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飘炖彭
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1 产品信息和操作指南 Rat TGF-β1 Precoated ELISA kit Cat# : 本试剂盒专用于科研, 而非用于诊断 Rat TGF-β

2 目录产品简介 1 知识背景 1 试剂盒组分 2 需要实验者自行准备的试剂与仪器 2 注意事项 3 试剂的配制 6 操作过程 8 结果分析 10 试剂盒的保存 10 操作步骤一览表 11 参考文献 12 ELISA 测定中可能出现的问题及解决方法 13 达优 ELISA 系列产品 16

3 1 产品简介 : 达优大鼠 TGF-β1 ELISA 试剂盒是通过酶联免疫吸附技术, 体外定量检测大鼠血清血浆缓冲液或细胞培养液中的 TGF-β1, 可同时检测天然的和重组的 TGF-β1 本试剂盒为预包被板, 整个过程孵育时间不超过 4 小时, 洗涤 12 次本试剂盒专用于科研, 而非用于诊断使用前请仔细阅读说明书并检查试剂盒组分, 若有任何疑问请与深圳市达科为生物工程有限公司联系, RD@dakewe.com. 检测范围 : pg/ml 灵敏度 :5 pg/ml 重复性 : 板内变异系数 <10%, 板间变异系数 <15% 2 知识背景 : 转化生长因子 -β1(tgf-β1) 能使正常的成纤维细胞的表型发生转化, 具有细胞抑制和促进生长双重作用 TGF-β1 分子量 25kDa, 非糖基化同型二聚体蛋白, 由二硫键连接 TGF-β1 基因结构具有高度保守性, 人和鼠 TGF-β1 的同源性高达 99% (1-4) TGF-β1 在治疗伤口愈合, 促进软骨和骨修复以及通过免疫抑制治疗自身免疫性疾病和移植排斥等方面发挥重要作用 (5) - 1 -

4 3 试剂盒组分 : 组分规格配制 Cytokine standard 2 瓶干粉状, 按瓶上说明操作 Biotinylated antibody 2 管 1:100 用 Dilution buffer R (1 ) 稀释 Streptavidin-HRP 2 管 1:100 用 Dilution buffer R (1 ) 稀释 Dilution buffer R (1 ) 3 瓶即用型 1N HCL 1 瓶即用型 1.2N NaOH 1 瓶即用型 Washing buffer (50 ) 1 瓶 1 50 用蒸馏水稀释 TMB 1 瓶即用型 Stop solution 1 瓶即用型 Precoated ELISA plate 8 12 即用型封板膜 2 张即用型说明书 1 份 4 需要实验者自行准备的试剂与仪器 : 1. 酶标仪 ( 建议参考仪器使用说明提前预热 ) 2. 微量加液器及吸头 :P10,P50,P100,P200,P 蒸馏水或去离子水 4. 全新滤纸 5. 旋涡振荡器和磁力搅拌器 6.37 温箱 - 2 -

5 5 注意事项 : 1. 试剂应按标签说明储存, 使用前室温平衡分钟实验前室温平衡对 Washing buffer (50 ) Dilution buffer R (1 ) Precoated ELISA plate 和 TMB 有重要意义 2. 冻干标准品冰上操作, 按照标签说明溶解干粉, 充分混匀, 按照一次使用量分装,-20 贮存, 避免反复冻融 3. 预包被板条使用前, 请平衡至室温后再打开外包装袋, 实验中不用的板条应立即放回包装中, 密闭封口,4 可保存 1 个月其余不用试剂应包装好或盖好 4. Washing buffer(50 ) 在 4 保存可能有结晶析出, 务必使结晶完全溶解后 ( 如加热平衡温度后混匀等 ) 再配制成 1 Washing buffer 工作液 5. Biotinylated antibody 和 Streptavidin-HRP 体积量很小, 使用前请高速短暂离心管子, 以使管壁或管盖的液体沉积到管底 6. 实验操作中请使用一次性的吸头, 避免交叉污染 7. 使用前检查试剂盒内各种试剂 ; 试剂稀释加样和中止反应充分混匀或者摇匀对实验结果尤为重要, 最好使用低速频率振荡器或者反应过程中每 15 分钟手工摇匀一次 8. 实验板孔加入试剂的顺序应一致, 以保证所有反应孔的孵育时间一致 - 3 -

