分子遺傳學

教 育 部 高 中 生 物 科 學 資 優 生 培 育 計 畫 高 雄 區 分 子 生 物 實 驗 手 冊 學 生 : 學 校 : 授 課 教 師 : 楊 文 仁 老 師 國 立 高 雄 大 學 生 命 科 學 系

實 驗 室 安 全 及 注 意 事 項 1. 嚴 禁 在 實 驗 室 中 飲 食 或 吸 煙 2. 實 驗 室 不 可 穿 著 脫 鞋, 必 要 時 應 戴 上 乳 膠 手 套, 以 確 保 自 身 安 全 3. 揮 發 性 溶 劑 藥 品, 應 在 通 風 櫥 中 量 取 配 製 ; 有 毒 物 質 或 致 癌 性 物 質, 取 用 時 應 戴 上 手 套, 必 要 時 應 戴 上 口 罩 ; 毒 性 藥 品 廢 液 需 應 依 照 規 定 指 示 處 理, 倒 入 規 定 之 廢 液 收 集 桶 中, 不 可 隨 意 往 水 槽 傾 倒 4. 實 驗 時 打 翻 任 何 藥 品 試 劑, 應 立 即 清 理 5. 實 驗 室 器 材 藥 品 於 使 用 後 應 整 理 清 潔 並 放 回 原 位 6. 實 驗 室 器 材 藥 品 不 可 擅 自 攜 出 實 驗 室 外 7. 所 有 儀 器 於 使 用 前 應 先 了 解 其 性 能 及 操 作 方 式 再 行 使 用 8. 應 清 楚 了 解 緊 急 沖 洗 站 沖 眼 站 滅 火 器 之 位 置, 若 發 生 任 何 緊 急 事 件 應 立 即 通 知 老 師 及 相 關 人 員, 並 進 行 緊 急 處 理 措 施 9. 有 任 何 問 題, 立 即 反 應 給 老 師 及 相 關 人 員 1

微 量 吸 管 (PIPETMAN) 操 作 要 點 1. 使 用 pipetman 前, 下 壓 按 扭 數 次, 以 做 排 氣 動 作 2. 將 管 尖 (tip) 裝 於 微 量 吸 管 柱 前 端, 安 裝 時 壓 緊 旋 轉 以 確 保 其 密 閉 性 3. 操 作 微 量 吸 管 時 要 盡 量 保 持 垂 直, 造 成 吸 取 液 面 的 最 小 截 面 積 4. 管 尖 浸 於 液 面 下 約 5 mm, 等 1~2 秒 待 其 氣 壓 回 穩 後 將 管 尖 拉 離 液 劑 5. 從 管 尖 排 出 液 劑 時, 應 將 吸 管 尖 之 管 口 靠 在 容 器 之 內 壁 上 ( 傾 斜 10~45 度 ), 緩 緩 壓 下 按 扭 至 第 一 段 處 6. 將 按 扭 完 全 按 下 ( 至 第 二 段 處 ), 並 小 心 的 將 管 尖 沿 著 容 器 內 壁 滑 動 而 拉 離 容 器 ( 如 此 可 使 試 劑 完 全 注 入 而 不 會 殘 留 在 吸 管 尖 內 ) 7. 設 定 吸 取 容 量 碼 表 值, 由 低 值 旋 轉 至 高 值 時, 需 旋 轉 超 越 所 欲 設 定 值 後, 再 反 轉 至 設 定 值 ; 由 高 值 旋 轉 至 低 值 時, 則 直 接 旋 轉 至 設 定 值 即 可 8. 吸 取 試 劑 時, 釋 放 按 鈕 不 可 過 速, 以 免 試 液 衝 入 吸 管 柱 內 而 腐 蝕 活 塞 9. 濃 稠 或 具 黏 性 之 試 液, 如 血 液 蛋 白 質 有 機 溶 劑 等, 均 需 先 行 將 tip 預 潤 切 勿 吸 取 溫 度 高 於 70 之 試 劑, 以 免 蒸 汽 侵 入 而 腐 蝕 活 塞 管 尖 2

