定 量 PCR PCR vs. Real-time PCR 一 般 的 PCR 反 應, 利 用 熱 循 環 步 驟, 使 目 標 基 因 以 2 n 進 行 擴 增, 將 微 量 的 DNA 目 標 片 段 放 大 最 後, 再 利 用 洋 菜 膠 電 泳 (agarose gel electro

Real-time PCR 概 論 Introduction 自 從 聚 合 酶 連 鎖 反 應 (PCR) 技 術 開 發 至 今, 幾 乎 是 分 子 生 物 學 中 最 被 普 遍 使 用 的 技 術 PCR 主 要 是 運 用 DNA 的 變 性 黏 合 及 延 伸 等 三 步 驟 的 循 環, 連 續 擴 增 目 標 DNA 片 段 在 人 類 的 疾 病 或 其 他 動 植 物 的 疫 病 蟲 害 檢 測 上, 以 PCR 為 基 礎 的 技 術 都 被 廣 泛 的 應 用, 例 如 多 重 聚 合 酶 連 鎖 反 應 (Multiplex PCR) 巢 式 聚 合 酶 連 鎖 反 應 (Nested PCR) 逢 機 增 幅 多 態 型 - 聚 合 酶 連 鎖 反 應 (RAPD-PCR) 序 列 特 徵 化 增 幅 區 域 (SCARs) 聚 合 酶 連 鎖 反 應 - 限 制 性 片 段 長 度 多 態 性 (PCR-RFLP) 以 及 即 時 聚 合 酶 連 鎖 反 應 (Real-time PCR) 等 其 中 以 Real-time PCR 近 年 被 使 用 的 頻 率 逐 漸 被 提 高, 除 了 反 應 時 間 大 量 的 縮 短 之 外, 儀 器 及 技 術 亦 不 斷 的 創 新 進 步, 真 正 可 以 做 到 兼 顧 到 準 確 度 敏 感 度 及 高 效 率 的 多 項 優 點 What is Real-time PCR Real-time PCR, 顧 名 思 義 可 以 視 為 兩 個 部 份, Real-time 和 PCR 藉 由 PCR 擴 增 的 原 理, 使 極 微 量 的 DNA 放 大, 再 經 由 光 學 系 統 達 到 即 時 偵 測 (Real-time) 的 效 果 每 一 次 PCR 擴 增 循 環 後, 將 其 生 成 反 應 產 物 之 數 量 記 錄 下 來, 待 反 應 全 部 完 成 之 後, 以 cycle number 和 生 成 產 物 做 圖, 可 得 到 一 反 應 曲 線 圖 形, 完 整 的 呈 現 PCR 反 應 中 每 一 個 cycle 產 物 的 生 成 情 形, 所 以 稱 為 即 時

定 量 PCR PCR vs. Real-time PCR 一 般 的 PCR 反 應, 利 用 熱 循 環 步 驟, 使 目 標 基 因 以 2 n 進 行 擴 增, 將 微 量 的 DNA 目 標 片 段 放 大 最 後, 再 利 用 洋 菜 膠 電 泳 (agarose gel electrophoresis) 進 行 結 果 分 析 我 們 可 以 經 由 產 物 的 片 段 大 小 擴 增 後 產 物 生 成 量 等 等 條 件 來 判 斷 實 驗 結 果 是 否 成 功 必 須 等 反 應 結 束 後 再 進 行 洋 菜 膠 體 電 泳 分 析, 對 於 反 應 過 程 並 沒 有 做 任 何 分 析 記 錄, 故 一 般 PCR 反 應 又 可 稱 為 End-point PCR PCR vs. Real-time PCR 一 般 的 PCR 反 應, 利 用 熱 循 環 步 驟, 使 目 標 基 因 以 2 n 進 行 擴 增, 將 微 量 的 DNA 目 標 片 段 放 大 最 後, 再 利 用 洋 菜 膠 電 泳 (agarose gel electrophoresis) 進 行 結 果 分 析 我 們 可 以 經 由 產 物 的 片 段 大 小 擴 增 後 產 物 生 成 量 等 等 條 件 來 判 斷 實 驗 結 果 是 否 成 功 必 須 等 反 應 結 束 後 再 進 行 洋 菜 膠 體 電 泳 分 析, 對 於 反 應 過 程 並 沒 有 做 任 何 分 析 記 錄, 故 一 般 PCR 反 應 又 可 稱 為 End-point PCR Real-time PCR 和 傳 統 PCR 一 樣 是 利 用 熱 循 環 步 驟 使 微 量 DNA 樣 本 進 行 擴 增, 達 到 放 大 的 目 的 但 是 最 後 並 不 是 以 洋 菜 膠 電 泳 進 行 結 果 判 讀 而 是 經 由 光 學 系 統 去 偵 測 反 應 中 產 物 量 ( 螢 光 物 質 ) 的 變 化 而 反 應 在 電 腦 上, Real-time PCR 會 紀 錄 每 一 個 PCR cycle 產 物 生 成 的 情 形, 藉 由 分 析 PCR cycle

