Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd Tel: 010-56371207 Solarbio Fax: 010-56371281/82 Http://www.solarbio.cn CyDye mono-reactive NHS Esters 菁染料琥珀酰亚胺酯 产品说明 菁染料是性能优良的荧光标记染料 摩尔吸光系数在荧光染料中是最高的 其琥珀酰亚胺酯是 最常用的脂肪氨基标记试剂 广泛用于蛋白 抗体 核酸及其他生物分子的标记和检测 通过改变 次甲基链的长度 可改变其荧光发射波长 每增加一个双键 按照Huoffman 规则正好红移约100nm 菁染料Cy3 和Cy5 已成为基因芯片的首选荧光标记物 另外 Cy5 Cy5.5 和Cy7 的吸收在 近红外区背景非常低 是荧光强度最高 最稳定的长波长染料 特别适合于活体小动物体内成像代 替放射性元素 但由于菁染料 尤其是不对称菁染料的合成副反应多 副产物极性相近 产物的 分离提纯相当困难 菁染料特别是水溶性菁染料分子极性大 分离提纯越加困难 图1. 脂溶性菁染料琥珀酰亚胺酯的结构式 图2. 水溶性菁染料琥珀酰亚胺酯的结构式 图3 菁染料琥珀酰亚胺酯的激发和发射波长光谱图 第 1 页 共 5 页
表1 菁染料琥珀酰亚胺酯的性质参数 Cy3 Cy3.5 Cy5 Cy5.5 Cy7 脂溶性菁染料 SE 分子量 568.73 668.84 594.76 694.88 620.80 水溶性菁染料SE分子量 765.95 1234.54 791.99 1260.58 818.01 最大吸收波长(nm) 552 581 650 678 摩尔吸光系数(M-1cm-1) 150 000 150 000 250 最大发射波长(nm) 570 596 670 695 780 A280nm/Amax 8% 24% 5% 18% 11% 菁染料琥珀酰亚胺酯 CyDye NHS 的标记 菁染料和生物分子的比例F/P=4 12之间荧光强度最高 F/P值过高荧光探针会自我淬灭并影响 生物分子的生物活性 标记生物分子最好是用单琥珀酰亚胺酯 但是用双修饰的CyDye NHS并没有 发现交联 CyDye NHS标记抗体在pH (8.5 9.4)时10分钟F/P可达5 6 而在pH 7.0几乎不反应 我 们用不同比例的Cy3标记anti-glutathione-S-transferase (GST)多克隆抗体发现用1:1 5:1 10:1 和 20:1 标记时得到的F/P值分别是 0.28:1 1.16:1 2.3:1和4.6:1 操作步骤 一 水溶性Cy3 NHS标记anti-GST多克隆抗体 市场上买到的抗体如果含有其它蛋白 例如serum albumin或gelatin等 或带氨基的缓冲液会影 响标记 在标记前需纯化 1. 在1 L 0.15 M NaCl 溶液中透析anti-GST抗体(浓度为 0.5 ml at 3 mg/ml) 常温透析4小时 2. 在4 C用新鲜的1 L 0.15 M NaCl 溶液再透析过夜 3. 第二天用1 L 0.1 M NaHCO3 (ph 8.3)透析4小时 4. 用0.22 µm注射器过滤头过滤抗体溶液 5. 用0.1 M NaHCO3 稀释少量的抗体 在280nm处测其紫外吸收值计算标记抗体的总量 IgG antibody摩尔吸光系数170 000 M-1 cm-1 at 280 nm). 6. 用DMSO配置Cy3 NHS (MW 765.95) 溶液浓度为10 mg/ml 计算所需体积以得到想要的CyDye NHS 和抗体的比值(例如20:1) 然后慢慢将其加入到抗体溶液中 同时在暗处常温缓慢搅拌45 分钟 7. 用1 L 0.15 M NaCl 溶液常温避光透析4小时除去未标记上的Cy3 8. 在4 C用新鲜的1 L 0.15 M NaCl 溶液再避光透析过夜 9. 用1 L of 0.01 M PBS/ 0.01% 叠氮化钠溶液常温避光透析4小时 在4 C常温避光再次透析过夜 第 2 页 共 5 页
