 量 線 濃 度 範 圍 為 25~100 ng/g), 對 LC-ESI/MS/MS 方 法 而 言 濃 度 範 圍 太 廣 超 過 線 性 範 圍, 故 在 表 3-6 對 於 有 容 許 量 之 4 種 QNs 其 CCα 及 CCβ 值 分 別 用 LOD 及 LOQ 取 代 五 實 際 檢 測 能 力 試 驗 樣 品 以 FAPAS 編 號 能 力 試 驗 ( 魚 肉 樣 品 ) 於 2008 年 7 月 間 寄 送, 總 計 有 56 間 實 驗 室 參 與 由 於 測 試 樣 品 有 高 濃 度 OXO 及 FLU 殘 留, 樣 品 萃 取 液 進 入 以 LC-ESI/MS/MS 前 稀 釋 25 倍, 檢 測 能 力 試 驗 魚 肉 樣 品 FLU 88.6 ng/g 及 OXO 279 ng/g, 此 次 能 力 試 驗 指 定 值 (assigned value) 70

85 FLU 90.8 ng/g 及 OXO 286 ng/g 經 統 計 分 析 以 此 方 法 檢 測 結 果 表 現 為 滿 意 ( 二 者 Z 值 均 為 -0.1), 此 外 也 使 用 本 研 究 開 發 之 HPLC-FLD(Chang et al., 2008) 檢 測, 表 3-7 顯 示 兩 種 方 法 均 可 達 到 滿 意 的 結 果 圖 3-3 能 力 試 驗 魚 肉 樣 品 OXO 及 FLU 之 LC-ESI/MS/MS 離 子 層 析 圖 71

86 表 種 QNs 於 吳 郭 魚 ( 魚 片 ) 之 基 質 效 應 與 絕 對 回 收 率 (n=4) Quinolone Matrix effect, % Recovery, % NAL FLU OXO CIN PIR PIP des-cip NOR ENO CIP LOM DAN ENR OFL MAR SAR ORB DIF

87 表 種 QNs 於 牛 奶 魚 蝦 豬 肉 雞 肉 之 CCα 及 CCβ 值 Quinolone Fish Shrimp Pork Chicken Milk CCα ng/g CCβ ng/g CCα ng/g CCβ ng/g CCα ng/g CCβ ng/g CCα ng/g CCβ ng/g CCα ng/g CCβ ng/g NAL FLU 0.44 a 0.59 b a 0.59 b 0.48 a 0.66 b OXO 0.48 a 0.66 b 0.42 a 0.58 b CIN PIR PIP des-cip NOR ENO CIP LOM DAN a 0.76 b 0.50 a 0.68 b ENR OFL MAR SAR a 0.52 b ORB DIF a: LOD ( 衛 生 署 有 訂 定 殘 留 容 許 量 之 基 質 ) b: LOQ ( 衛 生 署 有 訂 定 殘 留 容 許 量 之 基 質 ) 表 3-7 LC-ESI /MS/MS 及 HPLC-FLD 方 法 檢 測 FAPAS 能 力 試 驗 結 果 (n=3) Quinolone 方 法 LC-ESI/MS/MS LC-FLD ng/g R.S.D. ng/g R.S.D. FLU 88.6 (5.2 %) 86.9 (4.3 %) OXO (9.7 %) (9.5 %) 73

88 圖 3-3 能 力 試 驗 魚 肉 樣 品 OXO 及 FLU 之 LC-ESI/MS/MS 離 子 層 析 圖 74

89 第 四 節 討 論 一 質 譜 測 定 歐 盟 針 對 分 析 食 品 中 藥 物 殘 留 之 準 確 性, 於 歐 盟 法 規 96/23/EC 中 指 出 根 據 質 譜 儀 的 種 類 訂 定 得 分 點 Identification points (Ips), 對 於 group A 類 ( 禁 用 物 質 ) 之 化 合 物 最 少 需 4 Ips 低 解 析 質 譜 儀 (Low resolution mass spectrometry, LR), 偵 測 每 種 藥 物 取 其 母 離 子 之 m/z (LR-MS n precursor ion) 經 擊 碎 後 偵 測 子 離 子 之 m/z (LR-MS n transition products), 測 定 方 法 取 每 種 待 測 藥 物 選 一 個 母 離 子 得 到 (1.0 IP) 與 對 應 兩 個 子 離 子 (1.5 Ips 2=3.0 Ips), 故 本 研 究 以 串 聯 式 層 析 質 譜 儀 (LC/MS/MS) 檢 測 每 種 待 測 物 的 得 分 點 為 4 Ips, 符 合 歐 盟 之 規 範 選 擇 MRM 模 式, 可 有 效 減 少 背 景 干 擾 及 提 高 靈 敏 度 由 於 QNs 結 構 之 胺 基 (amino group) 在 酸 性 環 境 下 很 容 易 帶 正 電 荷, 以 ESI(+) 離 子 化 採 用 MRM 掃 瞄 模 式 分 析 鎖 定 母 離 子 MH + 經 撞 擊 後 再 偵 測 子 離 子 的 含 量 林 等 人 (2004) 比 較 移 動 相 中 不 同 濃 度 的 甲 酸 和 乙 酸 對 NOR OFL CIP ENR 離 子 化 效 率 的 影 響, 結 果 顯 示 甲 酸 比 乙 酸 更 有 利 於 FQNs 的 離 子 ( 質 子 ) 化, 應 是 甲 酸 給 質 子 的 能 力 優 於 乙 酸 所 致, 也 是 本 試 驗 中 移 動 相 中 添 加 0.1% 甲 酸 的 原 因 本 研 究 選 擇 18 種 常 見 之 QNs 進 行 方 法 開 發, Durden 等 (2007) 檢 測 6 種 FQNs 二 次 質 譜 顯 示 脫 水 峰 MH-18 + 脫 羧 峰 MH-44 + 是 2 個 主 要 離 子 碎 片, 因 此 在 進 行 MRM 檢 測 時 選 擇 脫 羧 峰 和 脫 羧 後 piperazinyl 環 斷 裂 重 排 的 產 物 離 子 作 為 監 測 離 子 以 提 高 質 譜 確 認 的 正 確 性 表 3-2 定 量 定 性 離 子 的 選 擇 (FLU, OXO, DIF, MAR, CIP, DAN, ENR, SAR 及 NOR) 與 Hermo 等 人 (2006) 報 告 一 致 75

90 二 樣 品 萃 取 及 淨 化 雖 然 有 許 多 LC/MS/MS 方 法 檢 測 不 同 動 物 性 食 品 源 之 QNs 殘 留 分 析 方 法, 如 魚 ( 林 等, 2004; Hatano, 2004; Hoof et al., 2005; Dufresne et al., 2007; Johnston et al., 2002; Samanidou et al., 2008) 動 物 內 臟 如 肝 (Verdon et al., 2005) 腎 (Toussaint et al, 2005) 及 肌 肉 (Hatano, 2004; Hermo et al., 2006; Clemente et al., 2006) 牛 奶 (Hoof et al., 2005 ; Hermo et al., 2006) 雞 蛋 (Durden et al., 2007), 檢 視 所 使 用 的 方 法 均 需 使 用 繁 覆 耗 時 的 萃 取 及 淨 化 步 驟 ( 液 - 液 萃 取 結 合 固 相 萃 取 步 驟 ), 本 研 究 利 用 LC-ESI/MS/MS 配 合 MRM 模 式 俱 有 高 靈 敏 度 高 選 擇 性 之 特 性 檢 測 複 雜 的 生 物 基 質 QNs 殘 留, 採 用 簡 單 快 速 之 液 - 液 萃 取 方 法, 樣 品 之 萃 取 液 為 含 1% 甲 酸 之 氰 甲 烷 溶 液, 經 減 壓 濃 縮 後 以 10% 乙 腈 定 容, 再 以 正 己 烷 去 脂, 適 用 5 種 不 同 基 質 ( 牛 奶 魚 蝦 豬 肉 雞 肉 ) QNs 萃 取 液 氰 甲 烷 含 1% 甲 酸 之 溶 液 的 目 的 是 維 持 在 弱 酸 性 可 增 加 QNs 藥 物 回 收 率, 氰 甲 烷 是 萃 取 及 沉 澱 蛋 白 質 最 佳 溶 劑, 添 加 無 水 硫 酸 鈉 可 去 除 樣 品 中 水 份 及 沉 澱 蛋 白 質 Hatano 等 人 (2004) 指 出 萃 取 QNs 使 用 氰 甲 烷 溶 劑 含 偏 磷 酸 醋 酸 或 甲 酸 的 目 的 是 維 持 在 弱 酸 性 可 增 加 QNs 回 收 率, 而 3 種 酸 ( 偏 磷 酸 醋 酸 及 甲 酸 ) 以 2% 甲 酸 - 氰 甲 烷 回 收 率 最 好 三 基 質 效 應 (matrix effect) 與 絕 對 回 收 率 (absolute recovery) 本 研 究 基 質 效 應 及 絕 對 回 收 率 之 探 討 模 式 係 參 考 Durden 等 (2007) 探 討 6 種 FQNs (CIP DAN ENR SAR LOM NOR) 於 雞 蛋 在 LC-ESI/MS/MS 之 基 質 效 應 及 絕 對 回 收 率,6 種 FQNs 基 質 效 應 102% (CIP) 至 116%( NOR) 絕 對 回 收 率 49% (CIP) 至 80% (LOM), 由 其 基 值 效 應 絕 對 回 收 率 推 論 兩 者 之 差 值 ( 基 值 效 應 - 絕 對 回 收 率 ) 可 反 76