實 驗 一 小 量 細 菌 質 體 DNA 的 製 備 及 其 定 量 目 的 本 實 驗 將 使 用 鹼 性 溶 裂 法 自 細 菌 細 胞 製 備 小 量 質 體 DNA, 並 利 用 DNA 會 吸 收 波 長 260nm 紫 外 光 的 特 性, 以 分 光 光 度 計 來 估 算 所 製 備 質 體 DNA 的 濃 度 背 景 質 體 是 細 菌 染 色 體 以 外 的 遺 傳 物 質, 由 雙 股 環 狀 DNA 組 成 細 菌 所 帶 質 體 的 大 小 及 數 目 不 定 質 體 DNA 可 以 在 細 菌 間 互 相 轉 移, 而 將 外 來 的 基 因 轉 移 到 其 他 宿 主 細 胞 中 表 現 因 此, 質 體 DNA 的 製 備 是 分 子 遺 傳 學 的 一 項 基 本 而 且 重 要 的 技 術 質 體 DNA 製 備 的 原 理 及 步 驟 1. 培 養 並 收 穫 細 菌 2. 破 壞 細 菌 的 細 胞 壁 與 外 膜 3. 破 壞 細 胞 膜 使 細 菌 裂 解 4. 移 除 染 色 體 DNA 5. 移 除 蛋 白 質 與 RNA 6. 純 化 DNA 鹼 性 溶 裂 法 製 備 質 體 DNA 有 許 多 方 法 用 於 製 備 質 體 DNA, 一 般 實 驗 室 常 用 的 是 鹼 性 溶 裂 法 (alkaline lysis method) 及 煮 沸 法 (boiling method) 鹼 性 溶 裂 法 的 原 理 是 以 NaOH 和 SDS 將 細 菌 分 解, 並 造 成 蛋 白 質 及 DNA 變 性, 再 用 酸 加 以 中 和 質 體 DNA 在 中 和 後 可 以 恢 復 原 狀, 而 大 部 分 細 菌 染 色 體 DNA 無 法 復 原, 並 與 SDS-K + 所 形 成 的 複 合 物 一 起 沉 澱, 藉 由 離 心 去 除 之, 再 以 酒 精 或 異 丙 醇 將 上 清 液 的 質 體 DNA 沉 澱, 即 可 得 到 質 體 DNA 本 實 驗 所 使 用 大 腸 桿 菌 (E. coli) 宿 主 細 胞 攜 帶 有 質 體 puc19 ( 圖 一 ), 由 於 puc19 帶 有 抗 ampicillin 抗 藥 性 基 因 (Amp R ), 故 需 將 細 菌 培 養 於 含 有 ampicillin 的 培 養 基 中, 才 能 篩 選 出 帶 有 puc19 質 體 的 細 菌 3

圖 一 puc18/19 質 體 示 意 圖 及 multiple cloning site 限 制 酶 切 位 材 料 與 設 備 儀 器 設 備 1. 桌 上 型 離 心 機 2. 1.5 ml 離 心 管 3. 震 盪 器 ( vortex ) 4. 微 量 吸 管 ( pipetman );P20 P200 P1000 5. 管 尖 6. 37 水 浴 槽 7. 分 光 光 度 計 (spectrophotometer) 8. 石 英 測 光 管 (cuvette) 藥 品 試 劑 1. 隔 夜 培 養 之 大 腸 桿 菌 (E. coli 攜 帶 質 體 puc19) 菌 液 2. 酚 ( phenol ) 3. 氯 仿 (chloroform) 4

4. 100% 絕 對 酒 精 (ethanol) 70% 酒 精 5. 異 丙 醇 ( isopropanol ) 6. 碎 冰 7. TE 緩 衝 液 (10mM Tris-HCl 及 1mM EDTA, ph8.0) 8. 無 菌 水 9. RNase 溶 液 I 50 mm glucose 作 用 : 25 mm Tris-HCl (ph 8.0) 作 用 : 10 mm EDTA (ph 8.0) 作 用 : 溶 液 II ( 使 用 前 新 鮮 配 製 ) 0.2N NaOH 作 用 : 1% SDS 作 用 : ( 1 ml 1N NaOH + 0.5 ml 10% SDS + 3.5 ml H 2 O = 5 ml 溶 液 II ) 溶 液 III ( 作 用 : ) 5M potassium acetate 60 ml glacial acetic acid 11.5 ml H 2 O 28.5 ml 實 驗 步 驟 1. 取 1.5 ml 隔 夜 培 養 的 菌 液, 置 入 1.5 ml 離 心 管 中, 於 室 溫 下 以 6,000 rpm 離 心 3 分 鐘, 將 菌 體 離 至 管 底 2. 移 除 上 清 液, 重 覆 步 驟 1 3. 將 離 心 管 中 的 上 清 液 (supernatant) 抽 出 丟 棄, 上 清 液 需 確 實 移 除 4. 加 入 100 µl 冰 冷 的 溶 液 I, 劇 烈 震 盪 (vortex) 使 沉 澱 物 (pellet) 再 懸 浮 需 確 定 沉 澱 物 完 全 溶 解 在 溶 液 I 中 5. 加 入 200 µl 新 鮮 製 備 的 溶 液 II, 上 下 翻 轉 試 管 數 次, 確 定 混 合 均 勻, 靜 置 於 冰 浴 中 5 分 鐘, 菌 液 將 呈 現 透 明 狀 6. 加 入 150 µl 冰 冷 的 溶 液 III, 上 下 搖 晃 試 管 數 次, 確 定 混 合 均 勻, 會 有 白 5

