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下雨柳
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1 第 27 卷第 1 期高压物理学报 Vol.27,No 年 2 月 CHINESEJOURNAL OF HIGH PRESSURE PHYSICS Feb.,2013 文章编号 : (2013) 温压结合超高压处理对芽孢 * 杀灭作用的研究进展章中 1,2,3, 胡小松 1,3, 廖小军 1,3, 张燕 1,3 (1. 中国农业大学食品科学与营养工程学院, 北京 ; 2. 宁夏大学农学院, 宁夏银川 ; 3. 国家果蔬加工工程技术研究中心, 北京 ) 摘要 : 详细介绍了温压结合超高压杀菌技术的优点, 指出其独特的应用优势, 深入完整地综述了温压结合超高压处理对各类细菌芽孢的杀灭作用及动力学研究成果, 并对温压结合超高压处理杀灭芽孢的机理做了初步总结在此基础上, 分析了该研究领域尚存在的问题, 提出了未来的研究重点和方向关键词 : 温度 ; 超高压 ; 芽孢 ; 高压杀菌中图分类号 :O521.9 文献标识码 :A 1 引言食品保藏是一个重要而普遍古老而永恒的问题造成食品腐败变质的一个重要原因就是微生物, 因此通过杀菌可以达到保藏食品的效果自 1810 年法国人阿培尔采用热杀菌技术保藏食品后, 各种新的食品杀菌保藏技术不断涌现, 如化学防腐剂杀菌辐照杀菌等, 但是因为这些新技术本身具有局限性, 目前热杀菌仍是工业上最普遍使用的杀菌技术然而热杀菌也存在一些难以克服的缺点, 主要体现在对食品感官和营养品质的不利影响近年来, 人们对食品品质要求越来越高, 希望尽可能在食品加工过程中保持食品原有的新鲜感官和营养品质, 同时科学技术飞速进步, 两者共同推动了新型食品杀菌技术研究的发展, 出现了如超高压杀菌技术高压二氧化碳杀菌技术高压脉冲电场杀菌技术强磁场杀菌技术超声杀菌技术等新型杀菌技术其中, 超高压杀菌技术是目前商业化应用程度较高的一种新型非热杀菌技术 2 超高压杀菌技术超高压杀菌技术只作用于对生物大分子立体结构有贡献的氢键离子键和疏水键等非共价键, 对维生素色素和风味物质等小分子化合物的共价键无明显影响, 使食品很好地保持了原有的营养色泽和 [1] 风味由于超高压技术显著提高食品品质, 因此该技术被中国日本欧美等国家的许多企业广泛应用于加工高品质乳制品大米制品蔬果汁果酱蒜泥火腿肠海鲜水产等食品, 超高压食品的销售量也快速增长超高压能很好地杀灭酵母菌霉菌病毒和细菌的营养体大量研究表明, 一般在 300~700MPa * 收稿日期 : ; 修回日期 : 基金项目 : 国家科技支撑计划项目 (2011BAD05B05); 国家自然科学基金 ( ) 作者简介 : 章中 (1977-), 男, 博士, 讲师, 主要从事果蔬加工非热加工研究. zhangzhong99@126.com 通讯作者 : 张燕 (1977-), 女, 博士, 副教授, 主要从事非热加工技术理论与应用研究. zhangyaṉ348@hotmail.com

2 148 高压物理学报第 27 卷压力下, 非芽孢类微生物可被杀死 [2] 但是, 由于细菌的芽孢极其耐压 [3], 芽孢会萌发生长进而导致食品腐败, 因此虽然超高压技术能很好地应用于高酸食品的杀菌和保藏, 然而对于低酸食品, 超高压处理后必须进行冷藏以防止芽孢萌发而导致食品腐败变质, 这给超高压食品的贮藏和运输带来很多不便, 这也是超高压技术最大的不足之处为了克服该缺点, 彻底杀灭细菌芽孢, 超高压技术必须与其它杀菌技术结合使用, 如热处理添加化学防腐剂等美国 Natick 陆军士兵系统中心组织了一个由大学科研机构超高压装备企业大型食品加工企业组成的研究联盟, 投资近千万美元, 耗时 7 年, 成功开发出针对低酸食品的温压结合高压杀菌 (High PressureThermalSterilization,HPTS) 技术 2009 年, 美国食品药物管理局批准了 HPTS 用于低酸食品杀菌目前,HPTS 已通过了美国国家食品安全与技术中心和美国 DUST(DualUseScienceand Technology) 联盟成员严格的验证程序和安全评估 3 HPTS 技术热力杀菌时, 温度越高时间越长, 食品品质受损越大据研究, 温度每升高 10, 食品的营养和感官品质的破坏速度就增加 2~3 倍, 因此降低杀菌温度能大大保护食品品质 HPTS 所采用的温度通常为 50~80, 与巴氏杀菌温度相近, 比传统的高温高压杀菌所用的温度低得多, 远远低于超高温杀菌所用的温度, 而且 HPTS 所用的时间大大少于巴氏杀菌所用时间, 可以说 HPTS 对食品营养和感官品质的影响远低于传统热力杀菌方法大量实验发现, 使用 HPTS 加工的鲜切蔬菜 ( 如白菜花胡萝卜白萝卜彩椒藕莴笋绿菜花冬瓜等 ) 的营养和感官品质远高于采用热杀菌的对照样品归纳起来, HPTS 