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1 临床血液细胞分析 复检的必要性及其措施 同济大学附属第十人民医院检验科 李 智

2 血细胞分析仪的发展近况 血细胞分析仪的发展已有 50 多年历史, 国内医院应用血细胞分析仪的情况也越来越普及 方便适用 更多功能和参数 更加准确 更快速度的血细胞分析仪, 已经是各血细胞分析仪发展的目标

3 血细胞分析仪的发展近况 血细胞分析仪近年的发展趋势 血常规检验多参数化 目前有的仪器甚至可以提供 种测量或计算参数, 尽管很多的新参数目前仍不能应用于临床 在美国凡进入临床应用的新参数需要经过 FDA 的批准, 其原则是经过多年实践验证该参数对临床诊断有意义 安全 有效 我国目前还缺乏这样严格的认证和批准体系

4 血细胞分析仪的发展近况 多功能组合与扩展血细胞分析仪已经不仅局限于血细胞的常规分析, 一些仪器加进了网织红细胞 (RET) 的分析功能 ; 有的增加了幼稚细胞和有核红细胞分析功能 ; 还有的可进行寄生虫提示 ; 有的加进了流式细胞仪的某些功能, 在常规血细胞分析的同时可以得到淋巴细胞亚群的分析结果 检测速度的提高由于许多仪器增加了自动进样系统, 测定速度加快, 一般可以达到每小时 个样品, 甚至可达 个标本

5 血细胞分析仪的发展近况 方法的改进和进展血细胞分析已不局限于单一的方法, 而是多项技术的联合应用 例如在白细胞分类上 : Coutler 采用了 VCS 技术, 即体积测量 射频高频传导性和激光散射技术 ; Sysmex 则采用了直流电阻抗 (DC) 与射频 (RF) 和特殊细胞染色技术 ; Bayer 公司的 ADVIA120 则采用激光散射和细胞化学 ( 过氧化酶和嗜碱细胞染色 ) 技术 ; Abbott 是采用多角度偏振光散射 (MAPSS) 技术对白细胞进行分析 在红细胞和血小板分析上也采用了光学和电阻法结合的处理方法

6 血细胞分析仪的发展近况 血细胞分析仪产品的系列化和流水线国际各有实力的厂家不断开发系列化产品以满足不同类型用户的需要 在全自动血液分析仪器的基础上又实现了全自动流水线使血细胞分析的发生了革命性的飞跃 血液标本从计数到推片和染色全部自动进行, 并能智能化地决定该涂片的制作要求 在规范化 标准化方面迈进一大步

7 血细胞分析仪的发展近况 流水线系统最为重要的是通过计算机控制整个工作系统 因此, 许多重要的来自仪器本身和专家经验的 复检规则 则可以通过系统软件而实施完成, 凡不符合规则的标本将被筛选出来, 进行人工复检 与条形码及 Lis 共用的优越性全自动血液分析仪加样本条码 通过 Lis 与医院信息系统 (His) 连接可将测定结果经过网络迅速传入医生诊室 有效缩短 TAT 国产血细胞计数仪发展方兴未艾

8 血细胞分析仪应用存在的问题 血细胞形态学检查是血常规检验的主要内容, 也是医学检验人员必须掌握的基本功 但是随着血液分析仪的普及, 形态学检查每每被忽视, 以致造成漏检 漏诊及误诊的现象常常发生, 已引起临床医生和检验人员的高度重视 工作量大, 人员少镜检复片无暇顾及 ; 科室不够重视 临检专业, 培训不够, 人员配备不足 ; 科室未制定相应的复检规定, 并缺乏相应的检查制度 ;

9 血细胞分析仪应用存在的问题 形态学的专业知识不足, 经验欠缺而造成漏检, 甚至引发医疗纠纷 ; 仪器提示的异常结果未引起重视 ; 出现的旗标信号不熟悉, 不了解其意义 ; 对仪器的性能 不同细胞种类的计数的限定范围 原理不了解, 不熟悉 ; 仪器使用不当, 缺乏必要的校准 质控 ; 试剂不配套 ; 试管不标准 ;

