西安交通大学学报 医学版 第 卷 内分泌治疗一直以来都是激素受体阳性乳腺癌患者的常用辅助治疗手段 虽然大多数患者在使用之初都有所获益 但是伴随着治疗的进行 耐药的出现 成为限制内分泌治疗的主要问题 他莫昔芬,2+$" 属于选择性雌激素 受体调节剂 是临床最常用的内分泌治疗药物之一 其作用机制包括阻断

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1 第 卷第 期 年 月 西安交通大学学报 医学版 "#$## %&'& $& 临床研究 双特异性磷酸酶 在乳腺癌及他莫昔芬耐药病例中的表达变化 张慧敏 刘 洋 周瑜辉 汤小江 任 予 何建军 西安交通大学第一附属医院乳腺外科 陕西西安 摘要 目的 初步探讨双特异性磷酸酶 %&' 在乳腺癌患者以及乳腺癌他莫昔芬 耐药患者中的表达变化及其与临床预后的关系 方法 使用 数据库分析 %&' 在 名不同临床病理特点的乳腺癌患者中的分布和表达情况 使用生存分析数据库分析 %&' 表达水平与乳腺癌患者生存情况的关系 收集 ( 例乳腺癌 耐药前后的配对标本进行免疫组化染色 分析 %&' 在耐药前后肿瘤标本中蛋白表达的变化情况 结果 %&' 在乳腺癌组织中的表达水平显著低于正常乳腺组织 且在 )#+",- 亚型中的表达高于其他亚型 %&' 的表达水平与乳腺癌患者的总生存 和无复发生存 呈正相关 与接受内分泌治疗的乳腺癌患者的无复发生存呈正相关 %&' 在 ( 例 耐药患者的配对标本中表达变化未见统计学差异 结论 在接受内分泌治疗的患者中 %&' 高表达的患者有更好的无复发生存 但是在 ( 例配对标本的检测中未发现 %&' 的表达差异有统计学意义 提示 %&' 与 耐药之间关系的探索有待更大样本的临床研究和更深入的细胞和分子生物学实验 关键词 乳腺癌 双特异性磷酸酶 他莫昔芬耐药中图分类号. 文献标志码 """#$ #%&" "#'%"&"##'&#& /01 0#++")&,"/0& ##+1 +,2+,".31 #034+,"#" %$,5$"275$,8'#5$5$ ,$028+,-2 +:,"4+,22"&"+;$58++:,"+", "## $( ) +#",##& -." $( )/'+ ) 01+ ","#, $( )/'+ " ",&-"$(")) +, 0&$()/'+# "#",###)" ), &$(")+,, ##,&&#"$( )/'+ #",&" &,##"#",,###"# && #"# $(,) )"+)) ("+ && #"$( )/'+#"# #",, #""# &$( ) )"+))(")""# "# "# $( + #)#" #")#, & () +,## "## $()# 收稿日期 修回日期 基金项目 陕西省科技攻关项目 12( 西安交通大学第一附属医院七年制学生临床创新基金 12/% 资助 '#25$ $'+$.$8$,552$2',,"+52;+"$12(,"-+"+,-""2;,+2"9#"25'$;$"$,552 5,'#$"82$ ,$028+,-2+:,"4+,22"&"+;$58+12/% 通讯作者 何建军 3,+-+",2 优先出版 "+"$8$,+-.((-( " #$#"