色 絲 狀 物 產 生, 靜 置 於 冰 浴 中 5 分 鐘 7. 以 12,000 rpm 離 心 5 分 鐘, 取 上 清 液 至 新 的 1.5 ml 離 心 管 中 8. 加 入 400 µl 的 phenol/chloroform, 搖 晃 試 管 使 其 混 合 均 勻 9. 以 12,000 rpm 離 心 5 分 鐘, 取 上 清 液 至 新 的 1.5 ml 離 心 管 中 ( 勿 吸 取 到 界 面 間 的 物 質 ) 10. 重 複 步 驟 8 ~ 9, 直 至 界 面 無 污 染 物 存 在 11. 加 入 2.5 倍 體 積 的 冰 冷 100% 絕 對 酒 精 ( 或 等 體 積 的 異 丙 醇 ), 混 合 均 勻, 置 於 室 溫 5 分 鐘 ( 或 -20,30 分 鐘 ) 12. 以 12,000 rpm 離 心 5 分 鐘, 移 除 上 清 液 13. 加 入 500µl 冰 冷 的 70% 酒 精 洗 沉 澱 物, 移 除 上 清 液 ( 注 意! 勿 使 沉 澱 物 掉 出 ), 於 室 溫 倒 置 20 分 鐘 (5~10 分 鐘 ), 使 試 管 中 的 DNA 乾 燥 ( 沉 澱 物 會 逐 漸 變 透 明 ) 14. 加 入 40 µl 的 TE 緩 衝 液 或 無 菌 水 將 試 管 底 ( 及 離 心 面 之 管 壁 ) 的 DNA 溶 出, 此 即 為 製 備 所 得 的 DNA 15. 此 時 製 備 之 DNA 中 仍 含 有 RNA, 可 加 入 RNase 將 其 去 除 取 出 20µl 的 DNA 溶 液, 加 入 1µl 的 RNase, 於 37 作 用 20 分 鐘 剩 下 的 20µl DNA 溶 液, 作 為 對 照 組 之 用 16. 取 出 2µl 加 水 稀 釋 至 98µl, 將 稀 釋 液 裝 入 石 英 測 光 管, 測 其 在 UV 260nm 及 UV 280nm 的 吸 光 值, 並 估 算 其 濃 度 17. DNA 樣 品 名 稱 標 示 清 楚 後, 進 行 後 續 分 析 或 儲 存 於 -20 備 用 6

煮 沸 法 (boiling method) 製 備 質 體 DNA 材 料 與 方 法 大 致 與 鹼 性 溶 裂 法 相 同, 另 外 包 括 下 列 材 料 : 1. lysozyme (10 mg/ml in 10 mm Tris-HCl, ph 8.0) 2. 5 M LiCl 3. 滅 菌 牙 籤 4. 沸 水 浴 STET 緩 衝 液 配 製 : 8% sucrose 8 g sucrose 5% Triton X-100 5 ml Triton X-100 50 mm EDTA 10 ml 0.5 M EDTA (ph 8.0) 50 mm Tris-HCl (ph 8.0) 5 ml 1M Tris-HCl (ph 8.0) 實 驗 步 驟 add dh 2 O to 100 ml 1. 取 1.5 ml 隔 夜 培 養 的 菌 液, 置 入 1.5 ml 離 心 管 中, 於 室 溫 下 以 6,000 rpm (12,000 rpm) 離 心 3 分 鐘 (1 分 鐘 ), 將 菌 體 離 至 管 底 2. 移 除 上 清 液, 重 覆 步 驟 1 3. 將 離 心 管 中 的 上 清 液 (supernatant) 抽 出 丟 棄, 上 清 液 需 確 實 移 除 4. 加 入 300 µl 的 STET 緩 衝 液, 使 沉 澱 物 再 懸 浮, 需 確 定 沉 澱 物 完 全 溶 解 5. 加 入 25 µl 的 lysozyme 溶 液,vortex 混 合 3 秒 鐘 6. 將 離 心 管 移 入 沸 水 煮 40 秒 鐘 ( 裝 上 防 管 口 爆 開 裝 置, 放 於 浮 板 上 ) 7. 於 室 溫 下 以 12,000 rpm 離 心 20 分 鐘 (15 分 鐘 ) 8. 用 滅 菌 牙 籤 將 白 色 的 細 菌 碎 片 沉 澱 物 移 除 9. 加 入 300 µl 的 5M LiCl 以 移 除 大 分 子 RNA, 混 合 均 勻, 置 於 冰 上 5 分 鐘 10. 以 12,000 rpm 離 心 5 分 鐘, 取 上 清 液 到 新 的 離 心 管 中 11. 加 入 600 µl 的 異 丙 醇, 混 合 均 勻, 置 於 -20,30 分 鐘 (20 分 鐘 ) 12. 以 下 步 驟 如 同 鹼 性 溶 裂 法 步 驟 12 ~ 17 7