91 映 萃 取 步 驟 造 成 的 流 失, 經 由 萃 取 步 驟 造 成 的 流 失 從 28 % (ENR)~66 % (NOR) Samanidou 等 (2008) 評 估 7 種 QNs 在 鱸 魚 萃 取 液 基 質 效 應 從 DAN ENR 與 FLU 20 到 40 % 之 抑 制 效 應, 對 CIP 則 為 180 % 增 強 效 應, 但 對 SAR OXO 及 NAL 沒 有 影 響 生 物 性 樣 品 進 行 藥 物 殘 留 檢 測, 經 萃 取 之 基 質 (matrix) 進 入 質 譜 儀 電 噴 灑 離 子 化 後, 基 質 中 的 成 份 ( 鹽 類 蛋 白 質 脂 肪 碳 水 化 合 物 醣 類 等 ) 均 會 干 擾 目 標 分 析 物 離 子 化 程 度, 基 質 效 應 可 能 是 抑 制 (ion suppression) 或 是 增 強 (enhancing) 反 應 (Samanidou et al., 2008), 降 低 基 質 效 應 的 方 法 可 使 用 有 效 率 的 淨 化 步 驟 或 是 改 變 層 析 條 件, 但 都 無 法 完 全 避 免 (Khong et al., 2005) Khong 等 (2005) 以 LC-ESI/MS/MS 定 量 蜂 蜜 中 的 四 環 素 類 抗 生 素 (tetracyclines; TCs), 發 現 TCs 蜂 蜜 萃 取 液 中 有 很 強 的 基 質 效 應,4 種 蜂 蜜 ( 瑞 士 不 同 地 區 或 不 同 花 蜜 來 源 的 蜂 蜜 ) 基 質 添 加 四 環 素 (tetracycline) 之 檢 量 線 與 溶 於 溶 劑 之 四 環 素 檢 量 線 做 比 較, 基 質 效 應 範 圍 從 163 % ( 瑞 士 相 思 樹 花 蜜 源 ) 至 226 % ( 瑞 士 多 種 花 蜜 源 ) 選 擇 內 標 (internal standard;is) 可 校 正 基 質 效 應 或 校 正 經 由 萃 取 過 程 造 成 的 損 失, 有 許 多 文 獻 在 建 立 多 重 分 析 QNs 添 加 內 標 :Toussaint 等 (2005) 採 用 LOM 為 內 標 定 量 兩 性 (amphoteric) QNs, 選 用 cincophen 為 內 標 定 量 酸 性 QNs;Durden 等 (2007) 採 用 NOR 為 內 標 定 量 CIP, 選 擇 LOM 為 內 標 定 量 DAN ENR 及 SAR ;Dufresne 等 (2007) 使 用 LOM 及 PIP 為 內 標 ; Hermo 等 (2006a) 採 用 NOR 為 內 標 同 位 素 (isotope) 內 標 是 最 佳 的 選 擇, 在 吳 郭 魚 ENR 及 其 代 謝 物 之 藥 物 動 力 學 研 究, 選 用 d5-enr 作 為 檢 測 ENR CIP 及 des-cip 之 內 標 是 適 當 的, 但 d5-enr 無 法 代 表 18 種 QNs 在 建 立 多 重 QNs 殘 留 分 析 方 法 要 選 擇 適 當 的 內 標 是 77

92 非 常 困 難, 故 本 研 究 使 用 外 添 加 法 於 基 質 中 建 立 檢 量 線 方 式 定 量, 建 議 當 樣 品 檢 出 QNs 殘 留 時 以 採 用 空 白 基 質 萃 取 後 添 加 之 檢 量 線 (matrix calibration curves;mcc) 模 式 定 量 78

93 第 四 章 恩 氟 喹 諾 酮 羧 酸 及 其 代 謝 物 在 吳 郭 魚 體 內 的 藥 物 動 力 學 之 研 究 第 一 節 引 言 恩 氟 喹 諾 酮 羧 酸 (enrofloxacin; ENR) 是 新 一 代 的 氟 喹 諾 酮 合 成 抗 菌 劑, 由 於 具 有 抗 菌 活 性 高 抗 菌 範 圍 廣 口 服 吸 收 完 全 體 內 分 佈 廣 等 優 點, 已 廣 泛 應 用 於 家 畜 禽 動 物 細 菌 性 疾 病 的 防 治 環 丙 沙 星 (ciprofloxacin; CIP) 是 ENR 的 主 要 代 謝 物 (ENR 脫 烷 基 ) 同 樣 具 有 療 效 (Papich et al., 2001), 目 前 已 應 用 於 人 醫 治 療 有 許 多 研 究 證 明 ENR 在 動 物 體 內 代 謝 為 CIP, 例 如 : 哺 乳 動 物 (Kung et al., 1993) 鳥 類 (Knoll et al., 1999 ) 魚 類 (Lewbart et al., 1990; Kim et al., 2006 ) 大 多 數 藥 物 在 動 物 體 內 都 會 發 生 生 物 轉 化, 形 成 極 性 強 水 溶 性 較 大 的 代 謝 物 而 目 前 對 水 產 動 物 藥 物 動 力 學 的 研 究, 多 針 對 原 形 藥 物, 然 而 代 謝 物 在 體 內 的 存 在 型 式 消 除 速 率 及 檢 測 也 是 藥 物 動 力 學 研 究 的 重 點 藉 由 LC-ESI/MS/MS 同 步 分 析 18 種 喹 諾 酮 類 抗 菌 劑 殘 留 方 法 之 建 立, 可 快 速 同 步 分 析 吳 郭 魚 體 內 ENR 及 其 代 謝 物 (CIP 與 des-cip) 殘 留 由 於 需 分 析 較 多 檢 體, 利 用 已 建 立 之 LC-ESI/MS/MS 方 法 加 入 內 標 (d5-enr), 並 簡 化 流 程 以 校 正 ENR CIP 與 des-cip 之 檢 測 有 關 水 產 動 物 ENR 藥 物 動 力 學 的 研 究 主 要 以 養 殖 規 模 較 大 之 經 濟 魚 類, 如 虹 鳟 (Bowser et al., 1992) 褐 鳟 (Koc et al., 2009) 大 西 洋 鮭 (Stoffregen et al., 1997) 淡 水 鲳 魚 (Lewbart et al., 1997) 尖 吻 鱸 (Intorre et al., 2000) 金 頭 鯛 (Rocca et al., 2004) 鯰 魚 (Kim et al., 2006 ), 甲 殼 類 動 物 有 中 華 絨 毛 蟹 (Tang et al., 2006) 鋸 緣 青 蟹 (Fang et al., 2007), 軟 體 動 物 有 歐 洲 烏 賊 (Gore et al., 2005), 尚 未 有 ENR 於 吳 郭 魚 之 藥 物 動 力 學 的 研 究 本 研 究 利 用 已 建 立 之 LC/MS/MS 方 法 分 析 吳 郭 魚 口 服 給 藥 (10 mg/kg) 及 血 管 給 藥 (2.5 mg/kg) 單 一 劑 量 恩 氟 喹 諾 酮 羧 酸 溶 液 後, 檢 測 各 臟 器 組 織 ENR CIP 與 des-cip 之 殘 留 量, 將 ENR CIP 與 des-cip 之 濃 度 各 與 採 樣 時 間 作 圖, 以 79

94 WinNonLin 軟 體 進 行 藥 物 動 力 學 分 析, 探 討 ENR 及 其 代 謝 物 在 吳 郭 魚 體 內 的 吸 收 分 佈 代 謝 與 排 除 的 情 形 除 了 瞭 解 藥 物 代 謝 模 式 外, 進 而 探 討 ENR 及 其 代 謝 物 (CIP, des-cip) 在 吳 郭 魚 體 內 的 分 佈 與 其 殘 留 機 制 藥 物 動 力 學 主 要 參 數 (Cmax T max t1/2α t1/2β AUC Cl) 是 設 計 給 藥 方 案 及 進 行 治 療 藥 物 監 測 (therapy drug monitor;tdm) 之 依 據, 進 而 達 到 最 有 效 的 治 療 作 用, 提 供 正 確 用 藥 及 水 產 品 安 全 監 控 與 管 理 的 理 論 基 礎, 確 保 我 國 水 產 養 殖 永 續 經 營 80