技术具有以下优点 :(1) 与传统高温热杀菌相比,HPTS 能很好地保持食品原有的色香味营养素和功能性成分 ;(2) 瞬时压缩, 作用均匀, 时间短, 操作安全, 杀菌效果好 ;(3) 能使各种各样的低酸食品在常温下长期保存, 在低酸食品的常温保藏上具有独特的应用优势 ;(4) 纯物理杀菌过程, 不添加防腐剂 ;(5)HPTS 使用电力, 对环境污染小, 洁净环保 ;(6)HPTS 在保压杀菌期间, 基本不需要电力, 能耗较低基于以上优势,HPTS 受到了人们的广泛关注关于 HPTS 杀灭细菌芽孢的研究报道较多, 但多集中在杀灭效果和动力学研究上 3.1 HPTS 对细菌芽孢的杀灭效果 [4] 1996 年,Roberts 等人发现 MPa 能有效杀灭嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢, 并且芽孢在常压 [5] 下的耐热性与芽孢在高压下的耐热性无关 1998 年,Mils 等人发现 400MPa 60 30min 能有效 [6] 杀灭芽孢 1999 年,Reddy 等人发现 827 MPa 55 5min 能杀灭约 5 个对数的肉毒杆菌芽孢 [7] 2000 年,Stewart 等人发现 404MPa 70 15min 能杀灭约 5 个对数的枯草杆菌芽孢, 而在室温下几 [8] 乎没有任何杀灭效果 2000 年,Okazaki 等人发现 HPTS 对不同菌种芽孢的杀灭效果是不一样的 [9] 2001 年,Ananta 等人发现高压结合中温能有效杀灭嗜热脂肪芽孢杆菌 ATCC7953 芽孢 2002 年, [10] Lee 等人发现高压结合中温 (45 71 或 90 ) 能成功杀死苹果汁中的酸土脂环酸芽孢杆菌芽孢 [11] 2003 年,Reddy 等人研究发现 HPTS 能有效杀灭蟹肉棒中的肉毒杆菌芽孢, 且压力越高温度越高 [12] 或时间越长, 杀灭效果越好 2006 年,Lee 等人发现 HPTS 能有效杀灭苹果汁中的酸土脂环酸芽孢 [13] 杆菌芽孢, 且苹果汁浓度会影响杀灭效果 2006 年,Scurrah 等人发现 HPTS 对不同菌种和菌株芽 [14] 孢的杀灭效果差异较大 2006 年,Reddy 等人发现, 当温度为 75 时, 超高压能很好地杀灭蟹肉和 [15] 磷酸缓冲液中多种肉毒杆菌菌株的芽孢 2006 年,Gao 等人发现, 压力温度和时间是杀灭芽孢的 [16] 3 个关键因素 2007 年,Estrada-Gir 췍n 等人发现压力温度和时间的组合在 550~620 MPa 70~ [17] 90 2s~15min 范围内时, 能有效杀灭豆奶中的嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢 2007 年, 高瑀珑等人研究了 HPTS 对枯草芽孢杆菌与嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢的影响, 结果表明 HPTS 能够破坏芽孢结构, 显著提高芽孢 2,6- 吡啶二羧酸 (DipicolinicAcid,DPA) 的泄漏率 (P<0.05), 而 DPA 与芽孢 DNA 的稳定 [18] 性有关 2008 年,Robertson 等人发现 600MPa 75 60s 能有效杀灭复原脱脂乳中的细菌芽孢, [19] 以硅油为传压介质时的杀菌效果比以水为传压介质时好 2008 年, 黄娟等人初步研究了 HPTS 的

3 第 1 期章中等 : 温压结合超高压处理对芽孢杀灭作用的研究进展 149 升压过程对凝结芽孢杆菌嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢失活发芽损伤的影响, 发现压力与热力的协同作用 [20] 显著, 热是造成芽孢损伤的一个重要因素 2008 年,Ju 等人研究了 HPTS (400~600 MPa 60~ 80 10~20min) 杀灭牛奶中蜡样芽孢杆菌芽孢的效果, 通过响应面法分析, 发现杀灭 6 个对数芽孢 [21] 的最佳条件为 :540MPa min 2009 年, 武玉艳等人研究了 HPTS 对不同介质中嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢灭活的影响, 结果表明, 嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢在不同介质中的失活率依次为 : 牛乳 > [22] 磷酸缓冲液 > 鸡腿菇 > 卤牛肉 2009 年,Bul 等人研究发现, 对于不同的菌种及菌株, 热和压力的协 [23] 同作用是不同的 2010 年,Wang 等人发现凝结芽孢杆菌和嗜热脂肪芽孢杆菌在鸡腿菇中对 HPTS 的抗性比其在磷酸缓冲液中的抗性要高, 且嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢的抗性比凝结芽孢杆菌芽孢高 [24-25] 2010 年,Gao 等人发现食品成分 ( 如大豆蛋白蔗糖 ) 和食品基质 ph 值能显著影响嗜热脂肪芽孢 [26] 杆菌和蜡样芽孢杆菌对 HPTS 的抗性 2011 年,Minh 等人报道了枯草杆菌芽孢的形成条件对其芽孢性质的显著影响, 包括芽孢对热处理和高压处理的抗性 3.2 HPTS 对细菌芽孢的杀灭动力学 [9] 2001 年,Ananta 等人用一个 n 级数学动力学模型精确描述了 HPTS 杀灭细菌芽孢的曲线 [27] 2004 年,Cléry-Barraud 等人发现 HPTS 能彻底杀灭炭疽杆菌芽孢, 当压力为 500MPa 温度为 75 时,D 值 ( 指在一定处理环境中及一定致死压力和温度条件下某细菌数群中每杀死 90% 原有残存活菌 [28] 数时所需要的时间 ) 约为 4min 2004 年,Rodriguez 等人在经典热力学和动力学原理基础上建立了 [29] 一个预测 HPTS 下芽孢死亡规律的模型 2006 年,Gao 等人使用响应面法研究了 HPTS 杀灭芽孢 [30] 的效果, 建立了描述灭菌规律的二次方程式 2007 年,Gao 等人还研究了食品组分和 ph 值对 [31] HPTS 杀灭枯草杆菌芽孢的影响, 建立了二次预测模型 2008 年,Zhu 等人研究了 HPTS 杀灭生芽孢梭状芽孢杆菌 PA3679 芽孢的动力学, 当压力为 700~900MPa 温度为 80 时, 得到的 D 值为 15.8 ~7.0min, 此外还建立了回归模型以预测 D 值为了更精确地研究 HPTS 杀灭芽孢的动力学,2009 年 [32] Shao 等人使用了聚甲醛保温桶以保持温度稳定性, 获得了更精确的芽孢死亡动力学数据 2009 年, [33] 王标诗等人研究了 HPTS 对嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢在磷酸缓冲液和牛奶中灭活的动力学规律, 结果表明在 3 种拟合模型 ( 线性 Weibul Logḻogistic 模型 ) 中, 线性模型不适合模拟这些存活曲线, 而 [34] Logḻogistic 模型能最好地模拟存活曲线 2009 年,Wang 等人研究了 HPTS 对凝结芽孢杆菌芽孢的杀灭动力学, 发现芽孢残存曲线均存在拖尾现象,Logḻogistic 模型对所有残存曲线的拟合效果最好 ; [23] 此外他们还研究了嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢和凝结芽孢杆菌芽孢对 HPTS 的抗性, 发现 Logḻogistic [35] 模型对芽孢残存曲线的拟合效果最好 2010 年,Ramaswamy 等人发现 : 用一级模型能很好地描绘处理时间对 HPTS 杀灭生芽孢梭状芽孢杆菌芽孢效果的影响 ;900MPa 80 时,D 值为 16.5min; 在和 900 MPa 下, 温度校正后 ZT 值 ( 灭菌时间减少到原来的 1/10 所需升高的温度 ) 分别为和 18.2 ; 同样在 80 时, 校正的 Z p 值 ( 灭菌时间减少到原来的 1/10 所需升高的压力 ) 为 [36] 714MPa 2011 年,Olivier 等人报道了在温压结合超高压杀菌过程中热与高压有很强的杀灭芽孢的协同作用, 并首次将 F 值 ( 在一定杀菌压力和温度下, 杀死一定浓度的某种微生物所需时间 ) 用于全面定量地确定 HPTS 杀灭芽孢的效果 3.3 HPTS 杀灭细菌芽孢的机理 [37] 关于 HPTS 杀灭细菌芽孢机理的研究报道不多 2006 年, 曾庆梅等人研究了 HPTS 对枯草杆菌芽孢超微结构的影响, 采用透射电子显微镜进行观察, 发现处理后芽孢外壳被破坏出现缺口, 芽孢内含物结构紊乱泄漏出现部分透电子区, 甚至内含物质完全泄漏, 出现细胞壁或孢子外壳残留 [38] 2008 年, 刘洁等人采用中温协同超高压方法研究了连续式施压和间歇式施压两种不同方式对枯草杆菌芽孢的灭活作用, 结果表明间歇施压能更有效地杀灭芽孢, 经扫描电镜观察, 芽孢外壳出现凹陷皱褶等形态变化 HPTS 对细菌芽孢的良好杀灭作用已得到公认, 但关于 HPTS 杀灭芽孢的机理, 目前远不够清楚有人认为 HPTS 杀灭芽孢的过程包括两个阶段 : 第 1 阶段, 超高压和热处理产生亚致死损伤芽孢 ; 第 2

