2012 年 1 月 Jan.2012 第 33 卷第 1 期 Vol.33 No.1 doi:10.3969/j.isn.1671-7775.2012.01.002 桑黄菌诱变菌株液体发酵试验 马海乐 1, 闫景坤 1, 祝子坪 1, 郑惠华 2 1, 杨小明 (1. 江苏大学食品与生物工程学院, 江苏镇江 212013;2. 江苏安惠生物科技有限公司, 江苏南通 226009) 摘要 : 以激光 - 紫外线复合诱变筛选的桑黄菌菌株 S1 为研究对象, 通过单因素试验初步研究了液体发酵条件, 根据二次回归旋转正交组合设计确定的最佳发酵条件为 : 装瓶量 120mL 接种量 17mL 发酵温度 26 摇床转速 135r min -1, 并通过验证试验得到实际菌丝产量为 (24.47±0.80)g L -1. 在此基础上进行了小型发酵罐试验, 得到的最佳发酵条件为 : 搅拌速度 180r min -1 温度 29 空气流量 6L min -1, 得到的菌丝和胞外多糖产量分别为 (68.23±2.51)g 和 (10.23±0.35)g. 关键词 : 桑黄菌 ; 诱变菌株 ; 液体发酵 ; 胞外多糖 ; 二次回归旋转正交组合设计中图分类号 :S646 文献标志码 :A 文章编号 :1671-7775(2012)01-0006-05 Liquidfermentationexperimentofmutagenicstrain from Phelinusigniarius MaHaile 1,YanJingkun 1,ZhuZiping 1,ZhengHuihua 2,YangXiaoming 1 (1.ColegeofFoodScienceandBiologicalTechnology,JiangsuUniversity,Zhenjiang,Jiangsu212013,China;2.JiangsuAlphayBiologi caltechnologycompanylimited,nantong,jiangsu226009,china) Abstract:PhelinusigniariusstrainS1mutagenizedwithlaserandUVwaschosentostudytheconditions ofliquidfermentationbysingle factorexperiment.basedonquadraticorthogonalrotationcombinationde sign,theoptimumconditionsweredeterminedasmediaamountof120mlwithinoculumsizeof17ml, andfermentationtemperatureof26 atrotatespeedof135r min -1.Accordingtoverificationexperi ment,theactualmycelialyieldwasattherangeof(24.47±0.80)g L -1.Thecompactfermentorex perimentwasconductedbasedonthedesignedoptimum conditions.theresultsshowthattheoptimum fermentationconditionswerewithstiringspeedof180r min -1 attemperatureof29 withairflowof 6L min -1.Themyceliaandexpolysaccharideyieldscanreachtherangeof(68.23±2.51)gand (10.23±0.35)g,respectively. Keywords:Phelinusigniarius; mutationalstrain;liquid fermentation; expolysaccharide; quadratic orthogonalrotationcombinationdesign 桑黄菌 (Phelinusigniarius) 为多孔菌科层孔菌属的珍贵药用真菌, 有 森林黄金 之美称 [1], 多糖是其主要功效成分, 具有广泛的药理活性和独特的药用价值, 如免疫调节 抗肿瘤 抗氧化和抗发炎等 [2-6], 其中桑黄多糖的抗肿瘤作用是已知高等真菌中抗肿 瘤效果最好的真菌之一, 对 S 180 胃癌的抑制作用较灵芝 巴西蘑菇等药用真菌还强 [7-8], 具有开发天然抗肿瘤药物的潜力, 已成为国内外研究的热点. 为提高发酵产量和增加经济效益, 有必要对发酵 [9] 菌种进行有目的地选育, 祝子坪等采用激光 - 紫外 收稿日期 :2011-02-02 基金项目 : 江苏高校优势学科建设工程资助项目作者简介 : 马海乐 (1963 ), 男, 陕西咸阳人, 教授, 博士生导师 (mhl@ujs.edu.cn), 主要此事农产品物理加工及食品生物技术研究. 闫景坤 (1982 ), 男, 山东临沂人, 讲师, 博士 (jkyan_27@163.com), 主要从事功能多糖研究.
