中国生物工程杂志! 蛋白单克隆抗体的制备及其表征 李 孜 包欣晨 高向东 陆小冬 徐 晨 中国药科大学生命科学与技术学院 南京 北京三元基因工程有限公司 北京 摘要 目的 用 () 蛋白免疫小鼠 获得 () 特异性单克隆抗体 为 () 的含量测定提供基础 方法 通过全基因合成的方法获得目的基因序列 转化大肠杆菌 * 细胞诱导 +," () 及 () 蛋白表达 纯化后用作抗原免疫小鼠 取脾融合 筛选稳定分泌抗体的阳性细胞株 制备并纯化单抗 通过 )-)".(/00*1)(, ' 等方法进行检测 结果 体外高效表达 () 蛋白 并成功制备特异性单克隆抗体 效价在 # * 以上 亲和常数为! 2 * 结论 获得高亲和力 () 单克隆抗体 为其含量的检测奠定了基础 关键词 () 细胞融合 单克隆抗体中图分类号 32 乙型肝炎病毒,4'%,+5 感染是全球性的重大疾病问题 每年有 # 6 万人死于 +5 感染引起的慢性肝炎 肝硬化和肝癌等 178" 具有抗病毒及免疫调节双重作用 是目前 +5 感染的一线治疗药物 慢性肝炎作为一种慢性疾病 在治疗上一般疗程较长 费用较高 然而临床上只有 #9 6#9 的慢性肝炎患者使用 178 治疗有效 如何在早期预测治疗疗效 确定干扰素治疗的适宜对象 正确指导临床用药就显得十分关键 # 寡腺苷酸合成酶 # " :,, () 是 ; ' 等在干扰素 ' '178 处理过的细胞提取液中发现的酶 干扰素处理人细胞 主要诱导产生 () - ()! - 和 () - 种类型 () 蛋白 " 在 178 和细胞膜上的受体作用下 细胞合成大量无活性的 () 当有双链 8( 或者具有微二级结构的单链 8( 存在时 () 被激活而具有催化活性 它以 (. 为底物 催化合成 "# 寡腺苷酸 "#( # "#( 特异性结合并激活核酸内切酶 8(, * 降解病毒的 8( 及细胞的 8( 从而发挥抗病毒的作用 临床研究表明通过在用药前后检测 () 活性在一定程度上可以预测患者使用 178 治疗的疗效 从而指导临床合理用药! 收稿日期 "#" 修回日期 "!" 通讯作者 电子信箱 $% &' ' 目前 () 的活性检测多采用放射免疫的方法 存在检测方法繁琐 费时 花费高的缺点 在临床上普遍应用有一定的困难 采用 0*1)( 的方法 通过检测 () 含量水平而推测其活性从而指导临床用药可能为解决这一困难提供便利 本研究通过原核表达快速制备免疫抗原 采用经典的杂交瘤技术制备 () 特异性单克隆抗体 为 () 的含量检测提供研究基础 材料与方法 材 料. 引物 上游引物 # "/( ( //( / /(((//((" 下划线部分为 1 酶切位点 下游引物 # "//(( ( / / /( / //(//" 下划线部分为 1 酶切位点 表达质粒 0 " < 由北京三元基因工程有限公司保存 * -0 *,) 感受态细胞 -8( 凝胶回收试剂盒 羊抗鼠 1 /"+. 可溶型单组份 = 底物溶液 增强型 +."-( 底物显色试剂盒购自天根生化科技 北京 有限公司 -8( 连接酶 限制性核酸内切酶购自 ; 公司 =%, () 购自 ( 公司 1) " =%, = ( : 1,, 购自 ) 公司 清洁级 (* 雌性小鼠 小鼠骨髓瘤细胞 ). "( 细胞购自中国药品生物制品检定所