4 150 高压物理学报第 27 卷阶段, 较温和的热处理使其失活 HPTS 灭活芽孢的机理可能涉及 : 改变芽孢蛋白理化性质 ; 改变芽孢内膜通透性, 使水分进入芽孢核心而重新水合 ; 压力导致芽孢扁平挤压或拉伸等 [27] 2007 年,Mathys [39] 等人使用流式细胞仪研究了 HPTS 对地衣芽孢杆菌芽孢的杀灭机理, 采用 SYTO16 和碘化吡啶对杀菌处理后的芽孢进行染色, 研究芽孢内膜变化, 提出了一种包含 3 个步骤的 HPTS 杀灭芽孢机制, 依 [40] 次为芽孢皮层水解和芽孢萌发一个未知步骤芽孢内膜破坏导致芽孢失活 2009 年,Mathys 等人 [41] 又使用一种新的分析方法来进一步研究 HPTS 杀灭芽孢的机制 2011 年,Vercammen 等人发现在 600~800 MPa 下, 芽孢的萌发与温度关系极大, 当温度为 60 时, 大多数萌发的芽孢被杀死 [42] 2011 年,Reineke 等人通过研究芽孢特有物质 DPA 的释放和芽孢热敏感性的增加情况, 认为 HPTS 杀灭芽孢的机制涉及休眠激活杀灭这 3 个生理步骤 4 结论与展望 HPTS 优点鲜明, 已成功应用于工业化生产, 应用前景非常广阔然而, 目前对其杀灭芽孢机理的研究却鲜有报道, 已有研究大多停留在用扫描电镜或透射电镜观察芽孢形态和结构变化观察 DPA 的释放情况及用荧光分光光度计或流式细胞仪观察芽孢内膜流动性和通透性变化的层次上, 到目前为止几乎没有关于 HPTS 对芽孢 DNA 和蛋白质 ( 特别是小分子酸溶性蛋白 ) 影响的报道人们对于 HPTS 杀灭芽孢的机理仍不够清楚, 这妨碍了 HPTS 在食品工业中的大规模应用对 HPTS 杀灭芽孢机理的深入研究已成为迫切需要解决的关键科技问题, 也是 HPTS 科学研究发展的大趋势 References: [1] OeyI,LileM,LoeyA V.Efectofhigẖpressureprocessingoncolour,textureandflavouroffruiṯ andvegetablebasedfoodproducts:areview [J].TrendsFoodSciTech,2008,19(6): [2] LudwigH,vanAlmsickG,SojkaB.Highpressureinactivationofmicroorganisms[J].ProgBiotechnol,1996,13: [3] Alpas H,Kalchayanand N,BozogluF,etal.Interactionsofhighhydrostaticpressure,pressurizationtemperature andphondeathandinjuryofpressureṟesistantandpressure-sensitivestrainsoffoodbornepathogens[j].food Microbiol,2000,60(1): [4] RobertsC M,HooverD G.SensitivityofBaciluscoagulanssporestocombinationsofhighhydrostaticpressure, heat,acidityandnisin [J].JApplBacteriol,1996,81(4): [5] MilsG,Earnshaw R,Paterson M F.EfectsofhighhydrostaticpressureonClostridiumsporogenesspores[J]. LetApplMicrobiol,1998,26(3): [6] ReddyN R,SolomonH M,FingerhutGA,etal.InactivationofClostridiumbotulinumtypeEsporesbyhighpressureprocessing [J].JfoodSafety,1999,19(4): [7] StewartC M,DunneC P,Sikes A,etal.SensitivityofsporesofBacilussubtilisandClostridiumsporogenes PA3679tocombinationsofhighhydrostaticpressureandotherprocessingparameters[J].InnovatFoodSciEmerg Tech,2000,1(1): [8] OkazakiT,KakugawaK,YonedaT,etal.Inactivationbehaviorofheaṯresistantbacterialsporesbythermaltreaṯ mentscombinedwithhighhydrostaticpressure[j].foodscitechres,2000,6(3): [9] AnantaE,HeinzV,SchluterO,etal.KineticstudiesonhigẖpressureinactivationofBacilusstearothermophilus sporessuspendedinfoodmatrices[j].innovatfoodsciemergtech,2001,2(4): [10] LeeSY,DoughertyR H,KangD H.InhibitoryefectsofhighpressureandheatonAlicyclobacilusacidoterrestris