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1 中国临床医学 年 月 第 卷 第 期 "%!%!."%<&%!8! (),% 论 著 慢性阻塞性肺疾病患者外周血 )4, 比率的变化 何燕超 揭志军 施劲东 梅周芳 钱 凌 黄琦慧 鄢莉宏 复旦大学附属上海市第五人民医院呼吸内科 上海 摘要 目的 研究慢性阻塞性肺疾病!%!0$!%&")5( 患者外周血中 "( C!4$ C ' 和 细胞介导的免疫失衡与该疾病进展之间的相关性 方法 选择 年 月至 年月在上海市闵行区江川社区及 复旦大学附属上海市第五人民医院接受门诊或住院治疗的稳定期和急性发作期 ")5( 患者共 例 同时收集吸烟或不吸烟 的健康对照者各 例 测定受试者的肺功能 采用流式细胞术测定受试者外周血中 和 "( C!4$ C ' 占 "( C 细 胞的百分比 分析 "( C 和 "( C!4$ C '"( C 比率以及 "( C!4$ C ' 比值在不同分组中的变化及 其临床意义 结果 与健康对照组相比 稳定期 ")5( 患者外周血中 "( C 和 "( C!4$ C ' 明显升高 而 "( C!4$ C '"( C 明显降低 急性发作期 ")5( 患者的 "( C "( C!4$ C '"( C 和 "( C!4$ C ' 均比对照组明显升高 轻度 中度 重度和极重度的 ")5( 患者中 "( C 和 "( C!4$ C ' 逐步升高 而 "( C!4$ C '"( C 逐步降低 ")5( 患者的 "( C 和 "( C!4$ C ' 与肺功能负相关 "( C!4$ C '"( C 与肺功能正相关 结论 "( C!4$ C ' 失衡参与了 ")5( 的疾病进展过程 提示 "( C!4$ C ' 免疫调节治疗可能成为 ")5( 治疗的新途径 关键词 慢性阻塞性肺疾病 免疫调节 细胞 淋巴细胞 中图分类号 1 文献标志码 &)4, $& %%"%!" $$&%% -;%!,%2-%&!<!.B8-:8B;8! ($%!.1$!<&%2.5!$-!$&%:%2"% %%!!!!%$0%$$"( C!4$ C '%& &&%0%%&$!'!%!.!%!0$!%&")5($!!.4 %%$%")5(%0'!40!%!.")5(&.!2.5!$-!$!. &%:%.!%! <%!%!%&!%!.%!%!&!%!$!%.%!%!.0,& $!.%&"( C!4$ C '%"( C.!$$0!!&&%&0.!!!."( C "( C!4$ C '"( C %&"( C!4$ C '!%&.!$%& %.%%&""!$&!%!'!$!!."( C %& "( C!4$ C '%$$0!!&!.$%0")5('%.%%&!!. "( C!4$ C '"( C '%.%&&!!."( C "( C!4$ C '"( C %& "( C!4$ C C %&"( C!4$ C &$ '&%$%&!&")5(!!."( C!4$ C ' "( C '&&!&<!!!!."( C %&"( C!4$ C '%")5( 收稿日期 接受日期 基金项目 上海市闵行区自然科学基金 <- 上海市科学技术委员会自然基金生物引导类项目 0 上海市卫生系统优秀学科带头人资助项目 复旦大学青年骨干科研启动基金 2$$!&082%!%&!%!.<%( %2 <- 8!%&!%!!' & 5!,!.2 <%$2%%& %!!' "!!% 04%&&!.2-2 %&!%&!%!.2:$10;!"&!. &%:% 作者简介 何燕超 硕士 住院医师! 通信作者 "!$!%&!%! %!

