教 育 部 高 中 生 物 科 學 資 優 生 培 育 計 畫 - 高 雄 區 DNA 萃 取 純 化 與 電 泳 分 析 重 組 DNA 技 術 與 基 因 選 殖 聚 合 酶 連 鎖 反 應 (Polymerase Chain Reaction, PCR) DNA 定 序 (DNA sequencing) 基 因 定 點 突 變 (Site-directed mutagenesis) 技 術 DNA 交 互 配 對 ( 雜 交 ) 反 應 (DNA hybridization) 授 課 教 師 : 楊 文 仁 任 職 單 位 : 高 雄 大 學 生 物 科 技 研 究 所 1 細 菌 質 體 DNA DNA 可 分 為 兩 大 類 :(1) 質 體 (plasmid) DNA;(2) 染 色 體 (chromosomal) DNA, 質 體 通 常 存 在 細 菌 內 質 體 是 細 菌 染 色 體 以 外 的 遺 傳 物 質, 由 雙 股 環 狀 DNA 組 成 細 菌 所 帶 質 體 的 大 小 及 數 目 不 定, 通 常 只 有 數 千 個 鹽 基 對 (bp) 質 體 DNA 具 有 自 行 複 製 的 能 力, 可 以 在 細 菌 間 互 相 轉 移, 而 將 外 來 的 基 因 轉 移 到 其 他 宿 主 細 胞 中 表 現 在 生 物 技 術 的 應 用 方 面, 質 體 DNA 常 被 用 來 做 為 載 體 (vector) 以 選 殖 特 定 的 DNA 以 及 表 現 特 定 的 蛋 白 質 之 用 因 此, 質 體 DNA 的 製 備 是 分 子 生 物 學 的 一 項 基 本 且 重 要 的 技 術 質 體 DNA 製 備 的 原 理 及 步 驟 1. 培 養 並 收 穫 細 菌 2. 破 壞 細 菌 的 細 胞 壁 與 外 膜 3. 破 壞 細 胞 膜 使 細 菌 裂 解 4. 移 除 染 色 體 DNA 5. 移 除 蛋 白 質 與 RNA 6. 純 化 質 體 DNA 2 1
細 菌 質 體 DNA 萃 取 萃 取 質 體 DNA 的 方 法 很 多, 最 常 用 的 是 鹼 性 溶 解 法 (alkaline lysis) 及 煮 沸 法 (boiling method) 提 高 滲 透 壓 使 細 胞 裂 解 鹼 性 溶 解 法 (alkaline lysis) 原 理 是 利 用 鹼 處 理 質 體 DNA 和 染 色 體 DNA, 使 兩 者 雙 股 打 開 呈 單 股 狀 態, 再 加 入 酸 中 和 鹼 使 得 單 股 DNA 回 復 成 為 雙 股 DNA 細 菌 以 NaOH 及 SDS 分 解, 並 使 蛋 白 質 及 DNA 變 性, 再 以 酸 中 和 質 體 DNA 分 子 在 中 和 後 恢 復 原 態, 但 細 菌 染 色 體 DNA 則 無 法 完 全 復 原 而 與 SDS-K + 形 成 複 合 物, 可 用 離 心 沉 澱 加 以 去 除 上 清 液 中 所 含 的 質 體 則 可 以 酒 精 或 異 丙 醇 將 其 沉 澱 sodium dodecyl sulfate (SDS; 十 二 烷 基 硫 酸 鈉 ) http://bioinfo2010.wordpress.com/ 3 煮 沸 法 (boiling method) 製 備 質 體 DNA :( 原 生 質 ) 球 狀 體, 原 生 質 球 幾 乎 或 完 全 去 掉 了 細 胞 壁 的 細 菌 細 胞 Plasmid boiling Plasmid 4 2
http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/extraction/ 5 萃 取 的 質 體, 以 不 同 限 制 酵 素 作 用, 經 電 泳 分 離 DNA 片 段 後, 比 較 各 DNA 片 段 之 分 子 量 大 小, 用 以 檢 測 所 分 離 的 質 體 DNA 之 正 確 性 洋 菜 膠 電 泳 是 把 agarose 加 熱 溶 解 後 再 冷 凝, 洋 菜 膠 會 以 氫 鍵 形 成 凝 膠 而 經 限 制 酶 切 過 的 DNA 片 段, 在 電 場 影 響 下 會 在 凝 膠 中 移 動, 帶 負 電 荷 的 DNA 分 子 會 向 正 極 方 向 移 動 移 動 速 度 依 分 子 大 小 而 定, 分 子 愈 大 移 動 性 愈 慢 而 凝 膠 中 agarose 的 濃 度 決 定 了 空 隙 的 大 小, 特 定 大 小 的 DNA 片 段 在 不 同 濃 度 的 膠 中 移 動 速 率 均 不 同, 故 每 次 電 泳 均 需 以 DNA marker 做 為 比 較 核 酸 在 膠 體 中 可 經 溴 化 乙 錠 ethidium bromide (EtBr) 染 色, EtBr 會 嵌 入 核 酸 鹼 基 中, 以 紫 外 線 照 射, 則 核 酸 吸 收 紫 外 線 波 長 的 光 線, 再 經 EtBr 放 出 可 見 波 長 的 光 線, 藉 以 觀 察 核 酸 的 位 置 大 片 段 小 片 段 http://www.molecularstation.com/agarose-gel-electrophoresis/ 3
