上海农业学报 Ａ Ａ Ｓ ＤＯＩ ｊ 文章编号 种蛋感染蜡状芽孢杆菌的分离鉴定及其药敏试验 李 红 易建中 刘成倩 严华祥 上海市农业科学院畜牧兽医研究所上海 上海佳牧生物制品有限公司上海 摘 日龄鸡胚中细菌的存在情况及其性 要通过生化试验 序列分析和药敏试验等方法研究了 比 对 确 定 分 离 的 个 菌 株 均 为 蜡 状 芽 孢 杆 菌与 Ｇ Ｂ ｋ上 登 录 的 蜡 状 芽 孢 杆 菌 表明经 ＮＣＢＩＢ ＫＦ Ｊ Ｘ ＫＦ 菌株高度同源同源性高达 株分离菌株间也高度同源 药敏 株蜡状芽孢杆菌对环丙沙星 麦迪霉素 丁胺卡那 红霉素 新霉素 卡那霉素 庆大霉素 诺氟沙 试验发现 星 氧氟沙星对多黏霉素 Ｂ 复方新诺明 青霉素 氨苄西林 头孢氨苄 头孢拉定具有性 Ｓ ＲＮＡ 药敏试验 关键词鸡胚 蜡状芽孢杆菌 分离鉴定 中图分类号Ｓ 文献标识码Ａ Ｉ Ｂ ＬＩＨ ＹＩＪ ｚ ＬＩ ＵＣ ｑ ＹＡＮＨ Ｉ Ａ ｍ Ｈ Ｖ Ｓ Ｓ Ａ ｍ Ａ Ｓ Ｓ Ｃ Ｓ Ｊ ｍｂ Ｐ Ｃ Ｌ ｍ ＳＣ Ａ Ｔ ｋ ｍ ｗ ｑ Ｔ ｗ ｗ ｍ Ｂ ＮＣＢＩＢ ｍ ｗ ＫＦ Ｊ Ｘ ＫＦ Ｇ Ｂ ｋ ｗ ｍ ｗ ｐ ｍ ｍ Ｄ ｗ Ｂ ｍ ｋ ｍ ｍ ｋ ｍ ｍ ｐ ｍ Ｂ ｍ ｚ ｐ Ｋ ｗ Ｃ ｋ ｍ Ｂ Ｉ Ｓ ＲＮＡ Ｄ 影响种蛋孵化率除了遗传因素还有种蛋因素如蛋的破损与畸形 蛋壳的清洁消毒等其中细菌性因 素是影响孵化率的重要因素之一 传统的细菌鉴定方法是对细菌进行纯培养然后从形态特征 生化特 性及免疫学特性等方面进行鉴定 细菌作为单细胞生物具有多态性易变异导致某些生化反应不稳 定且受临床抗生素使用的影响有些菌株仅依靠形态和生化反应难以准确鉴定 在利用传统方法鉴 定细菌时经常遇到一些不能鉴定到种的菌株而这些菌株对临床诊断或流行病学研究具有重要意义 因 ＲＮＡ基因是细菌染色体上与编码 ＲＮＡ相对应的 ＤＮＡ 此需要借助其他方法对其进行准确鉴定 Ｓ ｋ存在于所有原核微生物中但不存在于真核生物及病毒中在进化过程中高度保守被 序列长约 称为细菌的 分子化石 可用于研究不同生物物种间的亲缘关系 同时其保守性又是相对的在保守区 存在着 个变异区 Ｖ 不同的科 属 种间均有不同程度的差异故又可作为细菌分类鉴定的 靶分子 收稿日期 ＹＦ 基金项目上海市科技人才计划 女博士助理研究员主要从事动物分子生物学和免疫学的研究 Ｔ Ｅ ｍ 作者简介李红 ｍ 男博士研究员研究方向蛋鸡育种与鸡蛋安全 Ｔ Ｅ ｍ ｑ ｑ ｍ 通信作者严华祥
李红等种蛋感染蜡状芽孢杆菌的分离鉴定及其药敏试验 目前临床上通常采用形态观察和生化试验鉴定病原细菌较少采用遗传学分析法 本研究运用 Ｓ ＲＮＡ基因序列分析鉴定 日龄鸡胚中细菌的存在情况及其性以期为鸡场的检疫及净化工作提供 参考 材料与方法 材料 Ｔ ＴＰ Ｒ 感受 鸡胚采集于上海家禽育种有限公司种鸡场 大肠杆菌 Ｅ 态细胞购于北京全式金生物技术有限公司 主要试剂 ＰＣＲ纯化试剂盒 克隆载体 ｐ ＥＡＳ Ｙ Ｔ均购自北京全式金生物技术有限公司 ＥＴ ｑｄｎａ聚合酶购 Ｋ Ｒ生物工程公司 药敏片购于杭州天和微生物试剂有限公司 自 Ｔ 样品的处理 然后用无菌酒精棉球擦拭整 在超净工作台上将采集的 日龄鸡胚 枚放于紫外灯下杀菌 ｍ 个蛋壳用无菌的镊子打开鸡蛋外壳用灭菌的棉拭子蘸取鸡胚内容物将棉拭子放入缓冲蛋白胨水内进 行增菌培养 有 个鸡胚长菌取菌液于 ＬＢ平板上划线培养获取单菌落 