附 錄 1. 以 分 光 光 度 計 對 DNA 或 RNA 定 量 時, 需 測 260nm 及 280nm 的 吸 光 值 核 酸 和 蛋 白 質 分 別 在 波 長 260nm 及 280nm 有 最 大 吸 光 值, 若 有 任 何 蛋 白 質 污 染 可 經 由 280nm 吸 光 值 得 知 因 此,A 260/280 比 值 可 提 供 評 估 樣 品 的 純 度 製 備 DNA 之 A 260/280 比 值 為 ; 製 備 RNA 之 A 260/280 比 值 為, 即 為 好 的 純 度 2. 核 酸 之 定 量 : 雙 股 DNA 在 UV 260nm 的 吸 光 值 = 1.0; 相 當 於 濃 度 µg/ml 單 股 DNA 在 UV 260nm 的 吸 光 值 = 1.0; 相 當 於 濃 度 µg/ml 單 股 RNA 在 UV 260nm 的 吸 光 值 = 1.0; 相 當 於 濃 度 µg/ml 3. 重 量 單 位 之 換 算 : 1 cg (centi-) = g 1 pg (pico-) = g 1 mg (milli-) = g 1 fg (femto-) = g 1 µg (micro-) = g 1 ag (atto-) = g 1 ng (nano-) = g 4. 注 意 事 項 : phenol/chloroform 為 毒 性 物 質, 操 作 時 要 小 心, 避 免 接 觸 皮 膚 使 用 後 應 集 中 放 置, 依 照 有 機 毒 物 廢 棄 物 相 關 規 定 處 理 8

目 的 實 驗 二 聚 合 酶 連 鎖 反 應 本 實 驗 的 目 的 在 使 學 習 者 熟 悉 PCR 的 基 本 原 理 及 操 作 技 術, 如 何 自 植 物 樣 本 中 抽 取 DNA, 並 利 用 瓊 膠 電 泳 來 分 析 PCR 產 物 背 景 PCR 原 理 聚 合 酶 連 鎖 反 應 ( Polymerase Chain Reaction, PCR ) 是 美 國 Cetus 公 司 的 K. B. Mullis 於 1984 年 所 發 明 的 一 種 在 細 胞 外 (in vitro) 複 製 DNA 的 技 術 此 技 術 將 一 段 特 定 的 DNA, 與 DNA polymerase 作 用, 在 短 時 間 內 經 denaturation annealing extension 等 步 驟 重 複 反 應, 使 產 物 以 2 n 的 速 率 急 速 增 加, 即 使 原 本 只 有 picogram ( pg, 10-12 g ) 的 DNA, 快 速 增 加 至 microgram (µg, 10-6 g) 此 技 術 不 論 在 學 術 研 究 或 生 物 科 技 之 應 用 上 均 有 劃 時 代 之 意 義, 因 此 Mullis 於 1993 年 榮 獲 諾 貝 爾 化 學 獎 PCR 的 原 理, 即 是 利 用 DNA 聚 合 反 應 (DNA polymerization), 重 複 地 進 行 DNA 的 合 成 主 要 包 括 下 列 三 個 步 驟 : 1. DNA 模 板 之 變 性 (DNA template denaturation) 利 用 高 溫 ( 一 般 約 94 ~ 95 ) 使 雙 股 DNA 變 性, 打 開 成 單 股 DNA 2. 引 子 的 煉 合 (primers annealing) 降 低 溫 度 ( 一 般 約 50 ~ 60 ) 使 具 有 對 DNA 模 板 序 列 互 補 的 引 子 與 DNA 模 板 煉 合 此 時 單 股 DNA 也 可 能 再 度 結 合 成 雙 股 但 由 於 引 子 的 濃 度 遠 超 過 DNA 模 板 的 濃 度, 所 以 單 股 DNA 再 度 結 合 成 雙 股 的 機 會 不 大 3. 引 子 的 延 伸 (primers extension) 將 溫 度 升 高 至 DNA 聚 合 酶 反 應 的 適 當 條 件 ( 一 般 為 72 ), 使 其 以 引 子 為 開 端, 依 據 DNA 模 板 序 列, 進 行 延 伸 作 用, 合 成 出 互 補 股 的 DNA 片 段 PCR 反 應 不 斷 重 複 此 三 個 步 驟, 產 物 得 以 幾 何 級 數 迅 速 地 增 加, 顯 著 地 提 高 實 驗 的 靈 敏 度 並 降 低 工 作 的 困 難 度, 現 已 成 為 分 析 DNA 的 利 器, 並 廣 泛 被 應 用 在 基 礎 分 子 生 物 醫 學 診 斷 刑 事 科 學 考 古 學 等 方 面 9

