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1 第 21 卷 4 期 中 国 病 毒 学 21(4): 年 7 月 VIROLOGICA SINICA July 2006 * 水 稻 矮 缩 病 毒 昆 明 分 离 物 抗 血 清 制 备 及 免 疫 捕 捉 PCR 检 测 彭 潞 波 1, 李 婷 婷 1, 魏 春 红 2, 方 琦 1, 董 家 红 1, 张 丽 珍 苏 晓 霞 1, 丁 铭 1, 张 仲 凯 1**, 李 毅 (1. 云 南 省 农 业 科 学 院 生 物 技 术 及 种 质 资 源 研 究 所, 云 南 昆 明 ;2. 北 京 大 学 生 命 科 学 学 院, 北 京 ) Antiserum Preparation against Rice Dwarf Virus Kunming Isolate and Detection by Immunocapture PCR Tests PENG Lu-bo 1,LI Ting-ting 1,WEI Chun-hong 2,FANG Qi 1,DONG Jia-hong 1, ZHANG Li-zhen 1,SU Xiao-xia 1,DING Ming 1,ZHANG Zhong-kai 1**,LI Yi 2 (1.The Biotechnology and Genetic Resources Institute,Yunnan Academy of Agricultural Sciences,Kunming , China; 2.College of Life Science, Peking University, Beijing , China) Abstract:By Using the modified method to extract Rice dwarf virus virions from infected rice leaves, a concentration 3.854mg/mL of purified virus virions reached, and the Rabbits was immunized with purified virions, yielding high titer antiserum; 1:20480 by the indirect enzyme-linked immunosorbent assay (I-ELISA) test. The antiserum successfully detected three rice samples from Kunming, Yuxi and Luliang by I-ELISA.Immunocapture polymerase chain reaction (IC-PCR), respectively was the utilized to show that serologic and molecular methods were successfully used for detection of Rice dwarf virus. Key word:rice dwarf virus(rdv); Antiserum; I-ELISA; IC-PCR 2 1, 关 键 词 : 水 稻 矮 缩 病 毒 ; 抗 血 清 ; 间 接 ELISA; 免 疫 捕 捉 PCR 中 图 分 类 号 :S432.1 文 献 标 识 码 :A 文 章 编 号 : (2006) 由 水 稻 矮 缩 病 毒 (Rice dwarf virus,rdv) 引 起 的 水 稻 矮 缩 病 害, 最 早 由 日 本 报 道, 随 后 在 东 南 亚 等 国 以 及 我 国 的 福 建 云 南 等 南 方 稻 区 普 遍 发 生, 云 南 主 要 发 生 于 中 部 及 南 部 地 区 [1] 水 稻 在 苗 期 至 分 蘖 期 感 病 后, 植 株 矮 缩, 分 蘖 增 多, 叶 片 浓 绿, 僵 直, 出 现 白 斑, 生 长 后 期 病 稻 不 能 抽 穗 结 实, 在 暴 发 流 行 年 份 可 以 引 起 水 稻 的 严 重 减 产 RDV 在 分 类 上 属 于 呼 肠 孤 病 毒 科 (Reoviridae) 植 