2008,28(6) 郭洪年等 : 抗蚜基因及其转基因植物 119 基因, 此类基因产物对多种蚜虫有较好的抑制效果, 如蛋白酶抑制剂来自雪花莲的外源凝集素 Galanthus nivalisagglutinin(gna), 来自苋菜种子的凝集素 Amaranthuscaudatusagglutin

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1 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology,2008,28(6):118~124 抗蚜基因及其转基因植物 1 郭洪年 2 侯汉娜 1 欧阳青 1 吴家和 (1 中国科学院微生物研究所植物基因组学国家重点实验室北京湖北第二师范学院化学与生命科学系武汉 ) 摘要在我国目前的环境条件下, 蚜虫作为农业害虫和植物病毒的传播者, 已经成为严重威胁农业生产发展的重要害虫之一抗蚜植物基因工程可以有效抑制蚜虫危害, 并且随着对生命科学的深入理解和技术手段的日益成熟, 得到广泛的关注和重视抗蚜植物基因工程的核心是抗蚜基因的筛选转抗蚜基因植物的培育以及生物安全性讨论了多种抗蚜基因, 并重点论述雪花莲凝集素和苋菜凝集素基因在目前科学研究和生产实践的应用关键词抗蚜基因转基因雪花莲凝集素苋菜凝集素中图分类号 Q789 蚜虫是农业上极为重要的害虫之一其宿主范围广泛, 对粮食棉花及油料作物都能造成严重危害, 致使产量下降, 品质降低在我国西北地区, 蚜虫对小麦和棉花的危害尤为严重以棉花为例,1994 年, 新疆北疆棉区的棉花产量因棉蚜危害损失三分之一 ;2001 年夏末秋初, 新疆全区 1500 多万亩棉花受到不同程度虫灾袭击当年棉田虫灾仅给石河子带来的经济损失估计就将超过 7 亿元除了蚜虫吸食植物汁液造成的危害, 它还是植物病毒传播的优良媒介 2000 至 2003 年, 在我国河南省多种植物病毒流行, 多种农业作物受害严重, 其中马铃薯和辣椒减产 50% 以上, 经济损失巨大, 蚜虫在病毒的传播中扮演了主要角色使用农药虽然可以在短时间内有效地防治, 但是极易使蚜虫产生耐药性, 不利于长期防治 ; 在使用农药的同时, 蚜虫的天敌也被杀死, 这些有益昆虫恢复生长的时间比蚜虫来得晚, 隔年会导致蚜虫的再次爆发 ; 而且农药污染环境, 与当前环境保护绿色生态农业的主流相悖植物基因工程为培育农作物抗虫新品种开辟了新的途径和常规育种相比较, 植物基因工程具有无法替代的优势首先, 基因资源丰富, 打破了以往常规育种要依靠一定亲源关系的局限来自于不同植物动物甚至微生物的基因均可作为基因工程育种的基因来源 ; 而且在传统育种过程中遇到的基因连锁情况也得收稿日期 : 修回日期 : 国家 863 计划资助项目 (2001AA21207) 通讯作者, 电子信箱 :wujiahe@im.ac.cn 到了根本解决来自苏云金杆菌的 Bt 基因经改造后导入棉花, 培育出抗虫棉是植物基因工程的典范 ; 其次, 随着生物技术的发展, 植物基因工程可以使外源基因在植物体内的表达得到精确的调控, 并可以对基因产物进行精确的定位目前, 转 Bt 基因棉花的大规模推广和应用, 使棉铃虫的危害得到很好的控制, 取得了较大的经济效益然而其它非靶标害虫 ( 主要是刺吸性害虫 ) 的种群发生数量明显上升, 危害日趋严重邓曙 [1] 东等研究表明种植 Bt 转基因棉花的的烟飞虱棉叶螨棉蚜等刺吸性害虫的发生数量比常规对照棉田增 [2] 长显著 ; 杨国正等在湖北的试验也证明了种植 Bt 棉花田块的蚜虫种群发生数量比常规棉田有显著上升许多研究均在大田自然条件下, 和常规棉田相比, 转 