文章编号 中图分类号 文献标志码!" 银屑病患者 +. 和 +# 细胞及其相关细胞因子的表达 杨婷婷 王 青 李 志 朴 君 朴敬爱 大连市中心医院检验科 辽宁大连 辽宁师范大学生命科学学院 辽宁大连 摘要 目的 探讨银屑病患者辅助性 5 细胞 5 和调节性 55,0 细胞及其相关因子表达的临床意义 方法 用流式细胞术检测 例轻度和 例重度银屑病患者及 名健康对照者外周血中 5 和 5,0 细胞的比例 用逆转录聚合酶链反应 # 检测维甲酸相关孤儿受体 和抗人叉头状转录因子 '(4 & 的表达 用酶联免疫吸附试验 8 检测血浆 5 和 5,0 相关细胞因子白细胞介素 8 和转化生长因子 5 ' 的水平 结果 与健康对照组比较 银屑病患者组 5 细胞比例 的 & 水平及 8 的浓度显著上升 且重度组显著高于轻度组 而重度银屑病患者 5,0 细胞 '(4 & 和血浆 5 ' 浓度均较健康对照组和轻度组显著降低 结论 5 和 5,0 细胞的比例及其相关因子的表达可作为银屑病病情进展的标志 关键词 辅助性 5 细胞 调节性 5 细胞 银屑病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银屑病是一种常见的慢性炎症性皮肤病 主要表现为表皮角质细胞过度增生和炎症细胞浸润 其发病机制尚不明确 现常用外用药物或光线疗法控制其病情的发展 但不能根治且易复发 有关专家表示未来的治疗模式应为药物阻断致病过程中导致银屑病斑块形成的过程 这就迫切需要找到其发病的根本机制 关于其发病机制现认为 #% J 5 淋巴细胞免疫功能异常发挥着重要 作用 以前研究证实银屑病发病中存在辅助性 5 细胞 5,, ), 5 和 5 细胞平衡失调 且以 5 型反应为主 此后发现 除了 5 和 5 细胞 5 细胞亚群的另两位成员辅助性 5 细胞 5,, ), 5 和调节性 5,0. ( -55,0 细胞在各类自身免疫性及炎症性疾病中均发挥重要作用 此外 最近研究显示 5 和 5,0 细胞的分化与机体的生理状态 基金项目 大连市医药卫生科学研究项目 作者简介 杨婷婷 女 年生 硕士 技师 主要从事临床检验工作 通讯作者 李 志 联系电话
检验医学 年 月第 卷第 期 8./(. ( -9,+ )", : - 7( &( 密切相关 此过程可能成为自身免疫性疾病发生的关键环节 本研究从细胞 & 和蛋白 种不同水平对银屑病患者外周血 5 5,0 细胞及其相关因子进行动态检测 以期进一步了解 5 5,0 细胞及其相关因子与银屑病之间的相互关系 材料和方法一 研究对象选取 年 月至 年 月在大连市中心医院门诊就诊的银屑病患者 例 男 例 女 例 年龄 ; 岁 平均年龄 岁 病程 个月 ; 年不等 所有患者符合银屑病的诊断标准 具有典型的红斑 银白色鳞屑等皮疹 均经临床与组织病理检查确诊 其中银屑病患者轻度 例 银屑病皮损面积和严重程度指数!(.!!.,.."+!,2, - "+,4!)(, 重度 例!)(, 所有患者 个月内未使用皮质类固醇激素和免疫抑制剂 排除其他严重疾病 其他皮肤病及自身免疫性疾病 另选取健康对照组 名 为大连市中心医院健康体检者 无免疫性及系统性疾病 无银屑病家族史和其他皮肤病 健康对照组与患者组一般资料比较 差异无统计学意义 二 仪器与试剂异硫氰酸荧光素 (,!),"!( ()-."., ' 5# 标记 抗人 #% 单克隆抗体 ' 5# 标记 抗人 #% 单克隆抗体 藻红蛋白花青素 -)(, - " 0,," 0," # 标记 抗人 #% 单克隆抗体 # 标记 抗人 #% 单克隆抗体及固定破膜剂为美国 >,)*." #(, 公司产品 藻红蛋白 -)(, - " 标记 抗人白细胞介素 ",, * " 8 单克隆抗体及同型 标记 抗人叉头状转录因子 ( *,.