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谘偕朱
5 years ago
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1 应用昆虫学报 " $ ) $+ -. $ "$"" $))Y SV的克隆和表达分析粘虫核糖体蛋白 L 李柯 " 山西师范大学生命科学学院临汾$ XKV和 V-KD技术克隆了粘虫 " $ " R 核糖体蛋白 : 基因" K7Q 的全长摘要运用 VS db-序列" L Q R 登录号$j by"$ 并对其进行生物信息学分析结果表明粘虫 K7Q 全长 db-序列为 )" MA包括非编码区 " MA 和非编码区 ) MA 其开放阅读框" MA 编码 $ 氨基酸肽链具有核糖蛋白 :蛋白家族典型特征该肽链理论分子量为 "$[ " R等电点为 [ Y"富含种类型的特定功能位点该蛋白 YZ ]Y[ "Z高度同源性应用荧光实时定量技术建立了粘虫脑部胚后发序列与其他动物 VX: 蛋白序列具有 )[ 育 K7Q 表达模式 K7Q 表达量随胚后发育脑部重建呈现出动态变化这一结果显示 K7Q 是在转录水平上呈现发育性调节关键词粘虫核糖体蛋白 : 克隆表达 ) + 4 U$ )) SV )4 + -) ) + 4) $ )" ) ) $ ) 4_ " K 4 : : b O 7 4 $ K - - db- M O A : " K7Q N C O " $ " R VS XKV C V-KD c S N C db- " L Q R OM $ j by"$ C )" M A C "" MA C C ") MA S A C O" MA C $ O C A A CN A C C O N "$[ " R C X [ Y"[SA C C A C C N )[ YZ +Y[ "Z O O C VX: O O N A M O A : O M C V Oc XKV C K7 A N C N O C M S K7 N C AO C A 7 8.) 4 " $ K7Q O A 昆虫变态机制常期以来一直是广大学者感兴趣的课题大量文献报道了变态昆虫脑细胞及神核糖体蛋白 : " VX: 为组成真核细胞核糖体小亚基 : 蛋白成分之一目前多种动物细经髓质区在脑部胚后发育过程中的发育行为 db- 序列都有报道 " - 菌和植物的 K7 " b C C C DCN C $)+ Q c + + $+ + $+ T $+ ^ "+ do + "+ : + "+ + $+ ^ + "+ 周奕华等"$+ -N R + "Y+ L C V "Y+ + "+ ^ + "$ 在 K + "+ 侯怡铃等" 人类 VX: 属于核糖体蛋白 :蛋白家族 VX: 功能的相变态过程中脑重建主要体现在神经母细胞增殖神经元的分化及次级轴突束的产生突触数量的 C M O O " 是关报道较少 8d8" " O XO 关键的负调节因子 " Q R C 肿瘤抑癌基因增加及髓质区生长和定位等方面 L") 最近研究表明除了参与核糖体组成资助项目$山西师范大学博士启动资金"Y"" O $ R $W$") O D Y "接受日期$"$$ $$ " 收稿日期$"$$

