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東 海 大 學 食 品 科 學 研 究 所 Graduate Institute of Food Science TUNGHAI UNIVERSITY 食 品 科 技 組 Food Technology Section 碩 士 論 文 Master Thesis 指 導 教 授 : 阮 進 惠 博 士 Advisor:Jin-Hewi Rwan, Ph. D. 分 離 大 豆 蛋 白 質 水 解 物 奈 米 顆 粒 之 製 備 及 特 性 之 研 究 Preparation and Characterization of Isolated Soy Protein Hydrolysate Nanoparticles 研 究 生 : 孫 百 秀 撰 Graduate Student:Pai-Hsiu Sun 中 華 民 國 九 十 九 年 十 月 October, 2010

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謝 誌 研 修 碩 士 學 位 期 間, 承 蒙 恩 師 阮 進 惠 博 士 於 研 究 上 給 予 悉 心 指 導 並 全 力 支 持, 使 本 論 文 得 以 順 利 進 行 在 論 文 撰 寫 期 間, 感 謝 恩 師 不 厭 其 煩 詳 閱 批 改 及 給 予 建 議, 讓 學 生 得 以 順 利 通 過 學 位 口 試 師 恩 浩 蕩, 永 誌 不 忘, 對 恩 師 敬 上 最 深 的 謝 意 論 文 口 試 期 間, 承 蒙 靜 宜 大 學 食 品 營 養 學 系 張 珍 田 博 士 及 本 研 究 所 蔡 正 宗 博 士, 撥 冗 審 閱 及 詳 加 斧 正, 提 供 寶 貴 意 見, 使 本 論 文 內 容 更 為 周 詳, 在 此 深 表 由 衷 感 謝 在 研 究 所 期 間, 感 謝 系 所 所 有 老 師 和 助 教 在 專 業 領 域 上 的 知 識 傳 授 及 協 助, 也 感 謝 本 校 化 材 系 張 有 義 及 李 國 禎 老 師 慷 慨 借 儀 器 及 協 助, 使 實 驗 得 以 順 利 進 行 ; 感 謝 靜 玫 欣 樺 怡 如 美 燕 慧 文 及 琪 雅 學 姐 在 實 驗 上 的 關 懷 與 指 導 ; 感 謝 同 窗 好 友 豪 駿 怡 樺 佑 年 青 蓉 韋 任 沂 璉 永 翰 展 維 綱 存 及 柏 村, 謝 謝 你 們 的 扶 持 與 打 氣, 總 是 能 在 我 遇 到 瓶 頸 時 給 予 最 有 用 的 建 議 ; 感 謝 希 奇 及 書 平 學 妹, 謝 謝 你 們 的 尊 重 與 陪 伴, 讓 我 能 專 注 於 我 的 研 究 上 ; 感 謝 好 友 采 凌 想 嵐 和 婉 君 對 我 的 關 心, 讓 我 感 到 無 限 溫 暖 研 究 所 期 間 得 到 太 多 人 的 幫 助, 無 法 一 一 詳 列, 在 此 一 併 致 謝, 謝 謝 你 們 的 一 路 相 挺 最 後, 感 謝 我 最 親 愛 的 爸 爸 和 媽 媽, 給 我 最 大 的 支 持 和 鼓 勵, 讓 我 無 後 顧 之 憂 下 完 成 學 業 ; 也 感 謝 姊 姊 和 弟 弟 包 容 我 的 任 性 將 此 論 文 獻 我 最 親 愛 的 家 人, 一 起 分 享 我 的 成 長 與 喜 悅 孫 百 秀 謹 致 於 東 海 大 學 食 品 科 學 研 究 所 中 華 民 國 九 十 九 年 十 月 4

目 錄 頁 數 中 文 摘 要......Ⅰ 英 文 摘 要.....Ⅲ 壹 前 言...1 貳 文 獻 整 理......2 一 腸 道 的 通 透 機 制......2 二 胜 肽 和 蛋 白 質 於 吸 收 上 的 障 礙.....4 三 幾 丁 質 與 幾 丁 聚 醣...5 ( 一 ) 幾 丁 質 (chitin) 與 幾 丁 聚 醣 (chitosan) 簡 介...5 ( 二 ) 幾 丁 質 與 幾 丁 聚 醣 結 構...5 ( 三 ) 幾 丁 聚 醣 物 化 特 性...7 ( 四 ) 幾 丁 聚 醣 之 製 備...9 ( 五 ) 低 分 子 量 幾 丁 聚 醣 之 製 備...9 ( 六 ) 幾 丁 聚 醣 之 物 性 分 析...11 ( 七 ) 幾 丁 聚 醣 安 全 性 與 法 規...13 四 幾 丁 聚 醣 之 應 用...15 ( 一 ) 食 品 加 工 之 應 用...15 ( 二 ) 生 醫 材 料 之 應 用...15 ( 三 ) 藥 物 控 制 釋 放 之 應 用...17 ( 四 ) 幾 丁 聚 醣 有 助 於 物 質 在 腸 道 吸 收 之 因 素...19 五 奈 米 科 技 發 展...24 ( 一 ) 奈 米 科 技...24 ( 二 ) 奈 米 在 食 品 之 應 用...24 ( 三 ) 奈 米 在 藥 物 之 應 用...26 ( 四 ) 奈 米 顆 粒 (Nanoparticles)...27 六 幾 丁 聚 醣 奈 米 顆 粒...32 ( 一 ) 常 見 幾 丁 聚 醣 微 / 奈 米 級 顆 粒 的 製 備 方 法...32 ( 二 ) 幾 丁 聚 醣 - 三 聚 磷 酸 鈉 (CS-TPP) 包 覆 蛋 白 質 之 機 制... 36 ( 三 ) 幾 丁 聚 醣 - 三 聚 磷 酸 鈉 (CS-TPP) 奈 米 顆 粒 之 應 用...42 ( 四 ) 幾 丁 聚 醣 顆 粒 之 特 性 分 析...44 七 分 離 大 豆 蛋 白 質 水 解 物 (isolate soy protein hydrolysates,isph)...47 ( 一 ) 大 豆 蛋 白 質 之 生 理 功 能...47 ( 二 ) 大 豆 蛋 白 質 水 解 物 之 生 理 功 能...48 ( 三 ) 分 離 大 豆 蛋 白 質 水 解 物 之 生 理 功 能...48 參 材 料 與 方 法...51 一 實 驗 材 料...51 I

