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烽符屠
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第 57 卷第 1 期厦门大学学报自然科学版 ) V.57 N.1 018 年 1 月 JuXmUv NuS) J.018 d:10.6043/j..0438-0479.

1 第 57 卷第 1 期厦门大学学报自然科学版 ) V.57 N 年 1 月 JuXmUv NuS) J.018 d: /j 文昌鱼中一个 A 肽介导的多基因表达载体构建华俊豪, 李光, 王义权 * 厦门大学生命科学学院, 细胞应激生物学国家重点实验室, 福建厦门 36110) 摘要 : A 肽 PA) 介导的多基因表达载体具有高裂解活性且上下游基因等摩尔表达等优点, 已广泛应用于动物转基因研究. 文昌鱼 mpxu) 作为一种新兴的模式动物, 尚无应用这种表达载体的报道, 为此在 pxt7 转录系统基础上构建一个 PA 介导的多基因表达载体. 将体外转录的 PA 介导的 mrna 注入文昌鱼卵细胞并受精后, 经激光共聚焦显微镜和蛋白质免疫印迹 Wb) 检测表明, 该 mrna 在文昌鱼胚胎中能够高效地翻译和剪切, 并且在信号肽的作用下 GP 蛋白定位于细胞核中, 而 mc 蛋白定位于细胞膜上, 上下游蛋白间的剪切效率达到 91%; 进而构建了由文昌鱼热激蛋白基因启动子 BbHp70) 启动, 并由 PA 介导的多基因表达载体, 实验证明其在热诱导和上下游蛋白剪切方面均达到了预期效果. 关键词 : 多基因表达载体 ;A 肽 ; 热激启动子 ; 共表达 ; 文昌鱼中图分类号 : Q78 文献标志码 : A 文章编号 : ) 多基因表达载体的优势在于可同时表达个或多个基因, 但早期常用的多基因表达载体多存在容量小, 易出现上下游基因表达失衡, 蛋白活性低或所表达蛋白不能精确定位等缺陷 1], 后来研究者在个目的基因间插入一段内部核糖体进入位点 IRES), 用于表达个非偶联的蛋白, 成功克服了表达活性低及不能精确定位等问题 ; 然而 IRES 与核糖体结合的亲合力不易调控, 对所表达的下游蛋白活性影响较大 ], 这些因素限制了这一策略在构建多基因表达载体上的应用. 近年来, 一种具有自剪切功能由 A 肽 PA) 介导的多基因表达载体得到广泛应用, 该策略避开了多基因表达时蛋白活性不高和下游基因表达 3] 量低等缺陷, 是较为理想的多基因表达方法. 此方法通过 PA 改变核糖体的活性, 促进 PA 的甘氨酸残基 G) 与 RNA-G 之间酯链的水解, 从转录复合物上释放上游多肽的同时又推进下游多肽的翻译 4] ; 此外, 在目的基因上游或下游插入信号肽编码序列, 可使所表达的目的蛋白定位到细胞核叶绿体线粒 5] 体细胞膜或胞质微管等特定位置. 文昌鱼 mpxu) 隶属于脊索动物门 Cd) 头索动物亚门 Cpd), 是介于无脊椎动物和脊椎动物之间的一个重要过渡类群, 也是现存脊索动物门中最古老的一个类群, 在研究脊椎 6] 动物起源与演化方面有十分重要的作用. 文昌鱼有个体小产卵量大体外受精体外发育胚胎及成体都透明而便于观察等优点, 随着实验室人工繁育成功 7] 8] 9] 诱导产卵技术完善和胚胎显微注射技术建立等一系列成果的取得, 其作为模式动物应用的脚步正不断加快. 然而现阶段以文昌鱼为材料的研究中, 还不像其他模式动物那样已有各种商品化的分子工具可以直接应用, 因此大大阻碍了文昌鱼作为模式动物的应用. 10] Km 等通过 psyc-97 质粒 pcs 转录系统 ) 在 HL 细胞斑马鱼 D) 胚胎小鼠 Mu muuu) 肝细胞中验证了 PA 介导的 GP 和 mc 基因表达, 且上下游蛋白剪切效率极高. 由于 pcs 转录系统在文昌鱼中表达效率不高, 为此本研究基于 pxt7 转录系统合成 NLS-GP-PAmCȳCAAX 的 mrna 并注入文昌鱼胚胎, 验证在受精后文昌鱼体内 PA 介导表达的 GP 和 mc 蛋白剪切效果, 进而构建由文昌鱼热激蛋白收稿日期 : 录用日期 : 基金项目 : 国家自然科学基金 , ,316746) * 通信作者 :wq@du. 引文格式 : 华俊豪, 李光, 王义权. 文昌鱼中一个 A 肽介导的多基因表达载体构建厦门大学学报自然科学版 ),018,57 1): C:HUAJH,LIG,WANG Y Q.CuAppd-kdmuxpvmpxuJ XmUvNS,018,571):44-49.C) p : jdu.