材 料 與 設 備 儀 器 設 備 DNA 溫 度 循 環 機 PCR 反 應 試 管 (0.2 ml) 微 量 吸 管 (P20 P200 pipetman, 可 吸 取 20 µl 200 µl) 無 蓋 的 離 心 管 (1.5 ml) 微 量 吸 管 尖 桌 上 型 離 心 機 震 盪 器 (vortex) 材 料 模 板 DNA 引 子 Taq DNA polymerase Taq polymerase buffer (10x) dntp 混 合 液 ( 各 dntp 的 濃 度 為 2.5 mm) 無 菌 去 離 子 水 實 驗 步 驟 1. 取 一 0.2 ml PCR 反 應 試 管, 依 下 列 用 量 加 入 反 應 物, 完 成 後 置 入 DNA 溫 度 循 環 機 中 注 意 Taq polymerase 要 最 後 才 加 入 並 於 加 入 所 有 反 應 物 後, 用 手 指 輕 敲 試 管 使 其 混 合 均 勻 可 用 無 蓋 的 1.5 ml 離 心 管 托 住 PCR 反 應 試 管, 置 於 離 心 機 中 離 心 數 秒 鐘, 使 反 應 物 集 中 於 底 部 把 PCR 反 應 試 管 置 入 溫 度 循 環 機 之 前, 將 試 管 立 於 碎 冰 上 Template DNA 1 µl dntp mix (2.5 mm) 4 µl forward primer (10 µm) reverse primer (10 µm) Taq polymerase buffer (10 X) 5 µl Taq polymerase 1 µl dh 2 O total 50 µl 4 µl (1 µl) 4 µl (1 µl) 31 µl (37 µl) 10

2. 設 定 溫 度 循 環 機 ( 圖 二 ) 的 程 式 ( 圖 三 ) 如 下 : 圖 二 PCR 溫 度 循 環 機 94 5 min (3 min) 94 30 sec 60 30 sec 25 ~ 30 cycles (20 cycles) 72 3 min (1 min) 72 10 min (5 min) 4 圖 三 PCR 程 式 設 定 3. 設 定 完 成 後, 按 下 START 鍵, 即 可 進 行 反 應 反 應 約 需 2~3 小 時 4. 反 應 完 畢, 取 出 樣 品 進 行 電 泳 分 析 11