2 中国生物工程杂志 5 8 方 法 重组质粒的构建及蛋白的表达 纯化和检测 () 基因序列来源于 81 数据库 在其 8 端添加 个 +, 的标签和 05 蛋白酶切位点 由生工生物工程有限公司 上海 全基因合成 总长度 0 " < 质粒为表达载体 构建 0 " "+," () 表达载体. 合成不含 +, 标签的 () 基因片段 构建 0 " " () 表达载体 转化入大肠杆菌 复合自动 2 诱导培养基诱导表达 +," () 蛋白使用金属螯合层析结合切胶纯化方法制备 用于动物免疫 () 蛋白使用强阳离子交换 ). 层析纯化 用于阳性细胞株的筛选 +, 单抗对 +," () 及 () 蛋白进行, ' 鉴定 动物免疫及细胞融合 共免疫 只 (* 雌性小鼠 按照 # 只的剂量背部皮下注射进行初次免疫 其后间隔 6 周按照 # 6# 只的剂量加强免疫 初次免疫周后小鼠尾静脉取血用 0*1)( 方法检测血清效价 取未免疫鼠血清作为阳性筛选阴性对照血清 取腹腔巨噬细胞为饲养细胞 免疫鼠血清用于阳性筛选阳性对照血清 加强免疫天后断颈处死 取脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞 ). "( 融合 融合后细胞置!>#9 培养箱内培养 阳性细胞株筛选 抗体的制备与纯化 阳性细胞株的筛选 每天观察 孔板细胞 记录和标记有细胞群落出现的孔 筛选并标记阳性孔 以有限稀释的方式 将强阳性的杂交瘤细胞进行亚克隆化 直至得到稳定的强阳性的单克隆细胞株 扩大培养后制备小鼠腹水及冻存 小鼠腹水制备及抗体纯化 将对数生长期状态圆亮饱满的杂交瘤细胞 轻柔吹打收集 致敏小鼠下腹部腹腔注射制备腹水! 6 天后 小鼠腹部明显膨大后 收集腹水 采用辛酸 硫酸铵法纯化腹水 用紫外分光光度法测定纯化后的单克隆抗体的蛋白浓度 纯化出的单抗分装后于 2> 保存备用 抗体的性质及表征 抗体的亚型鉴定 应用 1) " =%, = ( : 1,, 检测单克隆抗体的亚型 单克隆抗体的, ' 鉴定 取 +," () 及 () 蛋白进行 )-)".(/0 按? # 稀释单抗 加入羊抗鼠 1 /"+. 应用增强型 +."-( 底物显色试剂盒显色 抗体的纯度及分子质量检测 通过 )-)".(/0 法测定 单克隆抗体的效价检测 间接 0*1)( 法检测单克隆抗体的效价 对比检测纯化 "# 抗体及购买的鼠源单抗 # 抗体与固定化抗原的亲和常数按照 等提供的方法确定 结 果 及 蛋白的表达及纯化 重组质粒经测序正确后 转化入大肠杆菌经诱导表达 主要以包涵体的形式表达 +," () 分子量大约为 - () 分子量大约为 - 包涵体中目的蛋白含量占 9 以上 如图 +," () 的表达量约为 * () 的表达量约为 # * 纯化后 经软件分析 纯度均达到 9 以上 如图, ' 结果表明 +," () 能特异性与 +, 单抗结合 而 () 不能结合 如图 图 蛋白表达 纯化及检测! "# $%&' "#'#!!# " "% )-)".(/0,, $ ', +," () : () ' * -0 @%, : ' * -0 ', : 0 " "+," () @% :% ' * -0 ', : 0 " "+," () @ :% ' * -0 ', : 0 " " () @%:% # ' * -0 ', : 0 " " () @ :% 1 %, : +," ()! 1 %, : () )-)".(/0,, %' : +," () : (), ',, +," () : () 杂交瘤细胞制备及融合率和阳性率 取纯化后的 +," () 按照计划进行免疫 免疫后 (* 雌鼠脾细胞和 ). 小鼠骨髓瘤细胞融合后 块 孔板! 孔出现融合细胞 融合率为 9 以上 经 0*1)( 方法初步筛选 阳性孔有 个 阳性率为