http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/gel/ DNA 電 泳 影 片 : http://www.youtube.com/watch?v=sjipq78o-ts&feature=related 7 M 1 2 3 4 Circular form Linear form Coiled form Supercoiled form 二 一 年 國 際 生 物 奧 林 匹 亞 競 賽 國 手 選 拔 初 賽 Q: 下 列 那 種 處 理 最 不 會 影 響 DNA 片 段 在 電 泳 膠 體 內 之 泳 動 速 率? (A) 將 DNA 片 段 上 所 帶 的 負 電 加 以 中 和 (B) 增 加 DNA 片 段 的 長 度 (C) 將 DNA 片 段 的 序 列 改 變 (D) 將 DNA 片 段 上 的 胞 嘧 啶 加 以 甲 基 化 (E) 將 DNA 片 段 縮 短 解 答 : 8 4
重 組 DNA 技 術 (Recombinant DNA technology) = 基 因 工 程 ; 遺 傳 工 程 (Genetic engineering) Key element of biotechnoloy:use recombinant DNA methods to move a gene from any organism to any other organism. 9 重 組 DNA 之 建 構 製 備 重 組 DNA 分 子 的 兩 種 重 要 酵 素 : 1. 限 制 內 切 酶 : 就 像 一 把 剪 刀 在 特 定 專 一 位 置 上 剪 切 DNA 分 子 2.DNA 接 合 酶 : 就 像 膠 水 般 能 將 二 段 DNA 接 合 在 一 起 10 5
Restriction enzymes split DNA into specific fragments Restriction enzymes (restriction endonucleases, RE): recognize specific base sequences in double strand DNA and cleave, at specific places, both strands of a duplex containing the recognized sequences. 1. Restriction enzymes are found in prokaryotes. Their biological role is to cleave foreign DNA. 2. The recognized sequence is palindromic ( 迴 文 ). Greek means running back again. e.g. Radar; Do geese see God? 上 海 自 來 水 來 自 海 上 ; 花 蓮 噴 水 池 水 噴 蓮 花 Sac II (from Streptomyces achromogenes) 3. The pattern of fragment that DNA be cleaved by several RE can serve as a fingerprint of a DNA molecule (RE map) 11 限 制 酶 的 種 類 已 知 的 限 制 酶 分 為 Type I Type II 與 Type III 三 類 Type I 與 Type III 限 制 酶 同 時 具 有 endonuclease 與 methylase 的 活 性 Type I 限 制 酶 會 隨 機 的 切 割 距 離 辨 識 位 置 ~1000 bp 的 序 列,Type III 則 只 會 切 割 距 離 辨 識 位 置 24~26 bp 的 序 列 Type II 限 制 酶, 則 會 專 一 地 切 割 所 辨 識 的 核 酸 序 列 的 位 置, 一 般 可 辨 識 雙 股 DNA 上 特 定 的 4~8 個 鹼 基, 並 能 在 認 知 序 列 內 的 特 定 位 點 上 切 割 雙 股 螺 旋 DNA 每 一 種 限 制 酶 能 辨 識 一 特 定 的 DNA 序 列 並 加 以 切 割, 但 它 不 會 切 割 細 菌 自 己 的 DNA, 因 為 細 菌 DNA 上 的 切 割 位 置 已 被 甲 基 化, 稱 為 restriction-modification system 不 同 的 細 菌 中 可 純 化 出 具 不 同 專 一 性 的 限 制 酵 素, 可 用 來 做 基 因 剪 接 時 的 剪 刀, 使 其 成 為 基 因 或 分 子 遺 傳 操 作 上 極 為 有 用 的 工 具, 目 前 被 廣 泛 應 用 於 遺 傳 工 程 基 因 選 殖 (cloning) 和 基 因 圖 譜 分 析 (gene mapping) 12 6
