中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology,2009,29(9):12~16 醛糖还原酶抑制剂细胞筛选模型的建立 刘静刘建伟杜明梅杨立娜叶玲 ( 中国人民解放军总医院老年医学研究所北京 100853) 摘要目的 : 将糖尿病慢性并发症相关基因醛糖还原酶 (aldosereductase,ar) 基因与腺相关病毒 (adenoasociatedvirus,aav) 表达载体 psnav2.0 重组, 使其在 HEK293 细胞中表达, 以基因工程表达的 AR 为靶向, 建立醛糖还原酶抑制剂 (aldosereductaseinhibitor,ari) 细胞筛选模型 方法 : 首先采用酶切 连接等方法构建含有人 AR 基因序列的 AAV 表达载体 psnav?har, 将重组质粒转染 HEK293 细胞, 通过活性测定 Westernblot 和免疫荧光检测目的基因转染及表达的情况 结果 :PCR 酶切 DNA 测序均证实表达质粒 psnav?har 构建正确 转染 HEK293 细胞后, 一系列分析结果显示, 腺相关病毒表达载体介导的 AR 真核细胞表达产物是具有功能活性的目的蛋白 应用经典醛糖还原酶抑制剂 Sobinil 和 Zopolrestat 对此模型进行了验证 结论 :AR 高表达细胞模型的建立, 为进一步筛选 ARI 探讨多元醇通路学说在糖尿病慢性并发症发病机制中的作用奠定了基础 关键词醛糖还原酶腺相关病毒细胞模型中图分类号 Q789 随着糖尿病病程的发展, 糖尿病患者中多合并发生高血压 冠心病 肾病以及血管病变等糖尿病慢性并发症 (diabeticchroniccomplication,dcc) DCC 发生的具体机制尚未完全明确, 与其有关的多种机制中多元醇通路 (polyolpathway,pp) 的激活, 已经得到广泛的认可 PP 是葡萄糖代谢的途径之一, 由醛糖还原酶 (aldose reductase,ar) 及山梨醇脱氢酶 (sorbitol dehydrogenase,sdh) 共同构成,AR 是 PP 的关键限速酶 葡萄糖代谢途径示意图见图 1 [1] 当血糖浓度维持在正常生理水平时, 细胞内大多数葡萄糖可被己糖激酶转化为 6? 磷酸葡萄糖, 只有少量非磷酸化的葡萄糖进入 PP 在高血糖状况下, 己糖激酶被葡萄糖饱和, 占总流通量 1/3 以上的葡萄糖涌入 PP AR 被激活, 消耗大量的还原型辅酶 Ⅱ (NADPH) 和氧化型辅酶 I(NAD + ) 细胞内山梨醇和果糖积聚, 由于山梨醇对细胞膜的通透性较差, 氧化生成的果糖又难以代谢, 导致细胞渗透压显著升高, 细胞 收稿日期 :2009 01 19 修回日期 :2009 04 01 国家自然科学基金 (30472172) 北京市自然科学基金 (7092097) 资助项目 通讯作者, 电子信箱 :lye301@yahoo.com.cn 图 1 多元醇通路示意图 Fig.1 Schematicdiagram ofpolyolpathway 和组织受损, 这就是 DCC 发病机制的多元醇代谢途径激活学说 AR 激活已被证实是 DCC 的重要发病机制之一 [1,2] 研究表明, 醛糖还原酶抑制剂 (aldose reductaseinhibitor,ari) 可以抑制 AR 活性, 有效的改善高血糖状况下 AR 被激活引起的异常情况, 从而达到预防和延缓 DCC 的目的 [3,4] 重组腺相关病毒载体 (raav) 源于非致病的野生型腺相关病毒, 属于无病毒基因的病毒载体 由于其安全性好 宿主细胞范围广 ( 分裂和非分裂细胞 ) 免疫源性低 在体内表达外源基因时间长等特点, 作为基因传递载体, 被广泛用于基因功能 基因治疗研究及构建
2009,29(9) 刘静等 : 醛糖还原酶抑制剂细胞筛选模型的建立 13 疾病模型等方面 在前期工作的基础上, 本研究采用 raav 在体外构建 har 腺相关病毒表达载体 psnav?har, 并转染 HEK293 细胞 旨在通过 AR 的功能性表达与活性分析, 建立 DDC 与 PP 的靶向性研究模型及 ARI 筛选模型, 进而应用于中药醛糖还原酶抑制剂的筛查 1 材料与方法 1.1 材料 含有人 AR cdna 基因的质粒 pbluescriptiks? har( 简称为 pks?har) 为香港大学分子生物学研究所 SookjaK.Chung 教授馈赠, 腺相关病毒载体质粒 psnav2.0 为本元正阳基因有限公司产品,HEK293 细胞由本所细胞室提供,VigoFect 转染试剂购自威格拉斯生物技术有限公司, 羊抗 har(humanar) 多克隆抗体为 SantaCruz 公司产品,HRP 标记的二抗为鼎国公司产品,Cy5 标记的二抗为 Invitrogen 公司产品 醛糖还原酶抑制剂 Sorbinil 和 Zolporestat 由美国辉瑞 Pfizer 公司 PeterJ.Oates 博士馈赠 1.2 方法 1.2.1 AR 