李 孜等 () 蛋白单克隆抗体的制备及其表征 2 9 之后经过次亚克隆 筛选出 株能够稳定分泌单抗的杂交瘤细胞株 其中阳性最强的一株命名为 "# 抗体的亚型鉴定 取细胞培养上清 倍稀释后 经 1) " =%, = ( : 1,, 检测单克隆抗体的亚型 结果见表 吸光度数据显示 " 为 1 / 亚型 其他 # 株均为 1 / 亚型 表 ( 株单克隆抗体细胞株亚型测定 )'! $ *!!# %&' "#"% +!(,"#"& "#' '# " * 克隆编号 亚型 ( "# ( "!" " " "# 1 /! #!2!# 1 / # 2 1 /! 1 / #! 1 ( #! #2 1 = 2 # - 抗体的纯化及纯度和分子量检测 取对数生长期状态圆亮饱满的 "# 杂交瘤细胞 制备小鼠腹水 采用辛酸 硫酸铵方法纯化 紫外分光光度法测定蛋白浓度为!.) 调整抗体浓度为 )-)".(/0 对纯化的抗体蛋白进行纯度和分子量分析 电泳结果显示 抗体蛋白经还原电泳呈现清晰的两条带 其中重链约 # - 轻链约为 - 非还原电泳抗体分子大小约为 # - 经图像软件分析 其纯度可达 9 以上 结果见图 可以满足免疫分析的需要 图.- / 纯化抗体的 0 1 分析 0 1 '#' * "%$%!.- / '# " * :% : "# 8"' :% : "# / 抗体的!!# " 鉴定 +," () 和 () 蛋白经 )-)".(/0 转膜 一抗孵育 二抗孵育后显色显示 如图所示 其中 为 结果 为凝胶对照 +," () 和 () 蛋白均可以和单抗 "# 特异性结合 图 单克隆抗体!!# " 检测!!# " '#' * "%,"#"& "#' '# " *, ',, +," ()+ : () )-)".(/0,, +," ()+ : () ( 抗体效价测定纯化后的 "# 抗体及购买的 ( 鼠源单抗 初始浓度均为 系列稀释后 测定吸光度值 得稀释曲线 图 以吸光度值较阴性对照高 为阳性标准 计算 "# 抗体效价为 # # * 购买 ( 抗体效价为 * 图 -.- / 抗体及 &', 抗体稀释曲线 -0 $ "#&$! "% &.- / '# & &', 抗体亲和常数测定按照 的方法得出抗体稀释曲线 图 # 计算亲和常数为! 2 * 表明抗原抗体的结合力为中等以上强度 抗原 " 抗体结合物可以较稳定地存在 该抗体可以应用于免疫分析测定中 讨 论 目前我国有乙肝患者 万 对慢性 +5 感染 病毒复制指标持续阳性者 抗病毒治疗是一项重要措施 干扰素具有抗病毒及免疫调节双重作用 是目前 +5 感染的一线治疗药物 然而 使用 178" 治疗病毒性肝炎是一个长期用药的过程 不同患者对 178" 治疗的反应个体差异很大 临床上只有 #9 6#9 的慢
中国生物工程杂志 5 8 图 / 不同抗原包被浓度时单克隆抗体的稀释曲线 / & $ "#&$! ' %!!# &"'! '#!#&"#&!# ' "# 性肝炎患者使用 178" 治疗有效 而且其疗效也和 178" 的剂量和疗程 以及患者的自身情况有关 因而 如何在用药早期确定 178 治疗的适宜对象 治疗用最佳剂量及疗程 实为正确指导临床用药的重要手段! 之一 安萍等研究了 例慢性乙型肝炎患者临床应用 178 后 观察用药前后 () 活性变化 结果提示我们通过在用药前后检测 () 活性可以预测患者使用 178 治疗的疗效 从而指导临床合理用药 吴诗品 等通过对 # 例慢性乙肝患者的研究发现 () 基础活性较高的患者对 178 反应性较弱 若治疗时 () 活性没有明显升高 则说明该患者对外源 178 反应低下 不适宜使用 178 治疗 若患者治疗前 () 活性较低 治疗后活性明显升高 说明患者使用 178 治疗可能会获得较好疗效 如果能在干扰素治疗的早期就可以预期疗效 不仅可以更快地为患者制定有效的治疗方案以免延误病情 而且减轻了可能经过长期用药无效的患者身体和经济上的负担 关于抗原的选择 +," () 与 () 相比 增加了 +, 标签 在纯化上有较大的优势 表达量也比不含标签的蛋白高很多 并且 +, 标签的免疫原性很低 基本不影响蛋白的免疫 且动物免疫需要较长的时间 在实验早期采用 +," () 作为免疫原 方便了抗原的制备 后期采用 () 蛋白来进行筛选 规避了筛选出的抗原可能为针对 +, 标签的缺点 同时 采用不同的免疫抗原和筛选抗原 进行交叉筛选 在一定程度上 