+ /(4 '(4 单克隆抗体及同型为美国,>(!),"), 公司产品 十四酸佛波酯 乙酸盐 ( /( -!.,.),., 9 离子霉素和莫能霉素为美国 0. 公司产品 & # $ 97 7, 为大连宝生物有限公司产品 人 8 酶联免疫吸附试验,"1-, "*,+ "(!( /,".!.- 8 定量测定试剂盒为北京博凌科为生物科技有限公司产品 人转化生长因子."! ( "00 (3.) ( /,.5 ' 8 定量测定试剂盒为 K% 公司产品 流式细胞仪 # 8 为美国 >,)*." #(, 公司产品 引物由大连宝生物有限公司合成 三 样本采集和处理受检者清晨空腹静脉采血 置于肝素钠抗凝管中用于 5,0 细胞和 5 细胞的流式检测 置于乙二胺四乙酸, -,",+. ",,..), ).)+ %5 抗凝管中用于逆转录聚合酶链反应 ( -,.!,).",.) (" # 置于非抗凝管中用于 8 和 5 ' 定量测定 四 方法 流式细胞术检测 5 细胞和 5,0 细胞 密度梯度离心法 ')( 分离外周血单个核细胞,,. / ((+ ("(" ),. ), >9# 将分离出的外周血 >9# 加入 #% 和 #% 的荧光标记抗体温育 " 用于 5 细胞的表面标记 温育后的样本用 9 培养液洗涤 并加入到特殊培养液中 含 6 新生牛血清? 8 青霉素 0 8 链霉素 "0 8 9 离子霉素 0 8 莫能霉素 ( 8 置于 I 温箱温育 ; 特殊培养液各组分浓度和细胞培养时间等参考试剂厂家提供的数据 并经数次预实验结果确定 培养后的细胞进行固定破膜 按照说明书操作 之后加入荧光标记 8 抗体和对照抗体 温育 " 后待测 取外周全血 8 加入 #% 和 #% 的荧光标记抗体温育 " 然后用磷酸盐缓冲液 (!.,/,!( (" > 洗涤样本后进行固定破膜 按说明书操作 最后加入荧光标记 '(4 单克隆抗体和对照抗体 温育 " 流式细胞仪测定标记的 种细胞的荧光强度 界定 #% J #% J #% J 为 5 细胞 #% J #% 0 '(4 J 为 5,0 细胞 逆转录 # 检测维甲酸相关孤儿受体, "(+,.,+ (.",), ( 0.. 和 '(4 & 的表达 5 1( 法提取 & 后 逆转录合成 )%& 按以下条件进行逆转录反应 I " I " I " I " 然后 # 扩增目标 %& 个循环结束后 取 8 产物进行琼脂糖电泳 7 " 产物用凝胶成像系统扫描 检测基因与内参照条带灰度值的比值表示该基因 & 的表达水平 以.) " & 表达量为内参照 引物序列由大连宝生物有限公司设计和合成 '(4 上游引物 # ### # # ## 下游引物 # #5#55 5## 55
上游引物 ##5## #5 ## #5 5 5 #5 5# 下游引物 5# 555#5 # # 55#5 # 5 5 #5 5###.) " 上游引物 5# 5 5 5 # 55 # 5## 5 下游引物 ##5 # 555 # 5 # # 5 8 检测 8 和 5 ' 浓度 按照相应试剂盒说明书进行细胞因子 8 和 5 ' 的测定 五 统计学方法应用 统计软件进行分析 数据以 C 表示 组间采用多因素方差分析 以 为差异具有统计学意义 结 果一 各组外周血 5 细胞和 5,0 细胞的比例 与健康对照组比较 轻度和重度银屑病患者外周血 5 细胞比例显著升高 且轻度组和重度组间差异亦有统计学意义 与健康对照组比较 重度银屑病患者外周血 5,0 细胞比例显著降低 轻度组与健康对照组比较 差异无统计学意义 见图 图 二 各组外周血 '(4 & 的表达与健康对照组比较 银屑病患者外周血 & 的表达显著升高 且轻度组和重度组间差异亦有统计学意义 与健康对照组和轻度银屑病患者比较 重度银屑病患者 '(4 & 表达显著降低 轻度组与健康对照组差异无统计学意义 见表 图 图 流式细胞术检测 5 细胞和 5,0 细胞的表达 注 图 各组外周血中 5 和 5,0 细胞所占比例
