萃 取 橘 子 皮 的 酯 化 酵 素 進 行 位 置 專 一 的 酯 水 解 反 應 一 實 驗 目 的 : 酵 素 催 化 在 有 機 合 成 課 程 中 是 很 重 要 的 課 題, 由 於 酵 素 催 化 反 應 具 高 轉 換 率 及 高 度 立 體 專 一 的 特 性, 近 年 來 普 遍 用 於 不 對 稱 合 成, 且 已 獲 致 相 當 好 的 結 果, 使 得 仿 生 合 成 儼 然 成 為 有 機 合 成 的 一 種 新 潮 流 本 實 驗 以 橘 子 皮 分 離 出 來 的 酯 化 酵 素, 進 行 位 置 專 一 性 的 酯 水 解 反 應, 並 觀 察 其 活 性, 使 學 生 能 學 習 從 天 然 物 萃 取 出 的 酵 素, 進 而 對 酵 素 催 化 的 原 理 有 一 定 的 認 識 二 實 驗 方 程 式 : H 3 H 3 H 2 range peel esterase H H 3 or H 3 + H 3 H H + H H 3 三 實 驗 原 理 : 酵 素 催 化 反 應 依 所 使 用 的 酵 素 類 型 可 區 分 為 : 1 氧 化 還 原 酵 素 (xidoreductases) 2 傳 遞 酵 素 (Transferases) 3 水 解 酵 素 (Hydrolases) 4 分 解 酵 素 (Lysases) 5 異 構 酵 素 (Isonerases) 6 結 合 酵 素 (Ligases) 酵 素 的 活 性 可 藉 測 量 其 化 學 變 化 而 測 定 之, 如 連 續 追 蹤 反 應 過 程, 可 發 現 反 應 速 率 很 快 降 低, 可 能 由 於 受 質 與 生 成 物 的 平 衡,pH 值 改 變 或 生 成 物 對 酵 素 的 抑 制 1 溫 度 的 影 響 :
溫 度 每 增 10, 約 可 使 反 應 速 率 增 加 一 倍, 但 也 使 酵 素 因 變 性 而 致 失 去 活 性, 在 此 情 形 下, 最 適 溫 度 決 定 於 反 應 時 間 2pH 值 影 響 : 酵 素 的 接 觸 活 性 在 一 狹 窄 的 ph 範 圍, 大 部 分 酵 素 的 最 適 ph 值 在 5~7 間, 在 此 ph 值 下 呈 最 穩 定 狀 態, 一 般 以 緩 衝 溶 液 控 制 其 ph 值 穩 定 3 受 質 的 影 響 : 在 固 定 條 件 下, 反 應 速 率 決 定 於 酵 素 與 受 質 的 濃 度,Michaelis & Menten 假 定 酵 素 (E) 與 受 質 (S) 先 形 成 一 複 合 體 (ES), 然 後 再 轉 變 成 生 成 物 與 酵 素 E + S ES P + E 以 豬 肝 酯 化 酵 素 (PLE) 為 例, 受 質 先 與 酵 素 的 活 性 位 置 結 合 形 成 複 合 體, 再 由 其 上 的 親 核 基 攻 擊 完 成 水 解 圖 一 為 豬 肝 酯 化 酵 素 (PLE) 的 Serine 活 性 位 置, * PLE ( 豬 肝 酯 化 酵 素 ) 之 立 體 專 一 性 : PB Ser H L : 大 的 親 水 性 結 合 點 H S : 小 的 親 水 性 結 合 點 HL HS P F : 前 端 極 性 基 結 合 點 PF P B : 後 端 極 性 基 結 合 點 Ser: 活 性 位 置 H 3 Ser
H 3 Ser 圖 一 其 中 H L 為 大 的 親 水 性 結 合 點,H S 為 小 的 親 水 性 結 合 點,P F 為 前 端 極 性 基 結 合 點,P B 為 後 端 極 性 基 結 合 點 具 對 位 取 代 受 質, 芳 香 環 可 置 於 H L,-R 置 於 Serine 活 性 位 置,R 位 於 H S, 主 要 產 物 為 ( 圖 二 2) 而 若 為 鄰 位 取 代 受 質, 則 芳 香 環 可 置 於 H S,R 位 於 H L,-R 置 於 Serine 活 性 位 置, 主 要 產 物 為 ( 圖 二 3) 由 於 受 