第 期 马海乐等 桑黄菌诱变菌株液体发酵试验 线复合技术对桑黄菌进行诱变得到具有较高稳定遗 采用四因子二次回归正交旋转组合试验对诱变菌株 传性和较高多糖产量的优良菌株 Ｓ 因此 文中以课 Ｓ 液体发酵条件进行优化 设计试验因素水平 为独特研究对象 研究 题组前期筛选的优良菌株 Ｓ 如表 所示 液体发酵条件对其菌丝产量的影响 采用旋转正交组 表 各因素水平编码表 合设计优化发酵条件 并在此基础上进行小型发酵罐 试验 为工业化生产提供参考 因素 水平 装瓶量 ｍｌ 接种量 材料与方法 材 料 菌 株 桑黄菌诱变菌株 Ｓ 江苏大学食品与生物工程 学院微生物实验室保藏 培养基 液体种子培养基 由葡萄糖 蛋白胨 酵母粉 磷酸二氢钾 硫酸镁 组成 加 自来水配制至 ｍｌ 发酵培养基 由小麦粉 米糠 磷 硫酸镁 组成 加自来水配 酸二氢钾 制至 ｍｌ 仪 器 ＤＺＦ 型真空干燥箱 上海益恒实验仪器有 限公司 ＹＣ 恒温培养摇床 上海福玛实验设备 有限公司 ＢＪ Ｂ Ⅲ 型玻璃发酵系统 镇江格瑞生物 工程有限公司 Ｒ 旋转蒸发仪 Ｂ 公司 方 法 摇瓶液体发酵培养 摇瓶液体发酵培养 在 ｍｌ三角瓶中装一 温度 摇床转速 ｍ 结果与讨论 不同发酵条件对菌丝体产量的影响 装瓶量对菌丝体产量的影响 培养基的装瓶量不仅影响着摇瓶中溶解氧的含 量 还会影响培养液内代谢产物及有害成分的质 量浓度 因此装瓶量对菌丝生长有较大的影响 从图 可以发现 菌丝体发酵总产量随培养基装瓶量的 增加呈先增加后减小的趋势 在 ｍｌ时达最大 值 ｍｌ后趋于平缓 对单位培养基平均发酵产 量来说 随着装瓶量的增加 总体呈下降趋势 ｍｌ处有较大变化 ｍｌ后同样趋于平缓 因此 兼顾发酵菌丝体产量和培养基利用率 选择 ｍｌ 的装瓶量 定量的发酵培养基 接种 Ｓ 菌种 进行摇瓶发酵培 养 发酵结束后过滤菌丝 自来水冲洗干净后烘干至 恒重 计算菌丝平均发酵产量 试验中分别考察培养 基装瓶量 Ｘ 接种量 Ｘ 发酵温度 Ｘ 和摇床转速 Ｘ 对菌丝发酵产量的影响 每个处理水平重复 次 小型发酵罐发酵试验 Ｌ发酵罐中装 Ｌ发酵培养基 质量分数 的大豆油作消泡剂 接种质量分数 的液 体菌种 依次考察发酵罐搅拌转速 空气流量和发酵 温度对发酵菌丝体和胞外多糖 ＥＰ 产量的影响 发酵时间为 发酵结束后离心 ｍ 收集菌丝体洗净后烘干称重 发酵液离心 ｍ 上清液浓缩用体积分数 乙醇沉淀得胞 外多糖 洗净后烘干称重 发酵条件优化 在 摇瓶发酵培养 单因素试验基础上 图 装瓶量对菌丝体产量的影响 接种量对菌丝体产量的影响 发酵菌丝的生长是从菌种为出发点的 接种量 的多少直接影响到发酵产量的高低 本试验接种量 因素共设 个水平 试验结果见图 从图中可以看 出 随着接种量的增加 桑黄菌 Ｓ 单位培养基菌丝 体产量呈增加趋势 当接种量达到 后 菌丝体 产量趋于平缓