95 第 二 節 儀 器 材 料 及 方 法 一 藥 品 及 儀 器 設 備 1. 藥 品 及 溶 液 配 製 1.1 藥 品 : 本 實 驗 所 使 用 之 藥 品 皆 為 試 藥 級 以 上 的 藥 劑,ciprofloxacin (CIP, 100.0%), d5-enrofloxacin 購 自 RDH;Enrofloxacin (ENR, 98%) 購 自 Fluka;Desethylene ciprofloxacin HCl (des-cip, 98%) 購 自 Toronto Research sodium hydroxide (NaOH) 為 試 藥 特 級 購 自 Nacalai Tesque; 甲 酸 (formic acid) 甲 醇 (methanol ) 及 氰 甲 烷 (acetonitrile) 為 HPLC 級 購 自 J.T. Baker; 超 純 水 由 Milli-Q system (Millipore, Bedford, MA) 製 造 1.2. 溶 液 配 製 及 標 準 曲 線 的 繪 製 3 種 QNs 標 準 品 (ENR CIP des-cip) 以 50% 氰 甲 烷 含 2% 0.1 N 氫 氧 化 鈉 溶 液 配 製 成 200μg/ ml 濃 度, 以 10% 氰 甲 烷 稀 釋 配 製 成 10μg/ ml 混 合 標 準 品 內 標 d5-enrofloxacin (d5-enr) 以 50% 氰 甲 烷 含 2% 0.1 N 氫 氧 化 鈉 溶 液 配 製 成 10μg/ ml 濃 度 3 種 QNs 10μg/mL 混 合 標 準 品 再 以 10% 氰 甲 烷 稀 釋 兩 條 不 同 範 圍 之 檢 量 線 ( 及 5μg / ml ) 及 ( 及 1.0μg / ml), 檢 量 線 每 一 濃 度 標 準 品 均 添 加 最 終 濃 度 為 0.01μg / ml d5-enr 溶 液 為 內 標 標 準 曲 線 的 橫 座 標 為 分 析 物 濃 度 / 內 標 濃 度 縱 座 標 為 分 析 物 面 積 / 內 標 面 積 2. 儀 器 設 備 及 條 件 2.1. 儀 器 設 備 : 參 考 第 三 章 高 效 液 相 層 析 儀 及 質 譜 條 件 : 參 考 第 三 章 2.2 移 動 相 組 成 : 溶 液 A 為 去 離 子 水 ( 含 20 mm 甲 酸 銨 0.1% 甲 酸 ), 溶 液 B 為 氰 甲 烷 ( 含 0.1% 甲 酸 ) 依 表 4-1 移 動 相 之 梯 度 設 定 81

96 表 4-1 分 析 ENR CIP 及 des-cip 藥 物 移 動 相 之 梯 度 設 定 移 動 相 流 速 :0.7 ml/min, 注 入 體 積 :10 μl 時 間 (min) A(%) B (%) 表 4-2. 最 佳 化 二 次 質 譜 MRM 之 參 數 設 定 母 離 子 m/z 子 離 子 m/z DP V CE V Des-CIP CIP ENR D5-ENR

97 二 實 驗 用 魚 選 用 魚 體 沒 有 受 傷 游 動 力 正 常 之 吳 郭 魚 (Oreochromis hygrids Tilapia spp.)112 尾, 購 自 台 南 縣 養 殖 場, 體 重 650 ± 50 g/ 尾, 先 於 魚 池 馴 養 二 週 後, 犧 牲 一 尾 吳 郭 魚 分 析 確 認 無 藥 物 殘 留 後, 始 得 供 作 試 驗 三 養 殖 條 件 養 殖 池 ( 長 寬 : cm, 高 水 位 水 深 為 68.5 cm), 水 溫 25 ± 1, 連 續 充 氣, 日 換 水 量 50%, 溶 解 氧 大 於 6.0 mg/l, 試 驗 期 間 投 餵 不 含 藥 物 的 餌 料 四 給 藥 方 式 精 確 秤 取 ENR 2.5 g 加 入 50 ml 定 量 瓶, 加 入 30 ml 蒸 餾 水 及 5 ml 1N 氫 氧 化 鈉 溶 液 溶 解, 蒸 餾 水 定 容 至 50 ml, 置 於 超 音 波 水 浴 槽 振 盪 使 藥 物 均 勻 溶 解, 配 製 成 50 mg/ml 的 ENR 儲 備 溶 液 以 50 mm ph 9.0 之 磷 酸 氫 二 鉀 緩 衝 液 稀 釋 配 製 成 2.5 mg/kg.bw 的 尾 部 血 管 給 藥, 注 射 部 位 通 過 注 射 前 回 抽 尾 部 血 管 血 液 確 認 ( 圖 4-1)10 mg/kg. BW 用 塑 膠 軟 管 強 制 灌 入 ENR 標 準 品 溶 液 吳 郭 魚 的 食 道 ( 圖 4-2 ), 確 認 沒 有 回 吐 現 象 五 取 樣 吳 郭 魚 給 藥 劑 量 分 別 為 : 口 服 劑 量 10 mg/kg.bw 血 管 給 藥 劑 量 2.5 mg/kg. BW, 給 藥 後 間 隔 及 168 小 時 取 樣 ( 血 漿 肝 臟 腎 臟 胆 汁 及 肌 肉 ), 每 個 時 間 點 採 取 4 尾 魚 注 射 針 事 先 以 1% 肝 素 ( 作 為 抗 凝 血 劑 ) 83

98 潤 濕 後, 尾 部 血 管 採 取 血 液 2 ml 置 入 微 量 離 心 管 中 ; 以 注 射 針 吸 取 胆 汁 2 ml; 解 剖 分 離 ( 圖 4-3) 肝 臟 及 後 腎 ; 由 魚 體 一 側 取 去 皮 肌 肉 約 100 g 樣 品, 所 有 樣 品 立 即 保 存 至 -20 六 樣 品 製 備 ( 依 組 織 差 異 分 別 以 不 同 流 程 進 行 ) 1. 全 血 胆 汁 肌 肉 樣 品 : 解 凍 均 質 後 稱 取 1.0 g 放 置 於 50 ml 塑 膠 離 心 管 ; 加 入 20 ml 氰 甲 烷 0.05 ml D5-ENR 1 μg/ml 及 0.2 ml 甲 酸 以 振 盪 器 高 速 振 盪 萃 取 1 分 鐘 後, 再 加 入 約 2 g 無 水 硫 酸 鈉 振 盪 萃 取 10 分 鐘, 以 6000 rpm 4 離 心 10 分 鐘 將 上 層 液 經 濾 紙 過 濾 後 倒 入 250 ml 濃 縮 瓶,40 減 壓 濃 縮 乾 涸, 以 10% 氰 甲 烷 定 容 5 ml, 檢 液 以 0.22 μm Nylon 濾 膜 過 濾 2. 肝 臟 樣 品 : 解 凍 後 稱 取 1.0 g 放 置 於 50 ml 塑 膠 離 心 管 ; 加 入 20 ml 氰 甲 烷 0.1 ml D5-ENR 1 μg/ml 及 0.2 ml 甲 酸 以 振 盪 器 高 速 振 盪 萃 取 1 分 鐘 後, 再 加 入 約 2 g 無 水 硫 酸 鈉 振 盪 萃 取 10 分 鐘, 以 6000 rpm 4 離 心 10 分 鐘 將 上 層 液 經 濾 紙 過 濾 後 倒 入 250 ml 濃 縮 瓶,40 減 壓 濃 縮 乾 涸, 以 10% 氰 甲 烷 定 容 10 ml, 檢 液 以 0.22 μm Nylon 濾 膜 過 濾 3. 後 腎 樣 品 : 解 凍 後 稱 取 0.25 g 放 置 於 50 ml 塑 膠 離 心 管 ; 加 入 20 ml 氰 甲 烷 0.05 ml D5-ENR 1 μg/ml 及 0.2 ml 甲 酸 以 振 盪 器 高 速 振 盪 萃 取 1 分 鐘 後 再 加 入 約 2 g 無 水 硫 酸 鈉 振 盪 萃 取 10 分 鐘 以 6000 rpm 4 離 心 分 鐘 將 上 層 液 經 濾 紙 過 濾 後 倒 入 250 ml 濃 縮 瓶 40 減 壓 濃 縮 乾 涸, 以 10% 氰 甲 烷 定 容 5 ml, 檢 液 以 0.22 μm Nylon 濾 膜 過 濾 84

99 圖 4-1 吳 郭 魚 以 尾 部 血 管 進 行 注 射 給 藥 圖 4-2 吳 郭 魚 以 塑 膠 軟 管 口 服 投 藥 85

100 圖 4-3 吳 郭 魚 採 樣 組 織 ( 肌 肉 肝 臟 胆 汁 及 腎 臟 ) 86

101 七 數 據 分 析 採 集 的 組 織 樣 品 以 LC/MS/MS 分 析 ENR CIP 與 des-cip 之 含 量, 而 ENR CIP 在 吳 郭 魚 各 組 織 中 之 藥 物 動 力 學 則 以 WinNonlin Professional (ver.5.1, Phasight Corp., Mountain View, CA, U.S.A.) 軟 體 分 析 藥 物 動 力 學 模 式 與 相 關 參 數 的 計 算 1. 血 管 注 射 ENR 給 藥 使 用 之 動 力 學 模 式 與 方 程 式 如 下 : Model: 2 compartment IV-Bolus, macro-constants, no lag time, 1 st order elimination 二 指 數 方 程 式 : Ct = A*exp (-α*t) +B* exp (-β*t) (Ct: 血 管 給 藥 後 血 漿 中 藥 物 濃 度,A B 為 在 單 位 時 間 為 零 時 血 漿 中 藥 物 分 佈 排 除 相 之 截 距,exp 為 自 然 對 數,t: 時 間,α: 分 布 常 數,β: 排 除 常 數 ) 87

102 2. 口 服 ENR 給 藥 使 用 之 動 力 學 模 式 與 方 程 式 如 下 : 2 compartment 1st Order, macro-constants, no lag time, 1st order elimination 二 指 數 方 程 式 : Ct = A*exp (-α*t) +B* exp (-β*t) ) +C* exp (-K01*t) (Ct 口 服 給 藥 後 血 漿 中 藥 物,A B C 為 在 單 位 時 間 為 零 時 血 漿 中 藥 物 分 佈 排 除 及 口 服 吸 收 相 之 截 距,exp 為 自 然 對 數,t 時 間,α 分 布 常 數, β 排 除 常 數,K01 吸 收 速 率 常 數 ) 八 回 收 率 試 驗 分 別 取 濃 度 為 μg/ ml 標 準 品 0.05 ml 及 內 部 標 準 品 1 μg/ ml d5-enr 0.05 ml 加 入 空 白 全 血 及 肌 肉 中, 依 六 樣 品 製 備 之 1. 全 血 肌 肉 樣 品 製 備 流 程 萃 取, 每 一 濃 度 均 做 4 重 覆 試 驗, 計 算 回 收 率 88