( 一 ) 原 料...51 ( 二 ) 藥 品...51 二 實 驗 儀 器...52 三 材 料 準 備...54 ( 一 ) 幾 丁 聚 醣...54 ( 二 ) 不 同 分 子 量 幾 丁 聚 醣 之 製 備...54 ( 三 ) 10~30kDa 分 離 大 豆 蛋 白 質 水 解 物 之 製 備...55 四 實 驗 方 法...57 ( 一 ) 幾 丁 聚 醣 - 分 離 大 豆 蛋 白 質 水 解 物 - 三 聚 磷 酸 鈉 (CS-ISPH-TPP) 奈 米 顆 粒 之 製 備...57 ( 二 )CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 特 性 之 影 響 因 子...57 ( 三 )CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 在 胃 腸 液 中 之 安 定 性 之 影 響 因 子...59 五 分 析 方 法...61 ( 一 ) 幾 丁 聚 醣 去 乙 醯 度 之 測 定...61 ( 二 ) 幾 丁 聚 醣 水 解 物 之 分 子 量 分 析...61 ( 三 )10~30kDa 分 離 大 豆 蛋 白 質 水 解 物 分 子 量 分 析...62 ( 四 ) 蛋 白 質 定 量...63 ( 五 ) 包 覆 率 裝 載 率 及 產 率 之 分 析...63 ( 六 ) 奈 米 顆 粒 粒 徑 和 表 面 電 荷 之 測 定...64 ( 七 ) 安 定 性 之 分 析...64 ( 八 ) 蛋 白 質 電 泳 分 析...65 ( 九 ) 傅 立 葉 轉 換 紅 外 線 光 譜 儀 (FTIR) 分 析...66 ( 十 ) 掃 描 式 電 子 顯 微 鏡 (SEM) 觀 察...66 ( 十 一 ) 統 計 分 析...66 肆 結 果 與 討 論...67 一 樣 品 製 備...67 ( 一 ) 幾 丁 聚 醣 之 製 備...67 ( 二 ) 不 同 分 子 量 幾 丁 聚 醣 之 製 備...67 ( 三 ) 10~30kDa 分 離 大 豆 蛋 白 質 水 解 物 之 區 分...70 二 分 離 大 豆 蛋 白 質 水 解 物 濃 度 幾 丁 聚 醣 分 子 量 及 幾 丁 聚 醣 - 三 聚 磷 酸 鈉 重 量 比 對 幾 丁 聚 醣 - 分 離 大 豆 蛋 白 質 水 解 物 - 三 聚 磷 酸 鈉 (CS-ISPH-TPP) 奈 米 顆 粒 特 性 之 影 響...72 ( 一 )ISPH 濃 度 之 影 響...72 ( 二 ) 幾 丁 聚 醣 分 子 量 之 影 響....78 ( 三 )CS/TPP 重 量 比 之 影 響...82 三 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 於 胃 腸 液 中 之 安 定 性 之 影 響 因 子...91 ( 一 )CS/TPP 重 量 比 之 影 響...91 ( 二 ) 幾 丁 聚 醣 分 子 量 之 影 響...95 四 於 胃 腸 液 最 為 安 定 之 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 之 製 備 及 其 特 性...98 ( 一 ) 包 覆 率 裝 載 率 及 產 率 之 分 析...98 ( 二 ) 粒 徑 之 分 析...98 ( 三 ) 表 面 電 位 之 分 析...100 II

( 四 ) 以 SDS-PAGE 評 估 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 經 過 模 擬 過 胃 腸 道 消 化 試 驗 後 ISPH 分 子 量 之 變 化...100 五 掃 描 式 電 子 顯 微 鏡 (SEM) 觀 察 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 外 觀 型 態 104 六 傅 立 葉 轉 換 紅 外 線 光 譜 儀 (FTIR) 分 析 CS ISPH 及 TPP 之 鍵 結 情 形.106 伍 結 論...109 一 不 同 分 子 量 幾 丁 聚 醣 之 製 備...109 二 幾 丁 聚 醣 - 分 離 大 豆 蛋 白 質 水 解 物 - 三 聚 磷 酸 鈉 (CS-ISPH-TPP) 奈 米 顆 粒 之 製 備 及 特 性 之 影 響 因 子...109 ( 一 )ISPH 濃 度 之 影 響...109 ( 二 ) 幾 丁 聚 醣 分 子 量 之 影 響...109 ( 三 )CS/TPP 重 量 比 之 影 響...110 三 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 於 胃 腸 液 中 之 安 定 性 之 影 響 因 子...110 ( 一 )CS/TPP 重 量 比 之 影 響...110 ( 二 ) 幾 丁 聚 醣 分 子 量 之 影 響...111 四 於 胃 腸 液 最 為 安 定 之 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 之 製 備 及 其 特 性...111 五 掃 描 式 電 子 顯 微 鏡 (SEM) 觀 察 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 外 觀 型 態 111 六 傅 立 葉 轉 換 紅 外 線 光 譜 儀 (FTIR) 分 析 CS ISPH 及 TPP 之 鍵 結 情 形.111 七 總 結...112 陸 參 考 文 獻...113 柒 附 錄...126 III