6 9. 使用洁净的塑料容器盛装洗涤液 10. 洗涤过程中反应孔中残留的洗涤液应在滤纸上充分拍干, 直至滤纸上看不到水印勿将滤纸直接放入反应孔中吸水 11. TMB 对光敏感, 避免长时间暴露于光下, 避免与金属接触影响结果有毒, 避免与皮肤接触! 准备使用的 TMB 若变为蓝色, 表明 TMB 已经污染, 请丢弃请在终止反应后 10 分钟内读取 OD 值 12. 活化试剂由 1N HCL 和 1.2N NaOH 两种组分组成, 专用于无活性的 TGF-β1 样本检测前的活化该试剂具有腐蚀性, 避免与皮肤直接接触氢氧化钠溶液容易吸收空气中的二氧化碳而变质, 剩余的试剂应尽快拧紧放好 13. 请严格按照说明书标明的时间和温度进行孵育冬季室内温度偏低, 请使用恒温箱或培养箱温育为好 14. 试剂盒在保质期内使用, 且不同批号试剂不要混用 pg/ml 以上的结果为非线性的, 根据此标准曲线无法得到精确的结果大于 1000 pg/ml TGF-β1 的样本应以 Dilution buffer R (1 ) 稀释后重做在结果分析时, 结合考虑相应的稀释度 16. 特异性 : 不与大鼠其它细胞因子反应鼠 TGF-β1 与人牛猪马和山羊的 TGF-β1 有一定交叉反应 - 4 -

7 17. 生物样本中的 TGF-β1 通常以无活性的形式存在在检测 TGF-β1 活性前必须活化以释放 TGF-β1 的活性活化的方法主要有两种 : 加热活化和酸化活化加热活化 : 样本用 Dilution buffer R (1 ) 稀释 10 倍, 置 80 水浴中 8 分钟, 取出冷却 5 分钟,2 小时内检测酸化活化 : 血清血浆 :20 L 1N HCl 加入 40 L 样本中, 混匀, 室温孵育分钟再加入 20 L 1.2 N NaOH, 混匀最后加入 720 L Dilution buffer R (1 ), 混匀后检测注意 : 样本被稀释了 20 倍! 细胞培养上清 :20 L 1N HCl 加入 100 L 样本中, 混匀, 室温孵育分钟再加入 17 L 1.2 N NaOH, 混匀后加入 663 L Dilution buffer R (1 ), 立即检测注意 : 样本被稀释了 8 倍! 18. 以上样品稀释倍数仅供参考, 实验时应结合预实验结果确定最佳稀释倍数 - 5 -

8 6 试剂的配制 : 1. 提前 20 分钟将 Washing buffer(50 ) 和即用溶液从试剂盒中取出, 平衡至室温 2. Cytokine standard: 外观为冻干粉先按标签说明将冻干粉溶解, 静置 5-10 分钟, 再用 Dilution buffer R (1 ) 稀释到推荐检测浓度标准品溶解后混匀, 准确倍比稀释, 严格操作非常重要标准品的倍比稀释最好在进口的或者硅化的 EP 管中完成, 减少非特异性吸附在实验孔内进行倍比稀释时, 注意操作规范, 枪头勿刮划预包被的孔底母液若有剩余请按照一次用量分装,-20 保存 * 推荐标准品浓度梯度为 : 1000 pg/ml 500 pg/ml 250 pg/ml 125 pg/ml 62.5 pg/ml pg/ml 15.6 pg/ml 3. Biotinylated antibody:1 100 用 Dilution buffer R(1 ) 稀释, 混匀制成 Biotinylated antibody 工作液 4. Streptavidin-HRP :1 100 用 Dilution buffer R(1 ) 稀释, 混匀制成 Streptavidin-HRP 工作液 - 6 -

9 5. Washing buffer (50 ):1 50 用蒸馏水稀释 6. 即用型溶液 Dilution buffer R (1 ): 用于稀释 Cytokine standard 样本 Biotinylated antibody 和 Streptavidin-HRP 1N HCL 和 1.2N NaOH: 专用于无活性的 TGF-β1 样本检测前的活化 TMB Stop solution - 7 -