sporesinapplejuice[j].applenviron Microb,2002,68(8): [11] ReddyN R,SolomonH M,TetzlofRC,etal.InactivationofClostridiumbotulinum typeasporesbyhigẖpressureprocessingatelevatedtemperatures[j].jfoodprot,2003,66(8): [12] LeeSY,ChungHJ,KangD H.CombinedtreatmentofhighpressureandheatonkilingsporesofAlicyclobacilus acidoterrestrisinapplejuiceconcentrate[j].jfoodprot,2006,69(5):

5 第 1 期章中等 : 温压结合超高压处理对芽孢杀灭作用的研究进展 151 [13] ScurrahKJ,RobertsonRE,CravenH M,etal.InactivationofBacilussporesinreconstitutedskim milkbycombinedhighpressureandheattreatment[j].japplmicrobiol,2006,101(1): [14] ReddyN R,TetzlofRC,SolomonH M,etal.InactivationofClostridiumbotulinum nonproteolytictypebspores byhighpressureprocessingatmoderatetoelevatedhightemperatures [J].InnovatFoodSciEmergTech,2006, 7(3): [15] GaoYL,JuX R,Jiang H H.StudiesoninactivationofBacilussubtilissporesbyhighhydrostaticpressureand heatusingdesignofexperiments[j].jfoodeng,2006,77(3): [16] Estrada-Gir 췍 ny,guerrero-beltr 췍 nja,swansonbg,etal.efectofhighhydrostaticpressureonsporesofgeobacilusstearothermophilussuspendedinsoymilk [J].JFoodProcessPres,2007,31(5): [17] GaoYL,JuXR,WuD.Studyonsynergetickilingefectsofmildheattreatmentandhighhydrostaticpressureon Bacilusspores[J].FoodScience,2007,28(3):59-63.(inChinese) 高瑀珑, 鞠兴荣, 吴定. 微热协同超高压处理杀灭芽孢杆菌芽孢效果的研究 [J]. 食品科学,2007,28(3): [18] RobertsonRE,CarrolT,PearceLE.Bacilussporeinactivationdiferencesaftercombinedmildtemperatureand highpressureprocessingusingtwopressurizingfluids[j].jfoodprot,2008,71(6): [19] HuangJ,LiBS,WangBS,etal.Efectsofpressureincreasingprocessofhigẖhydrostaticpressure-assistedtheṟ malprocessingontwobacilusspores[j].foodscience,2008,29(6):90-95.(inchinese) 黄娟, 李汴生, 王标诗, 等. 高静压协同热处理的升压过程对两种细菌芽孢的作用 [J]. 食品科学,2008,29(6): [20] JuXR,GaoY L,Yao M L,etal.ResponseofBaciluscereussporestohighhydrostaticpressureand moderate heat[j].lwt-foodscitech,2008,41(10): [21] WuY Y,LiBS,RuanZ,etal.InactivationefectofhighpressurecombinedheatingonBacilusstearothermophilussporesindiferentmedium [J].FoodandFermentationIndustries,2009,35(4):5-9.(inChinese) 武玉艳, 李汴生, 阮业,2009,35(4):5-9. 征, 等. 热协同超高压对不同介质中嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢的灭活作用 [J]. 