物 呼 肠 孤 病 毒 属 (Phytoreovirus) 成 员, 病 毒 粒 子 为 正 十 二 面 体 球 形 结 构, 直 径 约 为 69.3nm, 无 刺 突, 无 脂 蛋 白 外 膜 包 被, 具 有 双 层 的 蛋 白 衣 壳 [2] 病 毒 基 因 组 由 12 条 双 链 RNA 片 段 组 成, 其 中 S8 编 码 病 毒 外 层 外 壳 蛋 白 [3],S6 编 码 蛋 白 与 细 胞 间 运 动 相 关 [4],RDV 侵 染 寄 主 还 可 引 起 RNA 沉 默 [5] 为 便 于 对 水 稻 感 病 植 株 的 快 速 检 测, 本 研 究 对 水 稻 矮 缩 病 毒 的 分 离 提 纯 方 法 进 行 了 改 进, 并 用 提 纯 的 病 毒 制 品 制 备 了 高 效 价 抗 血 清 应 用 制 备 的 抗 血 清 对 RDV 云 南 3 个 不 同 地 区 的 分 离 物 进 行 间 接 酶 联 免 疫 吸 附 测 定 (I-ELISA), 以 及 免 疫 捕 捉 多 聚 酶 链 式 反 应 (IC-PCR) 测 定, 建 立 了 快 速 检 测 RDV 的 血 清 学 和 分 子 检 测 方 法 1 材 料 和 方 法 1.1 实 验 材 料 提 纯 用 病 毒 材 料 采 自 云 南 省 昆 明 市 市 郊 感 病 稻 田, 其 他 毒 源 材 料 分 别 采 自 云 南 玉 溪 和 陆 良, 水 稻 病 株 具 有 明 显 矮 化 症 状, 局 部 有 细 小 褪 绿 斑 点 ; 免 疫 用 兔 子 购 自 昆 明 制 药 厂 实 验 动 物 处 收 稿 日 期 : , 修 回 日 期 : * 基 金 项 目 : 国 家 重 点 基 础 研 究 发 展 规 划 项 目 (G ) 作 者 简 介 : 彭 潞 波 (1975-), 女, 云 南 昆 明 籍, 助 理 研 究 员, 从 事 植 物 病 毒 学 研 究 ** 通 讯 作 者 : 张 仲 凯 (1966-), 男 ( 彝 族 ), 云 南 昌 宁 籍, 研 究 员, 从 事 植 物 病 毒 学 研 究 Corresponding author. Tel: , zhongkai99@sina.com

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3 彭 潞 波, 等. 水 稻 矮 缩 病 毒 昆 明 分 离 物 抗 血 清 制 备 及 免 疫 捕 捉 PCR 检 测 409 采 集 到 的 水 稻 病 株 经 电 镜 及 RDV 运 动 蛋 白 多 抗 血 清 I-ELISA 检 测 含 有 RDV,RDV 运 动 蛋 白 多 抗 血 清 由 北 京 大 学 李 毅 教 授 惠 赠 1.2 RDV 的 分 离 提 纯 将 经 鉴 定 含 RDV 的 水 稻 病 株 叶 片 剪 碎, 加 入 3 倍 体 积 的 0.1 mol/l PBS (ph6.4) 匀 浆, 过 滤, 应 用 CHCl 3 和 CCl 4 澄 清 PEG 沉 淀, 及 差 速 离 心 分 离 纯 化, 纯 化 过 程 中 应 用 电 镜 监 测 沉 淀 物 中 的 RDV 相 对 含 量 制 备 的 样 品 在 BECKMAN DU-640 型 紫 外 分 光 光 度 计 上 测 200nm~300nm 的 吸 收 光 值, 并 进 行 电 镜 观 察 1.3 RDV 兔 多 抗 血 清 制 备 及 其 效 价 检 测 用 提 纯 的 病 毒 对 家 兔 进 行 常 规 免 疫, 采 血, 测 [6] 定 效 价 间 接 ELISA 法 参 考 肖 火 根 等 的 方 法 测 定 抗 血 清 效 价, 在 ELX 808 型 酶 标 仪 (BIO TEK) 上 读 取 吸 光 度 值 (OD 值 ) 并 用 此 RDV 兔 多 抗 血 清 对 RDV 云 南 三 个 不 同 地 区 分 离 物 进 行 I-ELISA 检 测 1.4 水 稻 矮 缩 病 毒 样 品 的 免 疫 捕 捉 PCR(IC-PCR) 检 测 根 据 已 报 道 的 水 稻 矮 缩 病 毒 基 因 组 S8 片 段 的 [7] 引 物 序 列 合 成 引 物,P1:5 -CAAAG ATCTCCACC TGCCACTATG-3 ;P2:5 -GCGCTCGAGATTCAG GACCG-3 在 PCR 管 中 加 入 稀 释 为 1:5 000 的 RDV 兔 多 抗 血 清,4 下 包 被 过 夜,PBST 洗 涤 3 次 采 自 云 南 昆 明 玉 溪 陆 良 三 个 稻 区 的 水 稻 病 样 分 别 用 PBST 缓 冲 液 研 磨,1000 g 离 心 1min, 取 100μL 上 清 加 入 PCR 管 中, 温 育 3h;PBST 缓 冲 液 洗 涤 3 次,H 2 O 洗 涤 1 次, 短 暂 离 心, 吸 去 残 液 应 用 Promega 公 司 cdna 试 剂 盒 合 成 cdna 第 一 链, 取 5μL 反 转 录 产 物 进 行 PCR 反 应 PCR 反 应 体 系 50μL,cDNA 5μL,20mmol/LP1 P2 引 物 各 1μL, 10 PCR buffer(takara)5μl,10mmol/l dntp1μl, Taq 酶 1μL(TaKaRa), 超 纯 水 36μL 反 应 条 件 : 94 预 变 性 2min, 然 后 94 30s,54 1min, 72 1min,35 个 循 环 图 1 提 纯 的 RDV 粒 子 Fig.1 Purified RDV virions 2.2 RDV 昆 明 分 离 株 兔 多 抗 血 清 的 制 备 及 其 效 价 测 定 经 间 接 ELISA 法 测 定, 制 备 的 RDV 兔 多 抗 血 清 最 大 稀 释 到 时, 仍 有 明 显 的 阳 性 反 应, 其 效 价 为 以 往 RDV 的 分 离 提 纯 采 用 差 速 离 心 蔗 糖 密 度 梯 度 并 结 合 PEG 沉 淀 的 方 法 [8], 但 往 往 蔗 糖 梯 度 成 带 取 带 难, 不 易 获 得 理 想 的 病 毒 制 品 本 实 验 用 差 速 离 心 结 合 二 次 PEG 法, 避 免 了 制 备 和 使 用 蔗 糖 密 度 梯 度 的 繁 琐 以 及 抽 取 病 毒 带 来 的 不 方 便, 缩 短 病 毒 纯 化 时 间, 提 高 提 纯 病 毒 产 率 和 纯 度, 从 而 制 备 得 到 高 效 价 的 多 抗 血 清, 远 高 于 报 道 的 RDV 兔 多 抗 血 清 效 价 1: 2 000~1: [1] 2.3 RDV 兔 多 抗 血 清 对 3 个 分 离 物 的 I-ELISA 检 测 应 用 制 备 的 RDV 抗 血 清 (1:5 000) 与 RDV 云 南 昆 明 玉 溪 陆 良 3 个 分 离 物 进 行 间 接 ELISA 检 测, 结 果 均 呈 阳 性 反 应 2.4 RDV 的 IC-PCR 检 测 用 此 抗 血 清 对 RDV 云 南 玉 溪 及 陆 良 分 离 物 进 行 IC-PCR 扩 增, 得 到 大 小 约 为 1.35kb 的 目 的 片 段, 与 报 道 的 RDV S8 大 小 相 符, 见 图 2 表 明 IC-PCR [9] 方 法 利 用 免 疫 反 应 原 理 可 以 捕 捉 到 病 株 汁 液 中 微 量 的 病 毒 进 行 PCR, 可 以 检 测 到 样 品 中 的 RDV 2 结 果 与 讨 论 2.1 RDV 昆 明 分 离 株 的 分 离 纯 化 病 叶 研 碎 后 负 染 电 镜 观 察, 含 有 RDV 粒 体 及 较 多 的 寄 主 杂 质 ; 纯 化 后 的 RDV 为 半 透 明 乳 白 色 悬 液, 在 电 镜 下 观 察 到 直 径 为 70nm 无 刺 突 的 球 形 病 毒, 含 量 很 高, 未 见 寄 主 杂 质, 见 图 1 紫 外 分 光 光 度 仪 测 得 提 纯 病 毒 的 浓 度 为 3.854mg/mL, 推 算 提 纯 病 毒 的 产 量 为 115ng/g 病 叶 图 2 RDV 云 南 三 个 分 离 物 的 IC-PCR Fig.2 IC-PCR test of three isolates of RDV in Yunnan 1, DNA Marker; 2, Health rice plant; 3, RDV Kunming isolate; 4, RDV Yuxi isolate; 5, RDV Luliang isolate.