10. 用 0.22 µm 注 射 器 过 滤 头 过 滤 抗 体 溶 液 11. 用 0.01 M PBS/0.01 % 叠 氮 化 钠 整 数 倍 稀 释 标 记 抗 体 溶 液, 测 量 280nm( 蛋 白 ) 和 552nm(Cy) 处 的 紫 外 可 见 吸 光 度 12. 产 品 冷 冻 干 燥 成 粉 末 或 在 0.01 M PBS/ 0.01% 叠 氮 化 钠 溶 液 中,-20 避 光 储 存 F/P 计 算 : Cy3 在 552nm 摩 尔 吸 光 系 数 为 150 000 M-1cm-1; 此 蛋 白 在 280nm 的 摩 尔 吸 光 系 数 为 170 000 M-1cm-1; 不 同 蛋 白 的 摩 尔 吸 光 系 数 不 一 样 ;Cy3 染 料 本 身 在 280 nm 的 吸 收 是 552nm 处 的 8% 按 以 下 公 式 计 算 F/P 值 [Cy3] = A552/150000 [antibody] = {A280 - (0.08 A552)}/170000 F/P final= [Cy3]/[antibody]= {1.13 A552}/ {A280 - (0.08 A552)} 二 水 溶 性 Cy5 NHS 标 记 (D-ser2)-leucineenkephalin 1. Cy5 NHS 1.0 mg 溶 解 于 400 µl DMSO 后, 加 入 到 1mL 的 玻 璃 瓶 中 盛 有 (D-ser2)-leucine- enkephalin acetate (YSGFLT,0.7) 的 400 µl DMSO 溶 液 (Dye 和 peptide 投 料 比 是 1:1) 2. 然 后 加 入 15 µl 三 乙 胺, 常 温 避 光 搅 拌 反 应 混 合 物 过 夜 3. 用 HPLC 纯 化 蛋 白, 使 用 蛋 白 C18 柱 子 (25 cm 10 mm), 每 次 上 样 注 入 2 400 µl,30 分 钟 梯 度 洗 脱 从 0.1% TFA 水 溶 液 到 MeCN H2O(0.1% TFA)=70 30, 流 速 4mL /min ( 对 不 同 的 蛋 白 选 择 不 同 的 合 适 HPLC 梯 度 流 动 相 ) 4. 收 集 适 当 的 色 带 峰, 标 记 多 肽 的 保 留 时 间 比 未 标 记 的 多 肽 长 5. 产 品 冷 冻 干 燥 成 粉 末 或 在 水 溶 液 中,-20 避 光 储 存 ; 必 要 时 可 用 质 谱 表 征 6. CyDye 标 记 的 蛋 白 稳 定 性 取 决 于 蛋 白 本 身 例 如 标 记 的 IgG 在 4 可 避 光 保 存 2 月 ; 更 长 期 的 保 存 需 加 入 等 体 积 的 甘 油 -20 避 光 保 存 F/P 计 算 : Cy5 在 650 nm 的 摩 尔 吸 光 系 数 为 250 000 M-1cm-1, 所 用 蛋 白 在 280 nm 处 的 摩 尔 吸 光 系 数 为 170000 M-1cm-1;Cy5 在 280nm 处 的 吸 收 是 650nm 处 的 5% 按 以 下 公 式 计 算 F/P 值 [Cy5 dye] = (A650)/250 000 [peptide] =[A280 -(0.05 A650)]/170000 F/P final= [dye]/[peptide]= {0.68 A650}/ {A280 - (0.05 A650)} 三 水 溶 性 CyDye SE 标 记 OLIGO 氨 基 封 端 的 OLIGO 可 以 标 记 CyDye SE, 但 是 非 常 困 难 ; 标 记 前 因 为 OILGO 经 氨 水 脱 保 护, 请 务 必 洗 涤 掉 所 有 的 残 余 氨 水 然 后 将 样 品 真 空 干 燥 ; 然 后 溶 于 0.25 ml 的 0.5 M