第 卷 矩阵来实施试验 每个试验重复 次 取平均值 结 构矩阵及试验结果见表 表 试验安排及结果 图 接种量对菌丝体产量的影响 温度对菌丝体产量的影响 温度对微生物的生长起着非常重要的作用 适 宜的温度能使微生物在短期内得到大量的繁殖 产 生较多的次生代谢产物 本试验设计了 个温度梯 度进行试验 结果见图 由图可以看出 随着温度 时产量 的增加 菌丝体产量先增加后降低 在 最高 为发酵的最佳温度 产量 序号 Ｘ Ｘ Ｘ Ｘ Ｌ 图 温度对菌丝体产量的影响 转速对菌丝体产量的影响 对发酵液适当的搅动 可以促进氧气溶解 有利 于耗氧型微生物的快速生长和繁殖 因此摇床转速 对桑黄菌发酵产量有一定影响 本试验设计了 个 摇床转速水平进行试验 结果见图 从图中可以看 出 随着转速的增加 菌丝体产量先增加后下降 在 转速为 ｍ 时产量最高 采用 ＳＡＳ 软件对试验结果进行统计分析 得到影响发酵菌丝产量的回归方程 Ｙ Ｘ Ｘ Ｘ Ｘ Ｘ ＸＸ ＸＸ ＸＸ Ｘ ＸＸ ＸＸ Ｘ ＸＸ Ｘ 从式 中可以发现 对发酵产量影响较大的 因素是发酵温度 接下来依次为接种量 摇床转速 和装瓶量 为了进一步考察回归方程 的拟合程 度 对所得回归模型进行方差分析 结果见表 Ｆ 检验和失拟 检 验 结 果 表 明 回 归 方 程 失 拟 项 不 显 著 说明本试验无其他因素的显著影响 模型是合 适的 拟合 不 足 被 否 定 回 归 项 在 水 平 上 显 著 说明试验 所 选 四 因 子 对 桑 黄 菌 发 酵 产 量 均 有 图 摇床转速对菌丝体产量的影响 显著影响 方程的决定系数 Ｒ为 校正 发酵条件优化 为 表 明 模 型 的 可 信 度 较 决定系 数 Ｒ 试验模型的建立与统计分析 按四因子二次回归正交旋转组合试验设计结构 高 与实际情况拟合较好 可以较好地解释试验的 变化情况
第 期 马海乐等 桑黄菌诱变菌株液体发酵试验 表 试验结果方差分析表 随着搅拌速度的增加 菌丝体和胞外多糖产量分 来源 自由度 均方 Ｆ 值 Ｐ Ｆ 别呈增加和降低的趋势 当达到 ｍ 后 菌 模型 丝体产量降低 而胞外多糖产量略有增加 见图 线性 因而 搅拌速度过快或过慢都不利于发酵生产 二次项 交互项 失拟项 净误差 Ｒ Ｒ 此外 为了分析方程各项对指标的影响程度 对 回归方程 中各项系数进行 检验 结果见表 图 搅拌速度对菌丝体和 ＥＰ产量的影响 表 回归系数检验表 因素 评估系数 标准差 Ｐ Ｘ Ｘ Ｘ Ｘ ＸＸ ＸＸ ＸＸ ＸＸ ＸＸ ＸＸ ＸＸ ＸＸ ＸＸ ＸＸ 从表中可以看出 对于交互项系数只有 ＸＸ 显 著 表明装瓶量和接种量有显著交互作用 其他交互 项系数不显著 发酵条件的模拟寻优和验证 通过编码进行规划求解 桑黄菌发酵菌丝产量的 Ｌ 对应的最优发酵条件为 理论极值为 装瓶量为 ｍｌ 接种量为 ｍｌ 温度为 转 速为 ｍ 在最优发酵条件下进行验证试验 得到菌丝产量 为 ± Ｌ 与理论值基本一致 小型发酵罐试验 搅拌速度对菌丝体和 ＥＰ产量的影响 各种发酵试验最终目的是为了获得理想的菌 种 并根据这些发酵试验获得的数据进行有效地放 大 因此 本试验采用小型台式发酵罐进行发酵 获 得的参数比摇瓶发酵更接近于生产 因而便于扩大 生产规模 空气流量对菌丝体和 ＥＰ产量的影响 空气流量对发酵菌丝体和胞外多糖的产量均有 较大影响 见图 随空气流量增加 