4 410 中 国 病 毒 学 第 21 卷 IC-PCR 避 免 了 常 规 RT-PCR 中 RNA 样 品 制 备 的 损 失 和 破 坏, 提 高 了 RNA 浓 度, 从 而 提 高 了 检 测 的 灵 敏 度 suppressor from a plant double-stranded RNA Virus [J]. J Virol, 2005, 79: [6] Xiao H G, Fan H Z ( 肖 火 根, 范 怀 忠 ). Studies on the detection of papaya ringspot virus in infected tissue of plant by ELISA [J]. References [1] Zhang Z K, Li Y ( 张 仲 凯, 李 毅 ). Plant Viruses in Yunnan ( 云 南 植 物 病 毒 ) [M]. Beijing:Science Press, 2001: [2] Li Y, Chen Z L ( 李 毅, 陈 章 良 ). Molecular Biology of Rice Viruses ( 水 稻 病 毒 的 分 子 生 物 学 ) [M]. Beijing:Science Press, 2001: [3] Omura T, Ishikawa K, Hirano H, et al. The outer capsid protein of rice dwarf virus encoded by genome segment S8 [J]. J Gen Virol, 1989, 70: [4] Li Y, Bao Y M, Wei C H, et al. Rice dwarf phytoreovirus segment S6-encoded nonstructural protein has a cell-to-cell movement function [J], J Virol, 2004, 78: Virologica Sinica ( 中 国 病 毒 学 ),1994,9(3): [7] Li W, Li Y, Zhang X, ( 李 玮, 李 毅, 张 旭 ) et al. Molecular cloning and sequencing of the eighth largest segment of rice dwarf virus and its expression in E.coli [J]. Chin J Virol ( 病 毒 学 报 ) (1): [8] Gao X, Ouyang X, Chen Z-L, ( 高 谦, 欧 阳 新, 陈 章 良 ) et al. Partial cdna cloning and nucleotide sequence of rice dwarf virus genome [J]. J Integrat Plant Biol ( 植 物 学 报 ), : [9] Chen Z N, Lu Z G, Lu J ( 陈 枝 楠, 卢 泽 高, 卢 俭 ). A brief skech of the progress application of PCR [J]. Acta Phytopathol Sinica ( 植 物 病 理 学 报 ), (3): [5] Cao X S, Zhou P, Li Y, et al. Identification of an RNA silencing ( 上 接 第 411 页 ) 复 叙 述 图 表 中 数 据, 行 文 要 求 组 织 严 密 符 合 逻 辑, 突 出 重 点, 以 便 读 者 容 易 理 解 全 文 Figures: 图 题 置 图 下 方, 以 FIG.X. 