限 制 酶 的 命 名 限 制 酶 的 命 名 是 以 該 酶 來 源 的 原 核 生 物 的 名 稱 爲 依 據, 即 酶 的 名 稱 的 第 一 個 大 寫 字 母 取 自 於 屬 名 的 第 一 個 字 母, 第 二 三 個 小 寫 字 母 取 自 於 種 名 的 前 兩 個 字 母, 字 母 後 面 的 羅 馬 字 則 是 簡 單 地 表 明 該 種 生 物 中 不 同 限 制 酶 分 離 的 先 後 順 序 限 制 酶 名 稱 的 書 寫 方 式, 前 三 個 字 母 常 用 斜 體 或 加 下 橫 線 表 示 例 如, 分 離 自 產 色 鏈 黴 菌 (Streptomyces achromogenes ) 的 兩 種 限 制 酶 被 分 別 命 名 爲 SacI 和 SacII 若 同 一 生 物 種 內 又 分 爲 不 同 的 血 清 型 或 菌 株 品 系, 其 名 稱 則 放 在 限 制 酶 名 稱 的 第 三 個 字 母 之 後 例 如 限 制 酶 HincⅡ 和 HindⅢ 則 是 分 別 來 自 流 感 嗜 血 菌 (Haemophilus influenzae) 的 c 和 d 血 清 型 菌 株 E Escherichia ( 屬 ) co coli ( 種 ) R RY13 ( 品 系 ) I 首 先 發 現 在 此 類 細 菌 中 發 現 的 順 序 Quiz: 請 說 明 限 制 酶 HindIII 各 字 母 所 代 表 的 意 義 (12 分 ) 94 年 高 考 1. H: 2. in: 3. d : 4. III: 13 Type II restriction endonuclease EcoRI cleavage Cohesive end (Sticky end) (protruding; overhang) Hind II cleavage 7
15 DNA 連 接 作 用 16 8
DNA 連 接 酶 作 用 機 制 All ATP and NAD-dependent ligases appear to join DNA in a similar way but utilize a different nucleotide energy source to catalyze the reaction. 磷 酸 二 酯 鍵 重 組 DNA 影 片 (4 36 ): http://www.youtube.com/watch?v=x2jumg2e-ic 17 基 因 選 殖 的 步 驟 包 括 : 分 離 感 興 趣 的 DNA( 例 如 胰 島 素 基 因 ) 把 感 興 趣 的 DNA 接 合 到 載 體 把 重 組 的 DNA 轉 形 到 宿 主 細 胞 中 篩 選 含 有 重 組 DNA 的 宿 主 細 胞 檢 測 含 有 重 組 DNA 或 是 否 產 出 適 當 蛋 白 質 產 物 的 宿 主 細 胞 基 因 選 殖 (gene cloning) 18 9
選 殖 載 體 的 條 件 : 選 殖 載 體 (cloning vector) 具 有 複 製 起 點, 使 DNA 可 以 在 宿 主 細 胞 中 進 行 複 製 具 有 許 多 單 一 特 殊 的 限 制 酶 切 位, 以 供 選 殖 DNA 片 段 使 用 具 有 篩 選 性 的 標 記, 可 以 用 來 測 定 選 殖 重 組 DNA 是 否 已 轉 移 至 細 胞 中 或 顯 示 外 來 的 DNA 是 否 已 經 插 入 至 載 體 上 pbr322 multiple cloning site (MCS) 19 Clone a foreign DNA into the PstI site of pbr322 1. Cut the vector to generate the sticky ends 2. Cut foreign DNA with PstI also compatible ends 3. Combine vector and foreign DNA with DNA ligase to seal sticky ends 4. Now transform the plasmid into E. coli 20 10
Bacterial Transformation Traditional method involves incubating bacterial cells in concentrated calcium salt solution The solution makes the cell membrane leaky, permeable to the plasmid DNA Newer method uses high voltage to drive the DNA into the cells in process called electroporation Screening Transformants Transformation produces bacteria with: Religated plasmid Religated insert Recombinants Identify the recombinants using the antibiotic resistance (Fig. 4.4) Grow cells with tetracycline so only cells with plasmid grow, not foreign DNA only. Next, grow copies of the original colonies with ampicillin which kills cells with plasmid including foreign DNA. 21 Screening With Replica Plating Replica plating transfers clone copies from original tetracycline plate to a plate containing ampicillin. A sterile velvet ( 天 鵝 絨 ) transfer tool can be used to transfer copies of the original colonies Desired colonies are those that do NOT grow on the new ampicillin plate. Plasmid cloning 影 片 (4 24 ): http://www.youtube.com/watch?v=ackwdnj936o&nr=1 22 11