103 第 三 節 結 果 一 方 法 確 效 在 測 定 ENR 及 其 代 謝 物 的 血 中 濃 度 時, 首 先 對 方 法 進 行 驗 證, 測 定 3 個 濃 度 的 回 收 率 ( 每 一 個 樣 品 四 重 覆 ) 及 相 對 標 準 偏 差 (RSD), 同 時 要 求 方 法 的 靈 敏 度 ( 最 低 偵 測 極 限 ) 內 標 (Internal Standard) 的 使 用 在 分 析 上 相 當 普 遍, 在 LC/MS/MS 檢 測 內 標 同 位 素 (isotope) 是 最 佳 的 選 擇, 本 研 究 使 用 氘 化 物 d5-enr 每 ㄧ 標 準 品 ( 含 分 析 樣 品 ) 皆 含 d5-enr 上 機 濃 度 0.01 μg/g, 目 的 是 校 正 ENR CIP des-cip 之 基 質 效 應 及 回 收 率 為 因 應 待 測 檢 體 濃 度 的 廣 範 圍 (0.01~37 μg/g), 本 試 驗 採 取 兩 種 措 施, 使 待 測 檢 體 分 析 濃 度 在 線 性 範 圍 內 :1. 不 同 檢 體 稀 釋 倍 率 不 同 ( 全 血 胆 汁 肌 肉 樣 品 稀 釋 5 倍 ; 肝 臟 樣 品 稀 釋 10 倍 ; 腎 臟 樣 品 稀 釋 20 倍 ),2. 兩 條 不 同 濃 度 範 圍 之 標 準 品 (1.0~5.0 及 0.01~1.0μg/mL ), 觀 測 不 同 濃 度 範 圍 之 標 準 品 添 加 相 同 濃 度 內 標 (d5-enr 0.01 μg/ml), 以 0.05μg/mL 標 準 品 之 內 標 面 積 為 基 準 值 100%,0.01~1.0 ppm 內 標 相 對 值 為 90~105%;1.5~5.0 μg/ml 內 標 相 對 值 為 80~60%, 由 此 推 論 高 濃 度 標 準 品 進 入 質 譜 儀 會 與 內 標 (d5-enr 0.01 μg/g) 競 爭 離 子 游 離 化 效 能, 導 致 在 高 濃 度 標 準 品 之 內 標 面 積 較 低 的 原 因, 也 說 明 在 測 定 過 程 中 需 兩 條 不 同 濃 度 範 圍 之 標 準 品 混 合 3 種 QNs 標 準 品 (ENR CIP des-cip) 濃 度 檢 量 線 如 表 4-3, 每 一 種 QN 之 線 性 相 關 係 數 r 2 均 大 於 0.995, 定 量 偵 測 極 限 (LOQ)10 ng/g 吳 郭 魚 全 血 肌 肉 樣 品 分 別 以 μg/g 濃 度 做 添 加 回 收 及 精 密 度 試 驗 如 表 4-4 及 4-5, 全 血 平 均 回 收 率 86.91~103.2%, 相 對 標 準 偏 差 (RSD) 4.2~7.5%; 肌 肉 樣 品 平 均 回 收 率 89.85~98.20%,RSD 4.0~7.9% 測 得 的 日 間 精 密 度 89

104 表 種 喹 諾 酮 類 抗 菌 劑 標 準 曲 線 之 線 性 方 程 式 及 相 關 係 數 藥 品 選 擇 監 測 之 定 量 子 離 子 1.0~5.0 ppm r 值 0.01~1.0 ppm r 值 des-cip m/z y=134x-35 r= y=0.256x+5.52 r= CIP m/z y=88.2x-25.8 r= y=0.165x+1.01 r= ENR m/z y=147x-49.2 r= y=0.239x-2.48 r= 表 4-4 全 血 添 加 ENR CIP des-cip 回 收 率 及 方 法 精 密 度 (n=4) 藥 品 濃 度 μg/g ENR CIP des-cip 回 收 率 % Intra-day RSD (%) 表 4-5 魚 肉 添 加 ENR CIP des-cip 回 收 率 及 精 密 度 (n=4) 藥 品 濃 度 μg/g 回 收 率 % Intra-day RSD (%) ENR CIP des-cip

105 均 < 10% 由 此 可 判 定 本 測 定 方 法 具 有 較 高 的 準 確 度 及 可 靠 性 本 試 驗 僅 對 吳 郭 魚 之 全 血 及 肌 肉 做 方 法 確 效, 至 於 腎 臟 肝 臟 胆 汁 雖 未 進 行 方 法 確 效, 但 每 一 待 測 檢 體 均 添 加 內 標 d5-enr 0.01μg/g 可 校 正 基 質 效 應 及 回 收 率, 確 認 方 法 之 準 確 性 及 再 現 性 二 給 藥 後 ENR 及 其 代 謝 物 的 代 謝 途 徑 ENR 以 10 mg/kg b.w 單 次 口 服 ( 強 制 管 灌 ) 給 藥 吳 郭 魚 後, 並 分 別 在 0.25 到 168 小 時 內 的 14 個 時 間 點 採 樣 檢 測, 依 前 述 方 法 對 各 組 織 進 行 萃 取, 測 得 其 各 組 織 ( 血 腎 肝 胆 汁 及 肉 ) 中 ENR 及 CIP 的 濃 度, 以 探 討 其 變 化, 其 結 果 如 表 4-6 及 表 4-7 ENR 以 2.5 mg/kg.b.w 單 次 尾 部 血 管 注 射 給 藥 後, 以 相 同 模 式 測 得 其 各 組 織 ( 血 腎 肝 胆 汁 及 肉 ) 中 ENR 及 CIP 的 濃 度 見 表 4-8 及 表 4-9 組 織 中 殘 留 物 主 要 是 ENR 原 形 藥 物, 口 服 給 藥 各 組 織 中 均 可 偵 測 到 ENR 的 代 謝 物 CIP; 血 管 給 藥 在 血 液 及 肉 中 測 不 到 CIP, 腎 肝 胆 汁 可 偵 測 到 CIP; 至 於 CIP 的 代 謝 物 des-cip 只 在 口 服 給 藥 後 第 5~7 天 測 得 0.01~0.03 μg/g, 圖 4-4 口 服 給 藥 後 第 5 天 膽 汁 中 ENR CIP 及 des-cip 之 LC/MS/MS 離 子 層 析 圖 表 4-10 及 表 4-11 為 ENR 在 各 組 織 中 CIP 轉 換 率 :CIP 濃 度 /(ENR 濃 度 + CIP 濃 度 )x 100, 口 服 給 藥 代 謝 物 CIP 於 血 液 及 肌 肉 轉 換 率 為 0.43~5.07 % 肝 中 轉 換 率 為 0.72~12.19 %, 腎 中 轉 換 率 為 0.59~9.10 %, 胆 汁 中 CIP 隨 時 間 不 斷 累 積, 其 轉 換 率 為 1.68 ~40.42 % 血 管 給 藥 代 謝 物 CIP 於 血 液 及 肌 肉 轉 換 率 為 0 % 腎 中 轉 換 率 為 0.76~7.81 % 肝 中 轉 換 率 為 1.94~16.59 %, 膽 汁 中 CIP 轉 換 率 為 3.31~52.5 % 由 此 推 論 ENR 在 吳 郭 魚 體 內 主 要 在 肝 臟 中 代 謝, 最 高 有 40 % 轉 化 成 CIP 91

106 表 4-6 口 服 給 藥 後 血 腎 肝 胆 汁 及 肉 中 ENR 的 濃 度 時 間 ( 小 時 ) 血 μg/g 腎 μg/g 肝 μg/g 胆 汁 μg/g 肉 μg/g ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±0.20 表 4-7 口 服 給 藥 後 血 腎 肝 胆 汁 及 肉 中 CIP 的 濃 度 時 間 ( 小 時 ) 血 μg/g 腎 μg/g 肝 μg/g 胆 汁 μg/g 肉 μg/g ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±

107 表 4-8 血 管 注 射 血 腎 肝 胆 汁 及 肉 中 ENR 的 濃 度 時 間 ( 小 時 ) 血 μg/g 腎 μg/g 肝 μg/g 胆 汁 μg/g 肉 μg/g ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±0.07 表 4-9 血 管 注 射 ENR 血 腎 肝 胆 汁 及 肉 中 CIP 濃 度 時 間 ( 小 時 ) 血 μg/g 腎 μg/g 肝 μg/g 胆 汁 μg/g 肉 μg/g 0.25 ND 0.36± ± ±0.005 ND 0.5 ND 0.14± ± ±0.005 ND 1 ND 0.15± ± ±0.005 ND 2 ND 0.16± ± ±0.005 ND 4 ND 0.17± ± ±0.008 ND 8 ND 0.08± ± ±0.01 ND 16 ND 0.09± ± ±0.51 ND 24 ND 0.12± ± ±0.43 ND 48 ND 0.17± ± ±0.21 ND 72 ND 0.20± ± ±0.19 ND 96 ND 0.15± ± ±0.53 ND 120 ND 0.12± ± ±0.15 ND 144 ND 0.15± ± ±0.45 ND 168 ND 0.11± ± ±0.38 ND ND:Not Detected 93