質 不 同, 酵 素 催 化 可 選 擇 水 解 其 中 一 個 酯 基, 由 此 證 實 酵 素 催 化 的 專 一 性 一 般 以 4~6 個 學 生 為 一 組 並 用 相 同 的 羥 基 苯 甲 酸, 但 每 位 學 生 使 用 不 同 的 試 劑, 這 樣 便 可 合 成 一 系 列 的 雙 酯 衍 生 物, 接 著 每 一 種 雙 酯 以 橘 子 皮 酯 化 酵 素 ( 粗 萃 取 物 ) 買 來 的 豬 肝 酯 化 酵 素 (PLE) 以 及 Porcine Pancreatic 水 解 酵 素 (PPL) 進 行 酵 素 催 化 水 解 反 應 並 以 薄 膜 層 析 法 偵 測 水 解 產 物 測 定 水 解 速 率, 進 而 比 較 每 種 酵 素 催 化 的 專 一 性 H 3 H 3 H 2 range peel esterase H H 3 or H 3 + H 3 H??? H + H H 3 四 實 驗 步 驟 : 1 雙 酯 的 合 成 : 羥 基 苯 甲 酸 在 酸 催 化 下 與 不 同 的 醇 反 應 便 可 合 成 單 酯, 其 中 對 位 及 間 位 產 物 為 固 體 可 以 再 結 晶 純 化 之, 鄰 位 產 物 為 液 體 以 減 壓 蒸 餾 純
化, 羥 基 苯 甲 酸 之 醯 化 反 應 可 於 氫 氧 化 鈉 水 溶 液 中,0 下 快 速 加 入 合 適 的 醯 氯 化 合 物 製 得, 所 有 產 物 均 為 固 體 以 再 結 晶 純 化, 產 率 一 般 為 20~50%, 如 圖 二 所 示 圖 二 雙 酯 的 合 成 可 利 用 單 酯 在 比 啶 中, 加 入 合 適 的 醯 氯 化 合 物 迴 流 1 小 時, 以 水 終 止 反 應, 主 要 產 物 為 液 體, 產 率 一 般 為 60~90%, 如 圖 三 所 示 純 度 可 以 氫 核 磁 共 振 光 譜 ( 1 H-NMR) 檢 定 之 圖 三
2 橘 子 皮 萃 取 物 的 製 備 : 每 位 同 學 用 刀 子 刮 下 一 顆 橘 子 皮, 合 起 來 的 橘 子 皮 加 到 50~60 毫 升 的 50mM 內 含 2.3% 氯 化 鈉 的 檸 檬 酸 鈉 緩 衝 溶 液 (ph=5.5), 在 混 均 器 中 2 分 鐘 直 到 為 勻 相, 將 此 混 合 物 放 在 12,000 轉 速 的 離 心 機 內 離 心 10 分 鐘, 橘 色 的 上 層 澄 清 液 倒 入 燒 杯 中, 將 此 萃 取 液 放 在 冰 浴 儲 存, 可 保 存 至 少 24 小 時 3 酵 素 催 化 水 解 反 應 的 分 析 : 同 學 們 先 準 備 合 適 的 薄 膜 層 析 沖 堤 系 統, 用 以 分 開 雙 酯 (4) 單 酯 (2) 及 醯 化 後 的 酸 (3), 一 般 以 乙 酸 乙 酯 / 石 油 醚, 二 氯 甲 烷 或 二 氯 甲 烷 /10% 甲 醇 當 成 沖 堤 液, 接 著 將 0.1 克 的 雙 酯 溶 於 5 毫 升 丙 酮 配 製 下 列 各 組 : A:0.1 毫 升 的 雙 酯 (4)+ 0.9 毫 升 50mM 檸 檬 酸 鈉 緩 衝 溶 液 (ph=5.5) B:0.1 毫 升 的 雙 酯 (4)+ 0.9 毫 升 橘 子 皮 萃 取 物 :0.1 毫 升 的 雙 酯 (4)+ 0.9 毫 升 豬 肝 酯 化 酵 素 儲 存 液 (1.0 單 位 / 毫 升 於 50mM 磷 酸 鉀 溶 液,pH=7.0) D: 0.1 毫 升 的 雙 酯 (4)+ 0.9 毫 升 Porcine Pancreatic 水 解 酵 素 儲 存 液 (1.0 單 位 / 毫 升 於 50mM 磷 酸 鉀 溶 液,pH=7.0) 這 四 組 各 依 時 問 30 分 鐘 1 小 時 2 小 時 24 小 時, 以 薄 膜 層 析 分 析 並 觀 察 其 酵 素 水 解 的 過 程 若 30 分 鐘 後 便 完 成 水 解 則 用 10 倍 或 100 倍 稀 釋 酵 素, 以 便 能 估 算 水 解 速 率 利 用 橘 子 皮 萃 取 物 之 蛋 白 質 濃 度, 已 知 的 PLE 及 PPL stork 溶 液 的 濃 度, 每 一 種 酵 素 的 水 解 速 率 便 可 計 算 得, 而 整 組 的 結 果 可 用 以 評 估 改 變 取 代 基 對 酵 素 專 一 性 的 影 響 (1) 製 備 對 苯 甲 酸 乙 醯 酯 H H 1. NaH 2. acetic anhydride 3. H 3 + H H 3