與 生 成 產 物 這 兩 個 因 素 之 間 的 相 對 關 係, 來 進 行 實 驗 結 果 的 判 讀 所 以, Real-time PCR 相 較 於 End-point PCR, 較 重 視 DNA 樣 本 進 行 擴 增 的 過 程, 而 非 擴 增 後 生 成 的 產 物 Real-time PCR 的 配 備 主 要 有 PCR 機 器 光 學 系 統 及 電 腦 隨 著 技 術 的 改 良 進 步, Real-time PCR 在 精 確 度 及 敏 感 度 都 優 於 傳 統 PCR 目 前 Real-time PCR 螢 光 系 統 可 大 致 分 為 非 探 針 型 及 探 針 型 Real-time PCR 的 優 缺 點 Real-time PCR 的 優 點 就 實 驗 時 間 可 以 大 幅 縮 短, 也 可 在 電 腦 上 即 時 監 測 實 驗 結 果, 且 鑑 定 的 專 一 性 敏 感 度 及 準 確 度 也 較 一 般 PCR 方 式 為 高 檢 測 過 程 不 用 進 行 洋 菜 膠 體 電 泳 分 析, 除 了 可 以 節 省 時 間 及 洋 菜 膠 的 材 料 費 外, 也 可 避 免 多 做 這 個 實 驗 所 造 成 的 污 染 及 操 作 誤 差 此 外, 不 論 使 用 探 針 或 非 探 針 的 方 法, Real-time PCR 皆 可 精 準 定 量, 確 定 目 標 DNA 的 初 始 濃 度, 這 對 於 植 物 防 檢 疫 中 的 抗 病 育 種 及 輸 入 農 產 品 檢 測 方 面, 特 別 具 有 意 義 而 傳 統 PCR 僅 能 用 於 定 性 分 析, 至 多 能 達 到 半 定 量 (semi-quantitative) 的 程 度 甚 至 已 有 廠 商 開 發 出 手 提 式 的 Real-time PCR 機 器, 可 在 野 外 或 田 間 都 使 用 直 接 進 行 檢 測 而 Real-time PCR 的 缺 點 則 是 機 器 及 反 應 耗 材 的 費 用 相 對 較 高, 造 成 目 前 在 使 用 上 無 法 達 到 普 及 化 的 主 要 原 因

Ct value 在 進 行 Real-time PCR 結 果 分 析 時, 一 定 常 聽 到 Ct value ( 或 稱 為 Cq value Cp value) 這 個 名 詞 當 PCR 反 應 樣 本 擴 增 之 生 成 量 達 到 一 定 的 數 值, 而 此 數 值 之 相 對 應 cycle number, 即 為 Ct value 由 上 述 的 定 義, 我 們 可 以 發 現, 要 先 定 義 生 成 量 的 數 值, 才 可 以 得 到 Ct value 在 一 Real-time PCR 擴 增 曲 線 中, 我 們 要 如 何 選 取 適 當 的 臨 界 生 成 量 (threshold value) 來 當 做 我 們 的 定 義 值 呢? 在 做 選 取 之 前, 我 們 必 須 要 先 了 解 整 個 PCR 反 應 過 程 中 產 物 生 成 量 的 變 化 理 論 上,PCR 反 應 是 以 最 佳 效 能 2 n 進 行 擴 增, 若 是 以 擴 增 30 cycles 為 例, 產 物 會 以 2 1 2 2 2 3 2 4 2 5 2 6 2 30 進 行 對 數 增 加 但 是 實 際 上, 初 期 的 反 應 因 為 DNA 樣 本 數 過 少, 故 無 法 達 到 此 理 論 值 而 後 期 的 反 應, 因 為 酵 素 活 性 降 低 primer 耗 盡 等 種 種 因 素 導 致 整 個 PCR 反 應 無 法 達 到 最 佳 效 能, 而 無 法 以 對 數 進 行 擴 增, 所 以 整 個 PCR 反 應 只 有 中 段 的 部 分 是 以 理 論 值 進 行 反 應 當 PCR 以 理 論 值 進 行 對 數 擴 增 時, 其 具 有 高 精 確 度 與 高 再 現 性 等 特 徵, 最 能 夠 代 表 PCR cycle 與 生 成 產 物 的 相 對 關 係. 實 務 上, 由 軟 體 紀 錄 而 繪 製 的 曲 線 圖 形 中, 應 該 如 何 判 斷 哪 個 部 分 為 理 想 中 的 PCR 擴 增 區 段 呢? 我 們 可 以 在 分 析 軟 體 中 以 cycle number 對 fluorescence log value 進 行 做 圖 整 個 圖 形 中 呈 現 直 線 關 係 的 區 段, 卽 表 示 反 應 產 物 以 理 論 值 進 行 對 數 增 加, 我 們 就 可 以 將 臨 界 生 成 量 (threshold value) 定 義 在 此 區 段 即 可 當 產 物 的 生 成 量 達 到 此 threshold value 時, 其 相 對 應 的 cycle number