检验医学 年 月第 卷第 期 8./(. ( -9,+ )", : - 7( &( 表 各组外周血中 '(4 和 & 的表达 组别 例数 '(4 健康对照组 C C 银屑病 轻度组 C C 重度组 C H C H 注 与健康对照组比较 与轻度银屑病组比较 H 图 逆转录 # 检测 '(4 & 的表达 三 各组外周血 85 ' 的水平 与健康对照组比较 银屑病患者血浆 8 的水平均显著升高 且轻度组和重度 组间差异亦有统计学意义 与健康对 照组和轻度银屑病患者比较 重度银屑病患者体 内 5 ' 水平明显降低 而轻度组与 健康对照组间差异无统计学意义 见 表 表 各组外周血中 85 ' 的水平比较 组别 例数 8 0 8 5 ' 0 8 健康对照组 C C 银屑病 轻度组 C C 重度组 C H C H 注 与健康对照组比较 与轻度银屑病组比较 H 讨 论 5 细胞功能异常是维持银屑病疾病活动性的中心环节 与皮损的发生 发展和持续密切相关 本实验联合了流式细胞术 逆转录 # 及酶联免疫定量技术对银屑病疾病组和健康对照组 5 5,0 细胞及其转录因子和细胞因子水平进行了反复检测 从细胞水平 转录因子水平及蛋白水平对银屑病患者外周血中 种细胞的表达进行研究 本研究结果显示 随着银屑病患者疾病严重程度的加深 外周血 5 细胞所占的比例及其特异性转录因子 的 & 表达水平及血浆中 8 的表达水平均明显上调 与国内外现有的大多数研究结果相一致 另有学者发现银屑病皮损真皮浅层 8 阳性单一核细胞数显著增加 此外 有学者指出炎症性树突状细胞释放 8 和 8 激活产生 8 的 5 细胞 5 细胞和 5 细胞产生大量的银屑病细胞因子 8 干扰素 ",, (" 0.. '& 肿瘤坏死因子 ( ",) (!!.) ( 5&' 和 8 这些细胞因子介导产生角质形成细胞放大了银屑病的炎症反应 以上结果充分说明了 5 细胞及相关细胞因子 8 8 及 5&' 在银屑病发病过程中的重要性 本实验结果说明随着疾病严重程度的加深 其表达也随之增加 推测其可能参与中性粒细胞增生 成熟和趋化 诱导中性粒细胞迁移 到银屑病皮损处 加重炎症反应 $9 & 等 通过实验证实银屑病患者在接受紫外线照射治疗后 8 水平明显下降 趋近于正常对照组的水平 提示靶向阻断 5 8 通路可能阻止疾病的发生和发展 #% J #% 0 '(4 J 细胞是一种免疫性抑制细胞 在维持机体内环境稳定 诱导移植耐受及自身免疫性疾病的发生 发展中起重要作用 本研究显示 重度银屑病患者外周血 #% J 0 #% '(4 J 5,0 细胞的表达显著低于健康对照组 而轻度组与健康对照组比较差异无统计学意义 但是由于 5,0 细胞在外周血中的数量较少 我们又比较了各组 5,0 细胞的特异性转录因子 '(4 & 及细胞因子 5 ' 的表达 结果显示重度银屑病患者 '(4 & 的表达和 5 ' 的浓度显著低于轻度组和健康对照组 与流式检测的结果一致 说明银屑