2 第 1 期华俊豪等 : 文昌鱼中一个 A 肽介导的多基因表达载体构建 45 基因启动子 BbHp70) 启动的 PA 介导的多基因表达载体, 为文昌鱼未来的转基因研究和基因功能分析提供有效的分子工具. 1 材料与方法 1.1 材料实验中所用佛罗里达文昌鱼 Bmd) 引种自游智凯博士实验室 IuCu domb,tw,c), 采用本实验 7] 11] 室已建立的方法饲养, 按照已报道的方法诱导产卵 ; 实验中所用引物由厦门铂瑞生物科技有限公司合成 ;psyc-97 质粒由 Km 博士 Cm NUvMdS,RpubK) 提供 10] ; pxt7 和 BbHp70-pCAG 载体为本实验室自存 ; PmS 高保真 DNA 聚合酶 TqDNA 聚合酶限制性内切酶 Kp Ⅰ 和 Sp Ⅰ 购自 TKR 公司 ; D000DNA 分子质量标准购自天根生化科技北京 ) 有限公司 ;PCR 产物纯化试剂盒 DNA 凝胶回收试剂盒和质粒纯化试剂盒购自 Om 公司 ;T5α 感受态细胞购自 TG 公司 ;mmessage mma- CHINET7mRNA 合成试剂盒购自 Amb 公司 ; 荧光染料 4,6- 二脒基 -- 苯基吲哚 DAPI) 购自 R 公司 ;RIPA 裂解液购自碧云天公司 ;-GP 多克隆抗体购自 SCuzB 公司 ; 羊抗鼠肌动蛋白 ) 单克隆抗体购自 P 公司 ; 辣根过氧化物酶 - 增强型化学发光法 HRP-ECL) 显色底物购自 Adv 公司. 1. 质粒构建与 mrna 合成以含有目的片段 NLS-GP-PA-mCȳ CAAX 的质粒 psyc-97 为 DNA 模板, 按目的片段上下游序列设计引物 GP-PA-mCȳ15'- GGGGTACCATGGCTCCAAAGAAGAAGCGT-3') 和 GP-PA-mCȳR15'-GGACTAGTTCAG- GAGAGCACACACTTGCA-3'), 引物设计时分别在 5'- 端与 3'- 端引入 Kp Ⅰ 和 Sp Ⅰ 黏性末端酶切位点下划线 ), 用 PmS 高保真 DNA 聚合酶扩增目的片段.PCR 产物经酶切后连接到 pxt7 载体上, 转化 T5α 感受态细胞, 菌落 PCR 筛选阳性克隆, 测序验证, 获得重组的 GP-PA-mCȳpXT7 质粒. 类似地, 将 NLS-GP-PA-mCȳCAAX 与本实验室已有的 BbHp70-pCAG 载体重组, 获得 BbHp70:GP-PA-mCȳpCAG 质粒. 用 Sm Ⅰ 线性化 GP-PA-mCȳpXT7 质粒, 再用 mmessage mmachine T7 试剂盒体外转录合成 mrna,1.5% 质量分数 ) 琼脂糖凝胶电泳定量后分装, 置于 -80 冰箱中备用. 1.3 显微注射与胚胎培养 8] 显微注射参照 Lu 等的方法 : 用 00μL 移液枪将文昌鱼未受精卵细胞均匀铺在涂抹多聚赖氨酸的载玻片上使其成 ~3 条平行直线, 将 NLS-GP- PA-mCȳCAAX mrna 约 300/ μ L) 和丙三醇按 7 3 体积比 ) 混合后灌入注射器中, 灌针完毕后用金属片开针使其达到注射要求. 注射气泵充气完毕后注射压强 350~450P), 通过操作柄将注射针调至卵细胞赤道面下方 7~8μm 进行显微注射注射时间为 0.1~0.). 注射结束后立即向培养皿中滴加 5~10μL 精液受精, 同时在另一培养皿中对同一雌性 8] 个体所产的卵细胞用同样的方法受精作为对照. 体视显微镜 SZX7 型,Ompu 公司 ) 下观察到受精膜举起后即刻更换新鲜海水, 以彻底去除过量的精液和溶解在海水中的多聚赖氨酸, 同时清除显微注射时损坏的卵, 然后将受精卵置于 5 湿度饱和的培养箱中培养. 在胚胎发育期间, 荧光体视显微镜 SZX10 型, Ompu 公司 ) 下观察胚胎发光情况. 注射 BbHp70:GP-PA-mCȳpCAG 质粒约 340/ μ L) 的方法同上, 注射组和对照组的卵细胞在同样的条件下受精培养, 胚胎发育至原肠胚早期时 35 热激 0.5, 以诱导 BbHp70 启动下游基因表达 1], 然后在胚胎发育不同时期, 荧光体视显微镜下观察胚胎发光情况. 1.4 激光共聚焦显微观察选取有荧光蛋白表达的胚胎在 4% 质量分数 ) 多聚甲醛 - 吗啉丙磺酸溶液 PA-MOPS,pH=7.4) 中室温固定 0.5 后, 转至丙三醇中终止固定 ; 观察前将胚胎用含 0.1% 体积分数 ) 吐温 -0 的磷酸盐缓冲液 PBST,pH=7.4) 洗净, 再用 1μ/mL DAPI 染液进行细胞核染色 15 m 以勾勒胚胎轮廓 ; 然后于 80% 体积分数 ) 丙三醇中, 激光共聚焦显微镜 LSM780 型,Z 公司 ) 观察拍照, 其中观察 GP 的波长为 488m, 观察 mc 的波长为 543m, 观察 DAPI 的波长为 358m. 1.5 蛋白质免疫印迹 Wb) 实验分别收集注射组和对照组的 8 体节时期神经胚各 00 枚, 经 RIPAdmmupp) 裂解液裂解,1000/m 离心取上清, 获得可溶性总 p : jdu.

