第 卷第 期 年 月 上海交通大学学报 农业科学版!" # $ $"$"!%&'%' ' 文章编号 '('''''( 伏马毒素 9 单克隆抗体的制备及间接竞争 " 方法的建立 王雨晨 王 君 王元凯 严亚贤 上海交通大学农业与生物学院 上海市兽医生物技术重点实验室 上海 摘 要 采用戊二醛法将半抗原伏马毒素 9 分别与载体蛋白钥孔血蓝蛋白 和蛋白卵清白蛋白! 偶联成为完全抗原 9 和!9!9 作为包被抗原建立 " 方法 9 作为免疫原免疫 ) 周龄 9-&0 小鼠 应用杂交瘤细胞融合技术制备单克隆抗体 经三次亚克隆后 筛选出两株 ( 能特异 稳定分泌抗 9 单克隆抗体的杂交瘤细胞株 选择其中一株杂交瘤细胞通过体内诱生腹水的方法制备单克隆抗体 经检测表明单克隆抗体的亚型为 4 轻链为 型 采用间接 " 测得腹水纯化后效价达 &D 抗体对伏马毒素的半数阻断浓度 $ 为 )'24, 对玉米赤霉烯酮 黄曲霉素 9 等结构类似物几乎不存在交叉反应 与其他结构的氯丙嗪 链霉素等无交叉反应 利用获得的抗 9 单克隆抗体 建立了间接竞争 " 检测方法 检测灵敏度为 '24, 检测线性范围为 '(('24, 加标回收率在线性范围内达到回收率可达 )'55 关键词 伏马毒素 9 半抗原 单克隆抗体 间接竞争 " 中图分类号 ( 文献标识码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收稿日期 基金项目 国家高技术研究发展计划 )( 计划 项目 + 作者简介 王雨晨 ) 女 硕士生 研究方向 微生物学与免疫学 ",-.&.-%01-%1''02 严亚贤 为本文通讯作者 女 博士 副教授 研究方向 兽医微生物 ",-.&:-2:-.-2''02
上海交通大学学报 农业科学版 第 卷 24,'1,1%-%09.2.?-,&-210%;.)'55.2 10.%2-24' ',%2..291-2,%2%0&%2-&-2.%:.2.00%,..;" 伏马毒素,%2..2 是由串珠镰刀菌产生的真菌毒素 目前已知有 ) 种衍生物 分为 9$= 四类 其中以 9 最为常见 9 能够对玉米及其制品造成污染 以谷物为原料的一些产品中如面条 啤酒 调味品 动物饲料 甚至在芦笋中均检测到了 99 是伏马毒素中毒性最强的一种毒素 文献报道对多种动物有较严重的毒理作用 研究证实 伏马毒素可引发马的白脑软化症 猪的肺水肿综 合症 并可诱发人类的食道癌和肝癌 胃癌等疾病 从而给畜牧业和人类的健康带来危害 国内外已建立了多种伏马毒素的检测方法 其中高效液相色谱法 =$ 灵敏度高 在全球范围内的玉米及其制品的调查中 5 以上的实验室用的都是 ( =$ 法 其检测限可以达到 '',4?4 但是 该法需要对检测样品进行严格的预处理 仪器化程度高且价格昂贵 分析速度慢 同时要求有专业的操作人员 不利于在基层推广使用及大量样本筛 选 免疫学技术具有敏感 特异 简便的特点 近年来已被应用于伏马毒素残留检测 目前伏马毒素的免疫学检测试剂盒大多来自进口 而国内有关伏 马毒素的单抗制备 试剂盒的开发还相对落后 本研究旨在制备高特异性的伏马毒素单克隆抗体 在此基础上建立伏马毒素的免疫学检测方法 材料与方法 材 料 主要试剂伏马毒素 99 钥孔血蓝蛋白 和卵清白蛋白! 购自.4,- 公司 伏马毒素 9 单克隆抗体购自 0-, 公司 5 戊二醛 甲醇购自上海国药集团 鼠单抗亚类检测试剂盒购自 :$& 公司 = 标记羊抗鼠 4 购自 = &- 公司 实验用玉米糊粉购自欧尚超市 经过 =$ 测定为 9 阴性 实验所需缓冲液自行配制 主要器材酶联检测仪购自 9.%- 公司 $ 恒温培养箱购自 =0.%2 公司 孔 " 酶标板 孔及 孔细胞培养板购自 $%2. 公司 =%.2 亲和层 析预装柱购自,1-, =1-,-0.