10 血细胞分析仪应用存在的问题 临床知识匮乏, 对出现的一些情况认识不足而漏诊 ; 推片 染色技术 ( 或试剂质量 ) 不过关, 特别在一些基层医院 标本放置时间过长, 细胞形态发生改变, 导致误诊 漏诊 ;

11 复检的必要性 老龄化社会的发展, 增加了病人的复杂性 环境等因素导致临床变数的增加, 疑难和不典型病例增加, 对我们提出新的挑战 以我院为例 : 自 2001 年 ~ 至今年门诊初诊的急性白血病 204 例, 其中 109 例, 占 53.4% 为白细胞不增多性白血病, 其中 M5 48 例,M4 19 例, M1,M2 26 例,M3 11 例, 急淋 17 例, 其他 4 例 ( 巨核细胞性白血病, 浆细胞白血病, 红白血病, 恶性组织细胞病各 1 例 );1 例仅血小板低

12 复检的必要性 疑难和不典型病例增加, 对我们提出新的挑战 75 例高白细胞性白血病, 仅占白血病总数的 45.1% 其中 M5 22 例,M4 9 例,M1,M2 4 例, 急淋 9 例, 其他 4 例 ( 毛白 1 例, 浆细胞性白血病 2 例,M3 1 例 ) 鉴于以上原因, 中华医学会检验学会非常重视启动了临床血细胞 复检标准 工作

13 血细胞 复检标准 工作启动 组织和动员 : 丛玉隆主任为专家小组组长, 孙芾和李智为副组长 曾在烟台 青岛 北京开会, 做了详尽的布置和计划 目的 : 对国际血液学复检专家组制定的血细胞复检标准进行评估, 通过对实验数据分析制定出适合于我国人群的复检筛查标准

14 血细胞 复检标准 工作启动 参加单位 : 卫生部临床检验中心, 北京 301 医院, 北京协和医院, 北京人民医院, 北京大学第一医院, 北京和睦家医院, 上海第十人民医院, 上海东方医院, 长海医院, 华山医院, 华西医科大学附属, 医院北大深圳医院, 浙江温州一附院等

15 血细胞 复检标准 工作启动 参加评估仪器 : 1 ABBOTT, 2 ABX, 3 Bayer, 4 Beckman Coulter 5 迈瑞 5 SYSMEX 多种五分类血细胞分析仪

16 分析方法 * EDTA 抗凝静脉血标本,0.5-4hr 间检测 涂片 2 张, 瑞氏染色后两位检验员进行显微镜分析并各计数 100 白细胞, 取均值分析 * 按照全国血液学复检专家小组释义的国际涂片镜检阳性规则与仪器结果进行比较分析, 并进行准确性和可靠性计算 * 依照统计数据和各指标的临床应用价值建立自己的复检规则, 再次采集病人标本进行新规则的验证分析

17 制定规则的目的 保证血细胞检查结果准确性 提供正确的细胞形态学信息 提高工作效率 为临床诊断提供依据 为临床治疗方案提供依据 以 2005 年国际血液学复检专家组推荐的 41 条规则为基础, 建立适合中国人群的规则

18 参考文献 P.W. Barnes, S.L. McFadden, S.J. Machin et al. The International Consensus Group for Hematology Review: Suggested Criteria for Action Following Automated CBC and WBC Differential Analysis. Laboratory Hematology, 2005,11: , 中华检验医学杂志编辑委员会. 全国血液学复检专家小组工作会议纪要暨血细胞自动计数复检规则释义. 中华检验医学杂志, 2007,30:

19 国际联合小组提出的复检规则 成员来自 6 个国家的 17 个实验室, 仪器包括 Beckman Coulter, Sysmex, Bayer, Advia, Abbott 生产的多种型号血细胞分析仪 规则有 41 条, 在 15 个实验室进行了评估