Bt 棉花的田块中刺吸性害虫的种群数量呈明显的上升趋势 [3] 因此在大规模推广 Bt 转基因作物后, 如何解决刺吸性害虫日益严重的危害成为目前抗虫研究的一个主要方向目前, 采用植物基因工程培育抗蚜作物的关键是选择合适的抗蚜基因所谓合适的抗蚜基因, 一是抗蚜效果好, 对蚜虫的毒性强且抗虫谱广 ; 二是符合生物安全性的要求当前研究的抗蚜基因主要分为两类 : 一类是特异性的抗蚜基因, 此类基因通常只在同属或同种植物当中才会有抗蚜作用, 并且一般只对一种或几种蚜虫有很好的效果, 将此类基因转至其他植物中, 却没有抗蚜效果, 如 Mi?1.2 基因 ; 另一类是广谱性抗蚜

2 2008,28(6) 郭洪年等 : 抗蚜基因及其转基因植物 119 基因, 此类基因产物对多种蚜虫有较好的抑制效果, 如蛋白酶抑制剂来自雪花莲的外源凝集素 Galanthus nivalisagglutinin(gna), 来自苋菜种子的凝集素 Amaranthuscaudatusagglutinin(ACA) 等本文对这两类抗蚜基因的转基因植物的抗蚜性进行了分析, 对提高抗蚜性的的方法和途径进行了讨论, 希望能抛砖引玉有助于推动我国在这一研究领域的深入进展 1 特异性抗蚜基因目前认为这种基因的抗蚜机制与植物对病原菌的专一性抗性机制是相同的抗性基因与来自昆虫的无毒基因相互识别, 相互作用, 导致寄主植物产生抗性抗性基因的产物在整个抗性反应过程当中起重要作用, 它介导早期的信号传导诱发寄主植物的抗性反应与咀嚼型昆虫相比, 刺吸式的昆虫与植物细胞有更长的相互作用时间, 这样就提供了抗性基因和无毒基因相互识别和发生反应的条件 [4] 1.1 Nr 基因 Nasonoviaribisnigri 在欧洲是很常见的一种蚜虫, 对当地的主要蔬菜莴苣 (Letuce) 有很大危害 Nr 基因来自于野生莴苣 (Letuce), 对蚜虫 Nasonovia ribisnigri 具有专一的高度抗性 [5] 该基因已经通过传统的杂交育种方式从野生品种转移到栽培品种当中, 具有良好的抗性 [6] 但是对其它蚜虫, 如 Myzus persicae Macrosiphum euphorbiae 等, 则没有抗性 [7] Keygene 等借助 AFLP 已经确定了与之连锁的基因标记, 申请了相关专利 1.2 Vat 基因 Vat, 即 Virusaphidtransmision, 是由法国 INRA 的一个研究小组从朝鲜的一个甜瓜品种当中发现的 [8] 它的作用主要有两方面, 一是可以抑制蚜虫在植物器官上繁殖, 二是可以防止蚜虫传播病毒目前认为这两个功能具有不同的机制, 前者可能是化学因子的作用, 后者可能是含 Vat 基因植物体内的氧化还原电位高于蚜虫体内的氧化还原电位, 暂时堵塞虫口针末端, 导致蚜虫无法分泌唾液, 从而无法传毒 [9] 1.3 Sd1 基因该基因是一个显性的抗苹果红圆尾蚜 (Dysaphis devecta,wlk) 生物型 I 和 I 的抗性基因 Dicker [10] 观察到这种蚜虫不会侵染 Cox sorangepopen 品种 [11] Alston 等证明在 Cox 和 JamesGrieve 品种内存在 [12] 着单一抗性基因介导的抗虫性后来 Alston 等阐明了 3 种蚜虫的生物型和 3 个功能不同的抗性基因 (Sd1,Sd2,Sd3) 之间的关系, 其中 Cox 带有 Sd1 抗性基因, 能够抗苹果红圆尾蚜生物型 I 和 I Cevik [13] 等已经绘制了精密的物理图谱, 为最终克隆该基因奠定了基础 1.4 Mi?1.2 基因该基因是目前研究得最清楚的一个特异性抗蚜基因 [14,15] 它全长 