- 公司 &% 纯化系统为安玛西亚公司产品 实验动物 ) 周龄 9-&0 雌性小鼠 购自中科院上海动物所 = 细胞由本实验室保存 伏马毒素单克隆抗体的制备方法 伏马毒素 9 完全抗原偶联物的制备与鉴定 ) 利用戊二醛法 参照王君的方法将伏马毒素 99 分别与钥孔血蓝蛋白 和卵清白蛋白! 进行偶联 分别将偶联抗原! 9 和 9 按照包被浓度 以蛋白计 约 4, 稀释 以每孔 包被 孔 " 酶标板 分别以! 作为阴性对照 利用购自 0-, 公司的伏马毒素 9 单克隆抗体作为一抗 通过间接 " 法鉴定 9 偶联是否成功 动物免疫取,49 偶联物作为免疫抗原 用生理盐水稀释至 ', 加等量弗氏完全佐剂 经乳化后对小鼠进行颈背部和腹股沟多点皮下注射免疫 第 次免疫取 9,4 加等量弗氏不完全佐剂同第一次免疫法 每隔 周免疫 次 融合前 ( 腹腔注射不加佐剂的 9,4 进行加强免疫 加强免疫后采集小鼠少量血清备用 未免疫的小鼠的血清为阴性血清 > 3 冻存 细胞融合与筛选参照文献 的方法将小鼠脾细胞与 = 瘤细胞进行细胞融合与筛选 融合后 若 孔板内出现细胞集落并长至整个视野 倍镜下 的 以上时 取上清通过间接 " 方法检测 * 值 ' 者为阳性 筛选出阳性杂交瘤细胞 对阳性孔上清可再用间接竞争 " 法检测 选取竞争效果最好 阳性较强的细胞 利用有限稀释法进行亚克隆 每株细胞经 ( 次亚克隆 筛选能稳定分泌 9 单克隆抗体的杂交瘤细胞株 腹水制备与单克隆抗体纯化 采用小鼠腹腔诱导腹水制备单克隆抗体 正常 9-&0 小鼠提前 周腹腔注射 ', 灭菌液体石蜡进行预处理 将制备好的杂交瘤细胞注射预处
第 期 王雨晨 等 伏马毒素 9 单克隆抗体的制备及间接竞争 " 方法的建立 理过的小鼠 A 个细胞 只 约 后收集腹水 用 =%.2 亲和层析柱纯化腹水 利用 * =" 检测纯化抗体 抗体效价的测定利用间接 " 法检测单克隆抗体 方法是将纯化的 9! 浓度稀释至 '4, 然后每孔 =%.2 亲和层析法纯化抗 9 单克隆抗体为一抗 第一孔以 D 然后依次倍比稀释至第 孔 每孔 阴性血清 D= 4 单克隆抗体为二抗 以 值 ' 的为可疑 ' 为阳性 3 单克隆抗体亚类鉴定按 :$& 公司鼠单克隆抗体亚类检测试剂盒的说明书进行操作 间接竞争 +:( 检测方法的建立间接竞争 " 方法是将偶联抗原!9 以 孔包被 孔 " 酶标板 (3 温育 1=9 洗涤 ( 次 5 脱脂奶粉 3 过夜封闭后洗涤 ( 次 分别加入 孔优化后确定的最佳工作浓度 倍的抗 9 单克隆抗体 和 孔一定浓度的标准 9 同时设置阴性对照和空白对照 =9 分别代替!99 及单抗 (3 温育 1 后洗涤 加入 孔稀释一定倍数的 = 标记羊抗鼠 4( 3 温育 1 后洗涤 加入底物显色液 9 孔 ( 3 显色,.2 加入 孔,%& 的 终止反应 酶标仪检测 2, 处的 * 值 抗原最佳包被时间的确定 分别选择 ( 3 )1 五种不同的时间形式对抗原进行包被 确定最佳包被时间 抗原和抗体最佳工作浓度采用间接 " 法方阵测定 抗体稀释倍数为 DDD 抗原浓度分别选取 ''' 和 ' 4, 以 * 值在 ' 左右对应的抗原抗体浓度作为包被抗原和抗体最佳工作浓度 分别选择 DDD)D 作为酶标二抗的稀释倍数 采用间接 " 实验对检测效果进行比较 确定最佳酶标二抗工作浓度 标准曲线绘制以 '( 测定结果最佳抗体稀释度的两倍作为间接竞争 " 中的抗体浓度 竞争 9 浓度分别为 '''24, 以竞争抗原 9 抑制浓度对数为横坐标 以竞争率 竞争率 C 竞争抗原孔 * 值 > 空白对照 * 值 阴 性对照孔 * 值 A5 为纵坐标 绘制竞争标准曲线 因为竞争抗原 9 抑制浓度对数值与竞争率成线性回归关系 从而可以计算回归曲线的方程和相关系数 