Ｓ ＲＮＡＰＣＲ扩增与测序 ＰＣＲ反应的通用引物序列参照文献 目的片段长为 ｐ 引物由上海捷瑞生物技术有限公 ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ Ｒ ＧＧＴＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ 司合 成序 列 如 下Ｆ ＰＣＲ扩增体系为 μｌ引物浓度为 μｍ ｑ聚合酶浓度为 Ｕ 预变 μｌｔ μｌ 反应程序 变性 退火 延伸 ｍ 个循环 延伸 ｍ 利用 ＰＣＲ回收 性ｍ Ｔ克隆载体利用 Ｆ通用引物 ＭＦ ｗ Ｐ ｍ 试剂盒回收 ＰＣＲ产物将回收产物连入 ｐｅａｓｙ ＡＣＴＧＧＣＣＧＴＣＧＴＴＴＴＡＣ Ｍ Ｒ Ｐ ｍ ＧＴＣＡＴＡＧＣＴＧＴＴＴＣＣＴＧ 筛选阳性菌落进行测序 序列分析 ｐ ｗｗｗ ｍ 的 Ｂ 在 线 软 件选 择 Ｎ 将测序结 果 导 入 ＮＣＢＩ网 站 Ｃ 数据库运行 Ｂ 程序获取与该 Ｓ ＲＮＡ基因序列同源的序列和对应的细菌名称 判定为同属 相似度在 判定 相似度大于 的细菌判定为同种细菌相似度介于 为同科 生化试验 取菌液分别接种到葡萄糖 麦芽糖 半乳糖 蔗糖 乳糖 木糖 阿拉伯糖 甘露醇 果糖培养基中进行 Ｐ斜面 葡萄糖蛋白胨水 蛋白胨水 硝酸盐和淀粉培养基进行生化特性测定接种 糖发酵试验 接种到 ＭＳ 温箱培养 观察试验 后放入 药敏试验 对鸡胚中检出的菌采用纸片扩散法进行药敏试验选择常用抗菌药物相对应的药敏纸片 按照中华 Ｔ 对进行判断 人民共和国卫生行业标准 ＷＳ 与分析 鸡胚内容物的培养 个 日龄鸡胚打开后发现有 个鸡胚已经死 后发现 亡 将鸡胚内容物放入 进行增菌培养 个鸡胚中有 个鸡胚 Ａ Ｂ Ｃ Ｄ Ｅ 有细菌生长繁殖 其中 个为死亡鸡胚 有菌的鸡胚划线获取单菌落每 ++ +++ +++ +++ + + ++ 个平板分别挑取 个单菌落进行 ＰＣＲ鉴定 如图 所 号为阳性菌落 Ｂ鸡胚中 号为阳性 示Ａ鸡胚中 为阳性 菌落 Ｃ鸡胚中 号为阳性菌落 Ｄ鸡胚中 为阳性菌落 Ａ Ｂ Ｃ Ｄ Ｅ鸡胚中 菌落 Ｅ鸡胚中,-,-.0,123.4 图 鸡胚培养液 ＰＣＲ检测 Ｆ ＰＣＲ ｋ ｍ
上 海 农 业 学 报 的所谓非阳性菌落似乎也有条带存在以下可能可能是邻近阳性孔样品检测液流入导致微弱条带 可能 是含菌量太低扩增后条带比较弱 为了避免假阳性以及减少检测成本ＰＣＲ弱阳性的没有进行载体构 建以及后续的测序工作 Ｓ ＲＮＡＰＣＲ扩增与测序 Ｓ ＲＮＡ通用引物对单菌落进行 ＰＣＲ扩增鉴定在 ｐ左右扩增出特异性带利用 ＰＣＲ 利用 Ｙ Ｔ克隆载体利用 Ｆ通用引物筛选阳性菌落 Ａ鸡胚 回收试剂盒回收 ＰＣＲ产物回收产物连入 ｐｅａｓ 菌液 Ｂ鸡胚中 号菌液 Ｃ鸡胚 号菌液 Ｄ鸡胚中 号菌液 Ｅ鸡胚中 号菌液 进 中 ｐ ｗｗｗ ｍ 的 Ｂ 在线软件选择 Ｎ 行测序 将测序导入 ＮＣＢＩ网站 Ｃ 数据库运行 Ｂ 程序获取与该 Ｓ ＲＮＡ基因序列同源的序列和对应的细菌名称 软件与 ＮＣＢＩ中同源性最高的蜡状芽 比对显示与蜡状芽孢杆菌同源性最高 将序列导入 ＤＮＡ Ｘ ＫＦ ＫＦ 序列进行比对如图 所示 孢杆菌 Ｊ 4 0 3 256 7 25 5 8,. 