腺相关病毒表达载体 psnav?har 的构建 pks?har 质粒经 EcoRI 酶切, 将回收的 har 片段与同样经 EcoRI 酶切 去磷酸化的质粒 psnav2.0 连接, 转化 DH5α 感受态细胞, 经含氨苄青霉素 (100μg/ml) 的琼脂板挑出单个克隆, 重组质粒经 PCR 酶切鉴定后, 送 Invitrogen 公司测序验证 [5~7] 1.2.2 psnav?har 转染 HEK293 细胞 选择含 10% 胎牛血清的 DMEM 高糖培养基 采用 6 孔板, 把吹打均匀的细胞悬液计数后按照 0.5 10 5 密度接种, 待细胞长至 50% ~70% 融合时准备进行重组质粒转染 转染步骤 : 转染前 1h 更换培养基, 每孔为 2ml, 按照每孔 3.0μgDNA 及 2μlVigoFect 转染试剂的比例分别用 100μl 生理盐水稀释, 混和后室温静置 15min, 将混和物逐滴加入含有细胞的孔中, 置于 37 含 5% CO 2 的培养箱中继续培养 相同方法转染 psnav2.0 空载体作为实验对照 转染 24h 后观察 HEK293 细胞形态的改变 [8,9] 1.2.3 AR 活性的测定转染 48h 后收集细胞, 将细胞吹下后经 1000r/min,10min 离心, 去上清, 每孔细胞加 100μl 生理盐水, 置于液氮中 3min, 移至 37 水浴 3min, 反复 3 次, 冻融法提取总蛋白 AR 活性测定的反应体系包括以下成分 ( 终浓度 ):50mmol/L 的钠? 钾 磷酸缓冲液 (ph7.0),0.2mol/l 的硫酸铵,0.1mmol/L 的 NADPH,4mmol/L 的 DL? 甘油醛和适量蛋白提取液, 总体积为 0.4ml 空白管以双蒸水代替 NADPH, 紫外分光光度计记录 NADPH 在 340nm 处 3min 吸光值的下降来表示 AR 活性 1 单位 (U) 酶活性表示 1 分钟内 1μmolNADPH 被氧化的酶量,AR 活性用 U/gPr 表示 1.2.4 Sobinil,Zopolrestat 对 AR 蛋白活性的影响用经典的 ARISobinil 和 Zopolrestat 验证 psnav?har/ HEK293 作为醛糖还原酶抑制剂细胞筛选模型的可行性 方法同 AR 活性的测定, 测定温度为 25, 反应时间 3min 反应体系包括一定浓度的 ARI, 其余成分同 AR 活性测定 每种药物至少选取 3 个不同浓度 (Sobinil:10,1,0.1μmol/L;Zopolrestat:0.05,0.02, 0.01 和 0.005μmol/L), 重复 3 次, 取均值 IC 50 的计 [10] 算根据半数效量概率单位法进行 以药物浓度的对数为横座标, 相应浓度抑制率的概率单位为纵座标, 求出直线回归方程, 并根据方程计算 IC 50 值 (50% 抑制时的概率单位为 5) 1.2.5 Westernblot 法鉴定转基因 AR 蛋白表达将收集的细胞置于液氮中 3min,37 水浴 3min, 反复 3 次裂解抽提总蛋白,Bradford 法蛋白定量, 取等量 (40μg) 的细胞总蛋白按常规方法进行 12% 聚丙烯酰胺凝胶变性电泳 转膜 封闭 一抗为羊抗 har 多克隆抗体 (1 200 稀释 ),25~28 孵育过夜 ; 二抗为 HRP 标记的驴抗羊 IgG (1 200 稀释 ),37 孵育 2h,DAB 显色 1.2.6 免疫荧光抗体法检测 AR 蛋白转染 48h 后, 弃培养液, 冷丙酮固定 10min,PBS 冲洗, 用含 5% 兔血清的封闭液封闭 1h, 冲洗后加稀释的羊抗 har 一抗 (1 100 稀释 ),37 湿盒内 1h,PBS 洗 3 次, 加稀释的 Cy5 标记的兔抗羊二抗 (1 100 稀释 ),37 湿盒内 1h,PBS 洗 3 次, 甘油封片, 于 OLYMPUS 荧光显微镜下观察拍照 1.3 统计学分析 研究的资料属于单组设计一元定量资料, 数据以均数 ± 标准差 (x±s) 表示 均数比较应用 Student st 检验,P<0.05 表示差异具有统计学意义 2 结果 2.1 重组表达质粒的鉴定 PCR 鉴定引物 AR?F:5?ATGGCAAGCCGTATCCTG?3 ;AR?R:5?ATTGTGCTTGGCTGCGAT?3 反应条件