20 国际联合小组复检筛查规则简介 指标 处理方法 ( 基于初次或随诊检测 ) 新生儿 浏览血片 WBC: <4.0 或 >30.0 浏览血片 PLT: <100 或 <1000 浏览血片 HGB: <70g/L 或 >200g/L 浏览血片, 注意细胞形态 MCV: <75 或 >105fl 浏览血片, 注意细胞形态 MCHC: <30 或 >38 浏览血片, 注意细胞形态 RDW: 22 浏览血片, 注意细胞形态 无白细胞分类结果 浏览血片, 手工分类 中性粒细胞值 :<1.0 或 >20.0 浏览血片 淋病细胞值 :>5.0( 成人 ) 浏览血片 单核细胞值 :>1.5( 成人 ) 浏览血片 嗜酸细胞值 :>2.0 浏览血片 嗜碱细胞值 :>0.5 浏览血片 异常提示 浏览血片, 注意提示内容

21 本组 复检规则 研究情况 材料及方法 3044 份血液标本来自上海第十人民医院 (1194 份 ) 长海医院 (747 份 ) 和东方医院 (1103 份 ) 的门诊及住院患者, 其中首诊标本 2604 份, 其余 440 份为复诊标本 采血于 BD 公司 EDTA-K2 真空抗凝管, 轻轻颠倒混匀多次, 充分抗凝, 于室温 (25 ) 环境下,30 分 -4 小时内采用自动进样模式用 CD3700 分析仪检测 检测后及时推制厚薄适宜的血涂片各 2 张, 用瑞姬染色液染色 冲洗 凉干用于人工分类

22 本组 复检规则 研究情况 人员培训实验前所有参加实验的人员集中培训, 依据全国血液学复检专家小组统一的复检规定及 全国临床检验操作规程 和 白细胞分类技术参考方法 统一认识和规范操作, 对实验中出现的问题及时汇总并采取相应措施

23 本组 复检规则 研究情况 仪器校准实验前由 ABBOTT 公司工程师用 Calibrator 全血校准品统一对三家医院的 CD3700 分析仪进行校准, 并用新鲜全血对仪器作比对实验 性能验证并通过 每个实验室每日用质控品 WB COUNTROL 监测且全部在控 严格遵照仪器操作规程的要求检测标本, 记录分析数据

24 本组 复检规则 研究情况 血涂片复检每单位由经验丰富 技术熟练的检验师,2 人一组, 采用双盲法, 在显微镜油镜下, 每人计数 200 个 WBC, 共计 400 个 WBC, 以均值报告分类结果 ; 并作全片观察, 记录各类血细胞大小 形态 染色及结构异常等情况, 记录有无 RBC 凝集 PLT 聚集 巨大血小板 NRBC 异常细胞和寄生虫等

25 本组 复检规则 研究情况 复检规则制定参照国际血液学 4l 条血细胞复检规则, 结合 CD 3700 的性能特点及其报告的 WBC RBC PLT 数量异常和报警信息, 制定 CD3700 自动血细胞分析和白细胞分类的复检规则, 见表 1 仪器检测到的可疑信号以旗标表示, 旗标含义见表 2

26 本组 复检规则 研究情况 涂片镜检阳性判断标准参照中华医学会检验分会血涂片复检专家委员会制定的涂片镜检阳性判断标准, 即 ⑴ 红细胞明显大小不等 ( 指细胞大小相差 1 倍以上 ), 中央淡染区扩大 (>1/2 细胞 ) 的红细胞多于 30% ⑵ 巨大血小板多于 15% ⑶ 见到血小板聚集 ⑷ 存在球形包涵体 (Dohle 小体 ) 细胞 >10% ⑸ 中毒颗粒中性粒细胞 >10% ⑹ 空泡变性粒细胞 >10% ⑺ 原始和幼稚细胞 1% ⑻ 早幼粒细胞和中幼粒细胞 1% ⑼ 晚幼粒细胞 >2% ⑽ 异型淋巴细胞 >5% ⑾NRBC 1% ⑿ 浆细胞 1%

