VPp1,,, (, 266003) 摘 要 : 为 探 究 副 溶 血 弧 菌 (Vibrio parahaemolyticus) 的 生 物 防 治 方 法, 从 水 产 品 市 场 处 污 水 中 分 离 出 一 株 副 溶 血 弧 菌 噬 菌 体 VPp1 并 借 助 噬 菌 斑 形 态 电 镜 酶 切 等 技 术 对 其 进 行 了 分 类 鉴 定, 同 时 测 定 了 其 裂 解 谱 最 佳 感 染 复 数 一 步 生 长 曲 线 以 研 究 其 裂 解 性 能 分 类 鉴 定 结 果 表 明, 其 核 酸 是 线 型 双 链 DNA, 大 小 在 15 kb 左 右 具 有 一 个 正 二 十 面 体 的 头 部, 头 部 直 径 大 约 为 44 nm, 无 尾, 属 盖 噬 菌 体 科 (Tectivirus); 裂 解 性 能 研 究 结 果 表 明, 其 在 双 层 平 板 上 培 养 12 h 可 形 成 中 心 清 亮 的 噬 菌 斑, 周 围 有 大 而 明 显 的 晕 环 最 佳 感 染 复 数 为 0.0001, 潜 伏 期 为 10 min, 裂 解 量 为 90.3, 是 符 合 条 件 的 潜 伏 期 短 裂 解 量 大 的 理 想 噬 菌 体, 可 用 作 进 一 步 的 应 用 关 键 词 : 噬 菌 体 ; 副 溶 血 弧 菌 (Vibrio parahaemolyticus); 鉴 定 ; 裂 解 性 能 中 图 分 类 号 : Q939.48 文 献 标 识 码 : A 文 章 编 号 : 1000-3096(2013)01-0096-06 (Vibriosis),,,, (Vibrio parahaemolyticus) (Vibrio anguillarum) (Vibrio alginolyticus) (Vibrio harveyi) (Vibrio vulnificus) (Vibrio fluvialis) [1],, [2] [3],, [1],,,,,,,, (Bacteriophage) 96 / 2013 / 37 / 1, [4],,, 12 h,, 1 材 料 与 方 法 1.1 材 料 1.1.1 Vibrio parahaemolyticus 17802 ( VP 17802), Fujino [5] 1953 (American type culture collection, ATCC) V. parahaemolyticus : 2011-12-02; : 2012-03-25 : (31071540); (nycytx-50); (ZR2011CQ024) : (1987-),,,,, : 0532-82031550, E-mail: pengyongpy520@163.com;,, : 0532-82032389, E-mail: snow@ouc.edu.cn
VP VIB304 VP VIB461 VP VIB800 ; VP 17802(sj) F3-3 ; qdfsvp001, 16SrDNA 1.1.2 2216E, 1.1.3 SM 5.8 g NaCl, 2 g MgSO 4 7H 2 O, 50 ml 1 mol/l ph 7.5 Tris-HCl, 1 000 ml, 1.2 方 法 1.2.1 4, 30 ml 50 ml 5 000 r/min, 10 min, 5 ml 5 ml 2 2216E, 100 µl VP 17802(OD 600 = 0.837), 37 C, 5 000 r/min, 10 min, 0.22 µm,, 4 C, SM, 100 µl VP 17802(OD 600 = 0.837) 100 µl 5 ml 2216E,, 2216E,, 37 1.2.2 [6], : 1 ml SM,, 4 C, SM, 100 µl 100 µl VP 17802(OD 600 = 0.837), 37 C 30 min, 5 ml,, 37 C 5 1.2.3 SM,, 1.2.4,, 10 ml SM, 4 C, 8 000 r/min, 15 min, 0.22 µm,, 4 C 1.2.5 10 9 pfu/ml 1 ml 12 000 r/min 59 min ( ),,, UNIP-10 ( ) 20 1.2.6, DNaseI RNaseA Mung Bean Nuclease, 1.2.7 [7-8], : 20 μl 10 10 pfu/ml,, 2~3 min,, 2%, 10 min,, 1.2.8, 100 µl 100 µl (OD 600 = 0.837), 37 30 min, 5 ml,, 37, 30~300 VPp1 VP 17802(sj) F3-3 VP VIB304 VP VIB461 VP VIB800 qdfsvp001 1.2.9 (MOI ) 10 1 0.1 0.01 0.001 0.000 1 0.000 01 0.000 001, 100 µl 100 µl VP 17802 ( 3 10 7 CFU/mL ) 10 ml 2216E, 37 C 10 h, 4000 r/min 15 min,, 0.22 µm,, Marine Sciences / Vol. 37, No. 1 / 2013 97
1.2.10 [9] 1 ml 1 ml VP 17802 (OD 600 = 0.837) 10 8 ml 2216E, 37 C 5 min, 12 000 r/min 30 s,, 2216E 37 C 2216E, 37 C,, 30 min 5 min, 10 min,,, 2 结 果 2.1 噬 菌 体 的 分 离 纯 化 及 噬 菌 斑 的 形 态 观 察 VPp1, 37 C 12 h, VP 17802, ( 1),,, 10 10 pfu/ml 2 Fig. 2 The nucleic acid of phage VPp1 M1.1kb DNA ; A. VPp1 ; M2. λ-hind III digest DNA M1.1kb DNA ladder Marker; A. Phages nucleic acid; M2. λ-hind III digest DNA Marker 1 Fig. 1 The bacteriophage plaque of phage VPp1 2.2 噬 菌 体 核 酸 的 提 取 ( 2),,, Quantity One VPp1 15738.77 bp 2.3 噬 菌 体 核 酸 类 型 的 鉴 定 ( 3), DNaseI, RNaseA, DNA, RNA, 3 Fig. 3 Determination of the nucleic acid type of bacteriophage M. 1kb DNA ; A. ; B. DNaseI ; C. RNaseA ; D. Mung Bean Nuclease M.1kb DNA ladder Marker; A. Phages nucleic acid; B. Phages nucleic acid mixed with DNaseI; C. Phages nucleic acid mixed with RNaseA; D. Phages nucleic acid mixed with Mung Bean Nuclease 98 / 2013 / 37 / 1