14 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.29No.92009 为 :95 变性 5min;94 30s,52 50s,72 60s,30 个循环 ;72 延伸 7min PCR 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离在 700bp 左右出现预期大小的 DNA 条带 ( 图 2), 测序结果证实序列正确 对重组质粒分别进行 SmaI 和 EcoRI 酶切,SmaI 单酶切得 4.8kb,1.7kb, 1.1kb 和 839bp 四条带 ;EcoRI 单酶切分别得 2.9kb 和 1.4kb 两条带 均与理论长度一致 ( 图 3, 图 4) 图 4 重组质粒 psnav?har 的 SmaI 酶切鉴定 Fig.4 Restrictionendonucleaseanalysis M:λDNA/EcoRI?Hind IMarker;1,2:pSNAV?hAR(SmaI) 图 2 PCR 产物的琼脂糖凝胶电泳 Fig.2 Agarosegelelectrophoresis M:λDNA/EcoRI?Hind IMarker; 1,2:PCRproductsofhARclone 图 5 Westernblot 检测 AR 蛋白的表达 Fig.5 IdentificationofARproteinbyWesternblot 1:293cels;2:293celstransfectedbypSNAV2.0; 3:293celstransfectedbypSNAV?hAR 图 3 重组质粒 psnav?har 的 EcoRI 酶切鉴定 Fig.3 Restrictionendonucleaseanalysis M:DL?2000Marker;1,2:pSNAV?hAR(EcoRI) 2.2 Westernblot 检测目的蛋白 Westernblot 分析结果显示, 在 293 细胞中表达的 AR 蛋白大小为 37kDa( 图 5), 与文献报道一致 经 Gis? 10003.0 软件对蛋白印迹的条带灰度值进行分析, 外源 AR 蛋白在 293 细胞中的表达明显高于对照组 ( 图 6) 2.3 AR 活性的测定结果转染了 psnav?har 的 293 细胞中 AR 的活性为 (61.50±4.65)U/gPr, 对照组 293 细胞中 AR 的活性为 (30.41±1.56)U/gPr, 转染组明显高于对照组 (P< 0.05) 表明 HEK293 细胞中表达的外源 AR 具有功能活性 图 6 AR 蛋白的相对表达量 Fig.6 RelativeExpresionofARprotein 2.4 经典 ARISobinil,Zopolrestat 对 AR 活性的抑制作用结果表明 Sobinil 和 Zopolrestat 对 AR 有很好的抑制作用, 且随着浓度不断增加, 对 AR 酶活性抑制率逐渐升高 ( 图 7), 呈现浓度依赖性关系, 其 IC 50 分别为 610nmol/L 和 13.40nmol/L 2.5 免疫荧光抗体法检测 AR 蛋白与对照组 293 细胞相比, 转染了真核表达质粒 psnav?har 的 293 细胞中荧光信号明显增强 ( 图 8) 3 讨论 尽管严格控制血糖有益于预防 DCC 的发生和发展已得到国内外的广泛共识, 但多数患者无论如何也难以将血糖控制在正常水平 [11] 提示机体内有些其它环
2009,29(9) 刘静等 : 醛糖还原酶抑制剂细胞筛选模型的建立 15 图 7 Sobinil 和 Zopolrestat 对 AR 蛋白活性的抑制 Fig.7 InhibitionofARactivitybySorbinilandZopolrestat 图 8 免疫荧光检测 AR 蛋白表达 Fig.8 ExpresionofARdetectedby immunohistochemicalstaining(200 ) (a)293cels(b)293celstransfectedbypsnav?har 节和因素起着重要作用 因而那些与控制血糖无关却能够确实延缓 DCC 发生发展的物质, 如醛糖还原酶抑制剂 ARI, 就具有潜在的治疗意义 遗憾的是, 许多 ARIs 的临床试验都以副作用较大而告以失败 到目前为止, 尚无一个药物通过美国 FDA 研究人员仍不遗余力地从新的合成药物或天然产物中筛查着具有治疗作用的 ARI, 以期实现防治 DCC 的目标 [12] 中医药治疗消渴病具有悠久的历史 中草药为天然产物, 在预防治疗 DCC 方面显示了良好的应用前景 为了建立筛选中药 ARIs 模型, 最初将 AR 基因转入酵母宿主细胞, 在酵母中成功地表达了人重组 AR [13,14] 酵母属于真菌类低等真核细胞, 虽然其遗传性状比细菌复杂得多, 但许多应用于原核微生物的分子遗传技术同样适用于酵母, 如 DNA 既能以自主复制的形式, 又能以整合到基因组的方式被引入酵母细胞 另外, 酵母生长速度快, 繁殖周期短, 培养成本低 但由于酵母菌主要由 β? 