10 7 操作过程 : 1. 使用前, 将所有试剂充分混匀, 避免产生泡沫 2. 根据实验孔 ( 空白和标准品 ) 数量, 确定所需的板条数目样本 ( 含标准品 ) 和空白都应做复孔 3. 加样 :100 L/well 加入稀释后的 Cytokine standard 至标准品孔,100 L/well 加入样本至样本孔,100 L/well 加入 Dilution buffer R (1 ) 至空白对照孔盖上封板膜,37 温育 90 分钟 4. 洗板 : 扣去孔内液体,300 L/well 加入 1 Washing buffer 工作液 ; 停留 1 分钟后弃去孔内液体重复 4 次, 每一次在滤纸上扣干 5. 加检测抗体 :100 L/well 加入 Biotinylated antibody 工作液盖上封板膜,37 温育 90 分钟 6. 洗板 : 重复步骤 4 7. 加酶 :100 L/well 加入 Streptavidin-HRP 工作液盖上封板膜, 37 温育 30 分钟 8. 洗板 : 重复步骤 4 9. 显色 :100 L/well 加入 TMB,37 避光温育 5-30 分钟之间, 根据孔内颜色的深浅 ( 深蓝色 ) 来判定终止反应通常显色分钟可以达到很好的效果 - 8 -

11 10. 终止反应 : 100 L/well 迅速加入 Stop solution 终止反应 11. 读板 : 终止后 10 分钟内, 用检测波长 (measurement wavelength) 450 nm 读值推荐用双波长即检测波长 (measurement wavelength) 450 nm 参考波长或校正波长 (reference wavelength) nm 同时读板, 测量结果会更准确 - 9 -

12 8 结果分析 : 1. 推荐拟合曲线坐标对数或自然数, 拟合方程常见为直线二次方程及四参数方程, 通过各种应用软件拟合选取最佳标准曲线, 根据样本 OD 值查找相应浓度 2. 稀释的样本计算浓度时应乘以稀释倍数 9 试剂盒的保存 : 注意 : 本图仅供参考, 应以同次试验标准品所绘标准曲线来计算样本浓度 4ºC 可稳定保存 12 个月

13 10 操作步骤一览表 : 加样本或配好的 Cytokine standard, 设置对照,100 L/well 37 温育 90 分钟 ; 洗板 4 次加 Biotinylated antibody 工作液,100 L/well 37 温育 90 分钟 ; 洗板 4 次加 Streptavidin-HRP 工作液,100 L/well 加 TMB 显色液,100 L/well 37 温育 30 分钟 ; 洗板 4 次 37 避光显色 5-30 分钟加 Stop solution 100 L/well, 终止反应 10 分钟内读板在 λ=450 nm 处读取吸光值

14 11 参考文献 (1) Lawrence, D.A. (1996) Eur. Cytokine Netw. 7:363. (2) Cox, D.A. and T. Maurer (1997) Clin. Immunol. Immunopathol. 83:25. (3) Alevizopoulos, A. and N. Mermod (1997) BioEssays 19:581. (4) Kingsley, D.M. (1994) Genes Dev. 8:133. (5) Laverty HG. Cytokine Growth Factor Rev. (2009) Aug

15 12 ELISA 测定中可能出现的问题及解决方法问题可能的原因解决方法 1. 非常弱的结果 (1) 温育的时间或温度不 a. 校正温育箱温度 ; 够 ; b. 校正定时钟准确定时 ; (2) 显色反应时间太短 ; c. 使用新鲜合格的蒸馏 (3) 配制缓冲液的蒸馏水水 ; 有问题 ; d. 按照说明书保存试剂盒 (4) 加入抗体 / 酶的工作液和准确配制工作液 ; 浓度太低 ; e. 试剂室温平衡至少 20 (5) 酶标仪滤光片不正确 ; 分钟, 确保所有试剂已平 (6) 不正确的试剂储存方衡至室温 (18-25 ); 式 ; f. 校正移液器, 吸嘴要配 (7) 试剂盒没有充分平衡 ; 套, 装吸嘴时要紧密, 吸 (8) 移液器吸液量不足, 嘴内壁要清洁, 最好一次吸嘴内壁挂水太多或内壁性使用不清洁