2 "%!%!."%<&%! 8! 中国临床医学 年 月 第 卷 第 期 $%!&.%!%!!."( C!4$ C '"( C $!!&.%!% %""( C!4$ C '0%%!%$!'!%!. ")5("( C!4$ C '%!!&!$0!%$$!.!%!. ")5( ($!%!0$!%&%!!&!%$! 慢性阻塞性肺疾病!%!0 $!%&")5( 是一种以持续气流受限为特征的可以防治的呼吸系统疾病 近年来 ")5( 的发病率和病死率居高不下 成为备受关注的疾病之一 越来越多的研究证明 "( C 细胞 在 ")5( 相关的慢性炎性反应中发挥作用 辅 助性 细胞 $ 是 "( C 细胞的一种亚型 在转化生长因子 %.! '!.! 和白细胞介素 %% 的作用下 "( C 细胞可以 表达核孤儿受体家族成员 1)1 并向 分化 随后分化成熟的 分泌细胞因子 从而 发挥生物学效应 调节性 细胞 '! ' 是 "( C 细胞的另一种亚型 它是一种重要的免疫调节细胞 ' 中异位表达的叉头翼 状螺旋转录因子 $.!&! & 4 %$!%$!4$ 可以通过接触抑制 分泌抑制性因子 和 维持免疫环境的稳态 ' 平衡是 经典模型的补充 ' 平衡在机体免疫应答和免疫耐受中具有重要作用 因此 本研究通过检测各个阶段的 ")5( 患者外周血中 "( C!4$ C ' 的百分比 探讨 ")5( 的免疫学发病机制 并试图寻 找可以干预 ")5( 进展的有效靶点 ) 资料与方法 一般资料 收集 年 月至 年月在上海市闵行区江川社区及复旦大学附属上海市 第五人民医院接受门诊或住院治疗的 ")5( 患者 例 所有病例均符合中华医学会呼吸病学分会制定的诊断标准 且均不合并支气管哮喘 其他肺 部疾病 心力衰竭及自身免疫性疾病 除 例急性 发作期 ")5( 40!%!. ")5( ")5( 患者外 所有 例稳定期 ")5(0 ")5(2")5( 患者均完成肺功能检查 相关指标包括一秒用力呼气容积.!&4$!! %!%!%& 用力肺活量.!& $" 占预计值的百分比 6 $&" 占预计值的百分比 "6$& 以及 " 比率 根据 ")5( 全球策略!0 %.!"!% )0 ( )( 的分级标准 依据肺功能评估气流受限程度 将 2")5( 患者分为 )( 级 轻度 例 )( 级 中度 例 )( 级 重度 例和 )( 级 极重度 例 同时 收集在本院体检中心进行体检的非吸烟健康志愿者及肺功能正常 的吸烟者各 例 作为对照组 所有对照均不合并 其他疾病 本研究方案经上海市第五人民医院伦 理委员会批准 所有研究对象均签署知情同意书 所有入组患者及对照的具体临床资料见表 主要试剂和设备 流式细胞术使用的所有抗体以及细胞刺激培养所需的豆蔻酰佛波醇乙酯 $!0!5< 离子霉 素 布雷菲德菌素.&% 和 45 =1'% 均购自美国 ( 公司 淋巴细胞分离液!-$ 购自美国 2' 公 司 人 ' 染色试剂盒购自美国!% 公司 流式细胞仪 "20 购自美国 ( 公司 标本收集与处理 采集受试者外周血 置入肝素锂抗凝管内 将外周血用 6 氯化钠溶 液等倍稀释后 将其沿离心管边缘轻轻加至! -$ 分离液上面 室温 F" 离心 % 分离白膜层细胞即为外周血单个核细胞 $$ 0!!&!%!%5<" 用 15< 培养液洗涤细胞 次后 用含有 6 胎牛血清的 15< 培养液调整细胞密度为 F 个 将细胞铺至 孔板中培养 用于流式细胞学检测 流式细胞术检测 "( C 细胞比率 将细胞密度为 F 个 的新鲜 5<" 接种于 孔板 每孔 然后分别加入 ' 离子霉 素 5< 和 ' 于 和 6 ") 条件下培养细胞 分别加入 5 标记的鼠抗人 "( 单克隆抗体和 " 标记的鼠抗人 "( 单克隆抗体 避光反应 % 用 52 缓冲液洗涤 用固定破膜试剂盒 4 5= 中的 1'% 固定 1'% 破膜 然后加入 5" 标

