学校编码 :10384 分类号密级学号 : UDC 博士学位论文黄嘴白鹭 MHC 基因的分离鉴定及多态性研究 Isolation and polymorphism of major histocompatibility complex (MHC) genes in t

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暌麻蓝
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1 学校编码 :10384 分类号密级学号 : UDC 博士学位论文黄嘴白鹭 MHC 基因的分离鉴定及多态性研究 Isolation and polymorphism of major histocompatibility complex (MHC) genes in the Chinese egret (Egretta eulophotes) 王锃指导教师姓名 : 陈小麟教授专业名称 : 动物学论文提交日期 : 年 11 月论文答辩时间 : 年 12 月学位授予日期 : 年 04 月答辩委员会主席 : 王义权教授评阅人 : 2012 年 11 月

3 厦门大学学位论文原创性声明本人呈交的学位论文是本人在导师指导下, 独立完成的研究成果本人在论文写作中参考其他个人或集体已经发表的研究成果, 均在文中以适当方式明确标明, 并符合法律规范和厦门大学研究生学术活动规范 ( 试行 ) 另外, 该学位论文为 ( 动物生态与保护生物学 ) 课题组的研究成果, 获得 ( 动物生态与保护生物学 ) 课题组经费或实验室的资助, 在 ( 动物生态与保护生物学 ) 实验室完成 ( 请在以上括号内填写课题或课题组负责人或实验室名称, 未有此项声明内容的, 可以不作特别声明 ) 声明人 ( 签名 ): 年月日

5 厦门大学学位论文著作权使用声明本人同意厦门大学根据中华人民共和国学位条例暂行实施办法等规定保留和使用此学位论文, 并向主管部门或其指定机构送交学位论文 ( 包括纸质版和电子版 ), 允许学位论文进入厦门大学图书馆及其数据库被查阅借阅本人同意厦门大学将学位论文加入全国博士硕士学位论文共建单位数据库进行检索, 将学位论文的标题和摘要汇编出版, 采用影印缩印或者其它方式合理复制学位论文本学位论文属于 : ( )1. 经厦门大学保密委员会审查核定的保密学位论文, 于年月日解密, 解密后适用上述授权 ( )2. 不保密, 适用上述授权 ( 请在以上相应括号内打或填上相应内容保密学位论文应是已经厦门大学保密委员会审定过的学位论文, 未经厦门大学保密委员会审定的学位论文均为公开学位论文此声明栏不填写的, 默认为公开学位论文, 均适用上述授权 ) 声明人 ( 签名 ): 年月日

7 目录摘要... 1 Abstract... 3 第一章前言研究背景 MHC 简介 MHC 基因的特点 MHC 在保护生物学中的应用 MHC 多态性研究方法 SSCP 在 MHC 研究中的应用黄嘴白鹭的研究进展黄嘴白鹭简介黄嘴白鹭的保护现状黄嘴白鹭的研究进展本研究的目的与意义本研究的目的本研究的意义第二章 MHC class I 基因的分离鉴定及多态性分析实验材料样品采集地样品采集实验仪器与试剂方法与步骤基因组 DNA 提取血液总 RNA 提取黄嘴白鹭 MHC class I 基因 DNA 片段的获得黄嘴白鹭 MHC I cdna 序列获得黄嘴白鹭 MHC I 类基因 DNA 全长序列获得... 29

8 2.6 黄嘴白鹭 MHC I 类基因分型及单个位点分离年菜屿繁殖黄嘴白鹭种群 MHC I 类基因多态性检测实验结果黄嘴白鹭 MHC I 类基因的分离鉴定黄嘴白鹭 MHC I 类基因位点的确定及分离 SSCP 分型结果黄嘴白鹭 MHC I 类基因第三外显子的遗传多样性及正选择作用黄嘴白鹭 MHC I 类基因的等位基因分布频率及杂合度黄嘴白鹭 MHC I 类基因的基因重组检测结果讨论黄嘴白鹭 MHC I 类基因的鉴定位点特异引物的设计 SSCP 实验条件的优化黄嘴白鹭 MHC I 类基因的多态性水平黄嘴白鹭 MHC I 类基因的正选择和净化选择第三章 MHC class II 基因的分离鉴定及多态性分析实验材料方法与步骤黄嘴白鹭 MHC II DAB 基因 DNA 片段的获得黄嘴白鹭 MHC II DAB 基因 cdna 序列获得黄嘴白鹭 MHC II 类 DAB 基因 DNA 全长序列获得黄嘴白鹭 MHC II 类 DRA 基因 DNA 全长序列获得黄嘴白鹭 MHC II 类 DRA 基因 cdna 全长序列获得黄嘴白鹭 MHC II 类 DAB 基因分型及单个位点分离黄嘴白鹭 MHC II 类 DRA 基因分型及单个位点分离年菜屿繁殖黄嘴白鹭种群 MHC II 类基因多态性检测实验结果黄嘴白鹭 MHC II 类 DAB 基因的分离鉴定黄嘴白鹭 MHC II 类 DAB 基因位点的确定及分离黄嘴白鹭 MHC II 类 DAB 基因 4 位点的 SSCP 分型... 60