抗体特异性鉴定确定抗原抗体工作浓度后 以优化后最佳抗体工作浓度的两倍作为间接竞争模式中的抗体浓度 将伏马毒素 9 黄曲霉素 9 氯丙嗪 玉米赤霉烯酮 链霉素作为竞争抑制抗原 分别进行梯度稀释 各取上述稀释液与抗体各 混合 采用间接竞争 " 程序进行测定 计算抗体的半数抑制率 $ 计算交叉反应率, 5CA% 9% 其他被测物 以此作为 9 单克隆 抗体特异性指标 2 加标回收检测分别称取 '4 样品 玉米糊粉 量取, 甲醇 水 ( 溶液 置于, 离心管中 依次加入 ''('''4,9 标准品各 依据样品处理方法可得 样品中 9 浓度 C 加标浓度 A' 得样品中 9 浓度分别为 ''')''(('4?4 将样品置于涡旋仪上剧烈震荡使其混合均匀 静置使样品沉淀 用 <1-,-2 玻璃纤维滤纸过滤上清 置于 3 冰箱备用 每个浓度平行做 ( 次 进行间接竞争 " 的检测 按照回收率 C 实测浓度 加 标浓度 A5 计算回收率 结 果 伏马毒素 - 完全抗原偶联物的鉴定通过间接 " 法鉴定蛋白与 9 偶联效果 结果如图 两种偶联抗原检测得到的 * 值超过阴性对照 * 值的 ' 倍 可认为偶联成功 图 偶联抗原鉴定.4'2..0-.%2%10%24--2.42 杂交瘤细胞株的建立细胞融合 后 计算融合率为 5 间接 " 检测 阳性孔占 )5 用间接 " 和竞争 " 进行筛选 经 ( 次有限稀释克隆化 筛选
=! 上 海 交 通 大 学 学 报!农 业 科 学 版" 第!"卷 到!株效果最佳的杂交瘤细胞 </@ 和 </$$&经多 中和的量成正相关&中和后抗体与包被的 '3+>-W$ 次传代*冻存和复苏&杂交瘤分泌抗体稳定) 反应显色成反相关)说明抗体是特异性针对 -W$ >!单克隆抗体的制备与纯化结果.B. >a+04 检测结果显示纯化的 </@ 单克隆 的)通过间接竞争 4,1.+ 检测&结果显示对玉米赤 抗体共有两条多肽条带&一条是相对分子质量约为 反应&交叉反应均小于 #9!S&与 其 他 结 构 的 氯 丙!?cB的轻链&另一条是相对分子质量约为?#cB 的重链!见图!") 嗪*链霉素等无交叉反应!见图%") 霉烯酮*黄曲霉素 W$ 等结构类似物几乎不存在交叉 图%!单克隆抗体特异性鉴定 %!+ L L7 V I L V VD77 7 [7OX X : X7 图!!抗体.B. >a+04 电泳图谱!!2I L L7 V [7OX[X.B. >a+04 X?!抗体效价 将纯化后的</@腹水进行倍比梯度稀释&采用 间接 4,1.+ 方 法&检 测 各 稀 释 抗 体 的 'B 值&以 0%!? $且 = 50 %#9!所对应的最大抗体稀释倍 数为抗体效价&测定抗体效价为$h$<###) O!单克隆抗体亚类鉴定 通过鼠单克隆抗体亚类检测试剂盒&对纯化后 的</@腹水进行检测&图@结果表明本实验所获得 的单克隆抗体为1 R0$&轻链为$ 型) Q!间接竞争 CX# @J 检测方法反应模式的确立 按照$9 @的操作确立了间接竞争 4,1.+ 反应 模式如下#在@=Q 下& %I包被抗原%抗原最佳工作 浓度为 #9 $D,&抗 体 最 佳 工 作 稀 释 度 为 $h?##r %###%酶标二抗最佳稀释度为$hA###) T!标准曲线绘制 以竞争抗原 -W$ 抑制浓度对数为横坐标&以竞 争率!竞争率 g!竞争抗原孔 'B 值 b 空白对照 'B 值" $阴性对照孔 'B 值 e$##s"为纵坐标&绘制竞 争标准 曲 线&见 图?)当 -W$ 浓 度 在 #9!?"$!? $D,时有较好线性关系&得到的标准方程为# R g! & 其 中# ) 利 用 #? =A"$b#? $"#" D g#9 "=?? \ ; 7 '; <9 # 分 析& 16 >4,1.