Vectors for cloning large pieces of DNA Fosmids are similar to cosmids but are based on the bacterial F-plasmid. The cloning vector is limited, as a host (usually E. coli) can only contain one fosmid molecule. Low copy number offers higher stability than comparable high copy number cosmids. 23 如 何 分 離 真 核 生 物 中 感 興 趣 的 基 因 利 用 反 轉 錄 酶 製 備 感 興 趣 的 基 因 分 離 細 胞 全 部 RNA 純 化 mrna 以 反 轉 錄 酶 製 備 cdna (complementary DNA) 用 PCR 放 大 擴 增 感 興 趣 的 基 因 的 cdna 以 電 泳 分 離 純 化 感 興 趣 的 基 因 Use of reverse transcriptase to make cdna of a eukaryotic gene 24 12
聚 合 酶 連 鎖 反 應 (Polymerase Chain Reaction, PCR) 由 Kary Mullis 發 明, 並 於 1993 年 獲 得 了 諾 貝 爾 化 學 獎 PCR 能 使 DNA 在 試 管 中 大 量 擴 增, 其 原 理 是 在 擬 擴 增 的 DNA 片 段 兩 端 分 別 設 計 一 個 前 置 引 子 (forward primer) 和 反 置 引 子 (reverse primer), 使 其 與 已 變 性 的 單 股 目 標 DNA 緩 冷 配 對 黏 合 (annealing) 後, 利 用 DNA 聚 合 酶 (DNA polymerase) 以 目 標 DNA 的 兩 股 分 別 做 為 模 板 (template) 來 合 成 新 的 DNA 股 PCR 過 程 主 要 分 成 三 大 部 份 : 1. 變 性 反 應 (denaturation): 以 高 溫 92-95 使 雙 股 模 板 DNA 分 離 2. 緩 冷 配 對 黏 合 (annealing) : 使 引 子 與 單 股 模 板 DNA 做 緩 冷 配 對 (40-52 ) 3. 延 長 反 應 (extension): 將 溫 度 調 整 到 DNA 聚 合 酶 作 用 的 有 效 溫 度 而 合 成 新 的 DNA 股 (72 ) 在 理 想 的 條 件 下,DNA 以 幾 何 級 數 增 加 理 論 上, 一 個 DNA 分 子 若 重 複 操 作 PCR 25 次, 那 麼 DNA 的 分 子 數 將 會 擴 增 到 2 25 = 10 6 個 分 子 影 響 PCR DNA 合 成 時 精 確 性 的 因 素 所 欲 合 成 的 DNA 的 長 度, 長 度 越 長 出 錯 機 率 越 高 循 環 數 ( 越 多 時 精 確 度 越 低 ) 聚 合 酶 的 種 類 ( 有 校 對 能 力 者 為 佳 ) Mg 2+ (0.5-2.5mM) 的 量 等 25 聚 合 酶 連 鎖 反 應 (Polymerase Chain Reaction, PCR) 一 般 的 DNA 聚 合 酶 有 效 作 用 溫 度 是 37, 在 高 溫 分 離 雙 股 時 會 破 壞 DNA 聚 合 酶 的 活 性 然 而 在 耐 高 溫 的 細 菌 (Thermus aquaticus) 中 分 離 出 來 的 DNA 聚 合 酵 素 (Taq DNA polymerase) 在 95 中 其 活 性 的 半 衰 期 (half life) 長 達 40 分 鐘, 故 可 供 PCR 操 作 使 用 Taq 聚 合 酶 的 有 效 作 用 溫 度 為 72, 在 這 溫 度 下, 每 分 鐘 可 合 成 2000-4000 個 核 苷 酸 (nucleotides) 由 於 Taq 聚 合 酵 素 的 發 現, 使 PCR 之 操 作 得 以 自 動 化 Taq 聚 合 酶 缺 乏 3 至 5 端 外 切 酵 素 (exonuclease) 的 特 性, 因 而 在 DNA 合 成 時 沒 有 校 對 (proofreading) 的 功 能,Taq 聚 合 酶 合 成 DNA 時, 在 每 一 個 循 環 中 錯 誤 配 對 的 頻 率 可 高 達 1/6000 個 核 苷 酸 PCR 的 技 術 已 廣 泛 地 應 用 在 學 術, 工 業 和 醫 學 上 的 研 究, 例 如 DNA 序 列 的 分 析 病 原 菌 的 分 析 基 因 定 位 突 變 遺 傳 病 之 診 斷 基 因 表 現 與 選 殖 水 質 及 食 品 檢 驗 26 13