14.7kb, 编码 1257 个氨基酸, 定位于番茄的 6 号染色体上在植物抗性基因中,Mi?1.2 属于 nucleotide?bindingleucinerichrepeat(nblrr) 家族, 即富含亮氨酸的核苷酸结合家族转 Mi?1.2 基因的马铃薯可使 Wu?3 生物型的蚜虫 (potatoaphid,myzus euphorbiae,aredisolate) 在虫试 9 天后全部死亡, 而 Wu?4 生物型 (potatoaphid,myzuseuphorbiae, agreen isolate) 则没有受到影响 ; 但是表达 Mi?1.2 的转基因茄子却只能抵御线虫, 对蚜虫则没有效果 [16] 表明该基因介导的抗蚜作用不但效果好, 而且高度专一, 并具有种属特异性目前认为是该基因可以识别蚜虫的无毒基因, 启动下游一系列的反应但是该基因具有温度敏感性, 当土壤温度高于 28 С, 该基因介导的抗性逐步丧失 [17,18] 2 广谱抗蚜基因广谱性的抗蚜基因对蚜虫作用并没有专一性, 它们或者干扰蚜虫的生长发育 ( 如细胞分裂素 ), 或者影响蚜虫体内的营养吸收及生理代谢 ( 如一些小分子量的蛋白酶抑制剂 ), 但是直至目前, 大多数广谱抗蚜基因的作用机制仍不太明确, 有待进一步的研究这些基因主要包括细胞分裂素基因蛋白酶抑制剂基因少数 Bt 基因和植物凝集素基因 2.1 细胞分裂素 (cytokinin) 基因细胞分裂素又称富滋玉米素或异戊烯腺嘌呤, 在植物体内能够增强光合作用, 刺激植物细胞分裂, 促进叶绿体的形成, 加速植物新陈代谢和蛋白质的合成 [19] Semigocki 等将细胞分裂素基因 ipt 与蛋白酶抑制剂 I 基因启动子连接转化烟草, 发现转化子能够抑制绿桃蚜 (Myzuspersicae) 的发育, 被认为是植物激素的过量表达干扰了昆虫体内正常的生理代谢此项技术已经申请了专利 2.2 蛋白酶抑制剂 (proteaseinhibitor) 基因蛋白酶具有天然的抑制剂在预料之中, 否则这些蛋白酶将不会允许细胞的持续存在目前已有蛋白酶

3 120 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.28No 抑制剂应用于抗虫, 如豇豆蛋白酶抑制剂 [20] 慈菇蛋白酶抑制剂 [21] 但是同翅目昆虫体内缺乏蛋白酶, 所以通常的蛋白酶抑制剂对蚜虫没有效果, 而一些小分子量的蛋白酶抑制剂如 pepstain 和 chymostain, 对蚜虫则 [22] 有较强的毒性和抑制作用如 Ceci 等通过 Phage Display 筛选到的 chymotrypsininhibitor(chy8) 对桃蚜的半致死剂量可达到 75μg/ml, 若换算为转基因植物内的外源蛋白表达量则为 0.5% ~1%, 实用性很高 2.3 植物凝集素 (plantagglutinin) 基因 [23] 植物凝集素在植物蛋白中占有重要的地位, 分 [24] 布广泛, 功能繁多 Rahbe 等在体外系统地研究了多种植物凝集素对豌豆蚜生长和发育的影响, 发现来自尾穗苋的 ACA(Amaranthuscaudatusagglutinin) 具有很好的抗蚜效果, 对蚜虫的半致死浓度只有雪花莲凝集素 GNA(GalanthusnivalisAgglutinin) 的一半根据植物凝集素的来源及糖结合的特异性, 可将其分为 7 个蛋白质家族 : 苋菜凝集素家族结合几丁质的凝集素家族葫芦科韧皮部凝集素家族豆科类凝集素家族 2? 