2 西安交通大学学报 医学版 第 卷 内分泌治疗一直以来都是激素受体阳性乳腺癌患者的常用辅助治疗手段 虽然大多数患者在使用之初都有所获益 但是伴随着治疗的进行 耐药的出现 成为限制内分泌治疗的主要问题 他莫昔芬,2+$" 属于选择性雌激素 受体调节剂 是临床最常用的内分泌治疗药物之一 其作用机制包括阻断雌激素受体 3. 的活性 导致乳腺癌细胞周期停滞 活化胱门蛋白酶,8,8$8 和丝裂原活化蛋白激酶 8 家族中 的 41 和 ( 诱导癌细胞凋亡 众多研究表明 受体酪氨酸激酶.8 如表皮生长因子受体 人表皮生长因子受体 可以通过活化 信号通路磷酸化 3. 导致 3. 的持续活化 从而引起 效能改变 因此 信号在 原 发性及继发性耐药中起核心作用 在哺乳动物细胞中 信号通路有 个主要分支 3.$$ 5,$-#-,58+",-5$#-,$+",8$841$4#" 1$5+",-+",8$8 和 ( 8 3. 信号通路可被生长因子激活 常常参与促细胞生长的过程 而 3. 短暂微弱却可以抑制凋亡 41 和 ( 信号通路可被生长因子 细胞因子和细胞应激激活 并且根据激活因子和细胞内环境的不同导致细胞的生长或死亡 这 个分支均在细胞表面被激活 并分别由上游的 级联磷酸化 然后磷酸化的 88 进入细胞核磷酸化相应的转录 因子 从而影响靶基因的转录 双特异性磷酸酶 #,-8$+++28,,8$ %&' 可以去磷酸化 的全部 个家族成 ( 员 对 信号通路起负向调节作用 研究显示 %&' 在 的乳腺癌中表达低于癌旁正常乳腺组织 且 %&' 的表达水平与乳腺癌分期分级 呈负相关 %&' 的低表达提示较差的预后 另有文献却提示 %&' 可以介导乳腺癌化疗耐药 抑制 %&' 的表达水平或生物活性 可以通过增强 41 的活性增加化疗敏感性 但关于 %&' 在乳腺癌内分泌耐药中的作用迄今未见相关研究报道 根据现有的研究数据可推测出以下相互矛盾的结论 %&' 通过灭活 8 减弱.8 与 3. 的串话 提高细胞内的 %&' 水平 可能延缓甚至逆转 耐药 %&' 水平增高可通过降低细胞内 41( 或维持 3. 短暂微弱的活化状态 从而降低 诱导的细胞凋亡 可能有利于 耐药的产生 本研究通过临床数据库分析和配对标本检测初步探讨了 %&' 在乳腺癌耐药中的作用 旨在探索 耐药的分子机制以及分子标记物 为延 缓甚至逆转 耐药提供可能的理论依据 材料与方法 临床数据库分析 使用 $,"$5$"2$ -,8 在线数据库下载 名乳腺癌患者的基因表达和临床病理学数据 统计分析 %&' 在不同临床病理特点的乳腺癌患者中的分布和表达情况, 在线生存分析 使用,-,"$+$5-2$5 在线生存分析软件 -22,",-8+8 分析 %&' 表达水平与乳腺癌患者生存情况的关系 该软件中包括了 名乳腺癌患者总生存 ' 无复发生存.9' 无远处转移生存 %9' 以及肿瘤组织的基因表达水平等数据 这些数据来自于 33 和 三个大型数据库 通过整合分析数据库中的相应数据 得出患者的生存曲线以及 值 0. 值 风险比 等结果 - 临床病例标本的收集 收集 ( 年 月 日 年 ( 月 日就诊于西安交通大学第一附属医院乳腺外科并在规律辅助内分泌治疗 他莫昔芬 过程中复发 局部复发或转移 的乳腺癌患者 ( 名 分别取其在他莫昔芬治疗前切除的原发肿瘤及他莫昔芬治疗后耐药的肿瘤组织作为 对标本 共采集 ( 对. 免疫组化染色和图像分析 所有标本经 )) 中性甲醛固定 常规石蜡包埋后做 切片 将制备好的切片二甲苯脱蜡并逐级梯度乙醇水化 )) 双氧水孵育 +" 以阻断内源性过氧化物酶 柠檬酸缓冲液中微波修复抗原 牛血清白蛋白封闭 +" 后滴加 %&' 抗体, 英国 过夜 二抗孵育 +" 后 %7 显色 苏木素复染 分化 反蓝 梯度乙醇脱水 二甲苯透明 中性树胶封片 使用 -#8 光学照相系统采集图像 在每张切片癌巢区域随机抓拍 张 采用,$52 -#8 显微镜图像分析软件 检测图像平均吸光度 $,"$"8+ 该值可反映免疫组化染色的强弱 取 张片子的平均值反应一个标本的染色强度 / 统计学分析 采用 ''' 统计软件进行分析 数据以均数 标准差 表示 两组之间的比较采用 检验 多组之间的比较采用单因素方差分析 配对样本采用 <+-22" 符号秩和检验 生存分析采用, -,"$+$5 法 为差异有统计学意义, 结 果, 患者的临床病理特点 在 数据库中共有 名乳腺癌患者临床病理及.18$= " #$#"