圖 目 錄 頁 數 圖 一 營 養 物 質 經 由 腸 上 皮 細 胞 之 三 種 穿 透 模 式...3 圖 二 幾 丁 質 幾 丁 聚 醣 及 纖 維 素 之 基 本 結 構...6 圖 三 緊 密 連 接 蛋 白 錯 合 物 之 概 略 結 構...21 圖 四 以 穿 透 電 子 顯 微 鏡 觀 察 幾 丁 聚 醣 對 腸 道 上 皮 細 胞 之 影 響,(a) 為 Caco-2 細 胞 正 常 型 態,(b) 為 經 由 0.1% 幾 丁 聚 醣 處 理 30 分 鐘 後 之 細 胞 (c) 為 將 幾 丁 聚 醣 移 除 後, 繼 續 培 養 24 小 時 後 之 細 胞...23 圖 五 奈 米 藥 物 傳 遞 系 統...28 圖 六 奈 米 顆 粒 於 腸 道 吸 收 之 優 勢...30 圖 七 幾 丁 聚 醣 與 TPP 之 離 子 交 聯 反 應...37 圖 八 幾 丁 聚 醣 與 三 聚 磷 酸 鈉 在 不 同 ph 值 下 之 鍵 結 情 形...38 圖 九 幾 丁 聚 醣 包 覆 BSA 之 機 制 圖...41 圖 十 膜 反 應 系 統...56 圖 十 一 纖 維 酵 素 濃 度 對 幾 丁 聚 醣 水 解 度 之 影 響...69 圖 十 二 分 離 大 豆 蛋 白 質 水 解 物 (ISPH) 經 30 和 10kDa 濾 膜 區 分 所 得 的 濃 縮 物 分 子 量 分 布 圖...71 圖 十 三 ISPH 濃 度 對 包 覆 率 裝 載 率 及 產 率 之 影 響...74 圖 十 四 ISPH 濃 度 對 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 粒 徑 之 影 響...76 圖 十 五 幾 丁 聚 醣 分 子 量 對 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 粒 徑 之 影 響...81 圖 十 六 CS/TPP 重 量 比 對 CS-TPP 及 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 粒 徑 之 影 響...87 圖 十 七 不 同 ph 值 下 幾 丁 聚 醣 與 帶 負 電 聚 合 物 之 鍵 結 及 澎 潤 情 形...92 圖 十 八 CS/TPP 重 量 比 對 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 在 模 擬 胃 液 中 (ph 1.2 buffer) (a) 及 模 擬 腸 液 中 (ph 7.4 buffer)(b) 之 安 定 性 影 響...94 圖 十 九 幾 丁 聚 醣 分 子 量 對 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 在 模 擬 胃 液 中 (ph 1.2 buffer) (a) 及 模 擬 腸 液 中 (ph 7.4 buffer)(b) 之 安 定 性 影 響...97 圖 二 十 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 於 模 擬 過 胃 腸 液 中 之 SDS-PAGE 電 泳 圖...102 圖 二 十 一 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 之 掃 瞄 式 電 子 顯 微 鏡 (SEM) 觀 察...105 圖 二 十 二 幾 丁 聚 醣 (a) 分 離 大 豆 蛋 白 質 水 解 物 (b) CS-TPP 奈 米 顆 粒 (c) 及 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 (d) 之 FTIR 光 譜 圖...107 IV

表 目 錄 頁 數 表 一 幾 丁 質 三 種 晶 型 架 構 與 特 性...8 表 二 纖 維 素 酶 水 解 幾 丁 聚 醣 之 特 性...12 表 三 幾 丁 聚 醣 在 生 醫 材 料 主 要 特 性 及 其 應 用...16 表 四 幾 丁 聚 醣 在 藥 物 學 上 的 應 用 及 其 藥 物 傳 遞 形 式...18 表 五 奈 米 顆 粒 藥 物 傳 遞 系 統 現 況 與 產 品 特 性...31 表 六 常 見 幾 丁 聚 醣 奈 米 顆 粒 之 製 備 方 法 及 其 在 藥 物 蛋 白 質 或 基 因 上 的 應 用..33 表 七 ISPH 濃 度 對 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 表 面 電 荷 之 影 響...77 表 八 幾 丁 聚 醣 分 子 量 對 包 覆 率 裝 載 率 及 產 率 之 影 響...79 表 九 幾 丁 聚 醣 分 子 量 對 CS-TPP 及 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 表 面 電 位 之 影 響...83 表 十 CS/TPP 重 量 比 對 包 覆 率 裝 載 率 及 產 率 之 影 響...85 表 十 一 CS/TPP 重 量 比 對 CS-TPP 及 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 表 面 電 位 之 影 響...90 表 十 二 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 之 包 覆 率 裝 載 率 及 產 率 分 析...99 表 十 三 CS-TPP 及 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 之 粒 徑 及 表 面 電 位 分 析...101 V