46 厦门大学学报自然科学版) 018 年蛋白; BCA b d)法测定蛋白浓度,取 50 总蛋白经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳后,转移至硝酸纤维素膜, 5% 质量分数)脱脂牛奶封闭;一抗杂交 GP 按 1 1000稀释),洗膜,二抗杂交羊抗鼠按 1 5000稀释 ),洗膜,加 HRP 显色底物, 暗室内显色

目的片段经双酶切后连入 pxt7 载体中,转化感受态细胞后取阳性单克隆测序,结果证实目的片段正确插入 pxt7 载体中. 用同样的方法构建 BbHp70: GP -PA-mC pcag 重组表达载体并经测序验证. 个重组质粒图谱见附录图 S1 /0180107. du.

3 46 厦门大学学报自然科学版) 018 年蛋白; BCA b d)法测定蛋白浓度,取 50 总蛋白经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳后,转移至硝酸纤维素膜, 5% 质量分数)脱脂牛奶封闭;一抗杂交 GP 按稀释),洗膜,二抗杂交羊抗鼠按稀释 ),洗膜,加 HRP 显色底物, 暗室内显色 ECL. 结果与分析.1 目的片段 PCR 扩增与质粒构建以 psyc 97 质粒为模板,扩增 NLS GP -PAmC -CAAX 目的片段,大小为 1665bp, 1.5% 质量分数)琼脂糖凝胶电泳显示 PCR 产物符合预期大小,无杂带图 1). 目的片段经双酶切后连入 pxt7 载体中,转化感受态细胞后取阳性单克隆测序,结果证实目的片段正确插入 pxt7 载体中. 用同样的方法构建 BbHp70: GP -PA-mC pcag 重组表达载体并经测序验证. 个重组质粒图谱见附录图 S1 / du. /up d/ m m).. 外源 mrna 在文昌鱼胚胎内翻译表达 GP 和 mc 蛋白将由体外转录所得的 NLS GP -PA-mC 阴性对照; 目的片段. M. D000DNA 分子质量标准; NC.. 图 1 PCR 扩增 NLS GP -PA-mC -CAAX 目的片段.1 PCRmp NLS GP -PA-mC -CAAX CAAX mrna 注入文昌鱼未受精卵细胞,受精后于培养箱中培养,至胚胎发育不同时期,荧光体视显微镜下选取有荧光的原肠胚中期神经板时期和 5 体节时期的胚胎,于激光共聚焦显微镜下观察拍照,结果如图所示. 当胚胎发育至原肠胚中期时即可观察到 GP 发出的绿色荧光和 mc 发出的红色荧光, 此时种荧光均较微弱,随着胚胎发育时间的推移, 种荧光的亮度都不断增加;而未注射的对照组中只能观察到极其微弱的绿色荧光,这是文昌鱼自身发出的本底荧光 1],对外源 GP 发出的绿色荧光观察影响不大. 图中标尺均为 100μm. )原肠胚中期; b)神经板时期; ) 5 体节时期. 图 NLS GP -PA-mC -CAAX mrna 注射后在文昌鱼胚胎中的表达. NLS GP -PA-mC -CAAX mrnaxp mp xumb j du.