3 期 张慧敏 刘 洋 周瑜辉 等 双特异性磷酸酶 在乳腺癌及他莫昔芬耐药病例中的表达变化 数据 其中正常组织样本占 原发性乳腺癌占 转移性乳腺癌占 所有原发性乳腺癌患者的临床病理特点见表,0,1 基因表达水平和患者临床病理特点的关系 %&' 在肿瘤组织中的表达水平显著低于正常组织 图 图 而在不同的临床分期标本中表达水平无统计学差异 图 7 在 分子分型 中 )#+",- 型患者瘤组织 %&' 的表达水平显著高于 )#+",-7 型 03. 过表达型 03.$" 5+$ 和基底样型 7,8,--+$ 图 图 3. 阳性的乳腺癌患者瘤组织中 %&' 表达水平显著高于 3. 阴性者 图 %. 阳性患者 %&' 的表达水平也显著高于. 阴性患者 图 3 而 %&' 在 03. 阳性和阴性患者瘤组织中的表达水平无明显差异 图 9 表 / 例原发性乳腺癌患者的临床病理特点, -+"+2,2-2+,5,$5+8+82,+$"8+5+,5 5$,8,"$5 临床病理特点 例数 临床病理特点 例数 1 分期 03. 状态 阳性 阴性 可疑 不确定 分子分型 ( )#+",- ( 3. 状态 )#+",-7 阳性 7,8,--+$ 阴性 03.$"5+$ 不确定 125,--+$ ( (. 状态 阳性 阴性 不确定 ( 3. 雌激素受体. 孕激素受体 03. 人类表皮生长因子受体 图 1 表达水平与乳腺癌患者临床病理特点的关系 9+.$-,+2"8+ $$$"%&'$5$88+2","-+"+2,2-2+,5,$ $,8,"$5,+$"8 %&' 在不同组织中的表达水平 与正常组织相比 7%&' 在不同肿瘤分期中的表达水平 %&' 在不同分子分型中的表达水平 与 )#+",- 相比 与 7,8,--+$ 相比 %%&' 在不同 3. 状态中的表达水平 与 3. 阳性相比 3%&' 在不同. 状态中的表达水平 与. 阳性相比 9%&' 在不同 03. 状态中的表达水平 " #$#"

4 ' "' " 西 安 交 通 大 学 学 报 医 学 版 " 第 " 卷 图 D""I=J 基因表达水平热图 W $ H D BD+P T789:&M41+ P4 42 D 3 D43 M- DH E""I=J基因表达水平与患者生存情况的关系 " 将 在线 生 存 分 析 数 据 库 中 所 有 的 乳 腺 癌 患 者&根 据 789:& 高表达与低 表 达 组&分 析 结 果 显 示 $ 组 的 总 生存无统计学差异图 >"&但 789:& 高表达者有着 789:& 表达水平是 否 高 于 中 位 数 将 患 者 分 为 $ 组& 与 789:& 低 表 达 的 乳 腺 癌 患 者 相 比& 789:& 高 表 更好的无复发生存&且 风 险 比 HF"更 低 图 7"&提 达者有 着 更 好 的 总 生 存 图 <"和 无 复 发 生 存 图 腺癌患者的无复发生存' 示 789:& 表 达 水 平 可 能 影 响 接 受 内 分 泌 治 疗 的 乳 U"' 接 着 将 接 受 内 分 泌 治 疗 的 患 者 同 样 分 为 图 