葡聚糖构成厚实的细胞外壁, 使得胞内基因表达产物的提取纯化需要一定特殊的方法和试剂 加上细胞内的酶系比较复杂,AR 活性测定受 AR 表达水平 蛋白制备纯度及其它因素干扰, 本底较高, 限制了酵母细胞模型在中药 ARIs 筛选中的应用 腺病毒伴随病毒具有广泛的宿主范围, 可有效地将外源基因导入多种细胞并稳定表达, 且不表达任何病毒自身蛋白基因, 具有良好的安全性, 目前有许多研究将 AAV 载体用于基因治疗 [15~17] 本研究将 AR 基因克隆入腺相关病毒表达载体 psnav2.0 并转染 HEK293 细胞, 以期利用腺相关病毒的高感染效率, 提高 AR 基因在 HEK293 细胞中的表达水平, 逐步完善靶向性筛选 ARIs 的真核细胞模型 此外, 还尝试构建绿色荧光蛋白 (GFP) 与 AR 基因融合的细胞模型 [18], 力图以 GFP 作为指示探针, 研究重组腺相关病毒感染动物后,AR 在动物模型中的定位表达, 为进一步探讨多元醇通路学说奠定基础 参考文献 [1]Yabe?NishimuraC.AldoseReductaseinGlucoseToxicity:A PotentialTargetforthePreventionofDiabeticComplications. PharmacolRev,1998,50(1):21~33 [2]BrownleeM.Biochemistryandmolecularcelbiologyofdiabetic complcations.nature,2001,414(6865):813~820 [3]MiyamotoS.Recentadvancesinaldosereductaseinhibitors: potentialagentsforthetreatmentofdiabeticcomplications. ExpertOpinTherpatents,2002,12:621~631 [4]HotaN,KawamoriR,AtsumiY,etal.TheADCTStudy GroupStratifiedanalysesforselectingappropriatetargetpatients withdiabeticperipheralneuropathyforlong?termtreatmentwith analdosereductaseinhibitor,epalrestat.diabeticmedicine, 2008,25(7):818~825 [5]BhatnagarA,RuefJ,LiuS,etal.Regulationofvascularsmooth musclecelgrowthbyaldosereductase.chem BiolInteract, 2001,130?132(13):627 [6] 车祺, 蒋涛, 林伊凤, 等. 醛糖还原酶 (AR) 基因对大鼠肾系膜细胞的转染及 AR 抑制剂对其增殖的影响. 复旦学报 ( 医学版 ),2005,32(4):383~387 CheQ,JiangT,LinYF,etal.FudanUnivJMedSci,2005, 32(4):383~387 [7] 余榕捷, 高媛, 戴云, 等.VPAC2 在 CHO 细胞的表达及鉴
16 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.29No.92009 定. 生物工程学报,2006,22(6):996~1001 YuRJ,GaoY,DaiY,etal.ChinJBiotec,2006,22(6): 996~1001 [8] 刘长山, 朱禧星. 糖尿病患者红细胞醛糖还原酶活性的初步观察. 中国糖尿病杂志,1996,4(4):198~201 LiuCS,ZhuXX.ChinJDiabetes,1996,4(4):198~201 [9] 沈守祥, 董砚虎, 逄力男, 等. 红细胞醛糖还原酶测定荧光法的建立及临床应用. 中国糖尿病杂志,1999,7(3):154~ 156 ShenSX,DongYH,PangLN,etal.ChinJDiabetes,1999, 7(3):154~156 [10] 杨树勤. 中国医学百科全书 - 医学统计学. 上海 : 上海科学技术出版社,1985 197~202 Yang S Q. Chinese Medical Encyclopedia medical statistics. Shanghai: Shanghai Science and Technology PublishingHouse,1985 197~202 [11] Reddy G B, Satyanarayana A, Balakrishna N, etal. Erythrocytealdose reductase activity and sorbitollevelsin diabeticretinopathy.molecularvision,2008,14:593~601 [12]OatesP J.Aldosereductase,stilacompelingtargetfor diabeticneuropathy.curdrugtargets,2008,9(1):14~36 [13] 刘静, 叶玲, 刘建伟. 糖尿病并发症相关基因醛糖还原酶酵母细胞模型的建立. 中国老年学杂志,2005,25(11):1367 ~1369 LiuJ,YeL,LiuJW.ChineseJGerontol,2005,25(11): 1367~1369 [14] 叶玲, 刘建伟, 刘静. 酿酒酵母感受态细胞的低温保存及酵母菌落 PCR2 快速筛选鉴定. 