2 ) $ ) $+ -. $ 应用昆虫学报 " 卷 XO 的相互作用来外VX: 还通过参与 8d8" 与 + "+ K 调节细胞分化和凋亡 " U c " 均采用巢式 XKV扩增技术首先根序列 : 据多种动物 VX: 蛋白氨基酸序列的保守区域设 + " 作者非常感兴趣 K7Q 在变态昆虫脑部胚后发育过程中的功能因此本文以粘虫计简并引物 -$-"Q$ 和 Q" 引物 -$-" 与 V-KD接头引物 V-KD V-KD 用 " $ " R 作为实验材料克隆获 db-序列 : c $ 的扩增引物 Q$ 于末端全长 Q" 与 V-KD接头引物 V-KD V-KD db-序列并建立了粘虫脑部胚后得粘虫 K7Q 发育 K7Q 表达模式旨在为核糖体蛋白 : 的功能研究提供基础资料 :材料与方法用于 db-序列 : c " 扩增将末端全长 c$ 和 : c" 序列由 K D A 测序获得的 : db-序列软件组装后获得粘虫 K7Q 全长 K :材料虫源及饲养条件粘虫由西北农林科技大学无公害农药研究中心提供室内培养温度控制在 "" {$ \ 光周期为 4zd $ z$ 相对湿度 Z ]YZ 幼虫以小麦苗进行饲喂 K :方法 K K :总 DV的提取和 SV第一链的合成 : 任意选取龄粘虫幼虫头取其头部立即放入 X 含有液氮的研钵中充分研磨后加入 Vb- " 购自 S _ V公司然后按照 S _ V公司的图 :粘虫 : 基因克隆策略 + : ) + +8 )+ 4) $ )" ) ) :Q + KK:粘虫 :Q a 和 a 末端全长的克隆和测序通过 L Q R 数据库获得包括小菜蛾 7 ) + Vb- X 使用说明书进行总 Vb-的提取获 _ V公司扩增 db- 得总 Vb-后立即使用 S +" 登录号$ Q-d"))) 家蚕 V-KD 和末端全长试剂盒" 末端 V-KD 在 $ 4体全长的试剂盒 " + " 登录号$-Q:" 埃及伊蚊. + " 登录号$ mxx $))$) 印鼠客蚤 c $ + db-和系中反应合成含末端第一链末端第 db- 为分析 K7Q 在脑部胚后发育过程中一链 " 登录号$-Q8 等物种的 VX: 蛋白 " 氨基酸序列根据这些序列的保守区域设计 " 对的表达模式作者选取了 $$ 个发育阶段包括个幼虫阶段" 龄到 ) 龄4 ]4) $ 个前蛹阶段简并引物 -$-"Q$ 和 Q"" 表 $ 引物 -$ 和 -" V-KD 用于末端全长序列扩增引物 -$ 和 " XX ) 个蛹阶段" X X" X X) XY X$ 和 $ 个成虫阶段" - 新形成的蛹记为 X 随后的发以 db-为模板进行第末端全长的第一链育天数记为 X$ ]X$ 刚形成的成虫记 - 幼虫阶段选取蜕皮后第 " 天幼虫为实验材料每个阶段设置组每组取 ] 头用作实时定量模板提取选取的粘虫经 K." 麻醉后在冰上解剖出脑 X 中然后按照 S _ V公司立即放入 Vb- X 使用说明书进行总 Vb-的提取的 Vb- _ V公司提取的总 Vb-经检测合格后使用 S O : A _ 进行的反转录试剂盒 X + VS " 登录号$ bxx $")$ 瓦氏袖蝶 $ ) $ 轮扩增将稀释 $ 倍的第 $ 轮产物作为模 V-KD 进行第 " 轮扩增板用引物 -" 和 c $ 引物 Q$ 和 Q" 用于获得片段 : 末端全长 V-KD 以序列扩增引物 Q$ 和末端全 db-的第一链为模板进行第 $ 轮扩增将稀释长 $ 倍的第 $ 轮产物做为模板用引物 Q" 和 V-KD 进行第 " 轮扩增获得片段 : c" 上述 " 片段第 $ 轮扩增反应条件为$\ 预变性 O 然后 \变性 "\ 退火 "\ 延伸 db-模板反转录成 K K :粘虫 :Q 全长 SV序列扩增策略粘 $ O 共个循环最后 "\ 再延伸 $ O 第 " 轮巢式 XKV反应条件为$ \ 预变性 O + 然 db-序列扩增策略见图 $ K7Q 虫 K7Q 全长 db-序列 : c$ 和 db末端全长末端全长 )\退火 "\ 延伸 $ O 后 \变性 XKV产物共个循环+最后 "\再延伸 $ O

