青少年科技创新大赛中学生项目 乳品增香菌的分离筛选及应用 学科类别 微生物学 学生 杨智博 学校 唐山市第一中学
摘要 : 乳制品营养丰富, 含有人体必需的多种营养成分, 是广受喜爱的风味食品 然而, 天然的乳制品往往香气不足或含有不良香气, 影响 整体风味 解决这一问题最有效地方法是利用乳味香精进行增香 通过脂肪酶 蛋白酶酶解天然奶油可获得奶香丰富的乳味香料, 有效改善乳品风味 本文从含有丰富乳脂肪的样品中, 经过多步分离筛选, 获得了若干株高产脂肪酶的菌株 综合酶活测定, 发酵液酸值及风味筛选结果确定其中一株高产脂肪酶菌株具有潜在的应用价值 通过菌株的革兰氏染色确定该菌株属于革兰氏阴性菌, 进一步对菌株的 16S rdna 序列进行分析, 确定该菌株属于铜绿假单胞菌 乳品增香菌的分离与鉴定, 将为该菌株的进一步研究及在乳品调香领域的应用提供理论依据 关键词 : 增香菌 ; 脂肪酶 ; 筛选 ; 鉴定 2
目录 摘要...3 1. 引言...4 2. 材料与方法...5 2.1 实验材料...5 2.2 培养基成分...6 2.3 菌株的筛选与分离...6 2.4 酸碱滴定法测定脂肪酶活力...6 2.5 发酵液酸值测定...6 2.6 菌种鉴定...7 3. 筛选与鉴定...8 3.1 产脂肪酶菌株的筛选...8 3.2 备选菌株脂肪酶的活力测定...9 3.3 发酵液酸值测定及风味评估...10 3.4 产脂肪酶菌株鉴定...11 3.4.1 菌落形态观察及革兰氏染色...11 3.4.2 菌株 16SrDNA 序列测定...12 4. 结论...16 5. 进一步完善该项目的设想...16 6. 收获和体会...17 7. 参考文献...18 致谢...19 3
1. 引言 乳味香精是一种具有奶香香气的食品添加剂, 主要用于糖果 饮 料 冷食 焙烤食品等增香, 是食品工业中应用最为广泛的香精之一 [1] 乳味香精能够给食品原料赋予香气, 补充原有香气的不足, 矫正食品中的不良香气, 从而达到理想的整体风味 乳味香精可以通过化学法和生物法进行制备 其中化学法制备的 乳味香精是由一些化学合成的单体物质 溶剂或载体以及某些食品添加剂所组成的具有一定香型的混合物 工艺简单 成熟, 可工业化大生产 但该类型的香精香味单一, 与天然的奶香具有较大差距, 且在 食品健康越来越被关注的今天, 消费者对非天然的添加物较为排斥, 尤其是 2008 年的三聚氰胺事件对乳品行业带来了致命的打击, 在一定程度上限制了化学香精在食品领域内的应用 随着人们环保意识和 自我保健意识的增强, 食用纯天然 无污染 高品质的绿色食品, 已经成为广大消费者的共识 因此, 利用生物技术等方法获得天然风味物质是必然的趋势 以奶油 稀奶油 黄油等乳脂肪为原料, 通过脂肪酶水解作用可将奶油在一定条件下进行水解以增香 150-250 倍, 产生具有奶香特征的化合物 从 20 世纪 70 年代至今国内外有许多关于酶法制备乳味香 精的报道 酶法制备的乳味香精是天然的食品添加剂, 香气自然 柔和 奶味更加醇厚 留香持久浓郁, 因此以酶水解乳脂肪产物做为增香剂是研究的热点领域之一 该法的关键酶 脂肪酶是一种特殊的酯键水解酶, 可以将脂肪分解为甘油酯和脂肪酸, 能在油水界面上催化脂类物质分解 合成和酯交换反应 脂肪酶广泛的存在于动植物和微生物中 植物中含脂肪 酶较多的是油料作物的种子, 如蓖麻籽 油菜籽, 当油料种子发芽时, 脂肪酶能与其他的酶协同发挥作用催化分解油脂类物质生成糖类, 提供种子生根发芽所必需的养料和能量 ; 动物体内含脂肪酶较多的是高 等动物的胰脏和脂肪组织, 在肠液中含有少量的脂肪酶, 用于补充胰脂肪酶对脂肪消化的不足, 在肉食动物的胃液中含有少量的丁酸甘油酯酶 在动物体内, 各类脂肪酶控制着消化 吸收 脂肪重建和脂蛋 白代谢等过程 ; 细菌 真菌和酵母中的脂肪酶含量更为丰富 由于微生物种类多 繁殖快 易发生遗传变异, 具有比动植物更广的作用 ph 作用温度范围以及底物专一性, 且微生物来源的脂肪酶一般都 是分泌性的胞外酶, 适合于工业化大生产和获得高纯度样品, 因此微