聚 合 酶 連 鎖 反 應 (Polymerase Chain Reaction, PCR) PCR 影 片 : http://www.youtube.com/watch?v=_ygxcj4n-kq&feature=related 27 PCR 實 驗 操 作 :http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/pcr/ 利 用 PCR 技 術 將 DNA 分 子 擴 增 之 電 泳 圖 28 14
PCR 的 反 應 條 件 DNA template 0.1~1μg Primers 0.1-1.0 μm each dntps 0.2 mm each KCl 50 mm Buffer MgCl 2 1.5 mm Tris-HCl (ph 8.4) 10 mm Taq polymerase 2.5 Unit Total volume 50 or 100 μl 注 意! 此 為 PCR 常 用 之 反 應 條 件, 隨 著 樣 本 DNA 序 列 等 的 不 同, 各 項 條 件 應 斟 酌 調 整 PCR 溫 度 循 環 設 定 94 5 min 94 1 min 55 1 min 25 ~ 30 cycles 72 1 min 72 5 min 4 29 PCR 溫 度 循 環 設 定 起 始 以 高 溫 將 雙 股 DNA 分 離 對 PCR 而 言, 將 雙 股 DNA 完 全 分 開 是 相 當 重 要 的 起 始 步 驟, 作 用 不 完 全 將 會 降 低 PCR 的 產 量 在 GC 含 量 50% 以 下 時, 溫 度 設 定 在 95 時 間 1~3 分 鐘 時 間 可 隨 著 模 版 上 GC 的 比 例 增 加 逐 漸 調 升 通 常 94~95 進 行 1~2 分 鐘 即 可 將 兩 股 DNA 分 離, 如 果 GC 含 量 過 高, 可 將 時 間 提 高 至 4~5 分 鐘 或 者 加 入 10-15%glycerol 10%DMSO 5% formamide 等 溶 液 促 使 DNA 分 離, 但 此 等 溶 液 的 副 作 用 是 會 抑 制 Taq DNA polymerase 約 50% 的 活 性 Primer 黏 合 溫 度 一 般 來 說, 引 子 與 模 版 DNA 黏 合 溫 度 (annealing temperature;ta) 大 約 是 引 子 分 離 核 酸 溫 度 (melting temperature; Tm) 減 5 而 這 溫 度 最 好 落 於 55-75 之 間 如 果 除 了 目 標 產 物 外, 有 些 非 預 期 的 產 物 出 現, 則 可 逐 漸 提 高 黏 合 溫 度 約 1~2 若 2 條 引 子 所 算 出 之 Ta 相 差 超 過 6 以 上 ( 可 能 會 影 響 PCR 的 產 率 ), 可 以 將 算 出 溫 度 較 低 的 那 段 引 子 的 3 或 5 端 加 幾 個 鹼 基 T m ( ) = 2(A+T) + 4(G+C) 15
引 子 (primer) 設 計 的 注 意 事 項 : 1. 引 子 長 度 通 常 為 18-25 個 鹼 基 長 2. GC 含 量 約 佔 40-60% 3. 最 好 3 - 端 的 鹼 基 為 G/C 4. 避 免 引 子 本 身 形 成 二 級 結 構 5. 同 一 反 應 中 的 引 子 序 列 不 可 互 補, 以 免 造 成 自 相 黏 合 形 或 primer dimer 的 情 況 6. 避 免 引 子 所 要 黏 合 的 目 標 形 成 二 級 結 構 7. 引 子 黏 合 溫 度 盡 量 不 要 相 差 5 以 上 8. 3' 端 尤 其 重 要, 必 須 不 含 有 與 其 他 引 子 互 補 的 序 列, 並 且 要 與 模 板 完 全 互 補, 絕 對 不 可 以 有 mismatch 31 Design the primer pairs, 15-mer for each, to amplify the gene sequence below with PCR? It needs to indicate the 5 -and 3 -end of each primer. 5 -GCGTTGACGGTATCAAAACGTTAT TTTACCTGGTGGGCTGTTCTAATC-3 Ans: 5 -GCGTTGACGGTATCAAAACGTTAT TTTACCTGGTGGGCTGTTCTAATC-3 3 -CGCAACTGCCATAGTTTTGCAATA AAATGGACCACCCGACAAGATTAG-5 5 -GCGTTGACGGTATCAAAACGTTAT TTTACCTGGTGGGCTGTTCTAATC-3 ACCCGACAAGATTAG-5 5 -GCGTTGACGGTATCA 3 -CGCAACTGCCATAGTTTTGCAATA AAATGGACCACCCGACAAGATTAG-5 32 16
DNA polymerases 的 選 擇 Thermostable polymerase 種 類 繁 多, 一 般 常 使 用 Taq polymerase, 但 有 時 針 對 所 合 成 fragment 的 長 度 及 正 確 性, 可 考 慮 其 他 酵 素 33 反 ( 逆 ) 轉 錄 PCR (Reverse Transcription PCR; RT-PCR) 過 程 : 反 轉 錄 酶 以 RNA 為 模 版 合 成 互 補 DNA (complementary DNA; cdna), 接 下 來 再 利 用 PCR 的 原 理 來 大 量 擴 增 這 段 cdna RT-PCR 是 目 前 在 體 外 (in vitro) 觀 察 基 因 表 現 最 敏 感 的 方 法 之 一, 可 以 檢 測 很 低 拷 貝 數 的 RNA RT-PCR 廣 泛 應 用 於 遺 傳 病 的 診 斷 以 及 檢 測 RNA 含 量 的 定 量 分 析 Reverse transcription 影 片 (0:38):http://www.youtube.com/watch?v=68zTyjeUsqY 17