3 中国临床医学 年 月 第 卷 第 期 "%!%!."%<&%!8! 记的鼠抗人 单克隆抗体或同型 ' 标记 的细胞内抗体 避光反应 % 用 52 缓冲液 洗涤 最后用 52 重悬细胞 上流式细胞 仪检测 "( C "( C 细胞 即 占 "( C "( 细胞 即 "( C 细胞 的百分比 简称 "( C 比率 每次检测均设立同型对照 参数 表 )3, 患者及对照的临床资料对照组 2")5( 组非吸烟者吸烟者轻度中度重度极重度 3 ")5( 组 年龄 岁 性别 男 女 吸烟指数 0 0 0& 0& 6$& & 0& " 0 0 0& 0& "6$& & 0& " & 0& 与非吸烟者比较 0 与吸烟者比较 与轻度 ")5( 组比较 & 与中度 ")5( 组比较 与重度 ")5( 组比较 吸烟指数 每天吸烟支数 吸烟年数 所有 ")5( 组中戒烟者的吸烟指数为戒烟前的吸烟指数 秒用力呼气容积 " 用力肺活量 6$& 秒用力呼气容积占预计值的百分比 "6$& 用力肺活量占预计值的百分比 流式细胞术检测 "( C!4$ C '"( C 细胞比率 将细胞密度为 F 个 的新鲜 5<" 接种于 孔板 每孔 然后加入 5 标记的鼠抗人 "( 单克隆抗体和 " 标记的鼠 抗人 "( 单克隆抗体 避光反应 % 用 52 缓冲液洗涤 用 ' 染色试剂进行破膜 固定 52 洗涤 离心后 加入 5" 标记的鼠抗人!4$ 单克隆抗体及同型 ' 标记细胞内抗体 避光 % 用 52 缓冲液洗涤 最后用 含 6 多聚甲醛溶液的 52 重悬细胞 上流式细胞仪检测 "( C!4$ C ' 占 "( C 细胞的百分比 简称 "( C!4$ C '"( C 比率 每次检测设立同 型对照 统计学处理 采用!,! 软件对流式 细胞术检测结果进行分析 所有数据采用 2522 软件包进行统计学分析 计量资料以 3 表示 多组间比较采用单因素方差分析 有意义的 进一步行 检验 采用 5!% 相关分析法进行相 关性分析 相关系数用 表示 检验水准 为 结 果 受试者临床资料分析 本实验共纳入受试者 例 其中对照组 例 2")5( 患者 例 ")5( 患者 例 在对照组中 吸烟者的 6$& 和 " 比率均低于非吸烟者 这说明吸烟可能引起肺功能下降 2")5( 组的 6$& 和 " 比率均低于对照组 并随着 ")5( 分级增加 肺功能逐步降低 表 ")5( 患者外周血中 "( C!4$ C ' 失衡 为了探索 "( C!4$ C ' 平衡在 ")5( 发生及进展中的作用 本研究采用流 式细胞术分析了对照组 2")5( 组和 ")5( 组 患者的外周血 和 "( C!4$ C ' 占 "( C 细胞的百分率变化 结果 图 表 显示 与对照组相比 2")5( 组的 "( C!4$ C ' "( C 比率明显降低 ")5( 组的 "( C!4$ C '"( C 比率明显升高 而 2")5( 和 ")5( 组的 "( C 比率和 "( C!4$ C ' 比值均明显升高

4 $ 4; 5 -_ 3 0.,3 F4,,`8 -!! " $!U3,'! 2!V3' $!!中国临床医学!!"$年!月!第!2卷!第$期! 图A!各组受试者的 &DBPSC' T0 FSO( AR细胞流式检测结果 %和 O %4@, (L"<;%%4@, K"4@$! '<. 表B!对照组 $&DB E&;QD 组和 $L&;QD 组外周血 O A R细胞和 &DB PSC ' T FSO ( A R PSC ' T FSO ( 0 % 细胞的表达以及 O 0 % 比值 $Q$!细胞 对照组!(,"$ <;%%T- P4AS@ 组!(!"$ K(4AS@ 组!(%)$ )! $ ' ",!,' %% ) &$ %%!' $! ' $, " $$ )& <;%%4@$! ' <. '<. "!与对照组比较!!- 指 <;%和 4@$! 占 4@,< 细胞的百分比' ' %T4@$! '<.!' 2!<;N"4@!Cg 失衡与 P4AS@ 患 者肺功能的关系! 为了探讨 <;N%4@!Cg2g 4@=g 比率和 <;N%4@!Cg 比值均逐 步升高 %4@=g 比 "C$&4@!Cg <. 与肺功能的关系!本研究将对照组分为非吸烟 组和吸烟组!将 P4AS@ 组按肺功 能 分 为 轻 度'中 率在吸烟组高于非吸烟组 "C$!轻度组与非 吸 烟 组 差 异 无 统 计 学 意 义!而 中 度 组 4@!Cg 度'重度和极重度组&分析发现! <;N%4@=g 比率 %4@=g 比 率 低 于 轻 度 组 和 非 吸 烟 组 "C$!并 且 重 度 组 和 极 重 度 组 的 4@!Cg 和 <;N%4@!C 2 <. 比值在吸烟组高于非 吸烟组 "C$!在 P4AS@ 各组均高于非吸烟组 g g "C$!并 且 随 着 肺 功 能 分 级 进 展!