16 2. 标准曲线和测定的重复性差这是典型的由测定操作引起的问题, 包括 (1) 加样本及试剂量不准 ; 孔间不一致 ; (2) 加样过快, 孔间发生污染 ; (3) 加错样本 ; (4) 加样本及试剂时, 加在孔壁上部非包被区 ; (5) 不同批号试剂盒中组分混用 ; (6) 温育时间洗板显色时间不一致 ; (7) 孔内有污染杂物 ; (8) 酶标仪滤光片不正确 ; (9) 试剂 / 样本没有混匀 ; (10) 血清样本未完全凝固即加入, 反应孔内出现纤维蛋白凝固或残留血细胞, 易出现假阳性反应等 a. 重复某一样本时, 加样时间尽可能与第一次接近 ; b. 重复测定样本, 操作条件人员等应尽可能与上次保持一致, 以排除这些因素造成的不一致的可能性 ; c. 样本稀释前应充分混匀 ; d. 尽可能使用同一移液器并装紧吸嘴 3. 白板 ( 阳性对照不显色 ) (1) 漏加酶结合物 ; (2) 洗板液配制中出现问题, 如量筒不干净, 含酶抑制物 ( 如叠氮钠 ) 等 ; (3) 添加的试剂错误或者被遗漏 ; (4) 试剂过期 ; a. 请按说明书所示稀释倍数配制 ; b. 注意不要漏加 ; c. 每次加液前均应核对标签

17 4. 空白背景高 (1) 洗板不干净 ; (2) 显色液变质 ; (3) 试剂过期 ; (4) 试剂配制浓度有误, 如酶的浓度过高 ; (5) 蒸馏水受酶等污染 ; (6) 试剂混用 ; (7) 培养箱温度超过 37 或反应时间过长 a. 浓缩洗液准确配制 ; b. 50 倍浓缩洗涤液如有结晶则应让结晶于室温全部溶解后再量取稀释 ; c. 充分洗涤, 彻底拍干 ; d. 加样或加酶拍板的滤纸应弃去不用, 不要反复使用, 否则易造成污染 ; e. 吸嘴尽可能一次性使用 ; f. 使用新鲜蒸馏水 ; g. 不同批号试剂勿混用 ; h. 请按说明书所示稀释倍数配制 ; i. 显色反应时间适当缩短

18 13 达优 ELISA 系列产品达优小鼠 ELISA 试剂盒 Mouse IFN- γ ELISA kit( 预包被减步法 ) 96T Mouse IL-1 α ELISA kit( 预包被减步法 ) 96T Mouse IL-1 β ELISA kit( 预包被减步法 ) 96T Mouse IL-2 ELISA kit( 预包被减步法 ) 96T Mouse IL-4 ELISA kit( 预包被减步法 ) 96T Mouse IL-5 ELISA kit( 预包被减步法 ) 96T Mouse IL-6 ELISA kit ( 预包被减步法 ) 96T Mouse IL-10 ELISA kit( 预包被减步法 ) 96T Mouse IL-12 p70 ELISA kit( 预包被减步法 ) 96T Mouse IL-12/IL-23 p40 ELISA kit( 预包被减步法 ) 96T Mouse IL-17A ELISA kit( 预包被减步法 ) 96T Mouse IL-22 ELISA kit( 预包被 ) 96T Mouse TGF-β1 ELISA kit( 预包被 ) 96T Mouse TNF-α ELISA kit( 预包被减步法 ) 96T Mouse VEGF-A ELISA kit( 预包被 ) 96T Mouse IgE ELISA kit( 预包被 ) 96T Mouse MCP-1 ELISA kit( 预包被 ) 96T