9 3.4 黄嘴白鹭 MHC II 类 DRA 基因的分离鉴定黄嘴白鹭 MHC II 类 DRA 基因位点的确定及分离黄嘴白鹭 MHC II 类 DRA 基因 2 个位点的 SSCP 分型黄嘴白鹭 MHC II 类基因第二外显子的遗传多样性及正选择作用黄嘴白鹭 MHC II 类基因的等位基因分布频率及杂合度黄嘴白鹭 MHC II 类基因的基因重组检测结果讨论黄嘴白鹭 MHC II 类基因的鉴定黄嘴白鹭 MHC II 类基因的多态性黄嘴白鹭 MHC II 类基因的正选择与净化选择黄嘴白鹭 MHC 基因的基因频率与 Hardy-Weinberg 平衡黄嘴白鹭 MHC 基因的基因重组第四章结论创新点与展望本研究的主要结论本研究的创新点展望参考文献致谢... 95

11 Contents Abstract in Chinese... 1 Abstract in English... 3 Chapter I Introdution Background Introduction of MHC Feature of MHC Application of MHC in conservation biology Research methods of MHC polymorphism SSCP application in MHC research The research progress of Chinese Egret Introduction of Chinese Egret The conservation status of Chinese Egret The research progress of Chinese Egret The research purpose and significance The research purpose The significance of the study Chapter 2 Isolation and characterization of MHC class I genes and polymorphism analysis Materials Study areas Sampling Apparatus and reagents Methods and steps DNA isolation Blood total RNA isolation DNA fragments obtained from MHC I gene cdna sequences obtained from MHC I gene Full-length DNA sequence obtained from MHC I gene MHC class I gene typing and individual loci isolated MHC class I gene polymorphism detection Results... 34

12 3.1 Isolation and identification of MHC I gene Determination and separation of MHC class I loci SSCP typing results Genetic diversity and the positive selection effect on exon 3 MHC I Allele Frequency and heterozygosity of MHC I gene Recombinants of MHC I gene Discussion Characterization of MHC I gene Primer design for locus Optimization of SSCP conditions Polymorphism of MHC class I gene Positive selection and purifying selection on MHC I gene Chapter 3 Isolation and characterization of MHC class II genes and polymorphism analysis Materials Methods and steps DNA fragments obtained from MHC II DAB gene cdna sequences obtained from MHC II DAB gene Full-length DNA sequence obtained from MHC II DAB gene Full-length DNA sequence obtained from MHC II DRA gene cdna sequences obtained from MHC II DRA gene MHC class II DAB gene typing and individual loci isolated MHC class II DRA gene typing and individual loci isolated MHC class II gene polymorphism detection Results Isolation and identification of MHC II DAB gene Determination and separation of MHC class II DAB loci SSCP typing results of DAB gene Isolation and identification of MHC II DRA gene Determination and separation of MHC class II DRA loci SSCP typing results of DRA gene Genetic diversity and the positive selection effect on exon 2 MHC II gene... 69

13 3.8 Allele Frequency and heterozygosity of MHC II gene Recombinants of MHC II gene Discussion Characterization of MHC II gene Polymorphism of MHC class II gene Positive selection and purifying selection on MHC II gene Allele Frequency and Hardy-Weinberg equilibrium Recombinants of MHC Chapter 4 Conclusions and perspectives Conclusions New insights Perspectives References Acknowledgements... 95