菌丝体和胞外 后 两者趋 多糖产量均迅速增加 当达到 Ｌ ｍ 于平缓 且有下降趋势 因此 从节约能源考虑 采用 Ｌ ｍ 的空气流量为宜 图 空气流量对菌丝体和 ＥＰ产量的影响 发酵温度对菌丝体和 ＥＰ产量的影响 温度影响微生物生长代谢 是发酵控制的重要 参数 试验结果如图 所示 图 温度对菌丝体和 ＥＰ产量的影响 由图 可看出 随着温度增高发酵产量增加 在 时达到峰值 以后温度增高发酵产量降低 发酵生成试验 在 Ｌ发酵罐中装 Ｌ发酵培养基 加
第 卷 的大豆油作为消泡剂 接种 的液体菌种 搅拌 ｍ ｋ ｍ 速度为 ｍ 空气流量为 Ｌ ｍ 温度 ｍ ｍ ｍ ｍ Ｐ 发酵时间为 发酵结束后进行发酵产量 为 Ｂ Ｐ ｍ Ｂ 核算 结果如下 出罐量 ± Ｌ 离 心 ｍ ｍ 收集菌丝和发酵液 发 酵液体积为 ± Ｌ 发酵液浓缩用 ± 胞 乙醇沉淀多糖 得粗多糖量为 外粗多糖用硫酸苯酚法检测纯度为 菌丝 洗净 烘干 得菌丝干重为 ± Ｋ ＤＧ Ｃ ＬＨ Ｌ ＪＫ Ｅ ｍ Ｐ Ａｍ ＪＣ Ｍ 温 克 陈 劲 李 红 等 桑黄等四种抗癌药物抗 癌活性比较 吉林大 学 学 报 医 学 版 结 论 Ｗ Ｋ Ｃ Ｊ ＬＨ Ｃ ｍ ｍ ｍ ｍ 通过单因素试验得出桑黄菌诱变菌株 Ｓ 最 佳液体发酵条件 装瓶量 ｍｌ 接种量 发酵 温度 摇床转速 ｍ 对 Ｓ 菌丝发酵 产量影响的顺序为 发酵温 度 接 种 量 摇 床 转 速 装瓶量 Ｐ Ｊ Ｊ Ｕ Ｍ Ｃ Ｅ Ｚ Ｍ Ｃ ＳＷ Ｃ ＰＣＫ Ａ ｍ ｍｍ ｍ ｗ ｍ Ｔ Ｆ Ｓ Ｔ 对回归方程的方差分析和优化计算得到桑 黄菌诱变菌株 Ｓ 最佳发酵条件 装瓶量 ｍｌ 接 ｍｌ 发 酵 温 度 摇 床 转 速 种量 祝子坪 马海乐 曲文娟 Ｈ Ｎ激光与紫外线复合 诱变桑黄菌原生质体的研究 应用激光 ｍ 此条件下得到的菌丝产量为 Ｌ 通过 验 证 试 验 得 到 菌 丝 发 酵 产 量 为 ± Ｚ Ｚ ＭＨ ＱＷ ｊ Ｔ Ｌ 与理论值一致 发酵罐发酵得到桑黄菌诱变菌株 Ｓ 最佳发 ｍ 温度 空气流 酵条件 搅拌速度 量 Ｌ ｍ 在单因素试验的基础上进行生产试 ｍ ｍ ＵＶ Ｈ Ｎ ｍｐ Ａ Ｌ Ｃ 胡文彬 马海乐 周存山 桑黄菌液体发酵培养基及发 酵条件研究 中国食用菌 ± 胞外粗多糖量为 验 菌丝产量为 ＨＷ ＭＨ Ｚ Ｃ ± ｑ ｍ ｍ ｍ 参考文献 Ｒ 国家卫生部和国家中医药管理局 中华本草 第一 卷 Ｍ 上海 上海科学技术出版社 Ｃ Ｌ Ｐ ＬＺ ＬＸ Ｅ Ｐ Ｅ Ｆ Ｃ Ｃ 袁志发 周静芋 试验设计与分析 Ｍ 北京 高等教 育出版社 刘炳明 曹德斌 于迎春 等 杏鲍菇液体培养条件的 Ｐ ｍ 研究 中国食用菌 ｍ ｍ ｍｍ Ｉ Ｌ Ｂ ｍ Ｃ Ｄ ＹＹ Ｒ Ｉ ｍｍ Ｐ ｍ ｑ Ａ ｍ Ｙ Ｙ Ｚ ＪＳ Ｌ ＹＦ Ｏ ｍ Ｄ ｍ Ｐ Ｃ Ｒ Ｙ Ｙ ＹＬＢ Ｚ ＪＳ ＰＩ Ｓ Ｐ ｍ ｍ ｍ Ｅ Ｆ Ｃ Ｃ Ｐ ｊ Ｖ Ｃ ＴＳ ｍ ｚ ｍ ｍ ｍ ＵＶ ｍ Ｅ ｍ ｍ Ｐ Ｂ ｍ ｍ ｍｐ Ｂ Ｂ Ｂ ｍ Ｋ ｍｇｙ Ｒ ＳＩ Ｐ ｋｓｋ Ａ 责任编辑 祝贞学