3 期 db-的克隆和表达分析李柯$粘虫核糖体蛋白 : 经确认后用 "Z的琼脂糖凝胶电泳分离纯化然后 $S载体转化感受态细胞连接到 A8d ) d^ +XKV检测阳性克隆后送上海美季生物有限公司测序 SV克隆及检测表达量引物序列表 :粘虫 :Q 基因 - :V ) 4 W )$ )+ 4) $ )" ) ) :L SV 引物名称引物序列".MG O X O O X O c " V-KD -$ K-SKS-KLSLKKK-SLKKb--VS -" KKK-SLKKK--LKSL--V:8bSSK- Q$ --K-KK-LLSKKSKK-LL-SbLKVSKVS-b-K Q" LLLSSKSLKSSKSLLLSKSKSSSLSSVSSbLK 目的片段 V-KD V O d A. $ K$ -KK--KSKKL-KKSL--L K" SKSKK--KL--K-K--KL d$ -SLSLKL-KL-KL-SLSSL d" KSKLSSLS-L--LLSLSLL L+ $K S+ $- S+ b$- S K L+8$- K+ :$L K 注$ V$- K :生物信息学分析 db-模板作为制本研究中选用 ) 龄幼虫脑作标准曲线模板+ 模板的稀释倍数为 $ ~$ ~ X-:" NNN A 分析通过 D 蛋白质分子量和等电点采用 :.X8- 软件 $ " ~$ ~$ ~ 所有样品 db-模板稀释 $ " A AM M A 分析蛋白质的二级结 db倍后做为定量模板本实验选龄幼虫脑 C 软件 " NNN OM 构运用 S8A + K 样品为参照组 K7Q 相对表达量通过公式 " -- 分析蛋白质跨膜区用 8DL-[ 软件进行进化树的构建进化距离分析采用的邻接法 " bj S法获得将获得的数据输入 :X:: $[ 通过单因素方差分析用最小显著差数法 " M G 系统树的每个分支的统计学显 4:d 进行检验根据平均值 {标准误 C 绘图 A 进行检验重复次数为 $ 著性分析以 M 次 K A:粘虫 :Q 基因的表达分析 OXKV对 K7Q 在利用实时荧光定量脑部胚后的 $$ 个不同发育阶段的表达水平进行研究根据克隆所获得的 K7 序列采用 Q d [ 软件设计实时定量引物 " 表 $ 本. $ 作为内参基因内参文采用粘虫管家基因 $A + "$ 引物序列见表 $ " 李柯等 "$+ 4 :结果与分析 K:粘虫 :Q D扩增产物的检测经过巢式 XKV扩增电泳结果显示K7Q V-KD和 V-KD扩增的产物大小约为 Y MA 和 MA" 图 " 均与预期的片段大小一致将 XKV 产物克隆到载体中进行测序根据测序结果可知该基因和末端全长序列扩增的产物长分 ts8 AA 定量 XKV 仪上进行 XKV 反应别是 )$ MA 和 MA 将以上 " 条片段测序结果在 bkq进行 Q4-:S同源搜索结果表明所得片 +b "" $ 4上游体系$:QV7 段均与 K7Q 基因同源 4[ 4 下游引物 "$ O 4 引物"$ O K:全长 SV序列的获得及开放阅读框识别 [ 4 db-模板 $ 4CC^".Y 4 总体系为将经过扩增测序得到的 K7Q 末端全长序 K D A + 软件列和末端全长序列通过在定量 XKV 反应采用荧光染料 :QV L " 4 XKV程序采用二步法反应程序为$\ 预 + \ 预变性 $ )\ 退火延伸 $ 变性共循环+ 加上溶解曲线分析程序每个样品重复测定次 " NNN O 拼接得到粘虫该基 db-序列长为 )" MA 采用 bkq上的因全长 C 进行开放阅读框 " A 在线工具.V