胎发育至 5 体节时期时,可以观察到绿色荧光主要集中到细胞核内,而红色荧光则主要集中到细胞膜上图 3 b)),说明该时期的胚胎中重组 GP 和 mc 蛋白已被剪切开,在各自连接的信号肽作用下分别定位到细胞核内和细胞膜上. 蛋白质分子质量标准. ) GP; b). M.

.5 BbHp70: GP -PA-mC pcag 在文昌鱼胚胎中的表达检测 BbHp70 与 PA 结合构建的表达载体 BbHp70: GP -PA-mC pcag 在文昌鱼胚胎中的表达效果,结果如图 5 所示:当胚胎发育至神经图中标尺均为 0μm. )神经板时期; b) 5 体节时期.

4 第1期华俊豪等:文昌鱼中一个 A 肽介导的多基因表达载体构建 47.3 重组 GP 和 mc 蛋白在胚胎中的定位如图 3 所示:当注射 NLS GP -PA-mC CAAX mrna 的文昌鱼胚胎发育至神经板时期时, 可见较强的绿色和红色荧光图 3 )),表明外源 mrna 已翻译所编码的蛋白,但此时这种荧光在细胞中均主要分布在细胞质内,没有明显差异;当胚胎发育至 5 体节时期时,可以观察到绿色荧光主要集中到细胞核内,而红色荧光则主要集中到细胞膜上图 3 b)),说明该时期的胚胎中重组 GP 和 mc 蛋白已被剪切开,在各自连接的信号肽作用下分别定位到细胞核内和细胞膜上. 蛋白质分子质量标准. ) GP; b). M. 图 4 文昌鱼胚胎 8 体节时期 PA 剪切效率.4 T PA v 8 m mb 鱼中 100% 的剪切效率 10]..5 BbHp70: GP -PA-mC pcag 在文昌鱼胚胎中的表达检测 BbHp70 与 PA 结合构建的表达载体 BbHp70: GP -PA-mC pcag 在文昌鱼胚胎中的表达效果,结果如图 5 所示:当胚胎发育至神经图中标尺均为 0μm. )神经板时期; b) 5 体节时期. 图 3 重组 GP 和 mc 蛋白在文昌鱼胚胎细胞中的分布板时期, BbHp70 即可很好地启动下游 PA 连接的融合蛋白表达;待胚胎发育至 5 体节时期, GP 和 mc 蛋白已分别定位到细胞核内和细胞膜上. 3 讨.3 D bu mb GPd mc mp xumb p.4 文昌鱼胚胎中 PA 介导的种荧光蛋白剪切效率鉴于胚胎在 5 体节时期即可观察到上下游蛋白被剪切开的现象,为进一步检测 PA 介导的上下游蛋白在文昌鱼胚胎中的剪切效率,收集了 mrna 注射组和对照组 8 体节时期的胚胎各 00 枚,提取总蛋论头索动物文昌鱼是研究脊椎动物起源进化和发育的一种重要模式动物. 虽然文昌鱼的分子生物学研究中已有胚胎显微注射技术 9] BbHp70 介导的过表 ] 达技术 13] T 介导的基因敲除技术 14 及 T 转座酶系统介导的基因敲入技术 15],但分子生物学研究的技术手段依然缺乏,从而大大阻碍了文昌鱼作为模式动物的应用. 在转基因动物的构建过程中,为方便目标基因的白后用 W b 方法检测胚胎中 GP 和 mc 蛋白的剪切效率,结果如图 4 所示:在注射检测,常需要以 GP RP 和 YP 等示踪荧光蛋白与的GP; 45ku 处条带为文昌鱼内源 GP 蛋白,相对于外源的GP 少很多. 经ImJ软件分析比较条方法主要包括:构建多启动子mu p m )表 p 组 35ku 处有已剪切的 GP, 70ku 处有少量未剪切 1] 带灰度值, PA 剪切效率达到 91%,略小于其在斑马目标基因所编码的蛋白同时表达,这就依赖于一个介导多基因同时表达的载体. 目前构建多顺反子载体的达载体构建剪切 p )载体表达融合基因 u )以及基因之间以 IRES 或自剪切 PA du.