0 1 23 9: 9: ;: <:,:,:,: =: =: =: > @A @A 图 鸡胚菌与 株蜡状芽孢杆菌序列比对 Ｆ Ｓ ｑ ｋ ｍ Ｂ 比对细菌 Ｓ ＲＮＡ基因序列同源性 软件分析得出 个菌株的 Ｓ ＲＮＡ基因序列同源性在 左右 将序列导 将序列导入 ＤＮＡｍ Ｘ软件在菜单中选择 Ａ ｍ ＤＣ Ａ ｍ 得到细菌的 Ｓ ＲＮＡ基因序列同源性 入 Ｃ Ｂ Ｃ Ｄ Ｅ 序列比对如图 所示其中序列不一致的位置 比对 Ａ 和 Ｂ 相同因此序列同源性比对时只选择 Ｂ 进行比对 标在括号中注出 测序 Ｂ 图 鸡胚内细菌核苷酸同源性比对 Ｆ Ｎ ｍ ｋ ｍ 分离培养 蜡状芽孢杆菌在有氧或无氧的条件下均能生长无氧比有氧生长好 菌落形态在普通琼脂平板
李红等种蛋感染蜡状芽孢杆菌的分离鉴定及其药敏试验 培养 可形成圆形或近似圆形 质地软 培养基上 无色素 稍有光泽的白色菌落直径 ｍｍ 个体形态 将分离培养和纯培养的培养基制片作革兰氏染色可见单个 散在或形成 链状排列有偏端芽孢菌体两端钝圆为革 兰氏阳性较大的短杆状菌落 图 液体培养性状 蜡状芽孢 杆 菌 在 液 体 培 养 基 中 呈 均 匀 分 化 混 浊 生 长培 养 后形成小块状沉淀沉于管底振摇不散 生化试验 蜡状芽孢杆菌能分解葡萄糖 麦芽糖 半乳糖 蔗糖 木 糖 阿拉伯糖 甘露醇 果糖并产酸不能分解乳糖 硝酸盐还 原试验 甲基红试验 淀粉水解酶试验 接触酶试验 ＶＰ均为 倍 图 蜡状芽孢杆菌镜检 Ｆ Ｍ ｐ ｍ Ｂ ｍ 阳性吲哚试验为阴性 表 表 蜡状芽孢杆菌生化试验测定 Ｔ Ｂ ｍ Ｂ 葡糖糖 硝酸盐 甘露醇 接触酶 ＶＰ 半乳糖 麦芽糖 淀粉酶 蔗糖 吲哚 阿拉伯糖 甲基红 果糖 乳糖 木糖 药敏试验 鸡胚中分离的菌为蜡状芽孢杆菌对环丙沙星 麦迪霉素 丁胺卡那 红霉素 新霉素 卡那霉素 庆大 霉素 诺氟沙星 氧氟沙星但对多黏霉素 Ｂ 复方新诺明 青霉素 氨苄西林 头孢氨苄 头孢拉定具有 性 表 不同抗生素对蜡状芽孢杆菌的程度 Ｔ Ｒ Ｂ ｍｍ 抑菌圈直径 程度 诺氟沙星 ｍｍ 抑菌圈直径 程度 环丙沙星 麦迪霉素 氧氟沙星 丁胺卡那 多黏霉素 Ｂ 红霉素 复方新诺明 新霉素 青霉素 卡那霉素 氨苄西林 庆大霉素 头孢氨苄 四环素 中介 头孢拉定 抗生素 抗生素 结论与讨论 近 年来抗生素 激素 防腐剂等药物性饲料添加剂在动物饲养中的广泛应用有力地促进了动物 饲养业的发展但近年来研究发现药物性添加剂的普遍应用给人们带来了难以克服的弊端 美国食品 种安全的益生菌主要为乳酸杆菌 芽孢杆菌酵母菌等 蜡状芽孢杆菌作为 和药物管理局公布了 饲料添加剂已经在多种动物饲养实验中应用 不论在畜禽养殖业还是水产养殖业中的使用都取得了 乐观的效果 为搞清楚本研究中蜡状芽孢杆菌是否为有益蜡状芽孢杆菌下一步可开展培养基适应 性 温度适应性 耐酸碱性 代谢产物测定以及动物试验 若其为优良的蜡状芽孢杆菌可以考虑作为饲 料添加剂替代激素 抗生素 防腐剂 蜡状芽孢杆菌是广泛分布于土壤 水 空气 植物 饲料和各种食品的好气 中温 产芽孢的杆菌 该 该菌具有耐 菌常处于孢子和休眠状态下极易污染食物 一般不致病但有的菌株可引起食物中毒 耐酸碱 耐挤压和耐受颗粒饲料加工的影响等特点因此在饲料中可长期存在一旦有致 高温 病菌株污染饲料其孢子进入肠道后便能迅速在肠道上部复活 复活率接近 对畜禽的健康构 成潜在威胁 最近研究表明该菌在自然情况下可引起牛的乳房炎 骆驼的 脓疱病 犬和猪的腹泻