型核糖体失活蛋白家族 Jacalin 相关凝集素家族单子叶植物结合甘露糖凝集素家族 3 植物凝集素的抗蚜基因工程植物凝集素具有对多种单糖和寡聚糖专一性结合的能力这种特点使其在抗蚜植物基因工程方面有很大的潜力, 但在转基因植物的安全性方面, 其糖结合能力又限制了它的应用模式动物的喂养实验表明 :2? 型核糖体失活蛋白凝集素家族中的蓖麻蛋白具有致死毒性 ; 豆科凝集素家族中的菜豆凝集素可引起大鼠微绒毛的损伤, 影响肠道对食物的吸收, 并诱发细菌在小肠上繁殖 [25] ; 在几丁质结合凝集素家族中, 小麦胚乳凝集素也被认为对大鼠有慢性毒害作用 [26,27] 外源凝集素对人的毒性极低, 对蚜虫, 叶蝉和稻褐飞虱等同翅目刺吸式口器的吸汁性害虫和线虫具有极强的毒性, 对咀嚼式口器害虫有中等毒性 [28~32] 外源凝集素主要储存于植物细胞的蛋白体 (poretinbody) 中, 一旦被昆虫取食, 外源凝集素就会在昆虫的消化道中释放出来, 并与肠道围食膜上的糖蛋白相结合, 影响营养物质的正常吸收 ; 同时还可能在昆虫的消化道内诱发病灶, 促进消化道内细菌的繁殖, 对昆虫造成危害 [27], 外源凝集素在昆虫的消化道中与肠道围食膜上的糖蛋白相结合, 这种结合具有专一性, 即不同的外源凝集素与相应的糖类结合这些作用对害虫都造成危害, 从而达到杀虫的目的研究表明, 豌豆外源凝集素雪花莲外源凝集素等对害虫具有很高的毒性, 并且尚无确切证据表明对人有毒副作用 [33,34], 因而其编码基因成为植物抗虫基因工程中的常用基因 3.1 GNA 及其抗蚜性雪花莲凝集素 (GalanthusnivalisAgglutinin, 简称 GNA) 来自石蒜科的雪花莲植物, 属结合甘露糖的单子叶凝集素家族 GNA 由多基因家族编码, 基因内无内含子 [33] 在植物体内,GNA 的 mrna 编码的是一个前蛋白原, 其加工过程和其它结合甘露糖的单子叶凝集素家族的蛋白质加工过程相同, 即经共翻译加工和翻译后加工除去 5 端信号肽和 3 末端多肽, 成为成熟多肽来源于雪花莲中的 GNA 是目前使用最为广泛的凝集素抗蚜基因体外毒性实验表明,GNA 蛋白对刺吸式昆虫有强烈的抑制作用, 但对哺乳动物的毒性较低 [34] Hilder 等构建了 GNA 和 CaMV35S 启动子的融合基因转化烟草获得转基因植株虫试结果表明, 转基因烟草可以抑制 50% 的虫口密度 ; 与对照植株相比, 蚜虫 [35] 的大小体重和繁殖率有明显的下降周岩等将 GNA 与 CaMV35S 和 CoYMV 启动子构建成植物表达载体分别转化烟草, 表达外源基因的植株能够抑制 45% [36] ~60% 的虫口密度袁正强等对 GNA 基因进行了定点突变, 使之更加适合在植物中表达, 获得的转基因 [37] 植株可以抑制 70% 的虫口密度 Birch 等转化马铃薯的实验表明, 雌幼蚜在转化 GNA 的马铃薯上寿命缩短 51%, 但是并未发现对蚜虫有明显的毒性作用另外, 除蚜虫之外,GNA 蛋白还对另一些害虫的生长具有抑制作用 [38~41] 在中国,GNA 是被研究得最为广泛的抗蚜基因, 在某些领域已经接近实用阶段, 如转 GNA 的抗蚜枸杞 [42] 抗蚜水稻 [43,44] 抗蚜棉花 [45] 抗蚜小麦 [46] 抗蚜 [47] 大豆以及大白菜等不仅如此,GNA 还可以和其他抗虫基因联合使用, 从而使转基因植物对两种甚至多种害虫具有抗性田颖川等构建了 Cry1Ac 与 GNA 的双价表达载体, 前者为 CaMV35S 启动子驱动, 后者为韧皮部特异性启动子 SPP2(phloem protein2geneof Cucurbitamaxima) 驱动, 利用花粉管通道法转化棉花得到的转基因植株不但可以有效地抵抗棉铃虫, 而且降低棉蚜虫口密度达 56% ~88%( 未发表资料 ) 虽然有以上许多关于 GNA 抗蚜效果较好的报道, 然而, 到目前为止, 还没有见到有关转 GNA 基因植物大田推广