<;N% %4@=g 比 率 低 于 中 度 组 2g<. " % "C! 表2$& 表F!非吸烟者吸烟者和 E&;QD 患者外周血 O AR细胞 &DBPSC' T0 FSO( AR$&DBPSC' T0 FSO( %细胞的表达及 O %比值 $Q$ 对照组!细胞 非吸烟者!($"$吸烟者!($"$ <;%%T%T4@$! ' <. % <;% 4@$! '<. P4AS@ 组, %& %& %) ' '$ %),' ' "$ $ ") 轻度!(%%$ %$ $ ),% $ "! 中度!(%,$ 重度!(%%$ $,,8 8 && &%8 8 '! 8- %! %!! %)! %) 极重度!(%,$!, "8- '<. "! 与非吸烟者比较( "! 与吸烟者比较( "! 与轻度!!- 指 <;%和 4@$! 占 4@,< 细胞的百分 比' 8 4AS@ 组比较( "!与中度 4AS@ 组比较( "!与重度 4AS@ 组比较!'=! <;N4@!Cg <;N"4@!Cg 2g<. 与肺功能的相关性分析! 本研究进一 步分 析 P4AS@ 患 者 外 周 血 <;N%4@=g '4@!Cg %4@=g 比 率'<;N%4@!Cg 2g

5 中国临床医学 年 月 第 卷 第 期 "%!%!."%<&%!8! ' 比值与肺功能下降程度的相关性 结果发现 "( C 比率与 6$&"6$& 和 " 比率均负相关 "( C!4$ C '"( C 比率与 6$&"6 $& 和 " 比率均正相关 "( C!4$ C ' 比值与 6$& "6$&" 比率也均负相关 这些数据说明 ")5( 患者体内 "( C!4$ C ' 失衡与肺功能下降有高度的相关性 表 表 外周血 )4 和, 与肺功能的相关性分析 肺功能指标 "( "(!4$ '"( "(!4$ ' 值 值 值 值 值 值 "6$&6 6$&6 6$&". 讨 论 ")5( 与气管和肺组织对香烟烟雾等有害颗粒的异常慢性炎性反应有关 这些有害颗粒不仅 会引起上皮细胞损伤 激活固有免疫 而且会使机 体自身的抗原性发生改变 进而激活特异性免疫 近期有很多研究显示 香烟烟雾的刺激会激活 细 胞免疫 ' 对 细胞亚群的分化具有重要的 调节作用 ' 表达!4$ 后对 有明显的负 向调节作用 因此 研究 ' 平衡在不同 阶段 不同程度 ")5( 患者体内的变化具有重要的 临床意义 已有一些研究 发现 "( C ' 平衡在 2")5( 患者中有变化 但没有研究!4$ C ' 在 ")5( 患者体内的变化 ")5( 患者的主要临床表现为气流受限呈进行性进展 肺功 能的变化是 ")5( 进展的重要指标 因此 本研究 选取了健康对照人群 2")5( 患者及 ")5( 患 者作为研究对象 检测各组外周血中 和 "( C!4$ C ' 占 "( C 细胞百分比的变化 分析 "( C!4$ C ' 与肺功能的相关 性 并从免疫学角度探索 "( C!4$ C ' 失衡在 ")5( 发生及进展中的病理生理学机制 本研究分析 "( C!4$ C ' 在对照 组 2")5( 组和 ")5( 组的表达情况 结果发 现 2")5( 组的 "( C 比率高于对照组 而 "( C!4$ C '"( C ")5( 组的 "( C 比率低于对照组 和 "( C!4$ C '"( C 比率均高于对照组 遂进一步分析 "( C!4$ C ' 比值 发现 2")5( 组和 ")5( 组均高于对照组 这说明 ")5( 患者体内处于 优势状态 ")5( 患者的 "( C!4$ C '"( C 比率升高可能是由于 ")5( 急 性发作的情况下存在其他促 "( C!4$ C ' 分 化的因素 如感染等 为了进一步探索 "( C!4$ C ' 在 ")5( 中的作用 本研究将对照组分为非吸烟组和吸烟组 将不同严重程度的 2")5( 患者按肺功能 分级分为 组 分析发现 吸烟者的 "( C "( C!4$ C '"( C 和 "( C!4$ C ' 均高于非吸烟者 并且 随着 ")5( 严重程度的进展 "( C 和 "( C!4$ C ' 在 2")5( 组逐步升高 从中度 ")5( 开始 "( C!4$ C '"( C 比率明显下降 并随着疾病进展逐步降低 表 数据显示 吸烟者的 6$& 6$& 和 " 均低于非吸烟者 结果提示在 ")5( 前期 6$& 