即 為 Ct value 除 了 利 用 PCR 的 原 理 來 判 斷 Ct value, 目 前 市 面 上 所 販 售 的 Real-time PCR 儀 器, 其 分 析 軟 體 皆 有 auto Ct 之 功 能 以 2nd derivative maximum method 為 例, 軟 體 將 曲 線 圖 形 轉 換 為 數 學 方 程 式 後, 再 利 用 二 次 導 數 過 後 的 結 果 產 生 一 極 大 值, 此 極 大 值 所 對 應 的 cycle number 即 為 Ct value 不 論 是 利 用 PCR 的 原 理 做 為 基 礎 或 是 使 用 auto Ct 來 計 算 Ct value, 均 各 自 有 優 點 及 缺 點, 各 位 可 以 參 考 reference 或 是 實 驗 室 傳 承 下 來 的 經 驗, 來 決 定 最 符 合 實 驗 需 求 的 分 析 方 法 Ct value 與 data 判 斷 Real-time PCR 又 稱 做 quantitative PCR (qpcr), 故 時 實 驗 結 果 主 要 用 來 分 析 同 一 基 因 在 不 同 樣 本 中 之 含 量 試 想 在 兩 個 不 同 的 樣 本 中 偵 測 同 一 個 基 因, 一 個 所 含 的 copy 數 較 多, 另 一 個 較 少, 在 相 同 擴 增 條 件 下, 那 一 個 樣 本 會 先 進 入 我 們 所 設 定 之 threshold value 呢? 換 句 話 說, 那 一 個 樣 本 擴 增 較 少 的 次 數 之 後 就 可 以 達 到 設 定 之 threshold value 呢? 沒 錯! 樣 本 中 起 始 copy 數 較 多 時, 會 較 快 達 到 threshold value, 故 Ct 值 較 小 ; 換 句 話 說 Ct 值 較 小 的 樣 本, 其 起 始 之 copy 數 越 多 所 以 Ct value 越 小, 起 始 copy 數 越 多,Ct value 越 大, 起 使 copy 數 越 少, 並 且,Ct value 與 copy 數 是 呈 高 度 負 相 關, 因 此 我 們 卽 利 用 此 關 係 發 展 出 不 同 種 類 的 分 析 方 法