4 2008,28(6) 郭洪年等 : 抗蚜基因及其转基因植物 121 应用的报道随着 GNA 的研究进一步的深入, 该基因的实际应用也将成为可能, 这将为该基因的安全应用带来研究的必要虽然 GNA 蛋白对哺乳动物没有明显的毒性作用, 但在整个生态系统特别是涉及蚜虫的生物链时, 转 GNA 的植株对某些蚜虫的天敌生物的生存有一定的 [48] 影响 Birch 等的研究表明, 在转 GNA 的马铃薯马铃薯蚜和瓢虫三者之间存在着相互作用, 转 GNA 的马铃薯虽对瓢虫没有强烈的毒性作用, 却使雌瓢虫的寿命缩短 35% 这表明深入地探讨转基因植物的生物安全性是非常有必要的 3.2 ACA 及其抗蚜性 ACA 蛋白来自苋菜种子, 是植物的贮藏蛋白, 属苋菜凝集素家族与苋菜中的其他种子蛋白不同,ACA 蛋白不存在于蛋白体中, 而是存在于细胞质中该凝集素含有丰富的人体必需氨基酸如赖氨酸色氨酸和其他一些氨基酸, 是一种营养价值较高的蛋白质 [49], 根据世界卫生组织推荐的氨基酸含量标准,ACA 蛋白的氨基酸组成非常符合人类对必需氨基酸的要求 [50] [24] Rahbe 等系统地研究了 30 种植物凝集素在体外的抗蚜活性, 结果表明, 来自尾穗苋 (Amaranthus caudatus) 种子, 并与 2? 乙酰氨基?2? 脱氧?D 半乳糖专一性结合的凝集素 ACA (Amaranthus caudatus agglutinin) [51] 在体外的抗蚜活性比 GNA 和 ConA 更高, 其对蚜虫的致死浓度只有 GNA 的一半, 并且表观死亡率达到 100% 表明 ACA 可能是一种有效的抗蚜基因 [52] Guo 等用来自 CoYMV 的韧皮部特异性启动子驱动 ACA 基因表达, 在烟草中获得了平均约 80% 的抗蚜活性, 并对蚜虫具有一定的致死性在其实验中, 韧皮部特异性启动子的采用使得表达的 ACA 蛋白主要集中在植物组织的韧皮部, 这在理论上有助于减轻转基因组织的负担, 并增加针对蚜虫的有效浓度虽未进行平行比较但从初步的抗蚜试验结果看, 比 CoYMV? GNA34m 的转基因烟草的抗蚜效果好 [36] 这一结果与 [24] Rahbe 等的体外虫试结果的趋势基本一致 [53] 利用同一表达框架,Wu 等将 ACA 基因导入棉花中 ACA 在棉花可溶性蛋白中的含量从 0.02% 到 0.45% 不等虫试结果表明, 转基因植株对于棉蚜 (AphisgosypiGlover) 的抑制率达到 64.5%, 田间试验正在进行中 4 存在的问题和对策 GNA 作为广泛应用的抗蚜凝集素, 研究得已经较为透彻, 但是其蚜虫抑制效率仍有待于进一步提高 ACA 作为一种新出现的抗蚜凝集素, 已经在烟草和棉花的抗蚜实验中显示了其较高的抗蚜活性为了取得更高的抗蚜活性, 张震山等将 ACA 基因与 GNA 基因构成双价抗虫表达框架, 导入烟草中, 获得了稳定的转基 [54] 因烟草 Lu 等对转基因烟草进行了抗虫分析, 结果表明, 与分别转化 ACA 或者 GNA 基因的植株相比, 双价抗虫植株具有更好的抗虫效果目前, 抗蚜植物基因工程遇到的主要问题依然是抗蚜基因的有效性随着生态环境的日益严峻, 抗蚜基因仅对蚜虫具有抑制作用已经不能满足生产实践中的要求, 更为重要的是对蚜虫的致死性提高植物中抗蚜基因的表达量, 或者增加抗蚜基因的有效浓度, 如在韧皮部的浓度, 从而提高对蚜虫的致死效果是一条有效途径因此, 探明 GNA 和 ACA 基因的抗蚜机理, 找出它们的抗蚜活性中心, 在同一个基因上编码多个抗蚜基因的活性中心, 针对性地提高抗蚜基因的单位活性, 从而使得抗蚜植物基因工程有突破性的进展参考文献 [1] 邓曙东, 徐静, 张青文, 等. 