生物脂肪酶是工业用脂肪酶的重要来源, 并且在理论研究方面也具有重要的意义 研究表明, 产脂肪酶的微生物大约有 65 个属, 其中细菌 28 个属 放线菌 4 个属 酵母菌 10 个属 其他真菌 23 个属 微生物种类真菌酵母放线菌革兰氏阳性菌革兰氏阴性菌 表 1.1 产脂肪酶的主要微生物 属 根霉 曲霉 青霉 毛霉, 阿舒囊霉, 地丝菌, 白僵菌, 根毛霉, 镰刀菌 假丝酵母 耶氏酵母 红酵母 毕赤酵母 酵母 丝孢酵母 汉逊酵母 球拟酵母 链霉菌 杆菌 葡萄球菌 乳杆菌 链球菌 微 球菌 丙酸杆菌 伯克霍尔德氏菌 胞菌 假单胞菌 色素细菌 不动杆菌 气单 本课题主要以含有丰富乳脂肪的样品为原料, 经分离筛选, 期待 获得能够高产脂肪酶, 且水解产物能够有有效调整天然乳品香味的菌株 并对菌株进行分类鉴定, 为进一步研究提供基础, 使新型的乳品 增香菌能够广泛应用于乳品调香领域中, 增加乳品风味 2. 材料与方法 2. 1 实验材料 产品 超市购得的各种品牌的干酪 奶油 奶酪 芝士等富含乳脂肪的 2. 2 培养基成分 富集培养基 : 蛋白胨 0.5% 酵母浸膏 0.5% NaCl 0.05% CaCl 2 0.05% 橄榄油乳化液 1% ( 橄榄油乳化液 : 聚乙烯醇 5% 蒸馏水 95%; 聚乙烯醇溶解液 : 橄榄油 =3:1)121 C 灭菌 15min 初筛培养基 : 牛肉膏 0.5% 稀奶油乳化液 1% 琼脂 1.5% 罗 5
丹明 0.05% ( 稀奶油乳化液 :4% 聚乙烯醇 96% 蒸馏水 ; 聚乙烯醇溶解液 : 稀奶油 =4:3)121 C 灭菌 15min 三丁酸甘油酯复筛培养基 :Tris-HCl 缓冲液 : 三丁酸甘油酯乳化液 =9:1 琼脂 1.5% ( 三丁酸甘油酯乳化液 :4% 聚乙烯醇 96% 蒸馏水 ; 聚乙烯醇溶解液 : 三丁酸甘油酯 =9:1)121 C 灭菌 15min 2. 3 菌株的筛选与分离 分别取各种原料的 5.0g 样品混悬于 50mL 无菌的生理盐水中, 剧烈振荡 取 2mL 样液接种于 50mL 富集培养基中, 摇床 28 C,180rpm, 培养 48h 随后将富集培养液梯度稀释, 取不同浓度样液 0.1mL 于罗丹明初筛平板, 涂布均匀,28 C 静置培养 72h 从初筛平板上挑选带有荧光圈 不同形态的菌落, 接种至 PDA 平板上,28 C 培养 72h 多次分离纯培养获得单菌落 挑取单菌接种至 10mL 液体培养基中, 摇床 28 C,180rpm, 培养 72h 最后, 将液体发酵液 4 C,10000rpm, 离心 10min 上清液加入三丁酸甘油酯打孔平板中,28 C 培养 72h, 观察测量水解圈大小变化 2. 4 酸碱滴定法测定脂肪酶活力 取两个 250mL 锥形瓶, 分别标为 A 瓶和 B 瓶 A 瓶为空白对照, B 瓶为样品瓶 分别在两个瓶中加入 5mL 磷酸缓冲液和 4mL 橄榄油乳化液,28 C 水浴保温 5min, 在 B 瓶中加入 1mL 酶液 反应 10min, 取出后立即在两瓶中都加入 95% 的乙醇 15mL, 在 A 瓶中加入 1mL 酶液 滴加 3 滴酚酞, 用 0.05mol/L NaOH 滴定 酶活力 (U/mL)=n(V-V0)/t*50, 其中 V 代表滴定样液所消耗的 NaOH 体积 (ml),v0 代表滴定空白样液所消耗的 NaOH 体积 (ml),t 代表反应 时间 (min),n 代表样品的稀释倍数 1mL 酶液于 28 C,pH7.5 条件下, 水解脂肪每分钟生成 1μmol 脂肪酸定义为 1 个酶活力单位 2. 5 发酵液酸值测定 将筛选到的菌株接种至 50mL 稀奶油中, 摇床 28 C,180rpm 培养 72h 发酵后测 AV 值, 并且初试风味 AV 值测定 : 将含有 0.5mL 酚酞指示剂溶液和 50mL 95% 以上浓 度的乙醇置入三角瓶中, 加热至沸腾, 当乙醇的温度高于 70 C 时, 用 0.1mol/L 的氢氧化钠溶液滴定至溶液变色, 并保持 15s 不退色 将中和后的乙醇倒入装有 2.5g 样品的三角瓶中, 充分混合, 煮沸, 用 6
氢氧化钠滴定至溶液变色 并保持 15s 不退色 即为滴定终点 记录 所使用的氢氧化钠的体积 酸值计算公式 AV=40*C*V/m 其中 40 为氢氧化钠的摩尔质量(g/mol) C 代表所用氢氧化钠标准溶液的浓度 (mol/l) V 代表所用氢氧化钠标准溶液的体积(mL) 2. 6 菌种鉴定 挑单菌与培养基平板划线 28 C 培养 72h 观察菌落形态 以结晶紫 碘液经涂片 干燥 固定 初染 水洗 媒染 脱色 复染 干燥等步骤进行革兰氏染色 利用显微镜下镜检观察 将单菌接种于液体培养基 利用试剂盒提取菌株基因组 以基因 组为模板 利用引物 27F (5'-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ) 1495R (5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA -3 ) 扩增大小约 1.6kb 的 16S rdna 片段 扩增使用 KOD-plus DNA 高保真聚合酶(Fermentas 公司产品) 扩增条件为 94 C 5 min 94 C 30 s 55 C 30 s 68 C 2 min 以上程序运行 30 个循环 最后 68 C 运行 10min 扩增产物交 由潍捷基生物技术有限公司进行序列测定 测序结果利用 BLASTn 与数据库序列进行比对 根据序列匹配结果确定菌株分类 图 2-1 显微镜观察测定菌株分类 7