反 轉 錄 PCR 合 成 第 一 股 cdna 使 用 的 引 子 種 類 35 即 時 聚 合 酶 連 鎖 反 應 (Real-time PCR; 即 時 PCR) Real-time PCR 又 稱 定 量 即 時 聚 合 酶 連 鎖 反 應 (Quantitative real time polymerase chain reaction, 簡 稱 qrt-pcr 或 q-pcr), 是 一 種 在 DNA 擴 增 反 應 中, 以 螢 光 染 劑 偵 測 每 次 PCR 循 環 後 產 物 總 量 的 方 法 一 般 的 PCR 進 行 後, 反 應 多 已 達 到 飽 和, 測 得 的 產 物 為 end-point 的 PCR 產 物, 若 要 以 傳 統 的 PCR 做 定 量 分 析, 則 要 對 同 一 樣 品 同 時 做 不 同 循 環 的 PCR 反 應, 再 將 產 物 以 電 泳 分 離, 費 時 費 工 且 容 易 污 染 即 時 PCR 的 基 本 原 理 有 兩 個 要 點 : 1. 對 PCR 反 應 中 的 每 一 個 循 環 的 產 物 能 進 行 即 時 偵 測 並 記 錄 下 來 2. 用 於 即 時 偵 測 PCR 產 物 的 螢 光 染 料, 標 記 在 一 段 可 以 與 目 標 序 列 進 行 特 異 性 結 合 的 探 針 上, 並 且 處 於 淬 滅 狀 態, 只 有 當 探 針 與 模 板 特 異 性 結 合 以 後 才 有 可 能 釋 放 出 螢 光 信 號 即 時 PCR 常 用 螢 光 探 針 有 三 種 : DNA 結 合 染 劑 (SYBR Green I) 雜 交 探 針 (hybridization probe) 水 解 探 針 (hydrolysis probe, 又 稱 TaqMan probe) q-pcr Probe 動 畫 : http://www.biosearchtech.com/support/videos/real-time-pcr-probe-animation-video.aspx q-pcr 動 畫 : http://www.lifetechnologies.com/featured-solutions/pcr/real-time-pcr-animation.html ( 因 時 間 因 素, 請 自 行 上 網 參 閱 ) 18
SYBR Green I 雜 交 探 針 (hybridization probe) 37 水 解 探 針 (hydrolysis probe) ( 又 稱 TaqMan probe) 即 時 PCR 19
每 一 輪 循 環 中 PCR 的 產 出 量 都 以 螢 光 信 號 被 記 錄 在 PCR 儀 器 的 光 學 檢 測 系 統, 在 某 一 循 環 中 螢 光 信 號 的 強 度 達 到 預 先 設 定 的 閾 值 (Threshold) 時, 對 應 此 時 的 循 環 數 稱 為 Ct 值 (Threshold Cycle) 目 標 DNA 起 始 濃 度 與 其 Ct 值 成 反 比, 目 標 DNA 的 起 始 濃 度 越 高, 其 螢 光 值 越 早 達 到 偵 測 之 閥 值, 其 Ct 值 越 小 ; 反 之 目 標 DNA 起 始 濃 度 越 低, 其 Ct 值 則 越 大 根 據 序 列 稀 釋 標 準 樣 品 的 Ct 值 及 其 已 知 起 始 濃 度, 即 得 一 標 準 曲 線 (standard curve), 根 據 此 標 準 曲 線. 可 以 由 樣 品 的 Ct 值 推 算 其 起 始 濃 度, 達 到 定 量 之 目 的 Ct 99 學 年 度 大 學 入 學 考 試 指 定 科 目 生 物 科 非 選 擇 題 利 用 遺 傳 工 程 技 術, 可 將 不 同 來 源 的 DNA 組 合 起 來, 建 構 出 重 組 DNA 試 回 答 下 列 問 題 1. 遺 傳 工 程 技 術 利 用 酵 素 以 切 割 DNA 請 問 這 種 酵 素 是 (a) 來 自 哪 一 類 生 物? (1 分 ) (b) 其 名 稱 為 何? (1 分 ) 2. 利 用 PCR 技 術 來 擴 增 目 標 基 因 時, 請 問 (a) 所 使 用 的 酵 素 名 稱 為 何? (1 分 ) (b) 在 對 溫 度 的 敏 感 性 質 上, 此 酵 素 有 何 特 性? (1 分 ) 3. 能 用 來 接 合 目 標 基 因 的 構 造 稱 為 載 體, 請 寫 出 兩 種 載 體 的 名 稱 (2 分 ) 4. 在 建 構 重 組 DNA 過 程 中, 請 問 (a) 能 接 合 目 標 基 因 和 載 體 的 酵 素 名 稱 為 何? (1 分 ) (b) 哪 一 類 原 核 生 物 常 被 用 來 複 製 重 組 DNA? (1 分 ) 解 答 : 1. (a) ; (b) 2. (a) ; (b) 3. ; 4. (a) ; (b) 40 20