+ 法 的 检 测 限 R $D,&检测范围16!#b16A#为 #9 16$#为#9 %%R "@" $D,&半数抑制率16?#为A9 $D,) =@9 #<R!<R 图?!-W$ 间接竞争 4,1.+ 标准曲线?!6 [ ; 7 J ; Y V 7 ; I O 77 V 图@!单克隆抗体的亚型鉴定 @!1 O V 77 V I L 7 7 VD77 7 [7OX X:!单克隆抗体特异性 间接竞争 4,1.+ 反应中&抗原浓度变化与抗体 -W$ [X1 6 >4,1.+ X!加标回收率 在样品中添加不同浓度的 -W$&按照前述方法 处理样品后利用 4,1.+ 法进行检测&加标回收结果
第 期 王雨晨 等 伏马毒素 9 单克隆抗体的制备及间接竞争 " 方法的建立 ( 见表 样品 9 浓度在 '4?4 范围内即加标浓度在 '(4, 时 回收率可达 )'55 该方法相对标准偏差低于 5 稳定性较好 表 样品加标回收率检测 /&#,"!#9-!"7!$! 加标浓度 4, > 实测浓度 4, > 回收率 5 ' ' '') '( '( '(' ' '( )'' ' ') ('' ' ' '') ' ))')' ' (' )''( 讨 论 偶联方法的选择载体蛋白是一种自身能引发免疫反应的生物大分子 具有好的抗原性 可溶性和较多的偶联基团 本实验选用的钥孔血蓝蛋白 是从软体动物 /!" 中分离出来的 大量的一级氨基可用于有效结合半抗原 可偶联的基团也较多 作为免疫原引起的免疫反应比血清白蛋白 9 和卵清白蛋白! 强! 与 的亲源关系较远 交叉反应程度很低 因此选用! 作为包被原载体蛋白 在后续建立 " 筛选单抗时 可以最大程度地避免非特异性交叉反应 大多数的半抗原有一个以上的反应功能团 不同的反应功能团与不同的载体联接可产生不同的抗 体 通常抗体对远离蛋白质偶联点的半抗原有较好的特异性 因此偶联时联接键应尽量远离半抗原的决定簇 9 的化学结构中第 位上各有一个丙三羧酸基团 是半抗原分子中相对较复杂的部位 即 9 的抗原决定簇就位于这 个基团的 ( $$ 区域内 据文献报道 9 第 位碳原子上的氨基是偶联的最佳部位 本实验采用戊二醛法进行偶联 它借助戊二醛两端的醛基与载体蛋白和半抗原的氨基以共价键方式进行联接 氨基是比较活泼的基团 易于与载体蛋白的羧基进行联接 且氨基所在的位置在结构上远离半抗原的决定簇 与偶联剂偶联后 可使 9 充分暴露于载体蛋白表面并显示出抗原决定簇 从而增强偶联物的免疫 原性 ) 阳性杂交瘤细胞株的筛选细胞融合后 对细胞集落大小达到检测要求的孔取上清并分两步进行 " 检测 先用间接 " 法筛选出阳性孔 再用间接竞争 " 法筛选出特异性符合要求的孔进行亚克隆 这样可以大大减少亚克隆的盲目性和工作量 对三次检测都有高效价的阳性杂交瘤尽早亚克隆 以防止阳性杂交瘤丢失 因为分泌特异性抗体的杂交瘤比不分泌型细胞生长缓慢 若不及早克隆化 由于非分泌型细胞生长快 就会抑制分泌型细胞的生长 最后可能导致阳性杂交瘤细胞的丢失 从融合开始到第一次亚克隆的时间应尽量控制在两周之内 这是本实验中确保获得特异性单抗的关键 间接竞争 +:( 方法的建立 年美国 * 和农业部伏马毒素研究工作小组建议马饲料中伏马毒素应低于,4?4 猪饲料伏马毒素应低于,4?4 肉牛和家禽饲料伏马毒素应低于,4?4 瑞典规定人类食物中伏马毒素限量为,4?4 我国出入境检验检疫行业标准 进口食品中伏马毒素 9 残留量检测方法 ) 采用了 " 检测技术 也有抗体 制备和应用检测的研究报道 但研究内容大多数是以抗伏马毒素多克隆抗体为基础 由于多克隆抗体常受到人工抗原合成批次 免疫剂量 试验动物 免疫时间 免疫血清储存时间等多种因素的干扰 很难提供标准化的相关试剂 而单克隆抗体特异性好 灵敏度高 易于标化 本实验的最低检测限 