转 Bt 基因棉对非靶标害虫及害虫天敌种群动态的影响. 昆虫学报,2003,01 DengSD,XuJ,ZhangQW,etal.ActaEntomologicaSinica, 2003,01 [2] 杨国正, 展茗, 杨长举, 等.Bt 转基因抗虫棉田昆虫群落结构研究. 湖北农业科学,2005,05 YangG Z,Zhan M,YangC G,etal.HubeiAgricultural Sciences,2005,05 [3] 宋荣, 汪飞, 封红兵, 等. 新疆棉区转 Bt 基因棉对棉田主要害虫及其天敌种群数量的影响. 中国生物防治,2002,03 SongR,WangF,FengHB,etal.ChineseJournalofBiological Control,2002,03 [4]FernandesG W.Hypersensitivity.aneglectedplantresistance mechanism against insect herbivores. Environmental Entomology,1990,19:1173 ~1182 [5]EeninkAH,DielemanFL.Inheritanceofresistancetotheleaf aphid Nasonovia ribis?nigriin the wild letuce species. Lactucavirosa,Euphytica,1983,32:691~695 [6]EeninkAH,GroenwoldR,DielemanFL.Resistanceofletuce (Lactuca)totheleafaphidNasonoviaribisnigri.1.Transferof resistancefroml.virosatol.sativabyinterspecificcrosesand selectionofresistantbreedinglines.euphytica,1982,31:291~ 300 [7] Johannes Petrus,Antonius Jansen.Aphid resistance in

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材料方法载体构建转基因植株的获得

材料方法载体构建转基因植株的获得生物技术通报唐宏琨曾洪梅杨秀芬邱德文通过根癌农杆菌介导转化法将含有激发子基因的植物表达载体转化三生烟获得了转基因烟草植株用检测确认了阳性转化株用杂交和杂交进一步证实了基因的整合转录和表达对代转基因阳性株进行接种试验结果显示与非转基因对照相比表达的烟草叶片枯斑数量减少表明蛋白激发子基因的表达提高了转基因烟草对的抗性激发子基因烟草转化材料

2008,28(6) 郭洪年等 : 抗蚜基因及其转基因植物 119 基因, 此类基因产物对多种蚜虫有较好的抑制效果, 如蛋白酶抑制剂 来自雪花莲的外源凝集素 Galanthus nivalisagglutinin(gna), 来自苋菜种子的凝集素 Amaranthuscaudatusagglutin

2008,28(6) 郭洪年等 : 抗蚜基因及其转基因植物 119 基因, 此类基因产物对多种蚜虫有较好的抑制效果, 如蛋白酶抑制剂来自雪花莲的外源凝集素 Galanthus nivalisagglutinin(gna), 来自苋菜种子的凝集素 Amaranthuscaudatusagglutin