食品与发酵工 [22] BulM K,OlivierSA,vanDiepenbeekRJ,etal.SynergisticinactivationofsporesofproteolyticClostridiumbotulinum strainsbyhighpressureandheatisstrainandproductdependent[j].applenviron Microb,2009,75(2): [23] WangBS,LiBS,ZengQX,etal.Inactivationefectsofcoprinuscomatusinoculatedwithbacterialsporesbyhigẖ pressurethermalprocessing [J].ChineseJournalofHighPressurePhysics,2010,24(2): (inChinese) 王标诗, 李汴生, 曾庆孝, 等. 热压协同处理对接种于鸡腿菇中的细菌芽孢灭活效果的影响 [J]. 高压物理学报, 2010,24(2): [24] GaoYL.EficacyofhighhydrostaticpressureandmildheattoreduceGeobacilusstearothermophilus AS sporesinmodelfoodsystems[j].jfoodsafety,2010,30(1): [25] Gao Y L,JuX R.ModelingtheefectsoffoodingredientsandpH onhigẖpressureprocessinginactivationof Baciluscereusspores:Alaboratorialstudy[J].IntJFoodSciTech,2010,45(9): [26] MinhH N,DurandA,LoisonP,etal.EfectofsporulationconditionsontheresistanceofBacilussubtilisspores toheatandhighpressure[j].applmicrobiolbiotechnol,2011,90(4): [27] Cléry-BarraudC,GaubertA,MassonP,etal.Combinedefectsofhighhydrostaticpressureandtemperaturefor inactivationofbacilusanthracisspores[j].applenviron Microb,2004,70(1): [28] RodriguezAC,LarkinJW,DunnJ,etal.Modeloftheinactivationofbacterialsporesbymoistheatandhighpressure[J].JFoodSci,2004,69(8):E367-E373. [29] GaoYL,JuX R,Jiang H H.AnalysisofreductionofGeobacilusstearothermophilussporestreated withhigh hydrostaticpressureandmildheatinmilkbufer[j].jbiotechnol,2006,125(3): [30] GaoYL,JuX R.StatisticalpredictionofefectsoffoodcompositiononreductionofBacilussubtilis As sporessuspendedinfoodmatricestreatedwithhighpressure[j].jfoodeng,2007,82(1): [31] ZhuS,Naim F,Marcote M,etal.HigẖpressuredestructionkineticsofClostridiumsporogenessporesinground beefatelevatedtemperatures[j].intjfood Microbiol,2008,126: [32] ShaoY,ZhuS,RamaswamyH,etal.Compressionheatingandtemperaturecontrolforhigẖpressuredestructionof

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7 北京大学学报医学版 # +94* 4 ' % 论著!! "# $ #% %"&!%'!! $ "( )& * $ +,-.)/ ) 01 " * ). " 2")3 )01 ( /" 433% /1 " 0 "51 " -.)/$ 6',)") 4.))%) 0

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