27 本组 复检规则 研究情况 复检规则的评估以镜检结果为金标准评估复检规则 若符合任何一条复检规则且涂片镜检发现阳性结果, 那么该样本视为 真阳性 ; 若符合任何一条复检规则而涂片镜检时没有发现任何阳性结果, 那么该样本视为 假阳性 ; 不符合复检规则但涂片镜检却是阳性结果, 那么该样本视为 假阴性 ; 既不符合复检规则涂片镜检又是阴性结果, 那么该样本视为 真阴性

28 本组 复检规则 研究情况 复检规则的评估通过复检规则检测的 3044 份标本的结果 : 真阳性 17.1%, 真阴性 57.6%, 假阳性 21.9%, 假阴性 3.35% 对假阴性的分析 : 假阴性为 3.35%(102/3044), 低于国际血液学复检专家组制定的 5% 是保证患者检测结果安全性的最大可接受的假阴性率 102 例假阴性样本的分布情况为 : 血小板出现聚集和大血小板等形态异常 33 例 (32.4%); 白细胞出现中毒颗粒等结构异常 28 例 (27.45%); 红细胞形态结构异常 24(23.5%); 另有有核红细胞 11 例 (10.8%) 和不典型淋巴细胞 4 例 (3.92%)

29 本组 复检规则 研究情况 对假阳性的评估 : 其假阳性为 21.9%(667/3044), 主要出现在旗标阳性提示项上, 尤以 BAND VAR LYM RBC MORPH 占了其中的 80% 强 ; 另外还有 NRBC 和部分的血小板旗标

30 贝克曼系列复检研究 标本 :2006 年底到 2007 年 4 月共随机检测 3600 份标本, 其中 20% 为复诊病人标本 用于国际标准的评价和改进方案的制定 2008 年 5 月再检测 240 份标本, 用于对新方案的验证 参加单位 : 北京和睦家医院, 北京人民医院, 温州医学院附一院 仪器 :MAXM, GENS, LH750

31 贝克曼系列复检研究 根据中国实验室实际情况, 缩减至 23 条 考虑中国人群血细胞正常参考范围以及常规工作习惯 对新规则进行了再次临床验证, 没有漏掉血液病 论文已发表 : 国际血细胞复检规则在贝克曼 - 库尔特系列血细胞分析仪上的应用及改进方案 中华检验医学杂志,2008,31(7):

32 血细胞复检规则修改前 后评价结果比较 国际复检规则 新复检规则 验证结果 国外报道 标本数 (%) 标本数 (%) 真阳性 177 (4.9%) 355 (9.9%) 13.7% 11.2% 假阳性 870 (24.2%) 617 (17.1%) 15.8% 18.6% 真阴性 2534 (70.4%) 2563 (71.2%) 68% 67.3% 假阴性 19 (0.5%) 65 (1.8%) 2.5% 2.9% 复检率 1047 (29.1) 972 (27.0%) % 注 : 复检率 = 真阳性 + 假阳性

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35 血细胞显微镜检查包括 : 白细胞分析和分类计数 包括 : 分类计数的白细胞数量 淋巴细胞 单核细胞 嗜酸细胞 嗜碱细胞 分叶核粒细胞 杆状核粒细胞 晚幼粒细胞 中幼粒细胞 早幼粒细胞 原幼细胞 异形淋巴细胞 中毒颗粒和空泡变性等 红细胞形态 大红细胞 有核红细胞 靶形红细胞 椭圆形红细胞 小红细胞 镰状红细胞 球形红细胞 裂红细胞 泪滴形红细胞 低色素 高色素 红细胞大小不等 嗜碱性点彩 多色素 豪 - 周氏小体 异形红细胞等 血小板形态和数量估计 小血小板 大血小板 血小板聚集 血小板数量评估 EDTA 诱导假性血小板减少等 其它异常 : 寄生虫等

36 显微镜复检方法和注意事项 : 良好的涂片和染色 合适的读片位置 : 红细胞相接排列但很少重叠 红细胞形态分析

37 显微镜复检方法和注意事项 : 白细胞分析 白细胞数量评估 WBC x10 9 /L: 2-4 白细胞 /hpf (x40) WBC x10 9 /L: 4-6 白细胞 /hpf (x40) WBC x10 9 /L: 6-10 白细胞 /hpf (x40) WBC x10 9 /L: 白细胞 /hpf (x40) 如果有核 RBC 明显增加, 应校准 WBC 计数