108 表 4-10 口 服 給 藥 ENR 在 各 組 織 中 CIP 轉 換 率 時 間 blood Kinedy Liver Bile Muscle h % % % % % 表 4-11 血 管 注 射 ENR 在 各 組 織 中 CIP 轉 換 率 時 間 h blood % Kinedy % Liver % Bile % Muscle %

109 圖 4-5 及 4-6 吳 郭 魚 口 服 給 藥 各 組 織 中 ENR 濃 度 變 化,ENR 給 藥 後 迅 速 分 布 於 各 組 織 與 器 官, 給 藥 後 15 分 鐘 各 組 織 都 檢 測 到 ENR, 血 液 及 腎 臟 濃 度 在 1 小 時 後 達 最 高 峰 值, 第 1~8 小 時 快 速 下 降, 其 後 濃 度 開 始 緩 慢 下 降, 各 組 織 均 明 顯 有 雙 峰 現 象 ENR 在 胆 汁 中 1 小 時 後 大 量 累 積, 第 4~6 小 時 持 續 累 積 高 濃 度 ENR (18.78~25.1 μg/g), 透 過 腸 肝 循 環 (enterohepatic cycle), ENR 會 持 續 釋 出 至 血 液 及 肌 肉 中, 造 成 當 實 驗 結 束 時 ( 第 7 天 ) 血 液 及 肌 肉 中 均 維 持 在 1.02 及 1.51 μg/g 高 濃 度 圖 4-7 及 4-8 吳 郭 魚 血 管 注 射 後 各 組 織 中 ENR 之 濃 度 變 化,ENR 給 藥 後 迅 速 分 布 於 各 組 織 與 器 官, 給 藥 後 15 分 鐘 之 腎 臟 及 血 液 均 達 最 高 值, 第 0.25~24 小 時 快 速 下 降, 其 後 濃 度 開 始 緩 慢 下 降 由 圖 4-5~4-8 分 析 吳 郭 魚 體 內 代 謝 ENR 主 要 通 過 肝 臟 和 腎 臟 進 行 代 謝, 前 期 腎 臟 代 謝 更 為 明 顯, 即 通 過 排 泄 作 用 將 藥 物 排 出 體 外, 腎 臟 在 完 成 前 期 的 代 謝 作 用 後, 殘 留 情 形 和 血 液 及 肌 肉 中 的 殘 留 趨 勢 相 同, 消 除 相 當 緩 慢 肝 臟 在 前 期 主 要 是 進 行 生 物 轉 化 作 用 ( 透 過 N- 脫 烷 基 化 N- 氧 化 反 應 和 葡 萄 糖 醛 酸 結 合 反 應 ) 進 行 藥 物 代 謝, 前 期 肝 臟 中 濃 度 低 於 腎 臟 濃 度, 而 後 期 主 要 依 靠 肝 臟 進 行 代 謝, 並 在 胆 囊 中 累 積, 主 要 表 現 為 胆 汁 中 的 藥 物 濃 度 是 所 有 組 織 器 官 中 最 高 的, 且 下 降 緩 慢 當 實 驗 結 束 時 ( 第 7 天 ) 口 服 ENR 及 注 射 ENR 之 胆 汁 中 的 濃 度 維 持 在 及 3.13 μg/g 濃 度 ENR 及 其 代 謝 物 主 要 經 由 腎 和 膽 管 排 出, 故 第 7 天 膽 汁 中 ENR 及 其 代 謝 物 濃 度 高 出 血 液 10 倍 以 上 三 藥 物 動 力 學 分 析 將 血 管 給 藥 之 lncb ( 血 中 藥 物 濃 度 的 對 數 ) 與 Time( 投 藥 後 所 經 過 的 時 間 ) 作 圖, 可 獲 得 如 圖 4-9 之 二 相 性 下 降 曲 線 ( 非 一 直 線 關 係 ), 由 此 推 論 ENR 藥 物 於 吳 郭 魚 之 體 內 動 態 可 採 用 一 級 消 除 二 室 性 模 式 進 行 口 服 給 藥 及 血 95

110 管 注 射 ENR 在 吳 郭 魚 血 中 濃 度 之 藥 物 動 力 學 分 布 經 WinNonlin 分 析 二 室 性 模 式 ( 圖 4-10 及 圖 4-11 ), 由 分 析 後 之 參 數 ( 表 4-12) 分 別 得 到 口 服 給 藥 血 中 ENR 之 排 除 方 程 式 為 Ct= *exp (-2.154*t) * exp (-0.009*t) * exp (-0.324*t) ; 血 管 注 射 給 藥 血 中 ENR 之 排 除 方 程 式 為 Ct=3.397 *exp (-0.529*t) * exp (-0.013*t) 同 時 該 模 式 可 計 算 得 到 各 組 織 之 藥 物 動 力 學 參 數 ( 表 4-13),ENR 之 藥 物 曲 線 下 面 積 (AUC): 口 服 為 血 管 注 射 μg.h/ ml; 排 除 半 衰 期 (t 1/2β ): 口 服 為 血 管 注 射 小 時 ; 總 體 清 除 率 (Cl tot ) : 血 管 注 射 L/h/kg ; 表 現 分 佈 容 積 V d(ss) : 血 管 注 射 L/kg Fabs 絕 對 可 利 用 率 ( absolute bioavailability): 計 算 公 式 (Dimitrova et al., 2007) 如 下 :Fabs %= ( AUCoral / AUC i.v x t 1/2 i.v / t 1/2 oral ) 100, 本 研 究 吳 郭 魚 對 ENR 之 絕 對 可 利 用 率 為 99%, 表 示 口 服 吸 收 良 好 96

111 圖 4-4 口 服 第 5 天 胆 汁 ENR CIP 及 des-cip 之 LC/MS/MS 層 析 圖 97

112 Conc. (μg/g) Time (h) blood kidney liver bile muscle 圖 4-5 吳 郭 魚 口 服 給 藥 (0 至 24 小 時 ) 各 組 織 中 ENR 濃 度 變 化 Conc. (μg/g) Time (h) blood kidney liver bile muscle 圖 4-6 吳 郭 魚 口 服 給 藥 (0 至 168 小 時 ) 各 組 織 中 ENR 濃 度 變 化 98

113 Conc. (ug/g) blood kidney liver bile muscle Time (h) 圖 4-7 吳 郭 魚 血 管 給 藥 (0 至 24 小 時 ) 各 組 織 中 ENR 濃 度 變 化 30 μg/g blood kinedy liver bile muscle Time (h) 圖 4-8 血 管 給 藥 後 (0 至 168 小 時 ) 組 織 中 ENR 濃 度 變 化 99

114 log Conc (μg/g) Time (h) 圖 4-9 吳 郭 魚 血 管 給 藥 ENR 後 血 中 濃 度 變 化 100

115 Observed Predicted Time(hr) 圖 4-10 以 WinNonlin 預 測 吳 郭 魚 血 管 給 藥 ENR 後 在 血 液 內 的 分 佈 Observed Predicted Time(hr) 圖 4-11 以 WinNonlin 預 測 吳 郭 魚 口 服 給 藥 ENR 後 在 血 液 內 的 分 佈 101

116 表 4-12 口 服 給 藥 ENR 在 吳 郭 魚 體 內 的 藥 物 動 力 學 參 數 Parameter Units Estimate StdError AUC μg.h/ml K01_HL 1/hr K10_HL 1/hr α_hl hr β_hl hr K10 1/hr K12 1/hr K21 1/hr Tmax μg/ml Cmax μg/ml 表 4-13 血 管 注 射 給 藥 ENR 在 吳 郭 魚 體 內 的 藥 物 動 力 學 參 數 Parameter Units Estimate StdError AUC μg.h/ml K10_HL 1/hr α_hl hr β_hl hr K10 1/hr K12 1/hr K21 1/hr Cmax μg/ml CL tot L/h/kg V dss L/kg MRT hr