表 示,X 代 表 图 序 号, 如 有 分 图 应 以 大 写 A B C D 标 示 并 置 图 左 上 角, 图 注 应 置 图 题 下 方, 分 图 内 容 应 在 图 注 中 加 以 说 明 Tables: 表 格 请 用 三 线 表, 表 题 置 表 格 上 方, 如 对 表 内 内 容 有 附 加 说 明, 应 在 说 明 处 右 上 方 标 注 小 写 字 母, 在 表 格 下 方 对 标 注 处 给 以 解 释 Discussion: 讨 论 主 要 是 针 对 实 验 的 客 观 结 果 发 表 作 者 的 主 观 判 断, 内 容 包 括 :(1) 主 要 的 原 理 和 概 念 ; (2) 实 验 条 件 的 优 缺 点 ;(3) 本 人 结 果 与 他 人 结 果 的 异 同, 突 出 新 发 现 新 发 明 ;(4) 解 释 因 果 关 系, 说 明 偶 然 性 与 必 然 性 ;(5) 尚 未 定 论 之 处, 相 反 的 理 论 ;(6) 急 需 研 究 的 方 向 和 存 在 的 主 要 问 题, 讨 论 的 内 容 也 以 精 简 为 原 则, 要 清 楚 阐 明 主 要 论 点, 已 经 谈 过 的 不 宜 在 这 一 节 里 予 以 重 复 在 结 论 的 问 题 中 避 免 以 假 设 来 证 明 假 设, 以 未 知 来 说 明 未 知, 并 依 次 循 环 推 论 References:( 参 考 文 献 录 入 格 式, 中 文 期 刊 需 全 部 改 为 英 文 格 式 ) 期 刊 : 作 者. 题 名 [J]. 刊 名, 年, 卷 : 起 止 页. 图 书 : 作 者. 书 名 [M]. 版 次 ( 初 版 不 写 ), 出 版 地 : 出 版 者, 年. 起 止 页. 论 文 集 : 作 者. 题 名 [A]. 论 文 集 名 [C]. 出 版 地 : 出 版 者, 出 版 年. 页 次. 专 利 文 献 : 专 利 所 有 者. 专 利 题 名 [P]. 专 利 国 别 : 专 利 号, 出 版 日 期. 学 位 论 文 : 作 者. 题 名 [D]. 地 点 : 学 位 授 予 单 位, 出 版 年. 数 据 库 : 责 任 者. 联 机 网 上 数 据 库 [DB/0L]. 网 址 / 引 用 日 期. ( 文 献 作 者 录 入 格 式 : 姓 氏 列 前 ( 首 字 母 大 写 ), 名 缩 写 以 大 写 字 母 列 后, 中 间 无 任 何 标 点 ( 如 Allan G M, 请 注 意 原 引 文 献 姓 和 名 的 顺 序 ), 多 个 作 者 之 间 用, 隔 开, 限 列 3 名, 第 4 名 之 后 的 作 者 用 et al 表 示, 但 et al 前 应 有 3 位 作 者

5 中 国 病 毒 学 英 文 版 稿 约 411 中 国 病 毒 学 英 文 版 稿 约 中 国 病 毒 学 英 文 版 (Virologica Sinica) 是 由 中 国 科 学 院 主 管 中 国 科 学 院 武 汉 病 毒 研 究 所 和 中 国 微 生 物 学 会 共 同 主 办 国 内 外 公 开 发 行 的 高 级 学 术 性 双 月 刊 国 际 刊 号 仍 为 :ISSN , 国 内 刊 号 变 更 为 CN /Q 原 中 国 病 毒 学 中 文 版 (ISSN ,CN /Q) 为 中 国 科 学 引 文 数 据 库 和 中 国 科 技 信 息 所 中 国 科 技 论 文 统 计 与 分 析 的 统 计 源 期 刊, 同 时 加 入 了 中 国 学 术 期 刊 ( 光 盘 版 ) 和 中 国 期 刊 网 中 国 科 技 信 息 网, 被 著 名 文 摘 CA( 化 学 文 摘 ) BA( 生 物 学 文 摘 ) 等 国 内 外 20 余 种 文 摘 刊 物 和 数 据 库 收 录 主 要 刊 载 病 毒 学 及 各 分 支 学 科 具 有 较 高 学 术 水 平 的 原 始 