5 48 厦门大学学报自然科学版) 018 年 )神经板时期,标尺为 100μm; b) 5 体节时期,标尺为 100μm; ) 5 体节时期,标尺为 50μm. 图 5 共聚焦显微镜观察 BbHp70 启动的下游荧光蛋白表达. 5 O b v u p xp dbbbhp70 ud m p 连接等 16]. 其中 PA 具有序列短,高裂解活性,上下游基因表达量相同的优点 3];并且已经证实如果需要 3 个以上基因同时表达时,可以选择不同属的 PA 打破序列同源性以协助维持外源基因插入的稳定性 17]. 在将前人报道的 PA 介导的多基因表达载体 10] 引入文昌鱼转基因实验研究时,发现该载体在文昌鱼中的工作效率极低,故本研究用该系统中的 PA 与本实验室此前已构建的 BbHp70pCAG 载体重组,重构了一个由源于文昌鱼热激启动子启动的新载体结果显示:由 BbHp70: GP -PA-mC pcag. PA 连接的上下游蛋白在文昌鱼体内的剪切效率达到 91%,并可分别定位于细胞核内和细胞膜上;此外, 通过热诱导方式启动基因表达,不但表达效率高,而且可实现在特定时间启动基因表达. 由此,本研究成功构建了一个 PA 介导的多基因表达载体,为文昌鱼研究提供了一种高效可控并能同时平衡表达个蛋白的应用体系. 参考文献: 1] CHINNASAMY D,MILSOM M D, SHAERJ,. Mu v v MDVA v dm bu xp dd du. m MOI V J u, 006, 3 1): ] KOMAR A A,HATZOGLOU M. I b m u mrna: m x J u B Cm,005,80 5): ] SZYMCZAKWORKMAN A L, VIGNALI K M, VIGNALID A. D u A pp d d kdmu v C dsp H b P, 01, 01 ): ] DONNELLY M LL, LUKEG,MEHROTRA A,. A p v ua/bp " v" p m m d p,bu v : pu v b m "k p" J u G V, 001, 8 5): ] YANJ,WANG H, XU Q,. S qu d dw m "u v "App d qu mmb dxp A B m 010, 399 1): , 6] BERTRANDS, ESCRIVA H. Ev u d d v pm b :mp xu D v pm, 011, 138 ): ] ZHANG Q J,SUN Y,ZHONG J,.C uu u u w dp du d

6 第 1 期华俊豪等 : 文昌鱼中一个 A 肽介导的多基因表达载体构建 49 bjexpzb MDv Ev,007,3084): ] LIG,YANG X,SHU Z H,.Cuvpw C mpxu,bm b, pvplso,01,71): ] LIU X,LIG,ENGJ,.Amj mduzdampxubmbdvpmgdevu, 013,34): ] KIM J H,LEE S R,LI L H,.H v A ppddvdm pvu-1um,zbd mpls O,011,64): ] LIG,SHU Z,WANG Y.Y-udpdud dudpwcmpxu,bm b,bplso,013,88): ] LIG,ZHANG QJ,ZHONGJ,.Evud u dv u p pdg,009,4461): ] LID,LIG,WANG K,.IdupmmpxuHp70 G,01,5101): ] 王慧, 李光, 王义权. 文昌鱼 Hd 基因敲除和突变体表型分析遗传,015,3710): ] KOZMIKOVAI,KOZMIKZ.Gumpxu:m udmpxu dvbmgm,015,4: ] KERRIGANJJ,XIE Q,AMESRS,.Pdu pmpxv-xppexpdpu,011,751): ] TIAN Y,LI W,WANG L,.Exp A ppdmdd-up wud b p p BmdBpRCmmu, 013,4343): CuAPpd-kd Mu ExpVAmpxu HUAJu,LIGu,WANG Yqu * SKLbCuSB,SLS,XmUv,Xm36110,C) Ab: TmuxpvmddbAppd PA)pdvuv,qummuupmddwmxp,bwdppdm. Hwv,upd,muxpvvbppmpxu,pmw mdm vudvpmud,wudmuxpvbpabdpxt7pm.amjmrnabdvmpxudz,wbvdmbudmpdzdpxpu Wb.TuwdmRNA w ddpa mddpwvdvmpxumb.mv,gppwd uudmcpmmbudpdppd.tpw pwbu91%.um,wud-kppmbbhp70)mddpa mu xpv,dxpmwdxpdppvdddu. Kwd: muxpv ;Appd;-kpm;-xp;mpxu p : jdu.

材料方法统计学分析体外作用对细胞增殖的影响

材料方法统计学分析体外作用对细胞增殖的影响生物技术通报罗春燕官涛王红宁杨艳姜蓉胡晓舒华自森王建伟旨在探讨人参总皂苷对细胞表达的影响法显示对细胞增殖抑制程度呈剂量与时间依赖性增加且呈正相关关系流式细胞术表明能阻止细胞从期向期移行激光共聚焦显微镜观