117 第 四 節 討 論 有 關 於 水 產 動 物 ENR 及 代 謝 物 之 藥 物 動 力 學 研 究 所 使 用 之 分 析 方 法 大 多 為 HPLC 方 法 (Rocca et al.,2004 Gore et al.,2005 Tang et al.,2006 Wu et al.,2006 Fang et al.,2007 Koc et al.,2009), 僅 Kim 等 (2006) 應 用 LC/MS 方 法 檢 測 鯰 魚 目 前 尚 未 有 報 告 應 用 LC/MS/MS 方 法 探 討 ENR 及 其 代 謝 物 (CIP 及 des-cip) 之 藥 物 動 力 學 Martinez 等 (2006) 指 出 哺 乳 類 動 物 ( 貓 狗 及 牛 )ENR 主 要 代 謝 途 徑 在 肝 臟, 轉 化 成 主 要 代 謝 物 為 CIP 及 其 它 代 謝 (des-cip) 在 貓 體 內 血 液 可 測 得 有 20 % 轉 化 成 CIP, 在 狗 及 牛 體 內 血 液 可 測 得 有 50% 轉 化 成 CIP 關 於 QNs 藥 物 吸 收 出 現 雙 峰 現 象 探 討 OXO 及 FLU 在 鰻 魚 體 內 的 藥 物 動 力 學 研 究 ( 梁 等,2006) 中 有 發 現, 並 且 OXO 及 FLU 在 膽 汁 中 大 量 累 積 ; 鄭 等 人 (2006) 以 RP-HPLC 法 測 定 中 華 絨 毛 蟹 主 要 組 織 中 ENR 及 其 代 謝 產 物 中 之 研 究 也 有 相 同 現 象 ; 房 等 人 (2006) 以 肌 肉 和 藥 餌 給 藥 下 NOR 在 南 美 白 對 蝦 血 淋 巴 的 藥 物 動 力 學 研 究 中 也 觀 察 到 相 同 現 象, 雙 峰 現 象 可 能 與 腸 肝 循 環 胃 腸 道 吸 收 的 非 齊 性 (unhomogenous) 有 關, 組 織 中 濃 物 變 化 第 二 峰 出 現, 相 當 於 一 次 自 體 給 藥, 勢 必 影 響 藥 物 作 用 強 度 及 消 除 過 程, 使 血 中 藥 濃 度 對 時 間 作 圖 之 曲 線 及 藥 物 動 力 學 模 式 變 得 更 複 雜 具 有 腸 肝 循 環 的 藥 物 最 大 特 色 是 藥 物 作 用 時 間 一 般 較 長 ( 半 衰 期 較 長 ), 通 常 藥 物 在 透 過 膽 汁 排 泄 (biliary excretion) 時 會 受 到 腸 肝 循 環 的 作 用 時 會 有 如 此 分 布 現 象, 經 由 膽 汁 而 排 泄 至 腸 道, 再 被 腸 道 吸 收 後 送 回 肝 臟, 藥 物 在 肝 臟 與 腸 道 持 續 排 出 與 吸 收 下, 使 單 一 劑 量 作 用 時 間 延 長, 有 助 維 持 較 高 之 血 中 濃 度, 充 分 發 揮 藥 效 ( 呂 等,1995) 排 除 速 率 常 數 (elimination constant):k 指 單 位 時 間 內 消 除 藥 物 分 數 (h -1 ),k 反 映 了 生 物 體 內 對 藥 物 的 排 除 能 力, 凡 影 響 肝 功 能 及 腎 功 能 的 因 103

118 素 對 藥 物 之 排 除 有 重 要 影 響, 如 動 物 種 屬 年 齡 性 別 個 體 差 異 肝 或 腎 疾 病 和 合 併 用 藥 排 除 半 衰 期 (t 1/2β ) 反 應 了 藥 物 在 生 物 體 內 之 消 除 速 度, 是 藥 物 動 力 學 的 一 個 重 要 參 數, 意 義 與 重 要 性 與 k 相 似 本 實 驗 中 口 服 管 灌 給 藥 後 可 看 出 ENR 在 吳 郭 魚 體 內 需 花 更 長 時 間 代 謝, 排 除 半 衰 期 較 長 比 較 不 同 水 產 動 物 ENR 排 除 半 衰 期 (t 1/2β ): 中 華 絨 毛 蟹 肝 胰 腺 h ( 鄭 等, 2006) 韓 國 鯰 魚 Korean catfish 口 服 為 h 及 血 管 注 射 h (Kim et al., 2006) 褐 鳟 brown trout 口 服 為 h 及 血 管 注 射 h (Koc et al., 2009) 本 研 究 ENR 在 吳 郭 魚 體 內 排 除 半 衰 期 (t 1/2β ): 口 服 為 h 血 管 注 射 h, 相 較 於 韓 國 鯰 魚 及 褐 鳟 之 排 除 半 衰 期 要 長 許 多, 推 測 原 因 是 ENR 在 吳 郭 魚 體 內 代 謝 是 非 常 典 型 之 腸 肝 循 環, 其 最 大 特 徵 是 藥 物 作 用 時 間 較 長 表 現 分 佈 體 積 (V dss ) 數 值 大 表 示 藥 物 與 組 織 蛋 白 結 合 多, 主 要 分 佈 於 細 胞 內 液 與 組 織 間 液 ;V dss 小 的 表 示 藥 物 與 組 織 蛋 白 結 合 小, 較 集 中 於 血 漿 吳 郭 魚 血 管 給 藥 V dss L//kg, 韓 國 鲶 魚 3.93 L//kg 褐 鳟 3.40 L//kg 鋸 緣 青 蟹 (Fang et al., 2007)1.73 L//kg, 相 較 其 它 水 產 動 物 的 V dss 較 小 藥 物 在 生 體 內 的 可 用 率 (bioavailability) 可 由 進 入 體 循 環 之 速 率 及 進 入 之 藥 物 量 來 描 述 當 投 與 D 劑 量 的 藥 物 於 生 體 時, 經 由 吸 收 而 進 入 體 循 環 系 的 總 藥 物 量, 在 藥 物 動 力 學 常 用 可 用 率 availability 或 F 來 表 現 藥 物 之 吸 收 速 率 本 研 究 若 未 將 半 衰 期 計 算 則 口 服 F 值 為 125%, 將 半 衰 期 列 入 計 算 口 服 F 值 為 99%, 在 Dimitrov 等 人 (2007) 以 鴨 進 行 pefloxacin 及 其 代 謝 物 NOR 之 藥 物 動 力 學 研 究 亦 有 類 似 情 形 ( 口 服 AUC 大 於 血 管 注 射 AUC) 104

119 第 五 章 總 結 有 關 畜 禽 水 產 品 中 喹 諾 酮 類 藥 物 (QNs) 殘 留 檢 測 技 術 早 在 90 年 代 就 有 許 多 研 究, 經 過 多 年 的 試 驗 驗 證, 目 前 國 內 已 建 立 公 告 方 法 僅 CNS14684 檢 測 3 種 QNs ( 中 華 民 國 國 家 標 準, 2002) 及 衛 生 署 公 告 方 法 檢 測 7 種 QNs( 行 政 院 衛 生 署, 2002) 但 隨 著 LC/MS/MS 檢 驗 技 術 之 發 展, 使 畜 禽 水 產 品 中 QNs 殘 留 更 降 低 檢 測 極 限, 尤 其 是 針 對 沒 有 制 定 殘 留 容 許 量 的 FQNs, 如 :ENR CIP NOR 等 日 本 加 拿 大 及 美 國 在 食 品 貿 易 上, 相 對 地 提 出 新 的 限 量 要 求, 使 既 有 之 檢 測 方 法 無 法 符 合 進 口 食 品 及 輸 出 水 產 品 之 檢 測 需 求 本 研 究 除 了 開 發 有 效 率 準 確 之 畜 禽 水 產 品 中 QNs 多 重 殘 留 檢 測 分 析 方 法 (HPLC-FLD 與 LC/MS/MS 方 法 ), 研 究 ENR 及 其 代 謝 物 在 吳 郭 魚 體 內 藥 物 動 力 學 之 相 關 代 謝 和 排 除 情 形, 希 望 對 於 未 來 在 監 測 禽 畜 水 產 品 中 之 相 關 藥 物 殘 留 監 測 工 作 與 水 產 品 安 全 監 控 與 管 理 提 供 研 究 方 向 一 HPLC-FLD 法 檢 測 QNs 殘 留 對 多 數 實 驗 室 而 言, 以 HPLC-FLD 法 最 為 常 用, 本 研 究 選 定 14 種 常 見 QNs 經 FLD 及 UV 掃 瞄 分 析, 建 立 螢 光 及 紫 外 光 最 佳 檢 測 波 長 條 件, 考 量 FLD 感 度 佳 且 干 擾 較 少, 選 擇 FLD 為 偵 檢 器 由 於 PIR 在 FLD 之 感 度 較 UV 差 (ORB 與 ENR) 及 (OFL 與 NOR) 有 共 析 問 題, 最 後 選 擇 建 立 11 種 QNs (MAR NOR CIP LOM DAN ENR SAR DIF OXO NAL FLU) 之 HPLC-FLD 法 三 段 式 程 式 螢 光 ( 激 發 / 放 射 ) 波 長 偵 測,297/515 nm 檢 測 MAR 280/450 nm 檢 測 (NOR CIP LOM DAN ENR SAR DIF) 320/365 nm 檢 測 (OXO 105