中 文 摘 要 本 研 究 以 帶 正 電 之 幾 丁 聚 醣 (chitosan,cs, 去 乙 醯 度 85%) 及 帶 負 電 之 三 聚 磷 酸 鈉 (sodium tripolyphosphate,tpp) 利 用 離 子 交 聯 作 用 來 包 覆 分 離 大 豆 蛋 白 質 水 解 物 ( isolated soy protein hydrolysate,isph, 分 子 量 :10~30kDa) 並 製 成 奈 米 級 之 顆 粒, 以 包 覆 及 穩 定 ISPH 活 性 成 分 為 目 的 首 先 以 纖 維 酵 素 水 解 CS 至 高 分 子 量 (HMW 475.5 kda, 未 水 解 者 ) 中 分 子 量 (MMW 231.4 kda) 和 低 分 子 量 (LMW 131.1 kda) 之 CS, 並 分 別 溶 於 1% 醋 酸 溶 液 及 調 ph 值 至 4.7 接 著 於 不 同 濃 度 之 CS 溶 液 個 別 加 入 不 同 濃 度 (1~9 mg/ml) 之 ISPH 溶 液, 再 加 入 TPP(pH 9.0) 溶 液 混 合 均 勻 以 製 備 幾 丁 聚 醣 - 分 離 大 豆 蛋 白 質 水 解 物 - 三 聚 磷 酸 鈉 (CS-ISPH-TPP) 奈 米 顆 粒 探 討 ISPH 濃 度 CS 分 子 量 及 CS/TPP 重 量 比 對 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 之 包 覆 率 裝 載 率 產 率 粒 徑 大 小 表 面 電 荷 及 安 定 性 ( 模 擬 胃 腸 液 之 ph, 即 ph 1.2 和 ph 7.4) 之 影 響 之 後, 利 用 FTIR 分 析 CS TPP 及 ISPH 之 間 的 交 互 作 用, 並 以 掃 瞄 式 電 子 顯 微 鏡 (SEM) 照 相 觀 察 顆 粒 外 觀 結 果 顯 示, 在 包 覆 率 方 面,ISPH 濃 度 愈 低 CS/TPP 重 量 比 為 3/1 及 4/1 時 可 獲 得 較 高 之 包 覆 率 裝 載 率 方 面, ISPH 濃 度 及 CS/TPP 重 量 比 愈 高, 裝 載 率 愈 高 產 率 方 面,CS/TPP 重 量 比 愈 低, 產 率 愈 高 ; 粒 徑 方 面,ISPH 濃 度 及 CS 分 子 量 愈 低, 顆 粒 粒 徑 愈 小 表 面 電 位 方 面, 顆 粒 表 面 皆 帶 正 電 荷, 而 當 CS/TPP 重 量 比 減 少 至 2/1 時, 顆 粒 表 面 電 位 會 出 現 驟 降 之 情 形 ( 由 +47.6 mv 減 至 +24.0 mv) 安 定 性 方 面, 幾 丁 聚 醣 分 子 量 愈 高 CS/TPP 重 量 比 愈 低, 安 定 性 愈 佳 ; 而 以 高 分 子 量 之 CS,CS/TPP 重 量 比 3/1,ISPH 濃 度 5mg/mL 所 製 備 之 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 具 有 最 佳 之 安 定 性 ; 由 SDS-PAGE 分 析 證 I

實 CS-TPP 可 以 包 覆 及 保 護 ISPH, 避 免 其 遭 受 胃 腸 道 環 境 破 壞 此 外, 應 用 低 分 子 量 之 CS,CS/TPP 重 量 比 3/1,ISPH 濃 度 5mg/mL 所 製 備 之 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 以 SEM 觀 察, 可 見 奈 米 顆 粒 之 粒 徑 均 小 於 100 nm( 乾 燥 後 ) 且 呈 球 型 ; 由 FTIR 分 析 可 得 知 CS 之 胺 基 (-NH + 5-3 ) 會 與 TPP 之 離 子 (-P 3 O 10 及 -HP 3 O 4-10 ) 及 ISPH 之 羧 基 (-COO - ) 產 生 鍵 結 反 應 ; 且 CS-TPP 對 ISPH 之 包 覆 屬 於 物 理 性 ( 無 化 學 鍵 結 產 生 ) 關 鍵 字 : 幾 丁 聚 醣 水 解 物 分 離 大 豆 蛋 白 質 水 解 物 三 聚 磷 酸 鈉 奈 米 顆 粒 安 定 性 II

英 文 摘 要 ABSTRACT Chitosan (Mw 475.5 kda, deacetylation 85%) and its hydrolysates (Mw 231.5 and 131.1 kda, hydrolyzed by cellulase), were dissolved in 1% acetic acid solution and adjusted to ph 4.7, and added with isolated soy protein hydrolysate (ISPH) solutions (Mw 10~30 kda molecular weights, 1~9 mg/ml concentrations) before mixing with sodium tripolyphosphate (TPP) solution (ph 9.0) to prepare CS-TPP-ISPH nanoparticles. Such effective factors as chitosan molecular weight, ISPH concentration and chitosan / TPP mass ratio on the encapsulation efficiency (EE), loading capacity (LC), process yield (PY), particle size, zeta potential and stability (at ph 1.2 and 7.4) of the nanoparticles were investigated. Cross linking among CS, TPP and ISPH, and SEM of the nanoparticles were also determined. As a result, a high EE obtained in the low ISPH concentration, CS/TPP mass ratio at 3/1 and 4/1. LC increased in increasing ISPH concentration and CS/TPP mass ratio. A high PY obtained in the low CS/TPP mass ratio. CS-ISPH-TPP particle size decreased as CS Mw and ISPH concentration decreased. All nanoparticles showed positive charge, but when CS/TPP mass ratio at 2/1 the zeta potential will reduced from +47.6 mv to +24.0mV. The stable increased in increasing CS MW and decreasing CS/TPP mass ratio. ISPH was kept more stable in case of applying CS Mw at 475.5 kda, CS/TPP mass ratio at 3/1 and ISPH concentration at 5 mg/ml. In a additional, the particle size <100nm III

(SEM) and spherical in shape when prepared by CS Mw at 131.1 kda, CS/TPP mass ratio at 3/1 and ISPH concentration at 5 mg/ml. FTIR analysis showed that the tripolyphosphoic groups of TPP and the carboxyl groups of ISPH were linked with amino groups of chitosan in nanoparticles, and ISPH physically absorbed by CS-TPP(no band shifts). Key word: Chitosan hydrolysate ( CS ), Isolated soy protein hydrolysate(isph), Sodium tripolyphosphate(tpp), Nanoparticles, stability. IV