生物化学与生物物理进展, 2003,30(6):956~959 YeL,LiuJW,LiuJ.ProgBiochemBiophys,2003,30(6): 956~959 [15]SongK,DuJM,LouRH,etal.EfectofBio?Osloading withraav?bmp7onregenerationofbonedefectsarounddental implant.westchinjstomatol,2002,26(4):421?429 [16]YanH,GuoY,ZhangP,etal.Superiorneovascularization andmuscleregenerationinischemicskeletalmusclesfolowing VEGFgenetransferbyrAAV1pseudotypedvectors.Biochem BiophysResCommun,2005,336:287~298 [17]HoshijimaM,IkedaY,IwanagaY,etal.Chronicsuppresionof heart?failure progresion by a pseudophorylated mutantof phospholambanviainvivocardiacraavgenedelivery.nature Medicine,2002,8(8):864~871 [18] 杜明梅, 叶玲, 刘建伟, 等.Kozak 序列 +4G 提高绿色荧光蛋白在 HEK293 细胞中的表达. 生物工程学报,2008,24 (3):491~494 DuM M,YeL,LiuJW,etal.ChinJBiotech,2008,24 (3):491~494 AnAldoseReductaseInhibitorScreeningModelConstructed bytransfectionofpsnav?arintohek293cels LIUJing LIUJian?wei DUMing?mei YANGLi?na YELing (InstituteofGeriatrics,ChinesePLAGeneralHospital,Beijing 100853,China) Abstract Objective:Aldosereductase,involvedinthepathogenesisofdiabeticcomplications,was recombinatedwithanadenoasociatedvirusvectorpsnav2.0,anditwastransfectedintohumanembryonic kidney293(hek293)cels.thegeneengineeringproducedarwouldbeusedasatargetproteintoscreen aldosereductaseinhibitors. Restriction endonucleasedigestion and ligation procedureswereperformed to constructthearexpresionplasmidvectorpsnav?har.methods:afterconfirmationtherecombinantplasmid bypcr,restrictionendonucleasedigestion,anddnasequencing,psnav?harwastransfectedintohek293 cels.westernblotandimmunofluorescenceanalysiswereperformedtodetecttheexpresionofar andits enzymeactivity.results:theresultsofaseriesofanalysisincludingar activityasay,westernblotand immunofluorescenceanalysisshown the expresed protein mediated by the adeno asociated virusvector transfectinghek 293 cels, wasfunctionalar. Thetraditionalaldosereductaseinhibitors, Sobiniland Zopolrestat,wereusedtotestandverifytheconstructedcelmodel.Conclusion:TheestablishedARexpresion modelcanbeusedinmechanismresearchofactivationofpolyolpathwayondiabeticcomplicationsandscreening potentialaldosereductaseinhibitors. Keywords Aldosereductase Adenoasociatedvirus Celmodel