4 )) $ ) $+ -. $ 应用昆虫学报 " 卷 ]$$SLV 个酪蛋白激酶磷酸化位点 " ] $"$:--D+" ]"$Sb:d+$" ]$"$:Td+$) ] $)$SS D+$ ]$Y$ SLVD 和酰胺化作用位点 "$) ]$$TL_V 此外分析结果还显示一个核糖体蛋白 :蛋白家族特征位点 " ]Y$ V4TVD4D :L_^ 通过 :.X8-" A AM M A M 软件分析二级结构分析预测表明该蛋白 +螺旋占 [)YZ 无规则卷曲占 [Z延伸链占 "Z " 转角占 [Z 运用图 :粘虫 : 基因的 D扩增产物 + :D$ ) ): + 4) $ )" ) ) 8[db-O R d4"+ $[ V-KD巢式 XKV产物+ "[ V-KD巢式 XKV产物 8db-O R d4"+ $[A C V-KD C XKV+ "[A C V-KD C XKV C O.V 识别结果如图起始密码子 -SL位于第 ] 位核苷酸终止密码子 S-位于第 ) ]) 位核苷酸开放阅读框全长为 MA编码一个 $ 氨基酸残基的蛋白质非 C 7SV 的长度为翻译区 " " MA 非翻译区 " C S8A C 软件 " NNN OM N S8XVDdx O O 分析蛋白跨膜区分析结果表明其无跨膜区 KA:DL 进化树的构建 $[Y$ 软件将粘虫 K7Q 基因的应用 K Q R 上已登录的小菜蛾氨基酸序列与 L 7 ) + + " 登录号$ Q-d"))) 家蚕 " 登录号$ bxx$")$ 瓦氏袖蝶 $ ) + " 登录号$ -Q:" 白杨叶甲 " + ) + " 登录号$ -K$"Y + " " 登录号$K-^$ 印鼠客蚤 c $ ) " " 登录号$ -Q8 埃及伊蚊 7SV 的长度为 ) MA 在 7SV中有典型的加 -尾采尾信号 --S---可见 $ MA 长度的 X. + " 登录号$ mxx $))$) 切叶蚁 K Q 用 bkq" S b O 上的在线工具 Q4-:S" M $ $ + " 登录号$-dK"" 非洲爪蟾. " $+ " 登录号$ DL )"" 红火蚁将翻译所得的蛋白质 M O M c $ ) + " 登录号$bXx$Y" $$ 种动物的氨基酸序列进行同源性比对分析后 " 图运序列进行同源性搜索结果发现粘虫与家蚕的 VX: 蛋白一致性高达 YZ 由此可判定该序列用 8DL-[ 软件构建了系统发育树 " 图结果表明粘虫与小菜蛾 VX: 同源性高达 YZ 与为粘虫 K7Q 基因的全长序列编码一个完整的 VX: 蛋白质序列基因序列已提交 L Q R 登进化对上其它 $ 种动物的 VX: 同源性在 )[YZ ]Y["Z之间从系统发育树上可以看出本文 by"$ 录号为 j 克隆的粘虫 K7Q 与小菜蛾的 K7Q 有非常近的亲缘关系 K :蛋白质结构和功能分析 X O " NNN 通过在线工具 X A A A O O 对由 db-序列 K:: 在粘虫脑胚后不同发育阶段的转录水推测的 VX: 蛋白质序列分析发现其理论分子量 " R 等电点为 [Y" X 软件为 "$[ 利用荧光定量 XKV研究 K7Q 在粘虫脑部胚后 $$ 个不同发育阶段的转录水平 " 图 ) 结果显 " A AM M A M A x O A A A xa O 分析该蛋白显示富示K7Q 在幼虫期表达水平随龄期的增加而增加龄期脑中相对于龄期脑中 K7Q 表达水平 -8X和含种类型多个特定功能位点包括 " 个 L8X依赖性蛋白激酶磷酸化位点 " Y$ ]Y$ 呈现出显著性增加在前蛹期 K7 基因表达量相对减少在蛹期 K7Q 表达量呈现出动态变 :+$ ]$$ 4S 个蛋白激酶 K磷酸化位点"" ]$:S_+Y ]Y)$:L_+$$ ]$$:^_+$ 化在蛹的前期 K7Q 表达量随日龄的增加呈现逐渐递增趋势在第 Y 天表达量达到最大随所呈现平