病患者体内可能存在 5,0 细胞数量的减少以及免疫调节功能的缺失 以上结果可以证实无论是 5,0 细胞数量还是功能显著降低 不足以抑制效应淋巴细胞的增殖及免疫效应功能 导致炎症性细胞的过度分化 另一方面 5,0 细胞由于所处细胞环境的变化可能转化为 5 细胞 使其免疫抑制功能减弱而导致效应 5 细胞过度增殖 促进炎症的发展 然而在这一领域相关的研究亦 有不同的结论 = & 等研究发现银屑病患者皮损区 #% J #% 0 '(4 J 5,0 细胞的数量要高于健康对照组 且与疾病的严重程度呈正相关关系 出现以上不同的结果可能与所选取的研究对象所处的病程及取材的部位不同有关 由此可见 5,0 细胞及相关因子在银屑病患者体内的行为尚存在争议 还需要大量的实验进一步确定 5,0 细胞在患者体内的表达 在不同的细胞因子环境中通过不同的信号途径对初始 #% J 5 细胞向 5,0 或 5 细胞的分化进行调节 5,0 和 5 细胞的分化紧密联系 低剂量 5 ' 联合 8 或 8 8 可诱导初始 5 细胞向 5 分化 高剂量 5 ' 和在缺少炎症因子的情况下 5 ' 就会转而抑制 5 的分化 促进 5,0 细胞分化 可以看出 5,0 和 5 细胞在分化及功能上是相互拮抗的 本研究结果显示 银屑病患者血浆中 5 细胞显著升高且与疾病严重程度相关 而重度患者 5,0 细胞明显减少 说明 5 细胞的过度分化 5,0 细胞的数量减少及功能受损导致的 5 5,0 平衡失调可能是银屑病发病的重要原因 此外 在促炎条件下 5,0 细胞能分化成 5 细胞 重度银屑病患者 5,0 细胞分化功能的增强源于 表达的增多和 '(4 表达的减少 和 '(4 两者的平衡或许是决定 种细胞分化方向的关键 综上所述 在银屑病的发生 发展过程中 可以通过 5 和 5,0 细胞失衡来解释部分发病机制 但是银屑病 5 细胞的招募 增殖及与 5,0 细胞之间的分化和转化的基本机制有待进一步研究 以期为银屑病发病机制的探讨及临床治疗提供理论基础 参考文献 &,3 ( ).,.,"! (!(.!! : 4, "..)(, 徐维家 李志 杨婷婷 等 系统性红斑狼疮患者 5 和 5 细胞及其细胞因子水平的变化及临床意义 : 检验医学? 8:?8 L 9 8 5,. (0,",!!."+ 0,", )!(!(.!! : ).!%, (! (0? 5# &#B & B,. 5,+! /."),( 5 5,0), /.."), ".+,"( -(!! : ',, $8 & @ 5' 8%9 '8 % 5,.! ) - (." 5,0."+ 5 ),!."+! (, ". ( " - :, " "( B & 8 = & # & :,. "),.!,+ 5 ),!.,.))(.",+ /-'(4 J 5,0),.)). ("."+ )(,.,+ 3!(.!!+!,.!,!,2, - : # " "( 唐娟 张晓艳 宋佩华 等 寻常性银屑病患者皮损区及外周血单一核细胞中 8 的表达 : 中国皮肤性病学杂志 8 @ 9?L B' M 9$? : "( (0-(!(.!! : "",2 "( $9 & $? % % 55 # 8 5 9 9,. -!, ). -,,2.,+ 5 5."+ 5.!().,+ ), (* ",!"!(.!!2 0.!/, (,."+.,.2(, >,.," : ). %, 7,",,( 蒋延伟 王忠永 邱会芬 等 5 细胞和 5,0 细胞与银屑病关系的研究进展 : 滨州医学院学报 = & $ ' & & 8,. '(4 J,0. ( -5),!."+,.,+ )- (* ",!+,,". -,4,!,+ ".A,2! 0.,!(.!!2 0.! : > :%,. ( > 7 & # & : 7 & % $ $ ' # 7 &,. '(4 J,0. ( - 5 ),! (!(.!!.,"!,.! - +,,"., " ( 8 (+ )"0),!."+., ( "+ ",!(".!* " : : "2,! %,. ( 收稿日期 本文编辑 姜 敏 # # BB 5 ## # &,.