3. 筛选与鉴定 3. 1 产脂肪酶菌株的筛选 脂肪酶可降解油脂产生脂肪酸, 罗丹明 B 的阳离子能与脂肪酸发生反应, 紫外光照射下呈现橙黄色荧光 因此, 将备选样品涂布于 同时含有油脂和罗丹明 B 的平板, 如备选样品中含有高产脂肪酶的菌株, 则该菌落周围紫外光照射下会呈现橙黄色的荧光 本实验初筛过程采用稀奶油乳化液作为唯一的碳源, 该培养基营养缺乏, 含油量 极高, 一般的菌株很难在其平板上生长, 只有能够有效降解油脂的菌株才能够维持生长 以上选择压力辅以荧光观察, 有效地筛选到了 13 株备选目标菌株 图 3.1 利用罗丹明平板进行产脂肪酶菌株的初筛 除罗丹明平板筛选外, 三丁酸甘油酯透明圈法是常见的产脂肪酶菌株的筛选方法 脂肪酶分解平板中的三丁酸甘油酯产生透明圈, 且透明圈越大表明其脂肪活力越高 利用该方法, 本实验针对初筛获得的备选菌株进行复筛, 结果表明, 其中八株备选菌株均能够在三丁酸甘油酯平板上产生透明圈, 证明其合成脂肪酶的能力, 但透明圈大小各不相同, 分别以 A-H 进行命名 8
图 3.2 利用三丁酸甘油酯平板进行产脂肪酶菌株的复筛 3. 2 备选菌株脂肪酶的活力测定 为了精确评估备选菌株的产脂肪酶能力 需要对菌株产脂肪酶的 活力进行测定 但该酶的酶解反应易受底物的种类形态 反应时间 反应温度 体系的酸度等多种因素的影响 其反应较为复杂并且稳定 性差 在测定脂肪酶活力时往往会造成一定的误差 常用测定酶活力 的方法有酸碱滴定法 铜皂法 对硝基苯酚法和正乙烷抽提法 酸碱 滴定法相较其他三种方法而言操作简单 毒性小 危险性低 因此 本实验采用该方法进行脂肪酶活力的检测 图 3-3 分离培养被选株菌 9
将初筛得到的备选菌株经分离纯培养, 获得的单菌落接种于液体 培养基进行扩培, 上清液用酸碱滴定法测定脂肪酶活力, 检测结果如 表 3.1 所示 表 3.1 产酶菌株脂肪酶活力测定结果 菌株 V-V 0 (ml) U(U/mL) A 0.05 0.25 B 0.20 1.00 C 0.07 0.35 D 0.10 0.50 E 0.02 0.10 F 0.21 1.05 G 0.60 3.00 H 0.05 0.25 分析表 3.1 数据可知, 菌株 B F G 的脂肪酶活力与其余菌株 相比较为突出 但是, 实验发现酸碱滴定法的重复性不高 有报道表明, 造成该问题最重要的原因是橄榄油乳化液乳化程度不同 [25] 在酶 未完全被底物饱和的情况下, 乳化液微粒的大小直接影响酶活力的测定结果 微粒越小, 与脂肪酶的接触面积越大, 测定的活力也越高 制作橄榄油乳化液时, 由于聚乙烯醇为高分子聚合物, 在 90 以上 的高温下, 搅拌一个多小时才能将其溶解 温度过高超过 100 以上慢慢变色 脆化, 造成每次制作的乳化液差异性较大, 乳化液微粒大小不一致 因此, 在酸碱滴定测定的酶活力的基础上, 还需结合其他 的方法, 如发酵液的酸值即游离脂肪酸测定和风味评估结果对菌株的产脂肪酶的能力和质量进行综合评价 3. 3 发酵液酸值测定及风味评估 将 8 株备选菌株接入稀奶油, 发酵 72h 后测定发酵液酸值如表 3.2 10
所示 表 3.2 稀奶油发酵液酸值及风味评价 菌株 V(mL) AV(g/mg) 风味 A 0.81 3.216 香味无明显变化 B 1.00 3.600 香味无明显变化 C 5.52 8.659 酸味 D 2.01 2.600 酸败味 E 2.85 4.506 淡奶味 F 3.00 4.800 帕莫森干酪味 G 2.60 4.160 香味无明显变化 H 0.82 1.420 烤面包味 由表 3.2 分析可知, 菌株 C E F 的酸值与其余相比较为突出 从风味角度来评估, 菌株 E 发酵液有淡奶味 菌株 F 发酵液有干酪味 菌株 H 发酵液有烤面包味, 与其他菌株发酵液相比呈现了较为理想的风味 综合比较产酶培养液的酶活力测定结果 稀奶油发酵液的酸值及风味评估结果, 确定菌种 F 为目标菌株, 进行下一步鉴定 3. 4 产脂肪酶菌株鉴定 3. 4. 1 菌落形态观察及革兰氏染色 将菌株 F 于 PDA 平板进行划线,28 C 培养 72h, 菌落形态如图 3.4 左图所示, 该菌株菌落为白色, 圆形, 表面隆起, 边缘整齐 11