38 显微镜检查方法和注意事项 : 血小板形态分析和数量判断, 有无凝聚 1 个血小板 / 油镜读片视野 10x10 9 /L 如果数量判断结果与仪器计数结果差距较大, 需复检仪器结果或进行血小板人工显微镜计数 血小板计数减低, 显微镜见聚集存在时, 需要重新采集标本测定 标本持续凝集, 要用枸橼酸钠抗凝重新测定 疑难血片和特殊病例应请上级主管复查

39 对低值血小板复检原则的思考 目的 : 探讨全自动血液分析仪对低值血小板检测的准确度 方法 : 将 ABBOTT CELL-DYN 3700 血液分析仪检测出的 102 例血小板小于 50*10e9/L 的血常规标本同时用血小板计数参考方法和手工计数法进行比对, 使用 ROC 曲线观察血液分析仪对其检测的准确度

40 对低值血小板复检原则的思考 分组第 1 组血小板 /L~ /L 33 例, 第 2 组血小板 /L~ /L 35 例, 第 3 组血小板 /L~ /L 34 例,

41 对低值血小板复检原则的思考 结果 图 1:CD 例 PLT 的 ROC 曲线 图 2: 第 1 组 PLT 的 ROC 曲线 ROC Curve ROC Curve Sensitivity Sensitivity 1 - Specificity Diagonal segments are produced by ties. 1 - Specificity Diagonal segments are produced by ties.

42 对低值血小板复检原则的思考 图 3: 第 2 组 PLT 的 ROC 曲线图 4: 第 3 组 PLT 的 ROC 曲线 ROC Curve ROC Curve Sensitivity Sensitivity 1 - Specificity Diagonal segments are produced by ties. 1 - Specificity Diagonal segments are produced by ties.

43 对低值血小板复检原则的思考 图 5 手工计数 102 例 PLT 的 ROC 曲线图 6 手工计数第 1 组 PLT 的 ROC 曲线 ROC Curve ROC Curve Sensitivity Sensitivity 1 - Specificity Diagonal segments are produced by ties. 1 - Specificity Diagonal segments are produced by ties.

44 对低值血小板复检原则的思考 图 7 手工计数第 2 组 PLT 的 ROC 曲线图 8 手工计数第 3 组 PLT 的 ROC 曲线 ROC Curve ROC Curve Sensitivity Sensitivity 1 - Specificity Diagonal segments are produced by ties. 1 - Specificity Diagonal segments are produced by ties.

45 对低值血小板复检原则的思考 结论 : 全自动血液分析仪 CD3700 对低值血小板的检测准确度较好 (Area 0.893), 但随着血小板数值的降低, 其准确度明显下降 当血小板数值低于 10*10e9/L 时, 分析仪已无法保证检测准确性, 而传统的手工计数准确性差, 无法起到良好的复核作用 建议采用流式细胞术对此类标本进行复检

46 对 SYSMEX XE-2100 血液分析仪检测低值血 小板限的研究 对 SYSMEX XE-2100 血液分析仪检测出的 100 例血小板小于 /L 的血常规标本同时用血小板计数参考方法和手工计数法进行比对, 使用 ROC 曲线观察血液分析仪对其检测的准确度

47 对低值血小板复检原则的思考 分组第 1 组血小板 /L~ /L 33 例, 第 2 组血小板 /L~ /L 32 例, 第 3 组血小板 /L~ /L 35 例,

48 对低值血小板复检原则的思考 结果 图 1:XE 例 PLT 的 ROC 曲线 ROC 曲线 图 2: 第 1 组 PLT 的 ROC 曲线 ROC 曲线 ROC Area 为 Area 为 灵敏度 灵敏度 1 - 特异性 1 - 特异性图 2 第一组 PLT-I 结果 图 例 PLT-I 结果