增加了抗体的特异性 采用经典的单克隆抗体制备技术 利用抗原免疫动物 经过细胞融合 阳性克隆筛选 细胞株扩大培 养 动物体内诱生腹水等过程 最后获得了 () 的单克隆抗体 使用 "# 细胞株制备腹水制得的抗体效价达到 # # * 比购买的抗体效价高 # 倍以上 同时亲和力检测显示具有较高的亲和力 最终确定 株阳性细胞 其中有一株 " 亚型为 1 / 与其他 # 株 1 / 亚型不同 揭示了可能找到一对识别不同的抗原结合位点的单克隆抗体 为制备双抗夹心法检测 () 含量试剂盒提供了条件和基础 下一步计划将抗体酶标后 筛选配对抗体 摸索 0*1)( 检测条件 成功制备 () 检测试剂盒后 考察含量检测与活性之间的联系 为乙肝治疗的临床检测提供快速有效的手段 参考文献 ' 8, = 1 %,4'%, :,4'%, 8 41 % # # #" /, / % ' ' : %%' :', ',4' *4 '-, # # "# # A. +4, ( 7%': ' ', ' '":% : # " (,, : : % %, A 2! 2 2# "2#! +4, (/ )4 A ='B1 ' 'C " : " - ', "#(",, ' ' '"' : %, A 22 #" # +4, (/ 1 ' '":% : : :% ",': : 8(" 4 : C,, ', : # " :,,, A1 ' ', " # ) 4 ' + 5' % ',@ # " :,, : 8, *:%' ' ' 4' ',, A 5'! 2! "!! 安萍 秦绍明 杨开宇 等 慢性乙型肝炎病人注射 " 干扰素后 "#() 活性动态变化及其临床意义 天津医药 #!" (.3 ) =D ;D E = : A%' #!" 2 )%: '7.' ':% %":% :,, % %',.' 0$ '.%' #!" A - / 5, / =,%' : " 4 C %, A1 % = :, 2! "! "! 3 7 +%+ (",4'%, 4
李 孜等 () 蛋白单克隆抗体的制备及其表征 :,, ' %, '% % " ' '" " %, ' :.' 2 " 吴诗品 苏冬娜 + 患者.= 中 "#() 基础活性对 178 信号分子改变的影响 中华微生物学和免疫学杂志 " % ). )% - 8, A%' = ' : 1 % " 1" $& "#'#.+' '&! ' "#"%# "#"& "#' # " * *1 ( " /( ": * ": * ) :.' % 4 ', 8E E '".' / 0 ' 1 ' ' : E '& ( : (), : @, ' ' : % %, = :, (* @ ' %C : @ +," () $ ', : *, = : = ( @, ' ' : ': 1: %' : ' ',,, : = ( %' : @,%' : %,% : 4 ' ' 4 % 4,, @ )-)".(/0 0*1)(, ' : ' :,@ ' %, :,%, + $ ', () ' = ( : () @, : :, :, "# ' "#"= ( @,4 ' * :, "#"= ( @,!! * %, ' ' "#"= (,4 ' ' %' ' '4 : ()!* 2" () %,= : 广告索引 广州艾贝泰制药设备科技有限公司 封面 默克化工技术 上海 有限公司 封二 爱普拜斯应用生物系统贸易 上海 有限公司 彩 上海日泰医药设备工程有限公司 彩 上海森松制药设备工程有限公司 彩 镇江东方生物工程设备公司 彩 # 宝生物工程 大连 有限公司 彩 /0 @' 彩! 安倍医疗器械贸易 上海 有限公司 彩 2 ', 中彩 艾本德中国有限公司 中插 上海国强生化装备工程有限公司 中插 # 高科技与产业化 中彩 伯乐生命医学产品 上海 有限公司 封三 基因有限公司 封底