壹 前 言 胜 肽 和 蛋 白 質 屬 大 分 子 量 物 質 ( 分 子 量 >500Da), 具 有 高 度 的 親 水 性, 分 子 量 大 小 和 極 性 常 常 使 它 們 無 法 藉 由 一 般 擴 散 作 用 (transcellular transport pathway) 通 過 細 胞 膜, 導 致 它 們 的 吸 收 率 和 生 物 利 用 率 差 (Lee, 1991), 且 在 消 化 吸 收 過 程 中 容 易 受 到 腸 胃 道 酵 素 降 解, 失 去 其 功 能 活 性, 故 它 們 需 要 被 保 護 文 獻 指 出, 以 幾 丁 聚 醣 包 覆 藥 物 或 活 性 物 質 (bioactive agents) 時 可 降 低 其 在 胃 腸 內 之 強 酸 或 有 關 酵 素 破 壞 ; 幾 丁 聚 醣 可 隔 離 其 與 胃 腸 內 之 其 他 物 質 產 生 結 合 而 保 護 其 活 性 ; 利 用 幾 丁 聚 醣 之 黏 性 黏 附 在 腸 膜 壁 上, 可 延 長 其 在 腸 黏 膜 上 接 觸 之 時 間, 有 助 於 其 吸 收 性 (Tengamnuay and Mitra,1997); 幾 丁 聚 醣 可 暫 時 性 地 打 開 腸 膜 細 胞 之 緊 密 連 接 (tight junctions,tj) 通 道, 讓 其 易 於 進 入 細 胞 內 (Artursson et al.,1994); 另 外, 將 其 製 成 奈 米 顆 粒 可 促 進 其 進 入 腸 細 胞 內 上 述 這 些 特 性 具 有 提 高 藥 物 或 生 物 活 性 物 質 之 運 輸 及 吸 收 分 離 大 豆 蛋 白 質 水 解 物 (isolate soy protein hydrolysates,isph) 具 有 一 些 生 物 活 性 如 抗 氧 化 (Chiang et al.,1999) 降 血 壓 (Chiang et al., 2006) 促 進 脂 肪 分 解 ( 趙,2009) 抑 制 脂 質 生 成 (Tsou et al., 2010) 等, 但 經 由 胃 酸 及 胃 蛋 白 酶 作 用 會 將 其 水 解 至 更 小 的 胜 肽 或 於 消 化 道 系 統 中 與 其 他 食 物 成 分 結 合, 使 其 失 去 上 述 之 生 理 活 性 因 此, 本 研 究 嘗 試 以 幾 丁 聚 醣 作 為 壁 材, 將 大 分 子 分 離 大 豆 蛋 白 質 水 解 物 包 覆 或 吸 附 在 其 結 構 中, 並 將 其 製 備 成 奈 米 級 顆 粒, 希 望 透 過 此 方 式 能 增 加 水 解 物 或 大 分 子 胜 肽 物 質 在 腸 胃 道 之 安 定 性, 且 更 有 效 地 被 吸 收 及 利 用 1

一 腸 道 的 通 透 機 制 貳 文 獻 整 理 當 藥 物 或 營 養 物 質 經 由 口 服 方 式 進 入 體 內, 會 經 過 食 道 胃, 接 著 進 入 腸 內, 藥 物 或 營 養 物 質 分 子 經 由 腸 腔 (intestinal lumen) 穿 過 腸 道 上 皮 細 胞 (intestinal epithelium,>200m 2 ), 進 入 血 液 循 環 系 統 吸 收 利 用 分 子 通 過 腸 道 上 皮 細 胞 進 入 血 液 會 透 過 三 種 主 要 的 路 徑 ( 圖 一 ):(1) 被 動 擴 散 通 過 細 胞 膜 (transcellular pathway),(2) 被 動 擴 散 通 過 相 鄰 細 胞 間 隙 (paracellular pathway), 以 及 (3) 載 體 調 控 運 輸 (carrier-mediated transcellular pathway) 由 於 細 胞 的 細 胞 膜 主 要 是 由 脂 質 雙 層 膜 所 構 成, 故 親 脂 性 分 子 可 輕 易 透 過 細 胞 間 轉 運 擴 散 (transcellular diffusion) 方 式 通 過 細 胞 膜 ; 相 反 地, 親 水 性 分 子 是 無 法 被 細 胞 膜 上 載 體 辨 認, 無 法 通 過 疏 水 性 的 細 胞 膜, 因 此 其 要 通 過 上 皮 細 胞 之 阻 隔 則 須 透 過 相 鄰 細 胞 間 隙 (paracellular pathway) 運 輸 方 式, 將 物 質 運 送 到 細 胞 膜 內 然 而 透 過 相 鄰 細 胞 間 隙 運 輸 之 親 水 性 分 子 會 受 到 上 皮 細 胞 之 緊 密 連 接 (tight junction) 嚴 格 限 制 (ward et al., 2000) 決 定 分 子 穿 過 細 胞 膜 的 速 率 受 幾 個 因 素 影 響 :(1) 分 子 大 小 : 通 常 分 子 愈 大 通 透 速 度 愈 慢 ;(2) 分 子 對 脂 質 的 溶 解 度 : 因 細 胞 膜 為 磷 脂 雙 層 所 構 成, 故 物 質 對 脂 質 的 溶 解 度 愈 大, 穿 透 愈 快 ;(3) 物 質 之 極 性 : 非 極 性 物 質 易 穿 透 細 胞 膜, 極 性 物 質 則 不 易 穿 過 細 胞 膜 ;(4) 離 子 電 價 (ionic charge): 通 常 帶 正 電 比 帶 負 電 穿 透 快 ; (5) 分 子 形 狀 : 球 型 通 透 速 度 較 快 ( 陳,2004) 2

圖 一 營 養 物 質 經 由 腸 上 皮 細 胞 之 三 種 穿 透 模 式 Figure 1. Transport across intestinal epithelium. Molecules cross the intestinal epithelium into the blood primarily by three pathways : passive diffusion across the cell membranes ( transcellular pathway); passive diffusion between adjacent cells ( paracellular pathway); and carrier-mediated transport ( carrier-mediated pathway). (Ward et al., 2000) 3