DNA 定 序 (DNA sequencing) 在 1977 年, 有 兩 種 DNA 定 序 方 法 首 先 被 發 表 出 來 1. 哈 佛 大 學 A. Maxam 與 W. Gilbert 發 現 一 種 可 以 選 擇 性 分 解 鹼 基 的 化 學 定 序 法 2. 由 F. Sanger 發 展 出 來 的 雙 去 氧 核 苷 酸 定 序 法, 利 用 雙 去 氧 核 苷 酸 在 特 定 位 置 上 造 成 DNA 鏈 合 成 的 終 止, 進 而 推 導 出 DNA 序 列 這 兩 個 方 法,DNA 都 經 過 標 記 且 利 用 凝 膠 電 泳 分 離 DNA 片 段, 目 前 大 多 數 的 實 驗 室 都 使 用 Sanger 的 定 序 方 法 Strategy of the chain-termination method for sequencing DNA 2,3 -dideoxy analog Nobel prize in Chemistry (1980) 3 5 deduce Template sequence 3 -TACTATGCCAGA-5 42 21
現 在 DNA 定 序 都 已 自 動 化 了, 自 動 定 序 的 原 理 是 改 良 了 Sanger 定 序 的 方 法, 將 4 種 ddntp 標 定 上 不 同 的 螢 光 如 下 圖 所 示 : 43 Maxam-Gilbert DNA sequencing method 22
Chemicals used for Maxam-Gilbert sequencing method Base specificity Chemical used for base alteration Chemical used for altered base removal Chemical used for strand cleavage G Dimethylsulphate Piperidine Piperidine A+G Acid Acid Piperidine C+T Hydrazine Piperidine Piperidine C Hydrazine + alkali Piperidine Piperidine A>C Alkali Piperidine Piperidine 46 23
焦 磷 酸 定 序 (pyrosequencing) 技 術 Sanger 方 法 的 特 點 為 解 讀 序 列 能 力 較 強, 每 次 反 應 約 可 得 到 1,000 個 核 苷 酸 序 列, 因 此 可 提 供 較 多 的 DNA 訊 息 但 其 缺 點 為 操 作 較 複 雜, 不 易 於 一 定 時 間 內 分 析 大 量 檢 體 對 DNA 序 列 分 析 的 要 求 通 常 是 解 讀 的 序 列 越 長 越 好, 但 在 許 多 分 子 診 斷 工 作 中, 往 往 需 在 短 時 間 內 偵 測 很 多 DNA 檢 體, 而 且 只 需 短 短 的 幾 十 個 核 苷 酸 序 列 的 資 訊, 就 可 以 提 供 正 確 診 斷 例 如 : 在 臨 床 分 子 診 斷 領 域 中, 對 細 菌 和 其 他 病 原 微 生 物 的 分 子 診 斷, 或 在 偵 測 單 一 核 苷 酸 多 型 性 (single nucleotide polymorphism; SNP) 時, 只 需 對 最 具 代 表 性 的 十 幾 到 幾 十 個 核 苷 酸 片 段 進 行 序 列 分 析 即 可 在 這 種 情 況 下,Sanger 方 法 未 必 是 最 合 適 的 DNA 序 列 分 析 技 術 最 新 發 展 的 焦 磷 酸 定 序 (pyrosequencing) 技 術, 是 目 前 最 適 合 這 些 目 的 的 DNA 序 列 分 析 技 術 47 Pyrosequencing 技 術 是 新 世 代 的 DNA 序 列 分 析 技 術 (next generation sequencing technology), 是 針 對 短 到 中 等 長 度 的 DNA 序 列 樣 品 進 行 高 通 量 高 精 確 度 (99% 精 確 ) 和 再 現 性 佳 的 分 析 技 術 其 原 理 不 同 於 傳 統 Sanger 方 法, 係 利 用 幾 種 生 化 反 應 之 組 合 來 測 定 在 DNA 合 成 時, 過 程 中 會 產 生 的 焦 磷 酸 基 團 (PPi) 之 特 性, 進 而 將 PPi 轉 換 成 ATP,ATP 再 促 使 螢 光 酶 (luciferase) 放 出 生 物 冷 光 (bioluminescence) 放 出 的 冷 光 強 度 經 冷 光 儀 (luminometer) 偵 測 後, 轉 讀 出 DNA 序 列 該 技 術 特 點 包 括 : 對 DNA 的 序 列 分 析 無 須 進 行 電 泳 DNA 片 段 無 須 螢 光 標 記 ( 因 此 無 須 螢 光 分 子 的 激 發 和 檢 測 裝 置 ) 可 在 96 孔 盤 上 進 行 反 應, 因 此 能 同 時 進 行 多 檢 體 序 列 分 析 但 也 因 反 應 特 性 的 限 制, 精 準 讀 序 目 前 只 在 20-30 個 核 苷 酸 序 列 左 右 有 的 研 究 者 經 過 改 良, 可 使 該 技 術 的 讀 序 長 度 增 加 一 倍 以 上 48 24