15 摘要摘要主要组织相容性复合体 (Major histocompatibility complex,mhc) 是广泛存在于脊椎动物体内与免疫功能密切相关并编码免疫球蛋白样受体的高度多态基因群, 能编码种类丰富的细胞表面糖蛋白, 具有呈递抗原启动免疫应答的功能, 是动物适应性免疫系统的重要组成部分鸟类的 MHC I 和 II 类分子具有相似的结构都在免疫反应中发挥抗原递呈作用,I 类 MHC 基因的 exon3 和 II 类 exon2 编码抗原结合部位, 具有高度的多态性, 与物种抵抗病原体的能力及对复杂环境的适应性直接相关黄嘴白鹭 (Egretta eulophotes) 是全球性濒危迁徙水鸟, 目前全球种群数量仅为只本研究以黄嘴白鹭 2011 年菜屿繁殖种群的 48 个幼鸟个体和 15 个蛋壳表面擦拭 DNA 样本为对象, 通过对功能性 I 类和 II 类 MHC 经典座位的分离和遗传变异分析, 揭示了黄嘴白鹭 MHC 基因多样性现状和维持机制以及与免疫相关的适应性进化特性主要的研究结果如下 : 1 本文共分离得到黄嘴白鹭 MHC 基因 8 个位点的 cdna 和 DNA 序列, 序列均未发现终止密码子移码突变或插入 / 缺失其中 I 类 MHC 基因 2 个位点,DAB 基因 4 个位点,DRA 基因 2 个位点其中除了 DAB 基因中的 2 个位点外, 其余位点均是首次在黄嘴白鹭中发现 2 在以 2011 小菜屿繁殖黄嘴白鹭 63 个个体为研究对象, 利用座位特异性的 PCR-SSCP 基因分型和测序方法进行 I 类和 II 类 8 个 MHC 功能基因的遗传变异检测中共分离得到等位基因 65 条, 发现了一个单态的位点 DAB03, 其余的位点都是多态的与其他鸟类相比黄嘴白鹭的适应性免疫系统中 (MHC) 保留着较丰富的基因多态性 3 在 5 个位点 (UAA DAB01 DAB02 DAB04 和 DRA02) 上发现了正选择作用共存在 33 个受正选择压力的氨基酸位点充分表明正选择作用在黄嘴白鹭的适应性进化过程中, 发挥了重要作用 4 DAB03 位点为单态, 表明了黄嘴白鹭 DAB03 位点在其进化过程中, 历经的进化选择模式, 为极强的净化选择作用也说明了这个基因在机体中可能起 1

16 摘要着重要的作用, 如可能有针对性的识别某种病原体 5 黄嘴白鹭在 UAA 和 DAB 中存在重组, 并得到了两种检验方法的一致性支持在 UAA 位点上, 是位点内的等位基因之间发生重组, 在 DAB 基因中重组发生在多态性最高的 2 个位点 DAB01 和 DAB02 之间, 属于位点间等位基因的重组这说明基因重组是 MHC 基因多态性的产生与维持的机制之一本研究首次发现了黄嘴白鹭 MHC 基因 DAB 和 DRA 位点的全序列和对应的 cdna 序列以及 class I 类的部分序列在此基础上分离出黄嘴白鹭 MHC 基因共 8 个位点, 为每个位点设计了位点特异的引物, 成功分离出单个位点, 通过 SSCP 技术对各个位点的多态性进行了研究结果表明黄嘴白鹭 MHC 基因的多样性, 是由自然选择和基因内重组等多种因素来维持的, 平衡选择正选择净化选择和基因内重组, 是黄嘴白鹭在适应性进化过程中维持其 MHC 基因组多态性的主要进化驱动力由于研究时间的限制, 本研究在对 MHC 基因分离鉴定后只对福建小菜屿的黄嘴白鹭种群进行了遗传多样性的分析由于 MHC 基因受到栖息环境的影响会适应性的产生不同的等位基因用于抵抗不同的病原体, 本文只采用了一个繁殖地的数据进行分析, 对整个野生种群的适应性进化机制了解甚少希望在后续的研究中加入更多不同地区的黄嘴白鹭种群以作更全面的分析此外, 由于不同的 MHC 基因及同一个基因的不同等位基因可能对于不同病原体的抵抗能力是有差异的, 因此, 很有必要研究黄嘴白鹭的等位基因与具体疾病抗性的对应关系, 从而揭示黄嘴白鹭抗病性的分子机理关键词 : 黄嘴白鹭 ;MHC; 正选择 ; 基因重组 2

17 Degree papers are in the Xiamen University Electronic Theses and Dissertations Database. Full texts are available in the following ways: 1. If your library is a CALIS member libraries, please log on and submit requests online, or consult the interlibrary loan department in your library. 2. For users of non-calis member libraries, please mail to etd@xmu.edu.cn for delivery details.

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