二 胜 肽 和 蛋 白 質 於 吸 收 上 的 障 礙 大 分 子 物 質 由 於 分 子 量 大 及 溶 解 度 的 問 題 導 致 其 生 體 利 用 率 低 在 分 子 量 方 面, 分 子 量 低 於 500~700 daltons 者, 其 生 體 利 用 率 不 會 受 到 分 子 量 的 影 響 ; 然 而 分 子 量 大 於 500~700 daltons 者, 生 體 可 利 用 率 就 會 顯 著 降 低 在 溶 解 度 方 面, 藥 物 於 吸 收 過 程 中 需 具 備 足 夠 脂 溶 性 (lipophilicity), 才 能 透 過 transcellular pathway 以 被 動 擴 散 通 過 細 胞 膜 ; 若 脂 溶 性 不 足, 分 子 量 在 100~200 daltons 之 物 質 則 可 藉 由 過 相 鄰 細 胞 間 隙 (paracellular pathway) 運 輸 方 式 進 入 細 胞 膜 內 作 進 一 步 的 吸 收, 然 而 大 分 子 物 質 因 為 分 子 量 較 大, 因 此 無 法 藉 由 此 途 徑 通 過 腸 黏 膜, 造 成 吸 收 阻 礙 ( 羅,2007) 胜 肽 和 蛋 白 質 屬 大 分 子 量 物 質 ( 分 子 量 >500Da) 且 具 有 高 度 的 親 水 性 因 為 它 們 的 大 小 和 極 性 常 常 使 它 們 無 法 藉 由 一 般 擴 散 作 用 (the transcellular transport pathway) 通 過 細 胞 膜, 導 致 它 們 的 吸 收 率 和 生 物 利 用 率 差 (Lee, 1991) 蛋 白 質 等 大 分 子 物 質, 因 本 身 分 子 量 太 大 容 易 受 到 酵 素 分 解 半 衰 期 短 腸 黏 膜 滲 透 性 不 佳 等 因 素 的 影 響, 使 得 生 體 利 用 率 (bioavailability) 差, 因 此 常 以 侵 入 性 給 藥 方 式 ( 如 靜 脈 注 射 ) 才 能 獲 得 較 佳 的 治 療 及 吸 收 效 果 若 能 透 過 幾 丁 聚 醣 作 為 壁 材, 將 大 分 子 之 蛋 白 質 及 胜 肽 做 包 覆 或 吸 附 在 其 結 構 中, 並 將 其 製 備 成 奈 米 級 顆 粒, 此 方 式 不 僅 可 幫 助 蛋 白 質 或 胜 肽 大 分 子 物 質 能 避 開 酵 素 分 解 作 用, 還 可 透 過 幾 丁 聚 醣 特 殊 之 之 生 物 黏 著 性 (mucoadhesiveness), 將 顆 粒 黏 附 於 腸 黏 膜 上, 延 長 顆 粒 在 腸 道 的 滯 留 時 間, 增 加 蛋 白 質 或 胜 肽 等 大 分 子 物 質 在 腸 道 吸 收 的 機 會, 另 外 幾 丁 聚 醣 能 暫 時 性 的 打 開 腸 道 上 皮 細 胞 上 之 緊 密 連 接 (tight junction) 讓 包 覆 有 蛋 白 質 之 奈 米 顆 粒 能 被 完 整 吸 收, 增 加 蛋 4

白 質 之 生 體 利 用 率 三 幾 丁 質 與 幾 丁 聚 醣 ( 一 ) 幾 丁 質 (chitin) 與 幾 丁 聚 醣 (chitosan) 簡 介 幾 丁 質 又 名 甲 殼 質 甲 殼 素, 一 般 成 淡 黃 色 至 褐 色 的 棉 絮 狀 或 絲 狀 固 體, 具 有 高 度 彈 性 及 延 展 性 早 於 1811 年 法 國 植 物 學 家 Braconno 以 氫 氧 化 鈉 的 稀 溶 液 加 熱 處 理 洋 菇 時 發 現 有 不 溶 物, 當 時 命 名 為 Fungine,1823 年 法 國 科 學 家 Odier 在 昆 蟲 表 面 發 現 類 似 物 質, 而 將 其 命 名 為 Chitin, 希 臘 語 意 為 包 裹 物, 中 譯 名 為 幾 丁 質 幾 丁 聚 醣 一 般 成 白 色 帶 淡 黃 色 的 粉 末 狀 固 體 於 1859 年 Rouget 將 幾 丁 質 置 於 氫 氧 化 鈉 溶 液 中 加 熱, 發 現 其 可 溶 於 有 機 酸, 稱 之 為 幾 丁 酸 ;1894 年 Hoppe-Seyler 將 此 物 正 式 命 名 為 幾 丁 聚 醣 (chitosan)( 陳,1999) 幾 丁 質 廣 泛 分 布 在 自 然 界 中, 主 要 存 在 於 甲 殼 動 物 ( 蝦 蟹 等 ) 的 外 殼 節 肢 動 物 ( 如 昆 蟲 ) 的 外 皮 軟 體 動 物 ( 烏 賊 ) 的 外 殼 和 內 骨 骼, 以 及 真 菌 或 酵 母 菌 等 微 生 物 的 細 胞 壁 中, 為 一 非 常 具 有 價 值 且 值 得 開 發 之 原 料 而 幾 丁 聚 醣 是 由 幾 丁 質 經 過 去 乙 醯 基 (deacetylation) 後 所 得 的 產 物 總 稱 ( 二 ) 幾 丁 質 與 幾 丁 聚 醣 結 構 纖 維 素 (cellulose) 幾 丁 質 (chitin) 與 幾 丁 聚 醣 (chitosan) 三 者 具 有 相 似 之 結 構, 如 圖 二 纖 維 素 的 基 本 組 成 單 位 為 葡 萄 糖, 幾 丁 質 則 由 1000~3000 個 乙 醯 葡 萄 糖 胺 殘 基 相 互 連 接 組 成 的 聚 合 物, 基 本 組 成 單 位 為 乙 醯 葡 萄 糖 胺 ( acetylglucosamin ), 分 子 量 通 常 在 10 5 ~10 7 之 間 ; 按 化 學 結 構 是 為 聚 -N- 乙 醯 - 葡 萄 糖 胺 (poly-n-acetyl- 5