Pyrosequencing 技 術 的 基 本 步 驟 及 原 理 如 下.. 1. 一 個 特 異 性 的 定 序 引 子 和 單 鏈 DNA 模 板 結 合, 然 後 加 入 酶 混 合 物 ( 包 括 DNA polymerase ATP sulfurylase Luciferase 及 Apyrase) 和 受 質 混 合 物 ( 包 括 Adenosine-5 -phosphosulfate (APS) 和 Luciferin) 2. 在 反 應 中 加 入 一 種 dntp, 若 它 正 好 能 和 DNA 模 板 的 下 一 個 鹼 基 配 對, 則 會 在 DNA 聚 合 酶 的 作 用 下, 添 加 到 引 子 的 3 端, 同 時 釋 放 出 一 個 分 子 的 焦 磷 酸 (PPi) 3. 在 ATP 硫 酸 化 酶 的 作 用 下, 生 成 的 PPi 可 以 和 APS 結 合 形 成 ATP; 在 冷 光 酶 的 催 化 下, 生 成 的 ATP 又 可 以 和 冷 光 素 結 合 形 成 氧 化 冷 光 素, 同 時 產 生 可 見 光 通 過 CCD 光 學 系 統 即 可 獲 得 一 個 特 異 的 檢 測 峰, 峰 值 的 高 低 則 和 相 匹 配 的 鹼 基 數 成 正 比 4. 反 應 體 系 中 剩 餘 的 dntp 和 殘 留 的 少 量 ATP 在 Apyrase 的 作 用 下 發 生 降 解 5. 加 入 另 一 種 dntp, 重 覆 進 行 第 2~4 步 驟 反 應, 根 據 獲 得 的 峰 值 圖 即 可 讀 取 準 確 的 DNA 序 列 訊 息 49 Pyrosequencing enzyme reactions Phosphodiester bond formation and release of pyrophosphate during the incorporation of a nucleotide at the end of a growing DNA strand. Apyrase is an ATP diphosphohydrolase. It catalyses the removal of the gamma phosphate from ATP and the beta phosphate from ADP. The phosphate from AMP is not removed. 25
DNA sequence determination by pyrosequencing 焦 磷 酸 定 序 動 畫 : http://www.youtube.com/watch?v=nffgwgfe0aa 51 基 因 定 點 突 變 (site-directed mutagenesis) 技 術 定 點 突 變 是 加 拿 大 科 學 家 Michael Smith 發 明, 他 與 PCR 發 明 者 Kary Mullis 在 1993 年 共 同 獲 得 諾 貝 爾 化 學 獎 基 因 突 變 可 經 由 自 發 性 或 經 誘 導 產 生 在 定 點 突 變 法 之 前, 突 變 株 的 產 生 必 須 經 由 自 然 界 或 用 化 學 等 方 法 讓 基 因 突 變, 這 屬 於 隨 機 突 變 而 突 變 株 必 須 在 生 物 體 上 產 生 改 變, 才 能 確 定 有 突 變 發 生 突 變 位 置 必 須 利 用 分 生 或 化 學 方 法 來 確 定 定 點 突 變 是 經 由 設 計 好 的 寡 核 苷 酸, 在 任 何 一 個 基 因 片 段 上 進 行 隨 意 或 設 計 好 的 突 變, 意 即 此 突 變 是 預 先 設 定 好 的, 所 以 也 有 人 將 它 稱 為 反 向 遺 傳 法 target gene (M13 正 股 ) (DNA polymerase) 26
Tyrosine Phenylalanine DNA 交 互 配 對 ( 雜 交 ) 反 應 (DNA hybridization) 利 用 螢 光 標 定 之 DNA 探 針, 藉 由 hybridization 的 過 程, 在 染 色 體 上 將 基 因 或 DNA 定 位 54 27
南 方 墨 點 法 (Southern blot) 由 英 國 科 學 家 Edwin Southern 發 明, 因 此 命 名 為 Southern blot, 用 以 偵 測 經 由 膠 體 電 泳 分 離 的 樣 品 中, 含 有 特 定 序 列 的 DNA 片 段 類 似 的 技 術 也 被 用 來 偵 測 經 由 膠 體 電 泳 分 離 的 樣 品 中, 含 有 特 定 序 列 的 RNA 片 段, 稱 為 北 方 墨 點 法 (Northern blot) 用 以 偵 測 蛋 白 質 的 方 法 稱 為 西 方 墨 點 法 (Western blot) Southern blot 動 畫 : http://www.youtube.com/watch?v=6fjjjatsr50 Northern blot 動 畫 : http://www.youtube.com/watch?v=kfhzfyad nng&feature=related 西 方 墨 點 法 (Western blot) Western blot 動 畫 : http://www.youtube.com/watch?v=agu-nkvkioa&feature=related 28