取 一 個 50 毫 升 三 角 錐 瓶 加 入 0.138 克 4- 氫 氧 基 苯 甲 酸 再 加 入 0.8 毫 升 10% 氫 氧 化 鈉 攪 拌 兩 分 鐘 加 入 0.104 毫 升 (~2d) 乙 酸 酐 攪 拌 十 分 鐘 加 入 2 毫 升 乙 醚 萃 取 加 入 4 毫 升 水 幫 助 分 層 收 集 有 機 層 ( 貼 上 標 示 B) TL 片 上 點 上 標 準 點 (B point) (2) 製 備 4- 氫 氧 基 苯 甲 酸 甲 酯 H H H 3H H 2 S 4 H 3 H acetic chloride pyridine H 3 H 3 A 取 一 個 50 毫 升 三 角 錐 瓶 +0.138 克 4- 氫 氧 基 苯 甲 酸 +3 毫 升 甲 醇 ( 預 先 進 行 冰 浴 ) 慢 慢 滴 入 5 滴 濃 硫 酸 水 浴 下 迴 流 30 分 鐘 加 入 5 毫 升 水 以 5 毫 升 乙 醚 進 行 萃 取
加 入 6 毫 升 10% 碳 酸 鈉 水 溶 液 收 集 有 機 層 ( 貼 上 標 示 ) TL 片 上 點 上 標 準 點 ( point) (3) 作 一 張 標 準 的 TL 片 : ( 展 開 液 使 用 乙 醚 : 正 己 烷 =1:1) A 0.01 克 雙 酯 溶 在 0.5 毫 升 的 丙 酮 : B 0.01 克 對 苯 甲 酸 乙 醯 酯 溶 在 0.5 毫 升 的 丙 酮 0.01 克 4- 氫 氧 基 苯 甲 酸 甲 酯 溶 在 0.5 毫 升 的 丙 酮 (4) 橘 子 皮 的 萃 取 液 : 2 顆 橘 子 皮 加 上 200 毫 升 緩 衝 溶 液 (50mM 檸 檬 酸 鈉 含 2.3% 氯 化 鈉 ph=5.5) [ 配 製 緩 衝 溶 液 :14.7 克 檸 檬 酸 鈉 + 23 克 氯 化 鈉 + 962 毫 升 蒸 餾 水 ] 放 入 果 汁 機 中 攪 打 3 分 鐘 將 橘 子 皮 漿 液 置 入 離 心 管 中 進 行 離 心 ( 注 意 : 離 心 管 對 稱 重 量 不 得 相 差 0.1 克 以 上 ) 將 離 心 液 置 於 冰 箱 冷 藏
(5) 酵 素 水 解 反 應 : 準 備 兩 個 50 毫 升 的 三 角 錐 瓶 並 分 別 標 上 記 號 甲 乙 甲 瓶 中 置 入 0.3 毫 升 雙 酯 溶 液 (A) 及 2.7 毫 升 緩 衝 溶 液 乙 瓶 中 除 了 置 入 0.3 毫 升 雙 酯 溶 液 (A) 及 2.0 毫 升 緩 衝 溶 液 外 再 額 外 加 入 0.7 毫 升 橘 子 皮 的 萃 取 液 甲 乙 兩 瓶 持 續 搖 晃 並 分 別 於 15 分 30 分 及 一 小 時 以 TL 來 檢 測 反 應 變 化 情 形 五 儀 器 裝 置 : 高 速 離 心 機 果 汁 機 TL 片 跑 片 槽 紫 外 光 燈 三 角 錐 形 瓶 及 毛 細 管 等 六 藥 品 性 質 : Sodium irtrate 檸 檬 酸 鈉 6 H 5 Na 3 7.2H 2 Acetone 丙 酮 H 3 H 3 白 色 有 鹽 味 的 粉 末, 溶 於 水, 微 溶 於 乙 醇, 150 時 失 水 遇 熱 時 分 解, 在 醫 學 上 用 作 阻 凝 劑, 亦 可 用 於 飲 料 乳 酪 製 作 和 電 鍍 無 色 微 香 液 體 易 著 火, 密 度 0.778, 沸 點 56.5 與 水 乙 醇 乙 醚 氯 仿 油 類 互 溶 化 學 性 質 活 潑, 能 發 生 鹵 化 加 成 縮 合 等 反 應 廣 泛 用 於 油 脂 樹 脂 化 學 纖 維 等 溶 劑 為 合 成 藥 物 樹 脂 及 合 成 橡 膠 等 的 重 要 原 料