實 驗 三 以 限 制 酶 切 割 DNA 和 瓊 膠 電 泳 分 析 目 的 本 實 驗 之 主 要 目 的 在 使 學 習 者 熟 悉 利 用 限 制 酶 (restriction enzymes) 對 序 列 認 知 的 專 一 性 來 切 割 及 鑑 定 DNA, 並 以 瓊 膠 電 泳 觀 察 結 果 背 景 何 謂 核 酸 內 切 酶 在 原 核 生 物 細 胞 中, 多 存 在 有 核 酸 內 切 酶 (restriction endonucleases), 簡 稱 限 制 酶 它 們 組 成 限 制 修 飾 系 統 (restriction modification system) 一 方 面 標 記 自 體 DNA, 一 方 面 將 侵 入 細 菌 細 胞 的 外 來 DNA 切 掉, 但 不 會 切 已 標 記 ( 例 如 甲 基 化 ) 的 自 體 DNA 因 其 對 DNA 序 列 的 認 知 具 有 專 一 性, 而 成 為 在 生 物 技 術 上 的 一 項 重 要 工 具 限 制 酶 之 命 名 限 制 酶 命 名 是 以 其 來 源 的 細 菌 之 學 名 簡 稱 而 得, 例 如 EcoRI 是 由 Escherichia coli RI 而 來 依 對 DNA 序 列 的 認 知 及 切 割 部 位 不 同, 可 將 限 制 酶 分 成 I II III 等 三 型 第 I 型 其 認 知 序 列 與 切 割 部 位 相 距 至 少 1000 bp 以 上 ; 第 II 型 限 制 酶 可 在 其 認 知 序 列 中, 很 準 確 地 切 在 特 定 的 位 置, 所 以 此 型 限 制 酶 常 被 用 於 生 物 技 術 的 分 子 選 殖 上 通 常 其 認 知 的 序 列 為 4 ~ 6 個 鹼 基 ; 第 III 型 其 切 割 部 位 在 認 知 序 列 附 近 幾 十 個 鹼 基 有 些 限 制 酶 在 其 認 知 的 序 列 中, 將 對 稱 的 雙 股 交 互 的 切 開, 使 DNA 片 段 的 3 和 5 端 形 成 黏 著 端 (sticky end), 有 些 則 會 在 對 稱 軸 上 將 認 知 位 置 切 開 形 成 平 頭 端 (blunt end) 瓊 膠 電 泳 瓊 膠 電 泳 是 將 agarose 溶 解 於 TAE 緩 衝 溶 液 中, 冷 卻 後 agarose 會 以 氫 鍵 形 成 凝 膠, 在 電 場 影 響 下 使 帶 負 電 的 DNA 分 子 向 陽 極 移 動, 移 動 速 度 依 分 子 大 小 而 定, 分 子 愈 大 移 動 愈 慢 一 般 而 言, 在 某 範 圍 內 DNA 片 段 的 大 小 其 移 動 距 離 的 對 數 ( log ) 與 凝 膠 濃 度 成 直 線 相 關, 因 此 必 須 選 擇 一 個 適 當 的 濃 度, 才 能 有 效 地 將 DNA 片 段 分 開 例 如 0.8% (w/v) 濃 度 適 度 分 離 0.5~10 kb 的 線 狀 DNA 用 已 知 的 DNA 片 段 為 標 誌, 可 用 來 決 定 未 知 長 短 的 DNA 片 段 大 小 在 瓊 膠 電 泳 上 也 可 測 定 DNA 的 純 度 和 完 整 性, 被 RNA 污 染 會 12

造 成 低 分 子 量 位 置 的 band 模 糊 不 清 利 用 限 制 酶 切 割 所 產 生 的 DNA 片 段, 可 測 試 質 體 圖 譜 是 否 正 確? 本 實 驗 將 以 限 制 酶 切 割 DNA 片 段 來 鑑 定 質 體 DNA 的 圖 譜, 並 利 用 瓊 膠 電 泳 觀 察 DNA 的 大 小 純 度 和 圖 譜 完 整 性 材 料 與 設 備 儀 器 設 備 1. 水 平 迷 你 瓊 膠 電 泳 系 統 2. 微 波 爐 3. 桌 上 型 離 心 機 4. 水 浴 槽 5. 照 像 系 統 6. Ethidium bromide 染 劑 容 器 7. 玻 璃 瓶 8. 1.5 ml 離 心 管 9. 微 量 吸 管 尖 10. 塑 膠 平 板 11. 漂 浮 墊 藥 品 試 劑 1. 實 驗 一 所 製 備 的 質 體 DNA 2. 瓊 膠 ( agarose ) 3. Ethidium bromide ( EtBr;10 mg/ml ) 4. Restriction enzymes:bgl I, Hind III 5. Restriction enzymes reaction buffer (10 x) 6. purified BSA 1mg/ml (100x) 7. DNA ladder (50ng/µl) 8. DNA loading dye (6x) 9. 無 菌 水 10. TAE buffer (1M Tris, 15mM EDTA, 125mM sodium acetate, ph=7.8) 11. 蠟 紙 ( parafilm ) 12. 熱 感 應 相 紙 13. RNase (10 mg/ml) 13