E""I=J 表达水平与患者生存分析 W >P E D P42, 4789:&1+ P4D4/+D 4 5 Y YD E M<#所有乳腺癌患者中 789:& 高表达组红色"和低表达组黑 色"的 总 生 存 曲 线% U#所 有 乳 腺 癌 患 者 中 789:& 高 表 达 组 红 色"和低表达组黑色"的 无 复 发 生 存 曲 线% >#接 受 内 分 泌 治 疗 的 乳 腺 癌 患 者 中 789:& 高 表 达 组红 色"和 低 表 达 组黑 色"的 总生存曲线% 7#接受内分泌治疗的乳腺癌患者中 789:& 高表达组红色"和低表达组黑色"的无复发生存曲线' DH F" 内分泌耐药患者的临床病理资料 " & 例于 & 年内复发 &$#] "&提示为原 发 性 耐 药& "例均为&年后复发 料见表 $' DH G" 内 分 泌 耐 药 的 乳 腺 癌 组 织 中 "I=J 蛋 白 的 表 达情况 " 在所收集 的 乳 腺 癌 原 发 灶 和 耐 药 的 复 发 癌 灶中均可见癌细胞的胞质被染成 黄色或褐 色图 "&提示为获 得 性 耐 药% #例为原发灶同侧胸 壁复发 '$#] "& $ 例为原发灶 同侧 锁 骨 上 淋 巴 结 转 其中 对 标 本 复 发 灶 的 平 均 吸 光 度 高 于 原 发 灶 移 $#%] "& &例为腰椎转移 &$#] "% &例复发后 HQF$ 状态发生改变 &$#] "& '例复发后激素受体 "#] "& # 对标本复发灶的平 均 吸 光 度 低 于 复 发 灶 '$#] "&经配 对 样 本 的 ` E 3P1P4 符 号 秩 和 检 验 提 "& & 例原发 灶 受体状 态 &$#] "' 所 有 内 分 泌 耐 药 患 者 临 床 病 理 资 示& 789:& 在原 发 灶 和 ;<= 耐 药 的 复 发 灶 之 间 的 表达差异无统计学意义 $%%#&图 #"' $$,,,$$0112) /01234%) 1 5/534 +#. +#.

5 期 张慧敏 刘 洋 周瑜辉 等 双特异性磷酸酶 在乳腺癌及他莫昔芬耐药病例中的表达变化 表, 内分泌耐药患者的临床病理资料, -+"+2,2-2+,5,$ $8+8,",+$"8 患者编号 复发部位 复发时间 月 原发灶受体状态 复发灶受体状态 胸壁 ( > >???? 胸壁? >???? 胸壁 >????? 胸壁 ( > >? > > > 胸壁 > > > 腰椎 > >???? 淋巴结 > >???? ( 淋巴结 (? >???? 图. 乳腺癌原发灶和 耐药的复发癌灶中 1 的表达情况 9+%&'$5$88+2"+"5+,5 5$,8,"$5,"5$8+8," 5$,8,"$5 乳腺癌原发灶 03@7 耐药的复发灶 03@ 乳腺癌原发灶 0@% 耐药的复发灶 乳腺癌原发灶 03@9 耐药的复发灶 03@ 乳腺癌原发灶 0@0 耐药的复发灶 0@ 图 /1 在乳腺癌原发灶和复发灶表达水平的变化 9+,"$2%&'$5$88+2"+"5+,5 5$,8,"$5,"5$8+8," 5$,8,"$5 - 讨 论内分泌耐药是激素受体阳性患者治疗过程中面临的主要临床问题之一 耐药的产生影响内分泌治疗的效果及患者的无复发生存 本研究首次结合临床 数据初步分析了 %&' 这一双特异性磷酸酶在乳腺癌内分泌耐药中的作用 通过 临床数据库基因表达水平的分析 我们发现 %&'.1 的水平在乳腺癌组织中显著降低 且在 )#+",- 型 3. 阳性. 阳性等预后较好的类型中表达水平显著高于 7,8,--+$ 型 03.$"5+$ 型 3. 阴性. 