研 究 论 文, 以 及 病 毒 学 研 究 的 新 技 术 新 方 法, 酌 登 综 合 评 论 和 研 究 简 报 本 刊 热 忱 欢 迎 作 者 惠 赐 英 文 文 稿 1 来 稿 要 求 和 注 意 事 项 1.1 本 刊 今 年 6 月 开 始 接 收 英 文 稿 件, 作 者 请 登 陆 本 刊 网 站 : 按 照 投 稿 指 南 撰 写 文 稿 通 过 网 站 传 递 电 子 文 稿, 国 内 作 者 需 同 时 提 供 中 文 文 题 作 者 单 位 摘 要 等 信 息 以 便 审 查 为 避 免 提 交 失 误, 请 另 将 文 稿 的 印 刷 稿 和 作 者 单 位 介 绍 信 通 过 邮 局 寄 送 编 辑 部 1.2 本 刊 已 加 入 中 国 学 术 期 刊 ( 光 盘 版 ) 和 中 国 期 刊 网 中 国 科 技 信 息 网 作 者 如 不 同 意 将 文 章 编 入 光 盘 版 和 网 上 数 据 库, 请 在 投 稿 时 声 明, 否 则 视 为 同 意 1.3 本 刊 将 通 过 电 子 邮 件 将 评 审 和 修 改 意 见 通 知 作 者 作 者 应 在 2 周 内 将 修 改 后 的 电 子 稿 件 返 回, 逾 期 寄 回 的 作 新 收 稿 处 理 本 刊 将 按 稿 件 的 收 稿 日 期 排 队 逐 期 发 表 1.4 文 稿 经 终 审 通 过 后, 编 辑 部 将 及 时 在 网 站 上 公 布, 请 作 者 留 意 不 拟 采 用 的 稿 件 编 辑 部 将 通 知 作 者, 稿 件 概 不 退 还, 请 自 留 底 稿 2 英 文 版 文 章 撰 写 格 式 Tittle: 题 名 一 般 不 要 超 过 25 个 字, 凡 获 基 金 资 助 课 题 应 在 题 名 右 上 角 标 注 * Authors: 中 文 作 者 要 用 汉 语 拼 音 ( 姓 氏 字 母 全 部 大 写 置 后, 双 名 的 前 名 首 字 母 大 写 后 名 全 部 小 写, 两 名 中 间 加 - 符 隔 开, 姓 名 均 不 缩 写 如 :Da-ming WANG), 国 外 作 者 遵 从 所 在 国 习 俗 不 同 工 作 单 位 的 作 者 应 在 作 者 右 上 角 标 注 序 号 以 示 区 别, 通 讯 ( 责 任 ) 作 者 右 上 角 同 时 标 注 ** 如 第 一 作 者 为 在 读 学 生, 应 将 导 师 注 明 为 通 讯 作 者 ( 文 章 首 页 地 脚 处 ) Received( 收 稿 日 期 ):Month Day, Year. Accepted( 修 回 日 期 ):Month Day, Year. ( 由 本 刊 填 写 ) * Foundation item( 基 金 项 目 ): 基 金 名 称 ( 编 号 ) ** Coresponding author( 通 讯 作 者 ). Tel:, Introduction: 介 绍 本 研 究 领 域 的 历 史 背 景, 前 人 所 获 得 的 主 要 成 果, 本 研 究 的 目 的 意 义 Materials and Methods: 材 料 和 方 法 部 分 主 要 介 绍 : 研 究 对 象 来 源 主 要 试 剂 厂 家 主 要 实 验 步 骤 和 检 测 方 法 和 技 术, 要 求 简 明 准 确 材 料 完 整 及 可 信, 常 规 方 法 应 尽 量 简 述 Rsult: 介 绍 实 验 的 主 要 结 果, 对 结 果 应 是 随 机 客 观 地 加 以 分 析, 不 应 有 意 无 意 地 加 以 挑 选 文 中 不 要 重

6 412 中 国 病 毒 学 第 21 卷 ( 下 转 第 410 页 )

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