5 期 db-的克隆和表达分析李柯$粘虫核糖体蛋白 : ) SV序列及推导的氨基酸序列图 :粘虫 : 基因全长 + :V ) ) 4 W )+ 4) $ )" ) ) : SV L8X依赖起始密码子" -SL 和终止密码子" S-- 用 ) 和 ) 标示+加尾信号 --S---用标示+ -8X和性蛋白激酶磷酸化位点用 ) 标示+蛋白激酶 K磷酸化位点用酰胺化作用位点用 ) 标示+酪蛋白激酶磷酸化位点用 -) 标示+ ) 标示+核糖体蛋白 : 蛋白家族特征位点用阴影部分标示 S C A C O R C O R C ) C ) + A C --S--- O R C + -8X C L8X C A C A R O R C C N N ) + A R KA A O R C )+ R A A O R C N - )+ O C O R C N )+ M O A :$ C C 递减趋势 :讨论母细胞重新激活而增殖形成组成成虫脑的大多数 R C S O $Y+ X R A C 次级神经元" Q S $$ 伴随着神经母细胞的增殖次级 XKV和 V-KD技术克隆获得本研究运用 VS 神经元形成初级神经束并延伸进入相应的髓质 db-序列其中包了粘虫 K7Q 全长为 )" MA 的区直到完成变态次级神经元才完成它的突触和 7SV) MA 的 7VS和 MA 的括 " MA 的 R + $)+ : + "+ 形态发生" Q db-序列演绎的蛋开放阅读框基于 K7Q 的 S O + "+ + " 总而 X 白质序列长 $ 个氨基酸在 bkq进行 Q 言之这些研究结果表明神经母细胞增殖和分化搜索结果显示粘虫 VX: 与其它动物的 VX: 一随龄期的增加而增加在末龄期到达最高峰+ 在蛹样都属核糖体蛋白 :蛋白家族期脑重建主要表现为不同的神经髓质区的分化完全变态昆虫胚后发育脑重建在时间和空间上是个高度复杂过程在幼虫期大多数脑神经位置的定位及体积的增大这些髓质区主要包 O C 蕈形体 " 括$ 附髓 "

"+ do + "+ : + "+ -N R + "Y+ L C V "Y+ + "+ ^ + "$ K7Q 在脑胚后不同发育阶段的表达量呈现动态变化在幼虫期表达水平随龄期的增加而增加在蛹的前期 K7Q 表达量随日龄的增图 C:: 在粘虫脑部胚后个不同发育阶段的表达 + C :D U$ )$ ) 4 4-8 R D ): DV - 4 :: + + $) -

6 )Y $ ) $+ -. $ 应用昆虫学报 " 卷图 A:粘虫 DL 氨基酸序列与其他 O 种不同物种的比对 + A: ) 4 W + )DL ) + 4) $ )" ) ). ) ) )+ ) O ) ) + 图 :基于 DL 氨基酸序列的粘虫和其他 O 种不同物种的系统发育树 + :8 )+ )DL ) + 4) $ )" ) ) 4O ) ) + O OM C 触角叶 " M 中 M C 和视叶 " A 心复合体 " M 这些髓质区体积在蛹期的前期急剧增加 C C C DCN C 在蛹期的后期结束增加 " b $)+ Q c + "+ do + "+ : + "+ -N R + "Y+ L C V "Y+ + "+ ^ + "$ K7Q 在脑胚后不同发育阶段的表达量呈现动态变化在幼虫期表达水平随龄期的增加而增加在蛹的前期 K7Q 表达量随日龄的增图 C:: 在粘虫脑部胚后个不同发育阶段的表达 + C :D U$ )$ ) R D ): DV - 4 :: + + $) - 8) 4 )$ 4 龄幼虫+4 龄幼虫+ 4)) 龄幼虫+XX前蛹+X新蛹化的蛹+X"" 日龄蛹+X 日龄蛹+X)) 日龄蛹+XYY 日龄蛹+X$$ 日龄蛹+-新羽化的成虫+图中数值为平均值 {标准差" $ +不同小写英文字母表示差异显著" 7 [ 4[ + 4[ + 4)[ + XXA AAA "" C A AA + X[ C C AA + X"[" C C AA + X[ C C AA + X)[ + XYY C C AA + X$[$ C C ) C C AA AA + -[ C C C - A N M d O {:D" $ ^ ON C C C [