DNA loading dye (6x) 製 備 0.25% bromophenol blue 0.25% xylene cyanol FF 30% 甘 油 溶 於 水 中 TAE 緩 衝 液 ( 25x ) 製 備 方 法 將 121g Tris base, 10.25g sodium acetate 及 18.6g EDTA 溶 於 750ml 蒸 餾 水 中, 再 用 冰 醋 酸 調 整 至 ph = 7.8, 加 水 調 整 體 積 至 1000ml 實 驗 步 驟 ( 一 ) 限 制 酶 切 割 DNA 實 驗 1. 取 欲 切 割 的 DNA( 約 0.5~1 µg), 置 入 1.5ml 離 心 管 中 2. 計 算 切 割 DNA 所 需 限 制 酶 的 量 ( 參 考 廠 商 提 供 的 相 關 資 料 ) 一 個 限 制 酶 的 單 位 (1 unit) 定 義 為 在 50 µl 的 反 應 體 積 中, 作 用 60 分 鐘, 可 切 割 1µg DNA 3. 取 適 當 的 反 應 體 積, 使 甘 油 含 量 小 於 5% (w/v), 並 計 算 須 加 入 多 少 10x 緩 衝 液, 使 其 反 應 混 合 物 中 的 最 終 濃 度 達 到 1x 緩 衝 液 的 使 用 須 參 考 廠 商 提 供 的 說 明 ( 低 中 高 鹽 類 之 緩 衝 液 ) 4. 加 入 適 量 的 蒸 餾 水 達 到 最 後 的 反 應 體 積 ( 此 次 實 驗 反 應 體 積 請 參 閱 P.16 實 驗 結 果 2 --- 限 制 酶 切 割 DNA 實 驗 ) 5. 在 離 心 機 高 速 離 心 5 秒, 以 減 少 管 壁 少 量 液 體 的 附 著 6. 將 反 應 物 放 入 37 水 浴 槽 作 用 一 小 時 ( 在 此 一 小 時 的 等 待 時 間 內, 另 外 著 手 進 行 瓊 膠 的 製 備 ) ( 二 ) 瓊 膠 的 製 備 1. 依 照 儀 器 說 明 將 迷 你 膠 體 電 泳 組 件 組 合 起 來 2. 將 25x TAE 緩 衝 液 用 蒸 餾 水 稀 釋 成 1x TAE 稱 取 0.2g agarose 溶 於 25ml 的 1x TAE 緩 衝 液 中 ( 製 備 成 0.8 % 的 瓊 膠 ), 用 微 波 爐 加 熱 使 溶 解, 待 冷 卻 至 45 左 右, 將 其 倒 入 膠 體 製 備 槽 中, 厚 度 約 7.5 mm, 並 立 刻 插 入 梳 板 (comb) ( 應 避 免 氣 泡 產 生, 並 注 意 液 面 是 否 平 整 厚 度 是 否 一 致 ) 3. 在 室 溫 下 冷 卻 凝 固 約 20 分 鐘, 輕 輕 的 將 梳 板 移 開, 瓊 膠 的 製 備 即 完 成 14

( 三 ) 膠 體 電 泳 1. 將 凝 膠 連 同 鑄 膠 皿 置 入 電 泳 槽 中, 再 倒 入 1x TAE 緩 衝 液 蓋 過 凝 膠, 達 電 泳 槽 內 側 的 刻 記 處 2. 剪 下 一 段 蠟 紙, 吸 取 1µl 的 電 泳 染 劑 溶 液 於 蠟 紙 上, 再 吸 取 5µl 經 限 制 酶 消 化 的 樣 品 與 其 混 合, 用 微 量 吸 管 將 混 合 液 加 到 凝 膠 凹 槽 (well) 中 取 2µl 的 DNA ladder 注 入 凹 槽 中, 以 做 為 DNA 樣 品 大 小 之 判 斷 標 準 3. 連 接 電 源 插 頭, 將 開 關 開 到 ON, 設 定 電 壓 100 volt, 電 泳 方 向 為 負 極 往 正 極 泳 動 ( DNA 帶 何 種 電 荷?) 4. 在 此 條 件 下 進 行 電 泳 約 23 分 鐘, 直 到 bromophenol blue 染 劑 移 動 到 距 離 凝 膠 底 部 約 1.5 公 分 處, 即 停 止 電 泳, 將 開 關 切 至 OFF, 拔 除 電 源 5. 取 出 凝 膠 置 入 EtBr 染 劑 溶 液 中 染 色 10 分 鐘, 以 H 2 O 洗 去 凝 膠 表 面 染 劑 6. 用 塑 膠 平 板 取 出 凝 膠, 置 於 照 相 系 統 的 透 射 光 源 板 上, 開 啟 紫 外 燈, 於 紫 外 光 下 觀 察 並 拍 照 紀 錄 結 果 Gen-KB LC DNA ladder (Hopegen Biotechnology Development Enterprise) 注 意 事 項 1. 電 泳 使 用 的 電 力 為 高 壓 電 ( ), 在 通 電 後 切 勿 碰 觸 電 泳 儀 器 2. EtBr 為 毒 性 物 質 ( ), 操 作 時 須 戴 手 套 3. 用 微 量 吸 管 將 各 成 分 加 入 1.5ml 離 心 管 時, 每 加 入 一 種 成 分 就 須 更 換 新 的 無 菌 吸 管, 以 避 免 交 叉 污 染 4. 進 行 限 制 酶 切 割 DNA 實 驗 時, 限 制 酶 應 放 在 -20 下, 直 到 使 用 前 才 取 出, 而 且 要 最 後 加 入 15