为 '24, 而宫慧芝等建立的 9 间接竞争酶联免疫吸附方法的最低检出浓度为 4 郭云昌等建立了基于单克隆抗体的直接竞争性酶联免疫吸附测定方法 *$" 其最低检出浓度为 24, 由此可见 基于单抗的间接竞争 " 检测灵敏度好于多克隆抗体建立的方法 国内外研究表明 伏马毒素污染最多的是玉米 全球 ( 个国家的零售玉米加工厂检测 9 污染平均值为 ''(,4?4 ) 结合 * 的限量要求 本实验建立的检测方法线性检测范围在 '( ('24, 在添加试样检测试验中 样品 9 浓度在 '4?4 加标回收率在线性范围内达到 )'55 符合检测要求 本方法有望开发为适合于谷物产品及饲料安全监测和风险评估的一种特异 经济的检测试剂盒
上海交通大学学报 农业科学版 第 卷.,,2%%2--:%,%2..29'%"&9## 参考文献 ---<&,-2 &&%, <$'?%201-&%,-&-0.-.2-1%.20 :,%2..29.%&-%,-.,,%2.&.%,' '!##/!))(' +%,%/?:%;-0%;-0 =%,' 2;.4-.%2.2%1.,-2%220 %,%2..29.2%%,.2%&-&&.,. ;-&.2.4'.;'#(&"' (.2%$.&;-=2-'0020%,%2..29-2 9.2 %-:.0-& =%4,-./ - '''"#'$ #0'$ # 9## *"&#"#$#% ))' 2%#..,-<-24*',%2..2-- %.&0%.%:.? -0%%.,-: &.; 0-20-(:-:%0%21-;.2-.,2 $1.2-: =$ -2 " '9## "&$ #5"&#$#% ((' 王硕 王向红 郑文杰 等 ' 采用酶联免疫检测技术定量检测食品中伏马毒素 9 含量的试剂盒及其检测方法 =' 中国专利 $')(' &.?%9!"/9&-'*;&%,2%- 2..;"%1*,.2-.%2%,%2..2 9.2 $-&'%"& 9## ) ))' -22 $24# #2$'*;&%,2%- %&:0&%2-& -2.%:- 2..; 2/:,&.2? ))' ) 王君 ' 伏马毒素 9 免疫学检测方法的研究 *' 中国优秀硕士学位论文全文数据库 ' %&.24=',,2%--: =-0.0-& %-01 ',.0-%2.;.:=' 李招慧 姜盼盼 何计国 ' 孔雀石绿单克隆抗体的制备及鉴定 ' 食品科学 (((>' 吴瑜 孟淑芳 胡昌勤 等 ' 抗青霉素单克隆抗体的制备及初步应用 ' 细胞与分子免疫学杂志 ( ((' 9-2%2*9-9.2 '2-&:. %22-/%&..29%;.2.&?:" '%"&9##' ( 何继红 沈建忠 侯晓林 ' 多拉菌素人工抗原的制备与鉴定 ' 中国兽医杂志 ' ) ' 进口食品中伏马毒素 9 残留量检测方法 ' 王海涛 魏慧娟 马吉林 等 ' 食管癌高发区玉米中伏马菌素 9 的检测 ' 肿瘤防治研究 ( )' 宫慧芝 计融 杨军 等 ' 伏马毒素 9 免疫学检测方法的建立 ' 中国公共卫生 ))' 郭云昌 刘秀梅 刘江 ' 伏马毒素 9 免疫检测方法的研究 ' 卫生研究 )()' )&&%, < $-?..0/--- < ',%2..22%;&,:0%%.2.1 0-20 %,%.24-0.;.:%0:-.,,%2.&.%, '$+',"#'*"&#"#$)) ))' 上接第 页 刘宏 朱刚 王延 等 ' 口蹄疫双佐剂灭活疫苗免疫动物 &')()' 抗体持续期的研究 ' 中国兽医科学 ( 王文 胡峻 黄炯 等 ' 牛口蹄疫 型 亚洲 型二价灭 &:)' 活疫苗的临床试验与免疫后血清抗体的持续期 ' 中 ( 朱刚 黄炯 刘宏 等 ' 不同佐剂口蹄疫 型灭活疫苗国兽医科学 (&'((' 免疫效果的比较 ' 中国兽医科学 (