19 达优人 ELISA 试剂盒 Human IFN-γ ELISA Kit( 预包被减步法 ) 96T Human IFN-α ELISA Kit( 预包被 ) 96T Human IL-1 β ELISA Kit ( 预包被减步法 ) 96T Human IL-2 ELISA Kit ( 预包被减步法 ) 96T Human IL-4 ELISA Kit( 预包被 ) 96T Human IL-5 ELISA Kit( 预包被减步法 ) 96T Human IL-6 ELISA Kit( 预包被减步法 ) 96T Human IL-7 ELISA Kit ( 预包被 ) 96T Human IL-8 ELISA Kit( 预包被减步法 ) 96T Human IL-9 ELISA Kit( 预包被 ) 96T Human IL-10 ELISA Kit( 预包被减步法 ) 96T Human IL-12p70 ELISA Kit( 预包被减步法 ) 96T Human IL-12/IL-23p40 ELISA Kit( 预包被减步法 ) 96T Human IL-6R/CD126 ELISA Kit( 预包被减步法 ) 96T Human IL-13 ELISA Kit( 预包被减步法 ) 96T Human IL-15 ELISA Kit( 预包被 ) 96T Human IL-17A ELISA Kit( 预包被 ) 96T Human IL-17F ELISA Kit( 预包被 ) 96T Human IL-22 ELISA Kit( 预包被减步法 ) 96T Human IL-23 ELISA Kit( 预包被减步法 ) 96T Human sil-2r ELISA Kit( 预包被减步法 ) 96T Human IL-31 ELISA Kit( 预包被减步法 ) 96T Human IL-33 ELISA Kit( 预包被 ) 96T

20 Human CD54/sICAM-1 ELISA Kit( 预包被减步法 ) 96T Human CD106/sVCAM-1 ELISA Kit( 预包被 ) 96T Human Adiponectin/Acrp30 ELISA Kit( 预包被 ) 96T human Resistin ELISA Kit( 预包被 ) 96T Human CRP ELISA Kit( 预包被 ) 96T Human TGF-β1 ELISA Kit( 预包被 ) 96T Human TNF-α ELISA Kit( 预包被减步法 ) 96T Human GM-CSF ELISA Kit( 预包被 ) 96T Human G-CSF ELISA Kit( 预包被 ) 96T Human EGF ELISA Kit( 预包被 ) 96T Human VEGF-A ELISA Kit( 预包被 ) 96T Human MCP-1 ELISA Kit( 预包被 ) 96T Human MIP-1α ELISA Kit( 预包被 ) 96T Human IP-10 ELISA Kit( 预包被 ) 96T Human FGF basic ELISA Kit( 预包被 ) 96T Human β-ngf ELISA Kit( 预包被 ) 96T Human HGF ELISA Kit( 预包被 ) 96T Human IgE ELISA Kit( 预包被 ) 96T Human perforin ELISA Kit( 预包被 ) 96T Human Granzyme B ELISA Kit( 预包被 ) 96T Human PD-1 ELISA kit( 预包被 ) 96T Human PD-L1 ELISA Kit( 预包被 ) 96T human MMP-1 ELISA Kit( 预包被 ) 96T human MMP-2 ELISA Kit( 预包被 ) 96T human Total MMP-3 ELISA Kit( 预包被 ) 96T

21 达优大鼠 ELISA 试剂盒 Rat IFN-γ ELISA kit ( 预包被减步法 ) 96T Rat IL-1β ELISA kit ( 预包被 ) 96T Rat IL-2 ELISA kit ( 预包被减步法 ) 96T Rat IL-4 ELISA kit ( 预包被 ) 96T Rat IL-6 ELISA kit ( 预包被 ) 96T Rat IL-10 ELISA kit ( 预包被减步法 ) 96T Rat IL-17A ELISA kit ( 预包被 ) 96T Rat TGF-β1 ELISA kit ( 预包被 ) 96T Rat TNF-α ELISA Kit ( 预包被减步法 ) 96T ELISA 辅助试剂 TMB (ready-to-use, 即用型 ), 1 plate 10 ml ELISA 辅助试剂盒 96T 深圳市达科为生物工程有限公司 Dakewe Bio-engineering Co., LTD (180701)

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Magi鈩?Coating Buffer 浣跨敤璇存槑产品信息和操作指南 Mouse IL-22 Precoated ELISA kit Cat# : 1212202 本试剂盒专用于科研, 而非用于诊断 Mouse IL-22 1212202 目录产品简介 1 知识背景 1 试剂盒组分 2 需要实验者自行准备的试剂与仪器 2 注意事项 3 试剂的配制 5 操作过程 7 结果分析 9 试剂盒的保存 9 操作步骤一览表 10 参考文献 11 ELISA