阴性等预后较差的类型和转移性乳腺癌 同时生存分析结果显示 %&' 高表达的患者有着更好的总生存和无复发生存 在接受内分泌治疗的患者中 %&' 的高表达与更好的无复发生存相关 以上临床数据库分析结果均提示 %&' 在乳腺癌中发挥一定的作用 且对接受内分泌治疗的患者预后有显著影响 然而 通过免疫组化法对 ( 名患者原发灶和耐药复发灶标本中 %&' 蛋白表达情况的分析并未发现统计学差异 产生这一与预期不符的结果 我们考虑主要有以下因素 样本量小 由于辅助内分泌治疗耐药出现的时间 " #$#"

6 ( 西安交通大学学报 医学版 第 卷 晚而病例收集时间不够长 耐药前后配对的标本收集较困难等客观原因所致 因此需要进一步扩大样本量对我们的假设进行验证.1 仅反映基因的转录水平 而翻译和转录后修饰都会影响蛋白表达水平 因此经过辅助治疗的肿瘤标本中 %&' 的转录后修饰和翻译等影响蛋白表达的生物学过程是否亦受到影响从而影响我们所观察到的总蛋白表达水平需要进一步研究 %&'8 家族中的 个成员均 对 8 的 个或数个通路有去磷酸化作用 而具体 耐药的形成过程中究竟是哪一个或哪几个 %&'8 发挥了作用 迄今尚未见全面系统的研究 或许 %&' 只是众多参与 耐药发生的双 特异性磷酸酶中的一个 & 等就认为 %&' 在 3.> 乳腺癌细胞系中的高表达可抵抗 的细胞生长抑制作用 在子宫内膜细胞中 高水平的 %&' 能增加 对 3. 的激动活性 在雌激素环境下 %&' 过表达与低水平的 3. 有关 但是雌激素剥夺或 干预能降低 %&' 的活性 导致 3. 上调 3. 的 '$5( 磷酸化和 -+"% 的表达 031'1 等的研究结果则提示 可以上调 %&' 的表达水平 而在 耐药的细胞株上调 %&' 可以增加 的敏感性 因此 对于 %&' 在乳腺癌 耐药中的作用需要更大样本的临床研究 同时对于 8 和 8 的表达水平的测定可更明确地提示在 耐药的发生过程中参与变化的具体分支及不同分支所扮演的角色 而细胞学实验则可以排除体内复杂的内环境变化带来的干扰 并且具体对 原发性和继发性耐药分别进行干预和分析以进一步消除混杂因素 综上所述 本研究发现 %&' 基因高表达预示着乳腺癌患者更好的临床预后 但未能发现 %&' 在乳腺癌原发灶和 耐药组织中的表达水平有统计学差异 关于 %&' 与 耐药之间的关系的探索有待更大样本的临床研究和更深入的细胞和分子生物学实验 参考文献 1/+$$+'+ +'+/'&# )#)"##")#,##&22+/3% 0# (& #''3 (& )#)# $3/& "3"# (& '33$4-1/33'3 1&"## #)##&+/( & +'34+/$5/+' &+## "#')) "#"),###&0#/ & 133-+/(3/ 03$'& ")##,( ))" ") #,##&3"# & ++13'$' 44-1$& +( " +(#,## )&0#/& 2/$03%333/+4$(&#" +(+( #""##&()#/ (& (- 1$&/)#" 4(##&0# / (& 70+'10-03'7&#"4( "#,##&-" $ (& $+1-$5511'$$&#" )",### )#&0#/& 0+($ '0$++/4'$+$&## ) #+(# &7,& 05(+//++'1 &3" )#", ))#))#&0#/ & ++13'$' 44+'1- &7# 4(" 4(,##) &#& 编辑 卓选鹏 " #$#"

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