120 FLU) 移 動 相 由 0.1% 甲 酸 水 溶 液 及 氰 甲 烷 組 成 進 行 梯 度 沖 堤, 搭 配 symmetry column C18 (250 x 4.5 mm i.d., 5 μm) 管 柱 分 離, 最 佳 化 HPLC 條 件, 結 果 顯 示 11 種 QNs 有 良 好 分 離 解 析 而 樣 品 萃 取 淨 化 步 驟 如 下 : 樣 品 使 用 0.3% 偏 磷 酸 : 氰 甲 烷 (1:1, v/v) 萃 取, 經 減 壓 濃 縮 去 除 氰 甲 烷 後 注 入 HLB 淨 化 經 方 法 確 效 驗 證 : 平 均 回 收 率 為 71.7 至 105.3%, 日 內 精 密 度 及 日 間 精 密 度 符 合 規 範,LODs 為 1.5 至 8.7 ng/g 之 偵 測 極 限, 低 於 國 內 衛 生 標 準 之 殘 留 容 許 量 本 研 究 建 立 之 HPLC 方 法 簡 單 快 速 靈 敏, 適 合 例 行 分 析 大 量 樣 品, 此 方 法 目 前 已 草 擬 國 家 標 準 方 法, 可 提 供 國 內 相 關 實 驗 室 參 考 二 LC-ESI/MS/MS 由 於 HPLC 方 法 有 共 析 問 題 以 及 歐 盟 對 於 不 得 檢 出 之 藥 物 須 符 合 4IP 之 要 求, 經 HPLC-FLD 方 法 檢 出 QNs, 須 再 進 一 步 以 LC/MS/MS 做 確 認 本 文 提 出 了 一 種 應 用 LC-ESI/MS/MS 搭 配 多 重 反 應 (MRM) 技 術 測 定 牛 奶 雞 肉 豬 肉 魚 及 蝦 中 18 種 QNs 殘 留, 所 建 立 之 分 析 方 法 之 特 色 :1. 特 異 強, 質 譜 訊 息 ( 一 個 母 離 子 及 定 性 定 量 離 子 ) 可 準 確 定 性, 2. 快 速 ( 使 用 簡 單 之 溶 劑 萃 取 法 就 可 以 有 效 減 少 背 景 干 擾 ),3. 靈 敏 度 高, 4. 目 前 文 獻 中 尚 未 有 建 立 之 18 種 QNs 多 重 殘 留 分 析 方 法 應 用 LC-ESI(+)/MS/MS 分 析 方 法 探 討 QNs 在 二 次 質 譜 碰 撞 裂 解 途 徑,QNs 中 最 常 見 的 質 譜 碎 片 特 徵 為 脫 水 峰 MH-18 + 及 脫 羧 峰 MH-44 + 是 QNs 分 子 含 有 羧 基 基 團 的 依 據 附 錄 圖 1~19 為 18 種 喹 諾 酮 類 抗 菌 劑 及 d5-enr 之 二 級 質 譜 碎 片 及 定 量 定 性 離 子 層 析 圖, 可 提 供 日 後 相 關 實 驗 室 建 立 喹 諾 酮 類 抗 菌 劑 質 譜 圖 資 料 庫 品 管 分 析 方 法 使 用 歐 盟 新 的 分 析 方 法 要 求 (2002/657/EC 及 ISO ), 可 有 信 心 地 判 斷 樣 品 所 含 的 藥 物 是 超 過 標 準 或 在 殘 留 容 許 量 範 圍 內 本 實 驗 條 件 106

121 下 所 測 得 18 種 QNs 之 CCα 範 圍 為 0.18 至 0.68 ng/g,ccβ 範 圍 為 0.24 至 0.96 ng/g 此 外 本 文 進 一 步 探 討 吳 郭 魚 之 含 18 種 QNs 之 基 值 效 應 及 絕 對 回 收 率, 每 種 QN 藥 物 於 不 同 生 物 基 質 及 經 不 同 萃 取 步 驟 之 檢 液 進 入 質 譜 中, 其 產 生 基 值 效 應 差 異 很 大 LC-ESI(+)/MS/MS 可 準 確 定 性, 但 對 於 準 確 定 量 則 需 使 用 基 質 添 加 標 準 品 法 建 立 檢 量 線 定 量 三 ENR 及 其 代 謝 物 在 吳 郭 魚 體 內 的 藥 物 動 力 學 之 研 究 藉 由 LC-ESI/MS/MS 同 步 分 析 18 種 喹 諾 酮 類 抗 菌 劑 殘 留 方 法 之 建 立, 使 用 d5-enr 為 內 標 能 有 效 校 正 樣 品 經 萃 取 淨 化 等 過 程 的 損 失 和 克 服 質 譜 檢 測 過 程 中 所 引 起 基 質 效 應 的 定 量 誤 差 兩 條 不 同 濃 度 範 圍 之 標 準 品 (1.0~5.0 及 0.01~1.0 μg/ml ), 每 一 種 QN 之 線 性 相 關 係 數 r 2 均 大 於 0.995, 俱 有 良 好 的 相 關 性 空 白 全 血 及 肌 肉 之 回 收 率 及 相 對 標 準 偏 差 (RSD) 試 驗 進 行 方 法 驗 證, 平 均 回 收 率 均 在 86% 以 上,RSD 在 8% 以 下, 定 量 方 法 偵 測 極 限 0.01 μg/g, 顯 示 該 方 法 為 試 驗 樣 品 的 準 確 定 量 提 供 保 障 應 用 所 建 立 的 方 法, 檢 測 了 給 藥 後 0.25~168 h 內 各 時 間 點 的 吳 郭 魚 組 織 中 ENR 及 其 代 謝 物 (CIP 及 des-cip) 之 濃 度 吳 郭 魚 兩 種 給 藥 方 式 的 血 中 濃 度 均 符 合 一 級 吸 收 二 室 開 放 模 式, 血 管 給 ENR 藥 的 主 要 藥 物 動 力 學 參 數 為 : 血 中 濃 度 - 時 間 曲 線 下 面 積 (AUC) 消 除 半 衰 期 (t 1/2β ) 最 高 血 中 濃 度 (C max ) 清 除 率 及 表 現 分 佈 容 積 (Vdss) 分 別 為 ± μg.h/ml, ± h, 4.70 ± μg/ml, ± L/h/kg, ± L/kg 口 服 給 ENR 藥 的 主 要 藥 物 動 力 學 參 數 為 : AUC 消 除 半 衰 期 最 高 血 中 濃 度 出 現 的 時 間 點 (T max ) 及 最 高 血 中 濃 度 (C max ) 分 別 為 ± μg.h/ml, ± h, 107

122 0.601±0.06h, ± μg/ ml ENR 口 服 給 藥 後 可 在 肝 腎 及 膽 汁 中 測 到 CIP(ENR 的 活 性 代 謝 物 ) 注 射 ENR 藥 後 除 了 在 血 液 及 肌 肉 中 測 不 到 CIP, 其 餘 臟 器 均 可 測 得 CIP,CIP 也 有 相 同 現 象 會 累 積 在 膽 汁 中 而 des-cip(cip 的 主 要 代 謝 物 ) 僅 在 口 服 給 ENR 藥 後 第 120 ~168 h 的 膽 汁 中 測 到 ENR 藥 物 在 吳 郭 魚 體 內 主 要 代 謝 型 式 還 是 以 ENR 及 其 代 謝 物 CIP 為 主, 故 監 測 ENR 在 吳 郭 魚 殘 留 情 形, 建 議 監 測 ENR 殘 留 其 指 標 性 殘 留 物 質 (marker residue) 之 含 量 為 ENR 及 其 代 謝 物 CIP 加 總, 殘 留 臟 器 標 的 (residue target) 可 選 擇 腎 肝 及 胆 汁 本 篇 ENR 之 藥 物 動 力 學 是 首 篇 報 告 使 用 LC/MS/MS 檢 測, 並 同 時 監 測 ENR 及 其 代 謝 物 (CIP 及 des-cip) 給 藥 後 各 臟 器 分 佈 情 形 本 研 究 ENR 在 吳 郭 魚 體 內 排 除 半 衰 期 (t 1/2β ) 相 較 於 韓 國 鯰 魚 及 褐 鳟 之 排 除 半 衰 期 要 長 許 多, 推 論 是 由 於 吳 郭 魚 ENR 及 其 代 謝 物 在 吳 郭 魚 體 內 為 典 型 的 腸 肝 循 環 而 且 會 大 量 累 積 在 膽 汁 中, 在 韓 國 鯰 魚 及 褐 鳟 的 報 告 中 並 未 指 出 ENR 在 韓 國 鯰 魚 及 褐 鳟 體 內 有 腸 肝 循 環 現 象, 這 是 首 次 報 告 觀 察 到 ENR 及 其 代 謝 物 在 吳 郭 魚 體 內 為 典 型 的 腸 肝 循 環 108

123 參 考 文 獻 王 信 斌 賴 宣 陽 陳 信 志 周 秀 冠 2008 禽 畜 水 產 品 中 動 物 用 藥 Quinolone 類 之 殘 留 量 調 查 藥 物 食 品 檢 驗 局 調 查 研 究 年 報 26: 李 俊 鎖 邱 月 明 王 超 2002 獸 藥 殘 留 分 析 喹 諾 酮 類 藥 物 殘 留 分 析 上 海 科 學 技 術 出 版 社, 中 國 大 陸, 上 海 p 行 政 院 衛 生 署 2008 動 物 用 藥 殘 留 標 準 衛 署 食 字 號 行 政 院 衛 生 署 2002 動 物 用 藥 殘 留 檢 驗 方 法 -Quinolone 類 多 重 殘 留 分 析 行 政 院 農 業 委 員 會 1996 動 物 用 毒 劇 藥 品 品 目 農 牧 字 第 A 號 公 告 行 政 院 農 業 委 員 會 動 植 物 防 疫 檢 疫 局 2006 動 物 用 藥 品 手 冊 林 峰 林 海 丹 吳 映 璇 王 芳 2004 LC-MS-MS 測 定 烤 鰻 中 4 種 氟 喹 諾 酮 藥 物 殘 留 量 分 析 測 試 學 報 23: 何 素 鵬 龔 培 森 王 渭 賢 1999 高 效 液 相 層 析 法 對 雞 肉 與 豬 肉 中 殘 留 Quinolone 類 抗 菌 劑 之 檢 測 台 灣 畜 牧 獸 醫 學 會 會 報 69:75-85 呂 車 鳳 況 慧 星 吳 永 惠 1995 獸 醫 藥 理 與 治 療 學 ( 上 冊 ) 藝 軒 圖 書 出 版 社 台 北 台 灣 p 房 文 紅 鄭 國 興 2004 水 產 動 物 藥 物 代 謝 動 力 學 研 究 概 況 中 國 水 產 科 學 11(4): 房 文 紅 鄭 國 興 2006 肌 注 和 藥 餌 給 藥 下 諾 氟 沙 星 在 南 美 白 對 蝦 血 淋 巴 中 藥 代 動 力 學 水 生 生 物 學 報 30: 房 文 紅 邵 錦 華 施 兆 鴻 2003 斑 節 對 蝦 血 淋 巴 中 諾 氟 沙 星 含 量 測 定 及 藥 代 動 力 學 水 產 生 物 學 報 27:13-17 周 珮 如 李 蕙 芳 徐 麗 嵐 蘇 淑 珠 周 薰 修 2006 禽 畜 水 產 品 中 動 物 用 藥 Quinolone 類 之 殘 留 量 調 查 藥 物 食 品 檢 驗 局 調 查 研 究 年 報 24: 陳 信 志 賴 宣 陽 周 秀 冠 2007 食 品 中 動 物 用 藥 Quinolone 類 之 殘 留 量 109