Mung Bean Nuclease, 3, DNA 2.4 噬 菌 体 的 电 镜 观 察 ( 4), VPp1,, 44 nm ICTV [10], (Tectivirus) 4 VPp1 ( 100000) Fig. 4 Electron micrograph of phage VPp1 2.5 噬 菌 体 裂 解 谱 的 测 定 37 12 h VPp1 VP 17802, VP 17802(sj) VP VIB304, VP VIB304 VP VIB461 VP VIB800 VP 17802(sj) F3-3 qdfsvp001 2.6 噬 菌 体 最 佳 感 染 复 数 (MOI 值 ) 的 测 定 1 1, 10 0.0001,,,, 0.0001, 2.62±0.03 10 10, VPp1 0.0001 2.7 噬 菌 体 一 步 生 长 曲 线 的 测 定 VPp1 5 5, VPp1 10 min,, 10 min; 10~30 min,, VPp1 20 min; 表 1 噬 菌 体 VPp1 最 佳 感 染 复 数 的 测 定 Tab. 1 Determination of bacteriophage VPp1 MOI ( ) ( ) (pfu/ml) 10 3.0±0.01 10 8 3.0±0.03 10 7 2.77±0.02 10 9 1 3.0±0.02 10 7 3.0±0.02 10 7 3.78±0.03 10 9 0.1 3.0±0.01 10 6 3.0±0.01 10 7 6.83±0.03 10 9 0.01 3.0±0.02 10 5 3.0±0.03 10 7 7.51±0.01 10 9 0.001 3.0±0.02 10 4 3.0±0.03 10 7 9.23±0.01 10 9 0.0001 3.0±0.01 10 3 3.0±0.02 10 7 2.62±0.03 10 10 0.00001 3.0±0.02 10 2 3.0±0.01 10 7 2.12±0.03 10 10 0.000001 3.0±0.01 10 3.0±0.03 10 7 7.35±0.01 10 9 90 min,, : = / =2.71 10 9 /3 10 7 =90.3 3 讨 论 5 VPp1 Fig. 5 One-step growth curve of phage VPp1 4 5, 6,,,, Marine Sciences / Vol. 37, No. 1 / 2013 99
[11], [12],,,,, 2005 (ICTV) 5, [13] DNA,, I,,,,, [14],,,,,, [15],,,, VPp1 0.0001, [16] 0.1~10, Onanong [17] 0.01,, VPp1 3 : VPp1, 90.3,, : [1],,,. [J]., 2009, 28(8): 475-481. [2],. [J]., 2001, 8(1): 89-93. [3] Yicheng S, Chengchu L. Vibrio parahaemolyticus: A concern of seafood safety[j]. Food Microbiology, 2007, 24: 549-558. [4],,,. [J]., 2004, 23(2): 35-38. [5] Fujino T, Miwatani T, Yasuda J. Taxonomic studies on the bacterial strains isolated from cases of shirasu food-poisoning (Pasteurella parahaemolytica) and related microorganisms[j]. Biken Journal, 1965, 8(2): 63-71. [6] 効, 穉. [M]. :, 1991: 10. [7],,. VP 10 [J]., 2003, 22(2): 14-16. [8],, -II (Vibrio fluvialis-ii) VP 8 [J]., 2000, 20(1): 20-31. [9]. O157 [D]. :, 2008. [10],. ICTV [J]., 2006, 21(1): 84-96. [11],,. [J]., 2010, 29(5): 291-294. [12]. SWBC-a [J]., 2009, 28(6): 337-340. [13],,. [J]., 2007, 27(4): 604-608. [14] Graschopf A, Blasi U. Functional assembly of the lambda S2 holin requires periplasmatic localization of its N2 terminus[j]. Arch Microbiol, 1999, 172: 31. [15]. K88 [D]. :, 2009. [16],,. [J]., 2007, 34(4): 735-739. [17] Onanong P, Nuttaporn P, Nuttika S, et al. Isolation and characterization of a novel Podoviridae-phage infecting Weissella cibaria N22 from Nham, a Thai fermented pork sausage[j]. Food Microbiology, 2011(28): 518-525. 100 / 2013 / 37 / 1
Isolation, identification and lysis properties analysis of a Vibrio parahaemolyticus phage VPp1 PENG Yong, DING Yun-juan, LIN Hong, WANG Jing-xue (Food Safety Laboratory, College of Food Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao, 266003, China) Received: Dec.,2, 2011 Key words: phage; Vibrio parahaemolyticus; identification; lysis properties Abstract: In order to develop an effective bio-controlling method against Vibrio parahaemolyticus, a virulent phage VPp1 was isolated from aquatic sewage water and identified by plaque shapes, restriction, electronic microscope and lysis properties analyses. The results revealed that VPp1 contains a linear double stranded DNA with 15kb in size and it has an icosahedral head with 44 nm in diameter and does not have a tail, suggesting that VPp1 belongs to the Tectivirus family. VPp1 forms plaques with transparent center and large halo after culture in double-layer agar plate for 12 hours and its optimum MOI value was 0.0001. A one-step growth experiment showed that the latent period and burst size were estimated at 10 min and 90.3 phage particles/infected cell, respectively. VPp1 could be widely used because of its short latent period and large burst size. ( 本 文 编 辑 : 谭 雪 静 ) Marine Sciences / Vol. 37, No. 1 / 2013 101