NaCl 溶 液 中, 用 Sephadex G-50 脱 盐, 用 5.0 mm borate 缓 冲 液 平 衡 到 ph=8.0, 然 后 用 以 上 硼 酸 缓 冲 液 冲 下 OLIGO 然 后 浓 缩 至 干 的 样 品 溶 于 0.1 M carbonate buffer (ph 8.5-9.0); 在 0.5mL 碳 酸 缓 冲 液 中 30 nmoles 的 OLIGO 加 入 到 CyDye SE 的 玻 璃 瓶 中 室 温 避 光, 密 闭 搅 拌 反 应 60min 反 应 物 经 Sephadex G-50 或 RP-HPLC 过 柱 纯 化, 冷 冻 干 燥 后 避 光 保 存 注 意 :Oligonucleotides 和 oligopeptides 由 于 太 小 经 常 会 留 在 过 滤 膜 上 或 在 冻 存 管 内 贴 壁 成 膜, 而 无 法 标 记 四 小 动 物 活 体 成 像 领 域 的 应 用 第 3 页, 共 5 页
活 体 动 物 体 内 成 像 技 术 是 指 应 用 影 像 学 方 法, 对 活 体 状 态 下 的 生 物 过 程 进 行 组 织 细 胞 和 分 子 水 平 的 定 性 和 定 量 研 究 的 技 术 小 动 物 活 体 成 像 是 近 年 来 在 生 物 医 药 方 面 非 常 活 跃 和 前 沿 的 领 域, 在 研 究 细 胞 行 为, 药 物 活 性 和 代 谢, 疾 病 的 进 展 等 方 向 取 得 了 革 命 性 的 进 步 分 为 生 物 发 光 成 像 ( 以 Caliper 和 Xengon 仪 器 为 代 表 ) 和 荧 光 成 像 ( 以 KODAK 和 CRI 仪 器 为 代 表 ) 1 荧 光 成 像 的 推 荐 步 骤 : (1) SPF 级 BALB/C 裸 鼠,6~8 周 龄,18~20 克, 实 验 前 24 h 自 由 进 食 饮 水 (2) 于 实 验 裸 鼠 腹 腔 内 注 射 2% 戊 巴 比 妥 钠 300µL(21/ kg) 麻 醉 动 物 将 裸 鼠 俯 卧 位 平 放 于 小 动 物 多 光 谱 活 体 成 像 系 统 的 记 录 暗 箱 中 实 验 时 将 Cy7 或 Cy7 标 记 的 生 物 分 子 或 药 物 最 好 溶 于 水 ( 或 甲 醇 / 乙 醇 / 乙 二 醇, 有 时 DMSO 200uL 能 把 小 鼠 杀 死 ) 稀 释 后, 于 裸 鼠 尾 静 脉 注 射 200µL ( 浓 度 0./mL), 最 佳 用 量 和 时 间 需 要 客 户 根 据 自 己 的 仪 器 和 药 物 试 剂 等 条 件 优 化 每 5min 记 录 1 张 动 物 在 体 内 发 射 荧 光 的 成 像 图 片, 分 析 荧 光 药 物 的 分 布 情 况 对 照 鼠 不 注 射 药 物, 进 行 同 时 记 录 记 录 结 束 后 迅 速 解 剖 裸 鼠 的 心 肝 脾 肺 肾 等 脏 器, 进 行 成 像 (3) Cy7 检 测 时 激 发 波 长 700~770 nm 带 通, 发 射 波 长 790 nm 长 通 液 晶 可 调 谐 滤 光 片 扫 描 范 围 780~950 nm, 扫 描 步 进 10 nm 曝 光 时 间 为 500 ms 不 同 的 药 物 代 谢 时 间 不 一 样, 注 射 入 裸 鼠 体 内, 荧 光 立 即 分 布 全 身, 然 后 逐 步 向 膀 胱 聚 集, 呈 现 显 著 的 肾 排 泄 的 特 点 一 般 4~6 小 时, 快 的 只 有 30 分 钟 ; 如 果 是 骨 骼 和 鼻 腔 等 部 位 靶 点 的 Cy7 标 记 药 物, 有 客 户 反 映 一 周 后 活 体 成 像 系 统 仍 能 检 测 到 荧 光 成 像 器 官 切 片 观 察 : 将 解 剖 的 器 官 迅 速 放 置 于 4% 多 聚 甲 醛 固 定 4 小 时 以 上,0%,20%,30%PBS 蔗 糖 依 次 沉 底,20µm 切 片, 多 聚 赖 氨 酸 洗 过 的 载 玻 片 贴 片, 晾 干,DAPI 染 色 共 聚 焦 显 微 镜 观 察, 激 光 器 为 氦 氖 633 nm 2 荧 光 成 像 常 见 问 题 (1) 什 么 类 型 的 小 鼠 适 合 活 体 成 像? 