實 驗 報 告 學 校 : 姓 名 : 1. 抽 取 質 體 DNA 實 驗 抽 取 質 體 DNA 吸 光 值 : OD 260 nm = ;OD 280 nm = ;OD 260 /280 = ; 估 計 DNA 濃 度 = 加 入 RNase 後, 測 得 質 體 DNA 吸 光 值 : OD 260 nm = ;OD 280 nm = ;OD 260 /280 = ; 估 計 DNA 濃 度 = 2. 限 制 酶 切 割 DNA 實 驗 (1) (2) puc19 DNA µl ( µg) puc19 DNA µl ( µg) (RNase treated) (RNase treated) No.3 Buffer (10x) 5 µl No.2 Buffer (10x) 5 µl Enzyme Bgl I 0.5 µl Enzyme Hind III 0.5 µl 無 菌 水 µl 無 菌 水 µl 總 體 積 50 µl 總 體 積 50 µl 反 應 條 件 :, 分 鐘 3. 瓊 膠 電 泳 分 析 實 驗 瓊 膠 濃 度 : 電 泳 照 片 電 壓 強 度 : 電 泳 時 間 : 染 色 時 間 : 照 片 說 明 樣 品 名 稱 體 積 lane 1:DNA ladder 2 µl 黏 貼 處 lane 2:pUC19 (uncut) µl lane 3:pUC19 (+ RNase) µl lane 4:pUC19/Bgl I µl lane 5:pUC19/Hind III µl lane 6:PCR product µl 16

作 業 學 校 : 姓 名 : 1. 請 依 據 您 抽 質 體 DNA 測 得 之 OD 值, 比 較 加 入 RNase 前 後, 對 估 算 DNA 濃 度 之 影 響 並 依 OD 260/280 比 值, 探 討 您 所 抽 出 DNA 之 純 度 (purity) 若 純 度 品 質 不 佳, 請 討 論 可 能 之 原 因? 該 如 何 改 善?(10 分 ) 2. 某 日, 老 師 拿 了 100 µl 未 知 濃 度 的 plasmid DNA 給 助 教, 助 教 取 了 5 µl 樣 品, 加 水 稀 釋 至 500 µl, 測 得 260nm 吸 光 值 為 0.25, 請 問 此 plasmid DNA 的 濃 度 為 何?(10 分 ) 3. 單 位 換 算 :(10 分 ) 1 ng = mg = fg = pg = µg = ag 4. 請 依 據 電 泳 圖 DNA ladder 估 算 您 所 抽 的 DNA 經 限 制 酶 Bgl I 及 Hind III 切 出 之 片 段 大 小 為 何? 未 切 割 的 DNA 電 泳 圖 中 呈 現 幾 個 條 帶 (band)? 請 解 釋 為 什 麼? (15 分 ) 5. 實 驗 課 時, 助 教 從 冰 箱 取 出 裝 有 不 同 樣 品 的 四 支 1.5ml 離 心 管, 發 現 標 籤 已 經 脫 落, 已 知 其 中 一 管 為 無 菌 水, 一 管 為 蛋 白 質 溶 液, 另 兩 管 為 不 同 濃 度 的 DNA 溶 液 請 依 據 您 實 驗 課 所 學 的 方 法, 幫 忙 助 教 確 定 四 支 離 心 管 分 別 為 何? ( 請 說 明 採 用 此 方 法 的 原 理 ) (15 分 ) 6. 一 線 性 DNA(linear DNA) 經 限 制 酶 做 一 次 與 兩 次 digestion 之 結 果 如 下, 請 畫 出 限 制 酶 圖 譜 ( 意 即 畫 出 restriction enzymes 在 DNA 上 的 切 位 圖 ) (20 分 ) restriction enzymes 切 出 片 段 (kb) EcoRI 2.9, 4.5, 7.4, 8.0 Hind III 3.9, 6.0, 12.9 EcoRI & Hind III 1.0, 2.0, 2.9, 3.5, 6.0, 7.4 7. 有 一 DNA 片 段 序 列 如 下 : 5 -CATGCCCATTCTTAACGTATTCGAAGGGTTGTTATCATGAACTTA-3 請 設 計 一 對 引 子 (primers), 長 度 各 為 10 mers, 利 用 PCR 來 放 大 此 段 DNA ( 請 標 示 清 楚 3 及 5 端 ) (10 分 ) 8. 某 生 進 行 PCR 實 驗, 電 泳 結 果 分 析 發 現 不 只 一 條 band 產 生, 請 問 可 能 的 原 因 為 何? 該 如 何 解 決?(10 分 ) ( 請 將 報 告 電 子 檔 e-mail 到 wjyang@nuk.edu.tw 檔 名 : 學 號 + 姓 名 ; 例 如 :1 號 高 大 雄 ) 17