124 調 查 藥 物 食 品 檢 驗 局 調 查 研 究 年 報 25: 梁 增 輝 林 黎 明 劉 靖 靖 江 志 剛 官 慶 禮 2006 恶 喹 酸 和 氟 甲 喹 在 鰻 魚 體 內 的 藥 代 動 力 學 研 究 海 洋 水 產 研 究 27:86-92 楊 先 樂 劉 至 治 孫 文 欽 蔡 完 其 2001 中 華 絨 螯 蟹 血 淋 巴 內 鹽 酸 環 丙 沙 星 的 反 相 高 效 液 相 色 譜 法 的 建 立 水 產 學 報 25: 楊 雨 輝 佟 恆 敏 盧 彤 岩 趙 吉 偉 2003 環 丙 沙 星 在 鯉 體 內 吸 收 代 謝 和 生 物 利 用 度 水 產 學 報 27: 鄭 宗 林 唐 俊 喻 文 娟 胡 鲲 葉 金 明 楊 先 樂 2006 RP-HPLC 法 測 定 中 華 絨 螯 蟹 主 要 組 織 中 的 恩 諾 沙 星 及 其 代 謝 產 物 上 海 水 產 大 學 學 報 15: Japan, Compliments of Leffingwell & Associates (2008) Maxium Residue Limits (MRLs) List of Agriculturals in Foods. /foundation/search.html Althaus, R, Berruga, M.I., Montero, A., Evaluation of a Microbiological Multi-Residue System on the detection of antibacterial substances in ewe milk. Anal. Chim. Acta. 632: Ambrose, P.G., Owens, R.C., Quintiliani,R and Nightingale,C.H., New generations of quinolones: with particular attention tolevofloxacin. Conn Med 61: Anadon, A., Martinez-Larranaga, M.R and Diaz, M.J., Pharmacokinetics and residues of enrofloxacin in chickens. Am.J.Vet.Res. 56: Andresen, A.T., and Rasmussen, K.E., Automated on-line dialysis and column switching HPLC determination of flumequine and oxolinic acid in fish liver. J.Liq.Chromatogr. 13: Andreu, V., Blasco, C and Picó,Y., Analytical strategies to determine quinolones residues in food and the environment. Trends Anal.Chem. 26: Bailac, S., Ballsteros, O and Barron.D., Determination of quinolones in chicken tissues by liquid chromatography with ultraviolet absorbance detection. J. Chromatogr. A 1029: Ball, P., Quinolone generatios: natural history or natural selection. Journal of Antimicrobial Chemotherapy 46 Suppl T1,

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132 附 錄 一 圖.1 NAL 二 次 質 譜 圖 及 定 量 定 性 離 子 層 析 圖 118

133 附 錄 一 圖.2 FLU 二 次 質 譜 圖 及 定 量 定 性 離 子 層 析 圖 119

134 . 附 錄 一 圖.3 OXO 二 次 質 譜 圖 及 定 量 定 性 離 子 層 析 圖 120

135 附 錄 一 圖.4 CIN 二 次 質 譜 圖 及 定 量 定 性 離 子 層 析 圖 121

136 附 錄 一 圖.5 PIR 二 次 質 譜 圖 及 定 量 定 性 離 子 層 析 圖 122

137 附 錄 一 圖.6 PIP 二 次 質 譜 圖 及 定 量 定 性 離 子 層 析 圖 123

138 附 錄 一 圖.7 des-cip 二 次 質 譜 圖 及 定 量 定 性 離 子 層 析 圖 124

139 附 錄 一 圖.8 NOR 二 次 質 譜 圖 及 定 量 定 性 離 子 層 析 圖 125

140 附 錄 一 圖.9 ENO 二 次 質 譜 圖 及 定 量 定 性 離 子 層 析 圖 126

141 附 錄 一 圖.10 CIP 二 次 質 譜 圖 及 定 量 定 性 離 子 層 析 圖 127

142 附 錄 一 圖.11 LOM 二 次 質 譜 圖 及 定 量 定 性 離 子 層 析 圖 128

143 附 錄 一 圖.12 DAN 二 次 質 譜 圖 及 定 量 定 性 離 子 層 析 圖 129

144 附 錄 一 圖.13 ENR 二 次 質 譜 圖 及 定 量 定 性 離 子 層 析 圖 130

145 附 錄 一 圖.14 OFL 二 次 質 譜 圖 及 定 量 定 性 離 子 層 析 圖 131

146 附 錄 一 圖.15 MAR 二 次 質 譜 圖 及 定 量 定 性 離 子 層 析 圖 132

147 附 錄 一 圖.16 SAR 二 次 質 譜 圖 及 定 量 定 性 離 子 層 析 圖 133

148 附 錄 一 圖.17 ORB 二 次 質 譜 圖 及 定 量 定 性 離 子 層 析 圖 134

149 附 錄 一 圖 18. DIF 二 次 質 譜 圖 及 定 量 定 性 離 子 層 析 圖 135

150 附 錄 一 圖.19 D5-ENR 二 次 質 譜 圖 及 (ENR D5-ENR) 定 量 定 性 離 子 層 析 圖 136

151 附 錄 二 : 個 人 簡 歷 畢 業 系 所 : 國 立 中 山 大 學 海 洋 生 物 科 技 暨 資 源 學 系 博 士 班 學 生 姓 名 : 張 菊 香 (Chui-Shiang Chang) 學 經 歷 : 新 竹 縣 立 竹 東 國 小 畢 業 新 竹 縣 立 竹 東 國 中 畢 業 臺 灣 省 立 新 竹 女 中 畢 業 國 立 台 灣 海 洋 學 院 水 產 食 品 科 學 系 畢 業 國 立 台 灣 海 洋 大 學 水 產 食 品 科 學 研 究 所 畢 業 中 華 民 國 專 門 技 術 人 員 食 品 技 師 高 等 考 試 及 格 中 華 民 國 專 門 技 術 人 員 營 養 師 高 等 考 試 及 格 私 立 長 庚 醫 學 院 醫 學 系 生 化 科 助 教 保 生 製 藥 副 研 究 員 台 灣 區 肉 品 發 展 基 金 會 分 析 員 經 濟 部 標 準 檢 驗 局 高 雄 分 局 技 正 績 優 事 蹟 97 年 經 濟 部 標 準 檢 驗 局 廉 潔 楷 模 98 年 經 濟 部 模 範 公 務 員 研 究 計 畫 90 年 自 行 研 究 計 畫 : 建 立 肉 品 中 荷 爾 蒙 殘 留 檢 驗 技 術 - 氣 相 層 析 質 譜 儀 (GC-MS) 方 法 92 年 研 究 計 畫 專 題 : 建 立 魚 肉 中 有 機 氯 農 藥 殘 留 檢 驗 137

152 - 氣 相 層 析 儀 (GC) 方 法 92 年 自 行 研 究 計 畫 : 建 立 魚 肉 中 甲 磺 氯 黴 素 氟 甲 磺 氯 黴 素 氯 黴 素 殘 留 檢 驗 - 氣 相 層 析 質 譜 儀 (GC-MS) 方 法 93 年 自 行 研 究 計 畫 專 題 : 以 高 效 液 相 層 析 法 同 步 檢 測 食 品 中 添 加 物 之 研 究 95 年 自 行 研 究 計 畫 專 題 : 建 立 高 效 液 相 層 析 (HPLC-FLD) 及 液 相 串 聯 式 質 譜 儀 (LC/MS/MS) 檢 測 喹 諾 酮 類 多 重 分 析 方 法 96 年 自 行 研 究 計 畫 專 題 : 建 立 檢 測 禽 畜 水 產 品 及 蜂 蜜 中 巨 環 內 酯 類 抗 生 素 ( 泰 黴 素 紅 黴 素 ) 及 林 可 黴 素 殘 留 LC/MS/MS 方 法 96 年 自 行 研 究 計 畫 專 題 : 建 立 液 相 串 聯 式 質 譜 儀 (LC/MS/MS) 檢 測 穀 物 毒 素 ( 真 菌 毒 素 ) 多 重 殘 留 分 析 方 97 年 自 行 研 究 計 畫 專 題 : 穩 定 同 位 素 稀 釋 技 術 應 用 於 LC/MS/MS 檢 測 分 析 食 品 中 氯 黴 素 甲 磺 氯 黴 素 及 氟 甲 磺 氯 黴 素 含 量 138