PCR efficiency 在 了 解 Real-time PCR 的 分 析 方 法 之 前, 我 們 必 須 先 知 道 PCR efficiency 對 於 Real-time PCR 的 重 要 性 決 定 PCR efficiency 的 因 素 包 括 了 primer 的 設 計 primer 的 濃 度 master mix 的 成 分 及 樣 本 的 純 度 等 等 通 常 我 們 可 以 將 樣 本 作 5 logs 的 序 列 稀 釋, 求 得 濃 度 對 Ct value 之 方 程 式, 此 方 程 式 之 斜 率, 可 以 利 用 公 式 進 行 PCR efficiency 之 換 算 有 下 列 兩 點 須 特 別 注 意 (1)PCR efficiency 可 接 受 的 範 圍 為 90%~110% (slope: -3.6 ~ -3.1), 若 是 超 出 這 個 範 圍 區 間, 則 必 需 重 新 確 認 實 驗 的 條 件, 如 primer 的 濃 度 primer 的 設 計 master mix 的 成 分 是 否 符 合 實 驗 需 求 Taq 的 活 性 樣 本 的 製 備 是 否 有 PCR inhibitor 的 存 在 等 等 (2) 若 是 進 行 相 對 定 量 分 析, 則 必 須 注 意 不 同 的 amplicon 其 PCR efficiency 是 否 相 同, 若 是 相 差 太 遠, 則 必 須 進 行 調 整 Chemistry 要 如 何 即 時 偵 測 產 物 變 化 量 呢? 目 前 常 用 的 方 法 可 大 致 分 為 兩 大 類, 探 針 型 SYBR Green system 及 探 針 型 probe system 分 述 如 下 : 1) SYBR Green system: 在 反 應 中 加 入 會 與 雙 股 DNA 嵌 合 而 釋 放 螢 光 的 物 質, 目 前 最 常 使 用 的 為 SYBR Green I SYBR Green 為 一 種 fluorescence DNA binding dye, 激 發 (excitation) 波 長 為 488 nm, 散 發 (emission) 波 長 為 522 nm 藉 由 與 雙 股 DNA 結 合 後 (minor groove), 其 螢 光 訊 號 能 增 加 800 倍 在 PCR 反 應 的 過 程 中, 隨 著 雙 股 DNA 含 量 的 增 加, 與 DNA 結 合 的 SYBR Green

亦 增 加, 螢 光 訊 號 即 隨 之 增 加 但 是, 需 要 特 別 注 意 一 點,SYBR Green 與 DNA 的 結 和 為 非 專 一 性, 使 用 前 必 須 先 確 定 PCR 產 物 的 均 一 性, 否 則 很 容 易 造 成 data 的 誤 判 2) Probe system: 依 據 不 同 的 系 統,probe 又 可 以 分 為 數 種 不 同 的 形 式, 但 是 基 本 的 原 理 為 利 用 PCR 產 物 的 序 列 來 設 計 一 段 互 補 的 核 酸 探 針, 並 在 探 針 的 兩 端 結 合 上 兩 能 階 相 差 甚 多 的 螢 光 物 質, 稱 為 Reporter 及 Quencher, 利 用 FRET(Fluorescence resonance energy transfer) 原 理 使 探 針 在 與 PCR 產 物 結 合 後, 造 成 散 發 光 (emission light) 波 長 的 改 變, 若 probe 在 游 離 態 時, 由 於 Reporter 及 Quencher 之 交 互 遮 蔽 作 用 並 不 發 光 的, 當 DNA 被 複 製 時, 此 probe 被 酵 素 水 解 後, Reporter 與 Quencher 分 離, Quencher 即 失 去 其 遮 蔽 效 應 導 致 Reporter 發 光 而 被 偵 測 到 如 果 不 是 目 標 物 種 來 做 偵 測, 探 針 就 不 會 雜 合 到 核 酸 上, 之 後 也 就 不 會 釋 放 出 螢 光 而 被 偵 測 到 隨 著 產 物 的 增 加, 改 變 後 的 散 發 光 強 度 也 隨 之 增 強, 進 而 達 到 及 時 針 測 的 目 的 使 用 探 針 系 統, 具 有 較 好 的 專 一 性, 且 可 以 藉 由 不 同 的 螢 光 波 長 及 探 針 的 配 合, 對 於 同 一 樣 本 同 時 進 行 多 目 標 偵 測 (multiplex detection) 假 如 使 用 TaqMan probe, 因 為 必 須 使 probe 水 解, 所 以 extension 溫 度 不 能 高 於 probe 的 Tm, 一 般 來 說 都 會 在 67 度 以 下, 所 以 就 會 有 2-step 的 PCR, 不 過 若 是 用 其 他 種 probe 或 SYBR Green 的 話, 就 不 一 定 有 這 樣 的 限 制, 但 設 計 出 一 條 好 的 probe