圖 二 幾 丁 質 幾 丁 聚 醣 及 纖 維 素 之 基 本 結 構 Figure 2. Structure of chitin, chitosan and cellulose. (Krajewska, 2004) 6

glucosamine), 屬 六 碳 糖 多 醣 體, 可 稱 為 動 物 纖 維 素 Muzzarelli(1977) 指 出 幾 丁 質 聚 合 方 式 依 據 三 度 空 間 的 立 體 排 列 可 分 為 α 型 β 型 γ 型 三 種, 其 晶 型 架 構 與 特 性 見 表 一 幾 丁 聚 醣 基 本 構 成 單 位 為 葡 萄 醣 胺 (glucosamine) 的 高 分 子 聚 合 體, 是 一 種 高 分 子 纖 維, 可 由 幾 丁 質 經 由 去 乙 醯 化 (deacetylation) 而 獲 得, 其 構 造 可 依 晶 型 的 不 同 分 成 四 種 :Tendon 型, 屬 斜 方 晶 系 ; Annealed 型, 亦 屬 斜 方 晶 系 ;L-2 型, 屬 單 協 晶 系 ; I-2 型, 屬 單 協 晶 系 目 前 幾 丁 質 和 幾 丁 聚 醣 在 去 乙 醯 程 度 上 的 差 異 並 無 明 顯 的 定 義 將 其 劃 分,Muzzarelli 及 Rocchett 在 1985 年 提 出 總 氮 量 佔 聚 合 物 的 百 分 之 七 (w/w) 以 上 者 為 幾 丁 聚 醣 ; 而 另 外 一 種 說 法 是 以 去 乙 醯 度 大 於 60 % 且 微 溶 於 酸 性 溶 液 者 稱 為 幾 丁 聚 醣 (Aiba, 1992) 幾 丁 聚 醣 結 構 的 可 變 性 大, 包 括 聚 合 長 度 聚 合 的 鍵 結 方 式 等, 通 常 可 製 成 膠 狀 (gel) 纖 維 狀 (fiber) 珠 狀 (bead) 薄 膜 狀 (film) 及 海 綿 狀 (sponge) 等, 以 供 各 式 使 用 (Sabnis and Block, 2000) ( 三 ) 幾 丁 聚 醣 物 化 特 性 1. 陽 離 子 特 性 幾 丁 聚 醣 在 酸 性 溶 液 中 或 小 於 其 pka(ph~6.3) 時 其 結 構 C 2 上 所 帶 的 胺 基 (NH 2 ) 會 轉 變 成 帶 有 正 電 荷 (NH 3 + ) 的 胺 基, 是 目 前 所 發 現 唯 一 具 有 帶 正 電 性 的 天 然 多 醣 ( 糜,2007) 2. 溶 解 性 幾 丁 聚 醣 可 溶 於 酸 性 或 弱 酸 性 的 有 機 酸 或 無 機 酸 中, 例 如 醋 酸 甲 酸 硫 酸 磷 酸 檸 檬 酸 蘋 果 酸 及 琥 珀 酸 等, 其 中 以 甲 酸 為 最 佳 7

表 一 幾 丁 質 三 種 晶 型 架 構 與 特 性 Table 1. Three crystal structures of chitin and their propertyes. 形 式 α type β type γ type 晶 系 斜 方 晶 系 單 斜 晶 系 斜 方 晶 系 與 單 斜 晶 系 混 合 (rhombic system) (monoclinic system) 架 構 對 稱 的 兩 股 雙 螺 旋 呈 現 對 稱 的 雙 股 螺 旋 架 構 呈 現 每 兩 個 平 行 長 鏈 就 會 反 向 平 行 (anti-parallel) 同 向 平 行 排 列 (parallel) 有 一 個 反 向 平 行 長 鏈 圖 示 特 性 構 形 緊 密, 質 地 堅 硬 架 構 較 鬆 散, 易 被 幾 丁 質 酶 架 構 緊 密 性 介 於 α type 與 β 自 然 界 中 存 在 最 多 (chitinase) 分 解 type 之 間 自 然 界 中 存 在 昆 蟲 甲 殼 類 動 物 烏 賊 體 內 軟 骨 藻 類 真 菌 類 (Muzzarelli, 1977; 賴,1979;Blackwell, 1988) 8

溶 劑, 可 溶 解 近 50% 的 幾 丁 聚 醣 而 醋 酸 常 被 選 用 作 為 測 定 幾 丁 聚 醣 溶 液 系 統 的 溶 劑 (Knorr, 1984), 溶 解 度 可 達 4% 以 上 ; 另 外 幾 丁 聚 醣 也 微 溶 於 鹽 酸 硝 酸 及 磷 酸 等 無 機 酸, 且 具 有 降 解 (degradation) 現 象 的 產 生 (Muzzarelli, 1977) 溶 解 後 的 幾 丁 聚 醣 可 提 供 高 黏 度 性 質, 具 有 黏 性 安 定 作 用, 但 其 不 溶 於 水 及 酒 精 中 3. 親 水 性 幾 丁 聚 醣 之 親 水 性 會 隨 著 其 去 乙 醯 程 度 多 寡 和 溶 液 之 ph 值 不 同 而 改 變 幾 丁 聚 醣 去 乙 醯 度 愈 高, 其 結 構 上 的 氨 基 愈 多 於 酸 性 下, 幾 丁 聚 醣 結 構 之 -NH 2 可 轉 為 -NH + 3 group, 使 其 帶 正 電 荷, 親 水 性 增 強 ; 鹼 性 下, 其 -NH + 3 group 會 轉 為 -NH 2, 使 其 親 水 性 減 弱 ( 四 ) 幾 丁 聚 醣 之 製 備 幾 丁 質 和 幾 丁 聚 醣 最 大 區 別 在 去 乙 醯 度, 目 前 用 來 製 備 幾 丁 聚 醣 的 方 法 有 : 熱 鹼 液 法 ( 徐,2001; 柯,2006) 酵 素 法 ( 徐,2001; 陳 等 人,2000) 和 微 生 物 ( 陳 等 人,2000; 莊,2002) 方 法 而 本 實 驗 使 用 熱 鹼 液 法 來 製 備 幾 丁 聚 醣, 其 具 有 反 應 時 間 短 去 乙 醯 度 較 高 以 及 製 備 成 本 較 低 等 優 點, 也 最 常 被 使 一 般 熱 鹼 液 法 中 最 常 使 用 氫 氧 化 鈉 溶 液 來 去 除 幾 丁 質 之 乙 醯 基, 其 濃 度 約 為 30 ~ 60 %(w/v), 鹼 液 濃 度 愈 高, 其 去 乙 醯 化 程 度 愈 高 ( 李,1988;Bough et al., 1978; Mima et al.,1983) 另 外, 幾 丁 聚 醣 之 去 乙 醯 程 度 亦 會 受 鹼 液 溫 度 鹼 液 作 用 時 間 幾 丁 聚 醣 本 身 的 分 子 量 或 結 構 上 的 差 異 影 響 ( 徐, 2001; 柯,2006) ( 五 ) 低 分 子 量 幾 丁 聚 醣 之 製 備 幾 丁 聚 醣 應 用 範 圍 十 分 廣 泛, 但 因 其 分 子 量 高 溶 解 度 差 黏 度 高, 使 其 應 用 受 到 限 制, 因 此 如 何 製 備 出 低 分 子 量 及 具 高 溶 解 度 之 9