上海农业学报 91 等 ; 在特定的条件下也可引起人急性发作的呕吐综合征及与其他食物引起的慢性腹泻综合征 [11] 蜡状芽孢杆菌污染的饲料和各类食品大多无腐败变质现象, 在组织和感官鉴定时, 除米饭有时微发粘或入口不爽外, 大多数食品均表现为完全正常的感官性状, 往往易被人们所忽视 本研究检测到鸡胚中存在蜡状芽孢杆菌, 鸡胚的死亡是否是蜡状芽孢杆菌引起, 还有待于进一步确证 鸡胚中蜡状芽孢杆菌的存在是饲料中存在的, 还是外界污染造成的, 或是鸡肠道内存在蜡状芽孢杆菌而导致鸡蛋的污染, 还有待于进一步的研究 细菌性因素是影响孵化率的一个重要因素, 因此, 要做好鸡场的检疫及净化工作 科学合理地用药是减少细菌产生性最有效的方法 所以, 应尽量提高对疾病诊断的准确率, 减少不必要的用药, 并严格用药剂量和疗程 ; 加强对细菌性的监测, 为大多数养鸡场 户 的用药提供科学依据 参考文献 [1] 张守印, 李振军, 张集, 等.16SrRNA 基因序列分析在非典型菌株鉴定中的应用 [J]. 中国卫生检验杂志,2008,184:616 617. [2]GRAYM W,SAONKOFFD,CEDERGRENRJ.Ontheevolutionarydescentoforganismsandorganeles:aglobalphylogenybasedonahighly conservedstructuralcoreinsmalsubunitribosomalrna[j].nucleicacidsres,1984,1214:5837 5852. [3]BOSSHARDPP,ZBINDENR,ABELSS,etal.16SrRNAgenesequencingversustheAPI20NEsystemandtheVITEK2ID GNBcardfor identificationofnonfermentinggramnegativebacteriaintheclinicallaboratory[j].jclinmicrobiol,2006,444:1359 1366. [4]FOXGE,MAGRUM LJ,BALCHW E,etal.Clasificationofmethanogenicbacteriaby16SribosomalRNAcharacterization[J].ProcNatl AcadSciUSA,1977,7410:4537 4541. [5] 王丽娟. 益生菌的研究及其应用进展 [J]. 饲料博览,1999,111:15 18. [6] 黄丽彬, 陈有荣, 齐凤兰. 蜡状芽孢杆菌在饲料中的应用 [J]. 粮食与饲料工业,20019:32 33. [7] 董永胜, 许军. 甜高粱秸秆固态发酵生产燃料乙醇的工艺研究 [J]. 酿酒,2007,344:49 51. [8] 杨佐毅, 李理, 刘冬梅, 等. 白腐乳中蜡状芽孢杆菌的分离与鉴定 [J]. 中国酿造,200817:39 47. [9] 黄丽彬, 陈有荣, 齐凤, 等. 蜡状芽孢杆菌在饲料中的应用 [J]. 粮食与饲料工业,20019:32 33. [10] 魏建功, 王梅岩, 蔡妙英, 等. 蜡状芽孢杆菌对骆驼的致病性的研究 [J]. 中国兽医杂志,1990,164:10 11. [11]BBI.InternationnalStatusoflargescaleproductionanduseoffuelethanolininBrazil[C].BeijingWorldFuelEthanolCongres,2001. 责任编辑 : 闫其涛