毛 发 对 光 有 散 射, 建 议 用 裸 鼠 (2) 给 裸 鼠 注 射 的 最 佳 和 最 大 注 射 试 剂 体 积? 试 剂 的 体 积 用 量 根 据 所 采 取 的 方 式 不 同 而 不 同, 下 面 是 体 重 25g 的 裸 鼠 注 射 量 Route Recommended Maximal 静 脉 注 射 Intravenous (IV) 50~125 µl 200 µl 腹 腔 注 射 Intraperitoneal (IP) 500 µl 2 ml 皮 下 注 射 Sub-cutaneous (SC) 100~250 µl 1 ml (3) 注 射 针 头 的 尺 寸 是 多 少? 推 荐 使 用 具 有 固 定 针 头 的 28~32 号 结 核 菌 素 或 胰 岛 素 注 射 器 (0.3 或 1mL) (4) 肿 瘤 成 像 需 要 注 射 多 大 剂 量 的 标 记 抗 体? 推 荐 起 始 用 量 50µg 来 优 化 最 佳 用 量 第 4 页, 共 5 页
5 未标记的染料在老鼠体内如何代谢 未标记水溶性染料通过膀胱排泄 静脉注射后最快能在3min 检测到膀胱内的荧光信号 6 注射后多长时间开始成像 成像时间和成像持续时间与注射试剂有关 血管示踪剂注射后马上即可成像并持续成像数小 时 注射标记的抗体IgG 到达靶点需要数小时 而后才成像并持续成像数天 7 Solar Fluor dyes 的荧光寿命是多少 Solar Fluor 647 在20 C 水中τ 1 ns Solar Fluor 680 在20 C 水中τ 1.2 ns Solar Fluor 在 20 C 水中 τ 0.7 ns 稳定性与储存 未开封的粉末在避光干燥-20 存放12月 CyDye NHS水溶液现配现用不能储存 任何溶解后的 CyDye NHS粉末最好立即使用 绝对无水的DMSO溶液-20 C保存最多2个星期 相关产品 Cy 系列 目录号 S1050 S1059 S1053 S1060 S1061 S1062 S1055 S1057 产品名称 Cy3 Cy3, SE Cy5 Cy5, SE Cy5.5 Cy5.5, SE Cy7 Cy7, SE Ex nm 548 548 646 646 673 673 747 747 Em nm 562 562 664 664 692 692 774 774 产品描述 规格 Solar Fluor 系列 Cy 系列升级产品 与 Invitrogen 的 Alexa Fluor 系列完全相同 目录号 S1063 S1064 S1065 S1066 S1067 S1068 S1069 S1070 S1071 S1072 产品名称 Solar Fluor 488 Solar Fluor 488, SE Solar Fluor 555 Solar r Fluor 555, SE Solar Fluor 647 Solar Fluor 647, SE Solar Fluor 680 Solar Fluor 680, SE Solar Fluor Solar Fluor, SE Ex nm Em nm 产品描述 494 518 FAM 的升级产品 494 518 FITC 的升级产品 556 567 Cy3 的升级产品 556 567 Cy3, SE 的升级产品 651 668 Cy5 的升级产品 651 668 Cy5, SE 的升级产品 680 702 Cy5.5 的升级产品 680 702 Cy5.5, SE 的升级产品 775 Cy7 的升级产品 775 Cy7, SE 的升级产品 第 5 页 共 5 页 规格