Ethyl Acetate 由 乙 酸 與 乙 醇 在 酸 性 條 件 下 行 酯 化 反 應 而 乙 酸 乙 酯 得 沸 點 77.15, 比 重 0.90 易 與 乙 醇 醚 H 3 2 H 5 等 有 機 溶 劑 混 合 具 有 水 果 香 味 的 無 色 中 性 液 體 易 燃 可 作 為 人 工 果 實 香 精 Dichloromethane 無 色 透 明 易 揮 發 液 體, 有 刺 激 性 芳 香 氣 味, 二 氯 甲 烷 有 毒, 對 肝 與 神 經 系 統 有 一 定 毒 性, 高 濃 度 H 2 l 2 時, 對 人 有 麻 醉 作 用, 蒸 氣 不 燃 燒, 與 空 氣 的 混 合 物 無 爆 炸 性, 比 重 1.33, 沸 點 39.75, 略 溶 於 水, 與 乙 醇 乙 醚 苯 油 類 等 主 要 用 於 代 替 易 燃 易 爆 的 石 油 醚 與 乙 醚, 可 作 為 脂 肪 和 油 的 萃 取 劑, 醋 酸 纖 維 塗 料, 有 機 合 成 反 應 溶 劑, 密 閉 儲 存 Ethyl Ether 一 般 比 較 穩 定, 不 與 水 氧 化 劑 還 原 劑 乙 醚 鹼 或 烯 酸 起 反 應, 但 濃 而 熱 的 強 酸 會 導 致 醚 2 H 5 2 H 5 鍵 的 斷 裂 具 有 迷 昏 麻 醉 的 效 果 Methyl-4-acetoxybenzoate 無 色 有 異 臭 味 液 體, 具 毒 性, 易 由 皮 膚 接 觸 4- 乙 醯 氧 基 苯 甲 酸 甲 酯 吸 收 H 3 6 H 4 2 H 3 七 注 意 事 項 : 1 使 用 離 心 機 與 果 汁 機 攪 拌 時 注 意 安 全 1 裝 入 溶 液 後 之 離 心 管 的 重 量 相 差 不 得 大 於 0.1 克 2 將 離 心 管 置 入 離 心 機 需 對 稱 放 入 3 待 離 心 機 旋 轉 自 動 停 止 後 方 可 掀 蓋 2 點 TL: 1 點 完 先 照 UV 燈, 以 確 定 濃 度 不 會 太 稀 2 沖 堤 液 面 不 可 超 過 起 點 線
3 沖 堤 過 程 中, 人 不 可 離 開, 一 到 達 終 止 線, 要 馬 上 取 出 4 毛 細 管 要 平 整 5 點 壞 的 TL 片 可 用 甲 醇 當 沖 堤 液 洗 6 每 次 使 用, 沖 堤 液 接 要 重 配, 因 為 乙 醚 易 揮 發 八 實 驗 問 題 : 1 試 說 明 酵 素 水 解 的 優 缺 點? 2 用 橘 皮 酵 素 水 解 methyl 4-acetoxybenzoate(diester) 會 得 到 何 種 產 物? 3 追 蹤 反 應 中,15min 30min 和 1hr 的 TL 片 有 何 不 同? 此 變 化 代 表 何 種 意 義?
萃 取 橘 子 皮 的 酯 化 酵 素 進 行 位 置 專 一 的 酯 水 解 反 應 實 驗 報 告 學 系 : 姓 名 : 學 號 : 組 別 : 日 期 : 數 據 及 結 果 : 1 配 製 緩 衝 溶 液 : ph= 藥 品 名 稱 結 構 式 分 子 量 用 量 莫 耳 數 檸 檬 酸 鈉 氯 化 鈉 蒸 餾 水 2 15min 30min 和 1hr 的 TL 片 與 標 準 品 比 較 : 1 沖 堤 液 為 : 2 自 行 畫 出 沖 堤 液 前 端 15min 30min 1hr standard 甲 乙 甲 乙 甲 乙 A B 3 R f 甲 R f 乙 1 R f 乙 2 R f 乙 3 15min 30min 1hr
甲 瓶 溶 液 為 乙 瓶 溶 液 為 化 合 物 A 結 構 式 化 合 物 B 結 構 式 化 合 物 結 構 式 R f A= R f B= R f = 橘 皮 酵 素 水 解 雙 酯 會 得 到 何 種 產 物,B 或?