7 期 ) db-的克隆和表达分析李柯$粘虫核糖体蛋白 : 加呈现逐渐递增趋势在第 Y 天表达量达到最大随后呈现递减趋势这种动态变化趋势与脑重建 L K V "Y[ K A A OM 过程脑细胞行为一致因此作者推测 K7Q 可能参与脑胚后发育重建 K7Q 在脑重建中的具体功 O M M. " ) ) N 能还需要进一步去证实本实验首次成功获得了粘虫 K7Q 的全长 db-和建立了 K7Q 在粘虫脑部胚后发育的表达模式是对昆虫核糖体蛋白研究的重要补充为今后更多核糖体蛋白序列的获得及相关功能研究提供了基础资料 C AO A O C C ") $)Y[ ^ : O8 S RS _ O b $[L C c M O A VX4$- C VX:$$ O O C C O O $ " "" $$[ ^ Q_ d Q U ^ K U^ "[K C c A C A M O A K: 致谢感谢西北农林科技大学无公害农药研究中心张兴教授对粘虫虫源的惠赠 O + + $+ ). + 7" " 4 + $ + ") " $Y[ ^ Dj CQ Dj C: : j "$[ d C d C O O A M C AO A O 参考文献 D +$) + +L $ G ) $[ - S 4 8 : j 8 A - $[SO b Q O j Q Q V ^ "[ M O A : C $ C X OM C AO OA M "A"[ $ $) "" $""[ " + M G ) +N $ $ N -N RS 4 : _ 4 S "Y[. C A OM C AO C [ 4_ ml: ^ 4 U8 "$[8 M N " + G ) "Y " $ $ $" C A t8 $[ " $ " R " 4 A C A $b C Q R V Q M R j _ O j Q $)[ X OM.) $ "" $$"$[ O M b C C V^ DCN Cj : $)[ X OM M N O +$) + + :A C OA C AO O M N+$+) )4 G ) " "" $""Y[ A A Q R V S O j $Y[X OM N $ $)" " $$"$[ X R A - S L8 $$[S A OM + + Kb: M N O +$) M C N " + b M C A C +$ 4+ N $ $$$ "$ $YY[ O O A G ) " " $Y[ Q c ^ V do 8 K O C8 X S "[ K M A OM C AO N " +$ OA A C M j ^K : j D "[ b A : X-. d M. " ^ O A O C C A OM C AO +. " "$ $))$[ O A G G ) " "$ $Y[ S O j : AA^ : A C d Od "[ Q RK4 L ")[ A M c $ 8CO" C d AO C A M C "$ " $$[ K d U U 48 4 V M D ^ Kb: N " +N $ $$ "" $$) $Y[ d ^ U V "[V M O A : $[ K C T Xj O C A 8d8" $ M C b A M O A A [) 8d8" M A A C A 8$ 4 $ ") " $"[ do _ b K ^ T "[D C AO N " + M $ T X A OM A dd C G ) " $$)"[ $ $ "" $$$[ L K 4 L R - $[: C O OO M O A Q O "$$ $" $[ U X R8T 4 Q C O 4 : j j c m X K "[V M O A : M

8 )Y $ ) $+ -. $ 应用昆虫学报 " C M 8d8"[ " $$)")[ 侯怡铃伍春莲侯万儒郝彦哲张田 "[大熊猫核卷 ") $$Y$[ 周奕华侯丙凯石东乔肖宇红石锐胡赞民陈正糖体蛋白亚基 VX: 基因的克隆及序列分析第三军医 A $" 基因 A 基因和 CQ 华 "$[杨树叶绿体大学学报 $ "$Y $$$[ 基因片段的克隆及序列分析中国生物化学与分子生 - 基因李柯阴环奚耕思廉振民 "$[粘虫 db-的克隆序列分析及表达量检测昆虫知识物学报$ " $)))$)[

生物技术通报相关载体及试剂动物组织及细胞培养总的提取及反转录内蒙古白绒山羊基因的分子克隆生物信息学分析

生物技术通报相关载体及试剂动物组织及细胞培养总的提取及反转录内蒙古白绒山羊基因的分子克隆生物信息学分析生物技术通报鲍文蕾杨娇馥李彬刘俊娥王潇郭旭东王志钢侯鑫刘东军旨在克隆内蒙古白绒山羊血管内皮生长因子基因并分析其基本表达模式采用技术克隆基因将得到的基因序列及其编码的氨基酸序列进行生物信息学分析利用半定量

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