是 非 常 重 要 的, 因 為 會 影 響 到 實 驗 的 判 讀 缺 點 為 實 驗 成 本 較 高, 且 需 要 花 費 較 多 的 心 力 對 於 探 針 的 效 能 進 行 確 認 Real-time PCR 可 以 使 用 的 範 圍 1) 絕 對 定 量 (Absolute quantification) 針 對 樣 本 作 絕 對 的 量 化 先 利 用 標 準 品 作 一 標 準 曲 線, 再 比 較 樣 本 與 標 準 品 的 相 對 關 係 依 據 使 用 標 準 品 的 不 同, 通 常 以 濃 度 ng/ml mg/ml 或 是 計 量 單 位 ng pg copy number 等 作 為 表 示 絕 對 定 量 常 用 於 臨 床 診 斷 和 病 毒 量 的 偵 測, 如 HBV HCV 的 檢 測 2) 相 對 定 量 (Relative quantification) 相 對 定 量 實 驗 不 需 要 標 準 曲 線 的 存 在, 所 以 實 驗 結 果 通 常 以 倍 數 (n-fold) 表 示 實 驗 的 設 計 上 通 常 會 包 含 三 個 數 值, 基 準 點 (calibrator) 實 驗 點 及 內 部 校 正 點 (internal control) 先 以 reference gene 做 為 內 部 校 正 點, 校 正 基 準 點 與 實 驗 點 之 間 非 實 驗 所 產 生 的 差 異, 如 樣 本 細 胞 數 不 同 pipetting error 等 等, 再 將 實 驗 點 與 基 準 點 作 比 較, 得 到 目 標 基 因 因 實 驗 設 計 而 產 生 的 變 化, 如 藥 物 對 細 胞 的 影 響, 可 將 加 藥 前 設 定 為 基 準 點, 加 藥 後 2 4 8 16 小 時 設 為 不 同 實 驗 點 進 行 比 較 相 對 定 量 通 常 使 用 在 研 究 基 因 表 現 的 實 驗 中 需 要 特 別 注 意 的 是, 在 進 行 相 對 定 量 實 驗 前, 必 須 先 確 定 reference gene 與 target gene 兩 者 之 PCR efficiency 相 差 不 遠, 才 可 進 行 後 續 的 分 析 3) Melting curve

在 進 行 Real-time PCR 實 驗 時, 我 們 該 如 何 確 認 PCR 產 物 的 專 一 性? 此 時, 我 們 可 以 利 用 DNA 半 解 離 溫 度 (Tm value) 的 特 性 判 斷, 若 是 只 有 單 一 的 產 物, 理 論 上 半 解 離 溫 度 均 相 同 但 是 當 有 第 二 組 半 解 離 溫 度 出 現, 不 論 是 PCR 產 物 的 不 專 一 或 是 primer dimer 的 形 成, 均 會 造 成 Ct value 的 誤 判 由 其 在 使 用 SYBR Green 的 系 統 時, 當 設 計 新 的 實 驗, 皆 需 要 進 行 melting curve 的 分 析 4) SNP Real-time PCR 也 可 應 用 在 DNA 序 列 之 SNP(single nucleotide polymorphism) 分 析, 常 見 的 方 法 有 下 列 三 種 (1)Ct method: 針 對 不 同 之 SNP 分 別 設 計 兩 組 探 針, 若 是 樣 本 為 homozygous, 則 只 有 其 中 一 組 探 針 會 得 到 Ct value; 若 是 heterozygous, 則 兩 組 探 針 均 會 得 到 Ct value (2) Tm method: 此 方 法 使 用 同 一 組 探 針, 若 是 探 針 與 序 列 之 間 形 成 mismatch, 則 其 melting curve 會 有 所 改 變, 以 此 原 理 進 行 樣 本 分 析 結 語 Real-time PCR 具 有 快 速 精 準 及 專 一 高 等 等 特 性, 目 前 應 用 的 範 圍 很 廣 泛, 不 論 是 基 因 表 現 量 的 分 析 或 是 Genotyping 上, 都 已 經 是 很 純 熟 的 技 術 在 2006 年 學 者 更 是 應 用 在 植 物 病 蟲 害 的 檢 測, 現 在 更 是 應 用 在 海 關 對 動 植 物 的 檢 疫 由 於 科 技 日 新 月 異, 在 real-time PCR 實 驗 上 所 需 要 的 reagent primer SYBR green probe 合 成 和 相 關 耗 材, 都 已 經 達 到 普 及 化 的 規 格 和 價 錢, 甚 至 機 器

也 已 經 不 在 是 遙 不 可 及 的 高 價 位 了, 相 信 有 一 天 real-time PCR 可 以 成 為 實 驗 室 的 標 準 實 驗 流 程 和 配 備