图 3.4 菌株 F 的菌落形态 左 和革兰氏染色镜检观察 右 进一步对该菌株进行革兰氏染色 显微镜观察确定该菌株属于革 兰氏阴性菌 呈球状 3. 4. 2 菌株 16S rdna 序列测定 16S rdna 是编码原核生物核糖体小亚基 rrna(16s rrna)的基 因 长度约为 1500bp 其序列是细菌分类学研究中最常用的分子依 据 本实验利用针对细菌 16S rdna 的简并引物 以菌株 F 基因组为 模板进行 16S rdna 的扩增 获得约 1.5kb 大小的目的条带(图 3.5) 图 3.5 菌株 F 16S rdna 扩增电泳检测结果 对扩增产物进行序列测定 经 BLASTn 比对发现 该序列与铜 绿假单胞菌(Pseudomonas Aeruginosa) DSM50071 的 16S rdna 序列 (NR_026078.1)具有 99.6%的相似度(图 3.6) 除此 菌落形态观察及 革兰氏染色结果与文献报道的铜绿假单胞菌特征相符 因此 确定经 12
分离筛选得到的高产脂肪酶的菌株 F 为铜绿假单胞菌, 命名为 Pseudomonas Aeruginosa YZB01 10 20 30 40 50 60 DSM50071GAACTGAAGAGTTTGATCATGGCTCAGATTGAACGCTGGCAGCAGGGGCCTTCAACACAT YZB01 GAACTGAAGAGTTTGATCATGGCTCAGATTGAACGCTGGCAGCAGGGGCCTTCAACACAT 70 80 90 100 110 120 DSM50071GCAAGTCGAGCTTATGAAGGGAGCTTGCCTTGGATTCAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGC YZB01 GCAAGTCGAGCTTATGAAGGGAGCTTGCCTTGGATTCAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGC 130 140 150 160 170 180 DSM50071CTAGGAATCTGCCTGGTAGTGGGGGATAACGTCCGGAAACGGCCGCTAATACCGCATACG YZB01 CTAGGAATCTGCCTGGTAGTGGGGGATAACGTCCGGAAACGGCCGCTAATACCGCATACG 190 200 210 220 230 240 DSM50071TCCTGAGGGAGAAAGTCGGGGATCTTCGGACCTCACGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGA YZB01 TCCTGAGGGAGAAAGTCGGGGATCTTCGGACCTCACGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGA 250 260 270 280 290 300 DSM50071TTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGA YZB01 TTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGA 310 320 330 340 350 360 DSM50071TGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGA YZB01 TGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCATACGGGAGGCAGCAGTGGGGA 370 380 390 400 410 420 DSM50071ATATTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCG YZB01 ATATTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCG 430 440 450 460 470 480 DSM50071GATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGCAGTAAGTTAATACCTTGCTGTTTGACG YZB01 GATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGCAGTAAGTTAATACCTTGCTGTTTGACG 490 500 510 520 530 540 13
DSM50071TTACCAACAGAATAAGCACCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGTG YZB01 TTACCAACAGAATAAGCACCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGTG 550 560 570 580 590 600 DSM50071CAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAAGTGGTTCAGCAAGCTTGATG YZB01 CAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAAGTGGTCCAGCAAGCTTGATG 610 620 630 640 650 660 DSM50071TGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCCAAAAGCTACTGAGCTAGAGTACGGTA YZB01 TGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCCAAAAGCTACTGAGCTAGAGTACGGTA 670 680 690 700 710 720 DSM50071GAGGTGGTAGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTG YZB01 GAGGTGGTAGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTG 730 740 750 760 770 780 DSM50071GCGAAGGCGACCACCTGGACTGTACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAG YZB01 GCGAAGGCGACCACCTGGACTGTACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTTGGGAGCAAACAG 790 800 810 820 830 840 DSM50071GATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGACTAGCCGTTGGGATCCTTGA YZB01 GATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGACTAGCCGTTGGGATCCTTGA 850 860 870 880 890 900 DSM50071GATCTTAGTGGCGCACGTAACGCGATAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTT YZB01 GATCTTAGTGGCGCACGTAGCGCGATAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTT 910 920 930 940 950 960 DSM50071AAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAA YZB01 AAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAA 970 980 990 1000 1010 1020 DSM50071GCAACGCGAAGAACCTTACCTGGCCTTGACATGCTGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGT YZB01 GCAACGCGAAGAACCTTACCTGGCCTTGACATGCTGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGT 1030 1040 1050 1060 1070 1080 14
DSM50071GCCTTCGGGAACAGAGACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGT YZB01 GCCTTCGGGAACAGAGACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGT 1090 1100 1110 1120 1130 1140 DSM50071TGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCAGCACCTCGGGTGGGC YZB01 TGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCAGCACCTCGGGTGGGC 1150 1160 1170 1180 1190 1200 DSM50071ACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCAT YZB01 ACTCTAAGGAGACTGCAGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCAT 1210 1220 1230 1240 1250 1260 DSM50071GGCCCTTACGGCCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAAAGGGTTGCCAAGCC YZB01 GGCCCTTACGGCCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAAAGGGTTGCCAAGCC 1270 1280 1290 1300 1310 1320 DSM50071GCGAGTGGGAGCTAATCCCATAAAACCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGAC YZB01 GCGAGTGGGAGCTAATCCCATAAAACCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGAC 1330 1340 1350 1360 1370 1380 DSM50071TGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGAATCAGAATGTCACGGTGAATACGTCCCCG YZB01 TGCGTGAAGTCGGCATCGCTAGTAATCGTGAATCAGAATGTCACGGTGAATACGTCCCCG 1390 1400 1410 1420 1430 1440 DSM50071GGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCTCCAGAAGTAGCTAGTCT YZB01 GGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCTCCAGAAGTAGCTAGTCT 1450 1460 1470 1480 1490 1500 DSM50071AACCGCAAGGGGGACGGTTACCACGGAGTGATTCATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGG YZB01 AACCGCAAGGGGGACGGTTACCACGGAGTGATTCATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGG 1510 1520 1530....................... DSM50071TAGCCGTAGGGGAACCTGCGGCTGGATCACCTCCTTA YZB01 TAGCCGTAGGGGAACCTGCGGCTGGATCACCTCCTTA 图 3.6 Pseudomonas Aeruginosa YZB01 与模式菌株 16S rdna 序列比对 15