49 对低值血小板复检原则的思考 图 3: 第 2 组 PLT 的 ROC 曲线图 4: 第 3 组 PLT 的 ROC 曲线 ROC 曲线 ROC Curve Area 为 Area 为 灵敏度 Sensitivity 1 - 特异性 图 3 第二组 PLT-I 结果 1 - Specificity 图 4 第三组 PL T-I 结果

50 对低值血小板复检原则的思考 图 5 XE-2100 PLT-O 法 ROC 曲线分析图 6 XE-2100 PLT-O 法 ROC 曲线分析 100 例 PLT-O 法检测血小板数第 1 组血小板 Area ROC Curve ROC Curve Area Sensitivity Sensitivity 1 - Specificity Diagonal segments are produced by ties. 1 - Specificity Diagonal segments are produced by ties.

51 对低值血小板复检原则的思考 图 6 XE-2100 PLT-O 法 ROC 曲线分析图 7 XE-2100 PLT-O 法 ROC 曲线分析 第 2 组血小板 Area 第 3 组血小板 Area ROC 曲线 ROC 曲线 Area Area 灵敏度 灵敏度 1 - 特异性图 6 第一组 PLT-O 结果 1 - 特异性图 7 第二组 PLT-O 结果

52 对低值血小板复检原则的思考 图 8 手工计数 100 例 PLT 的 ROC 曲线图 9 手工计数第 1 组 PLT 的 ROC 曲线 ROC 曲线 Area ROC 曲线 Area 灵敏度 灵敏度 1 - 特异性图 例手工法结果 1 - 特异性图 10 第一组手工法结果

53 对低值血小板复检原则的思考 图 10 手工计数第 2 组 PLT 的 ROC 曲线 图 11 手工计数第 3 组 PLT 的 ROC 曲线 ROC 曲线 ROC 曲线 Area Area 灵敏度 灵敏度 1 - 特异性图 10 第一组手工法结果 1 - 特异性 图 11 第二组手工法结果

54 不同方法学检测低值血小板的相关性研究 组别 PLT 范围 例数 电阻抗法 光学法 手工计数 参考方法 第 1 组 20~ ± ± ± ±10.55 第 2 组 10~ ± ± ± ±3.90 第 3 组 0~ ± ± ± ±2.69

55 不同方法学检测低值血小板的相关性研究 第 1 组电阻抗法 光学法与参考方法相关系数分别为 ; 第 2 组电阻抗法 光学法与参考方法相关系数为 ; 第 3 组电阻抗法 光学法与参考方法相关系数为 , 均具有高度相关性,(P<1) 手工法除第 3 组外, 其结果与参考方法无相关性, (P > 0.05)

56 不同方法学检测低值血小板的相关性研究 项目 第 1 组 (n=33) 第 2 组 (n=32) 第 3 组 (n=35) r P r P r P 电阻抗法 & 参考方法 * * * 光学法 & 参考方法 * * * 手工计数 & 参考方法 ** ** *

57 不同方法学检测低值血小板的相关性研究 电阻抗法 光学法 手工计数法各方法间相关性分析 : 电阻抗法与光学法均呈较高的相关性 r= ,(P<1 ); 手工法与光学法及电阻抗法在第 1 组及第 2 组无相关性,r= (P>0.05), 第 3 组有相关性 r= ,(P < 0.05)

58 不同方法学检测低值血小板的相关性研究 第 1 组 (n=33 ) 第 2 组 (n=32) 第 3 组 (n=35) 项目 r P r P r P 电阻抗法 & 光学法 * * * 光学法 & 手工计数 ** ** * 电阻抗法 & 手工计数 ** ** *

59 讨论和建议 临床实验室不能忽视显微镜复检, 将仪器结果直接发出, 造成漏检 检验科必须根据自己医院和所用仪器的特点制定出血细胞复检规则 向临床医生宣传该规则, 加强配合, 提高工作效率 利用实验室信息系统 血细胞分析仪提示功能, 保证复检规则正确应用

60 量体裁衣 根据自己医院的特点制定了血细胞显微镜检查的规则, 并应得到临床医生的认可 各医院检验科需根据自己的实际情况来制定自己的标准草案, 与临床有关人员讨论后做出决定

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