开始下降时 已经 开始出现 "( C!4$ C ' 失衡 并且随 着肺功能下降 "( C!4$ C ' 失衡逐 等 通过香烟烟雾刺激建立小鼠 ")5( 模型 检测不同肺功能阶段小鼠 "( C 和 "( C!4$ C '"( C 的变化 结果发现 短 期香烟刺激的小鼠 5<" 和肺部 "( C!4$ C ' 均比对照组明显增加 但是 "( C!4$ C ' 无明显变化 长期刺激的小鼠 5<" 和肺部 "( C!4$ C ' 比对照组明显减少 "( C!4$ C ' 比对照组明显升高 本研究结果与之类似 等 的动物实验结 果可见 "( C!4$ C ' 的变化不同于 呈 现一个稳步同方向的变化 而在吸烟组 "( C!4$ C ' 所占比例相对于肺功能正常的非吸烟者出现了升高 呈现出一个波动的变化 这表明 "( C!4$ C ' 可能在 ' 平衡中起到单独调节作用 已有研究证明 ' 细胞是体内

6 "%!%!."%<&%! 8! 中国临床医学 年 月 第 卷 第 期 重要的调节细胞 它可以通过接触抑制和分泌 而抑制 的分化及功能 而 是一种 促炎性反应细胞 它可分泌 和 等因子 激活 2 通路 抑制!4$ 的表达 进而抑制 ' 分化 因此 "( C!4$ C '"( C 比率在吸烟组出现升高 可能是由于 "( C!4$ C ' 对 分化的抑制作用 ")5( 前期可能通过 "( C!4$ C '"( C 比率升高而 抑制 分化 从而保护内环境稳态 但是随着 ")5( 进展 继续升高的 反过来抑制 "( C!4$ C ' 的调节作用 使内环境失衡 到 ")5( 晚期 "( C!4$ C ' 完全失衡 占绝对优势 本研究中 ")5( 患者的 "( C "( C!4$ C '"( C 和 "( C!4$ C ' 随着肺功能分级逐步变化 因此进一步分析 ")5( 患者 "( C!4$ C ' 和 "( C!4$ C ' 与肺功能的相关性 结果显示 "( C 和 "( C!4$ C ' 均与 6$&"6$& 及 " 负相关 而 "( C!4$ C '"( C 与 6"6$& 及 " 正相关 以上结果进一步说明 ")5( 患者体内 "( C!4$ C ' 失衡的过程与 肺功能的下降程度高度相关 综上所述 "( C!4$ C ' 失衡参 与了 ")5( 患者疾病进展的过程 与肺功能下降高 度相关 "( C!4$ C ' 对 ' 平衡起 到了重要的调节作用 本研究结果从免疫学角度 为揭示 ")5( 的病理生理机制提供了新的视角 同时 本研究也为 "( C!4$ C ' 应用 于临床评估 ")5( 的严重程度 指导 ")5( 的治疗 方案提供了一定的理论依据 然而 本研究尚存在 性别比率不均衡和样本量小等不足 因此检测 "( C!4$ C ' 是否可以应用于评估 ")5( 预后 指导 ")5( 治疗 还有待更完善的大样本研究来明确 参考文献 黄俊芳 王广发 慢性阻塞性肺病全球倡议慢性阻塞性肺病 指南 更新版 解读 中国医学前沿杂志 电子版 1<8"<<"":1;"1:(8)82 '%4$!%0"( C %!%!0 $!% & &%. %&$%&%!!!..!!0!%%&$ 4%5!2)% ();2 =< : =% %%&!%"%(%! )-=:1 8 =@ ; 2=:"- 2 (!$%%& %%%!.'! % 中华医学会呼吸病学分会慢性阻塞性肺疾病学组 慢性阻塞性肺疾病诊治指南 年修订版 中华结核和呼吸杂志 -188(" 5<)11)@ =2") ".!.'!4!%$& "%! < "-1 <! %&.!% '%!!4$! %%!$! 8(51A)88 () " "'!%1%&14$!%%& %&!%$!&!%.! "( C %!%!0 $!% & 1$ 1 )E2:8(51"&%$ -'0%8<& -2< ' &0 0% 0%.! %& '!"( C 4$!%! :) < 8=)"-%&' &!%%& 184$!%!& %&!=&' -):8)25)2=1$!' - &.%!% 0 $!! % '%!. %& $8 %! ;8 )58)5):)2 (8:1 1 2 '!%&& '%!%!. %.!$!" %$!%&$!%.! - 8 本文编辑 叶 婷 张艺鸣

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