4. 结论 乳制品因品种丰富, 营养价值高, 是广受喜爱的风味食品 然而 天然乳制品往往含有不良气味, 影响产品品质 利用乳品香精可以对天然乳制品进行调香, 但化学香精因其非天然性, 应用受到极大限制, 而生物法制备香精越来越受到人们的重视 其中利用脂肪酶 蛋白酶酶解天然奶油获得奶香丰富的乳味香料是该领域的重要方向 为了寻找新型的脂肪酶, 利用其酶解作用制备风味独特的乳制品 本课题的创新点是 : 1) 以含有丰富乳脂肪的样品为原料, 经过多步分离纯培养, 获得了若干株高产脂肪酶的菌株 2) 综合酶活测定, 发酵液酸值及风味筛选结果确定其中一株高 产脂肪酶菌株具有潜在的应用价值, 通过菌株的革兰氏染色确定该菌株属于革兰氏阴性菌, 进一步对菌株的 16S rdna 序列进行分析, 结合菌落形态观察确定该菌株属于铜绿假单胞菌 3) 乳品增香菌的分离与鉴定, 为研究的进一步开展提供了有利的基础 5. 进一步完善该项目的设想 为了使筛选菌株能够更有效的合成脂肪酶, 进一步的工作需要对产酶条件加以优化, 包括碳源, 氮源, 无机盐条件等, 并对不同条件进行组合, 从而确定菌株脂肪酶合成的最优条件 通过分析添加了菌 株发酵液的牛奶中各类脂肪酸的分布变化, 阐明乳制品风味变化的机理, 从而更加理性的指导乳制品的调香工作, 获得风味独特, 口感优秀的乳制品产品 当然, 如上所述, 生物安全性问题不容忽视, 因此 仍需要对筛选菌株进行生物安全性的全面评估, 保证乳品质量和人类健康 16
6. 收获和体会 经过一年来的学习探讨和阶段的试验, 我收获了很多 首先, 我收获了太多科学知识 从选题到试验一直到撰写论文, 我通过查找资料, 虚心咨询, 不耻下问, 学到了很多书本以外甚至是 生物学领域比较专业的知识, 虽然有些知识我只是略懂了些皮毛, 但这是我从课本走向生活, 从生活探索挖掘知识的途径, 我的视野开阔了, 回到课堂, 感觉学习也更有兴趣 其次, 实验的开展增强了我的实践操作和动手应用能力 我逐渐认识到生物科学是一门实验科学, 单单了解理论知识是远远不够的, 更需要通过在实践过程中发现新现象, 揭示新问题, 科学思维也得到 了充分的锻炼 再次, 我认识到了从事科学研究所必需的严谨态度, 这将使我更加认真对待今后的学习生活, 这一态度的养成也将使我在生活的各个 方面受益匪浅 最后, 在实验的过程中我与老师同学充分沟通, 体验到与人交流的快乐, 感受到了来自各个方面的温暖, 也使我学会了帮助别人 17
参考文献 [1] 白卫东, 张惠丹, 蔡育能, 汪薇等. 酶法制备天然奶味香精的研究进展. 中国食品添加剂. 2009, 6: 193-196. [2] 汪薇, 赵文红, 白卫东, 罗百然等. 乳酸菌发酵剂制备天然奶味香 精的研究. 食品与发酵工业. 2010, 36 (10): 191-195. [3] 张之涤. 酶法奶类香精的研制及其应用. 中国食品添加剂. 1999, 4: 51-53. [4] 薛静, 陶树兴, 田泽英, 苏蕊, 丛寅. 脂肪酶产生菌的筛选产酶条件及酶特性研究. 安徽农业科学. 2011, 39 (15): 8826-8830. [5] 武彦文, 欧阳杰, 张津凤等. 酶法水解奶油制备奶味香精的研究. 中国调味品. 2003, 298 (12): 39-42. [6] 刘志东, 郭本恒, 王荫榆等. 脂肪酶酶解黄油制备天然乳味增香物的研究. 食品工业科技. 2010, 9: 208-210. [7] 陈影, 赵征. 解脂假丝酵母脂肪酶水解乳脂肪的研究. 广州食品工业科技. 2010, 120, (1): 42-44. [8] 刘敏尧, 张军, 刘靓, 陈金发. 一种利用复合酶制剂制备奶味香 精的方法. 200610013839. 4. [9] 徐正萍, 张树林. 高倍风味强度酶解黄油的制备方法及在奶味香精中的应用. 201110089065. 4. [10] 孟玲, 王慧. 脂肪酶产生菌的筛选及产酶条件优化. 沈阳化工大学学报 2010, 24 (1): 15-19. [11] 沈同, 王镜岩. 生物化学 [M]. 北京高等教育出版社. 1991: 151-152. [12] 郭冉冉. 高产脂肪酶菌株的筛选及酶学性质的研究. 西南大学硕士学位论文. 2010: 3-24. [13] 江慧芳, 王雅琴, 刘春国. 三种脂肪酶活力测定方法的比较及改进. 化学与生物工程. 2007, 24 (8): 72-75.
致谢 本项目是在唐山一中于艳侠 王敬敏 郑玮老师的细心指导下完 成的 几位老师从论文的选题 研究方案的设计 实验技术的指导 研究工作的开展以及论文的撰写等各个方面给予了无微不至的帮助, 使我顺利完成项目研究并取得阶段性的进展 感谢唐山协和医院的乔国玉实验师, 在微生物基本操作及分子生物学实验方面所给予的指导, 让我认识微生物的魅力, 也使我对生物领域的兴趣进一步加深 感谢我的父母在实验过程中的陪伴和鼓励, 在遭遇困难的时候帮助我重拾信心, 最终我完成了一件自己难以想象的事情 实验的每一步, 都得到许多人的扶持 在此向给予我关心 帮助 和支持的所有老师 同学和家人表示最衷心的感谢!