幾 丁 聚 醣, 一 直 是 研 究 幾 丁 聚 醣 的 重 要 目 標 之 一 常 見 製 備 低 分 子 量 之 幾 丁 聚 醣 有 以 下 幾 種 方 法 : 酵 素 法 酸 水 解 法 超 音 波 降 解 法 超 音 波 與 剪 力 降 解 法 高 速 微 射 流 降 解 法 氧 化 劑 降 解 法 等 而 以 酵 素 來 水 解 幾 丁 聚 醣 具 有 專 一 性 高 水 解 條 件 溫 和 水 解 反 應 容 易 控 制 反 應 速 率 快 且 無 化 學 物 質 殘 留 問 題 等 優 點 Pantaleone 等 人 (1992) 指 出 有 10 種 葡 聚 醣 酶 (glycanase) 21 種 蛋 白 分 解 酶 (protease) 5 種 脂 肪 酶 (lipase) 和 1 種 單 寧 酶 (tannase) 具 有 水 解 幾 丁 聚 醣 的 活 性, 其 中 以 木 瓜 酵 素 (papain) 的 專 一 性 最 高, 其 次 分 別 為 脂 肪 酶 (lipase) 半 纖 維 素 酶 (hemicellulase) 和 纖 維 素 酶 (cellulase) 本 實 驗 利 用 酵 素 法 來 製 備 低 分 子 量 幾 丁 聚 醣, 並 選 擇 纖 維 素 酶 作 為 水 解 酵 素 纖 維 素 酶 可 將 纖 維 素 物 質 轉 變 成 葡 萄 糖 而 纖 維 素 酶 可 由 細 菌 真 菌 中 獲 得, 尤 其 是 真 菌 類 如 Trichorma viride 及 T. reesei., 一 般 而 言 纖 維 素 酶 依 水 解 作 用 方 式 可 分 為 三 類 :(1) 內 切 型 纖 維 素 分 解 酵 素 (endo-1,4-β-glucanases)(ec 3.2.1.4) 主 要 剪 切 纖 維 素 內 部 之 β-1,4- 配 醣 鍵 (2) 外 切 型 纖 維 素 分 解 酵 素 (exo-β-1,4-d-glucanase) 又 稱 1,4-β-D-cellobiohydrolases ( EC 3.2.1.91 ), 由 非 還 原 端 (non-reducing ends) 將 纖 維 素 以 纖 維 雙 醣 為 單 位 予 以 分 解 (3)β- 葡 萄 糖 酵 素 (1,4-β-D-glycosidases)(EC 3.2.1.21), 主 要 將 纖 維 雙 醣 或 短 鏈 之 纖 維 寡 醣 (cellooligosaccharide) 分 解 成 葡 萄 糖 (Xia et al., 2008) 幾 丁 聚 醣 與 纖 維 素 之 結 構 相 似, 已 有 許 多 文 獻 使 用 纖 維 素 酶 來 水 解 幾 丁 聚 醣 Pantaleone 等 人 (1992) 及 Muraki 等 人 (1993) 指 出 市 售 纖 維 素 酶 大 多 具 有 水 解 幾 丁 聚 醣 的 活 性, 其 exo-β-1,4-glucanase 活 性 愈 強 的 纖 維 素 酶, 水 解 幾 丁 聚 醣 的 能 力 也 愈 強 而 Xia 等 人 (2008) 10

指 出 以 不 同 來 源 之 纖 維 素 酶 水 解 幾 丁 聚 醣 皆 能 產 生 與 幾 丁 聚 醣 酶 相 當 的 活 性, 見 表 二 ( 六 ) 幾 丁 聚 醣 之 物 性 分 析 1. 分 子 量 的 測 定 不 同 分 子 量 的 幾 丁 聚 醣 有 不 同 的 特 性 及 應 用 範 圍, 常 見 分 析 幾 丁 聚 醣 分 子 量 方 法 有 : 黏 度 平 均 分 子 量 (Maghami and Roberts,1988; Roberts and Domszy, 1982) 高 效 液 相 層 析 法 (Wu and Bough, 1976) 光 散 射 法 量 (Beri et al., 1993) 及 膠 體 過 濾 分 析 法 (Mima et al., 1983) 本 實 驗 採 用 膠 體 過 濾 分 析 法 來 測 定 幾 丁 聚 醣 分 子 量, 其 原 理 為 利 用 分 子 篩 的 作 用 來 將 不 同 分 子 量 之 幾 丁 聚 醣 作 分 離, 分 子 量 較 大 者 滯 留 時 間 短, 分 子 量 小 者 滯 留 時 間 長 方 法 為 在 管 柱 中 填 充 一 定 孔 徑 的 膠 體, 並 以 醋 酸 緩 衝 液 作 為 其 流 動 相, 利 用 其 不 同 分 子 大 小 在 管 柱 內 滯 留 的 時 間 的 不 同, 配 合 RI 偵 測 器 來 偵 測 分 子 量 大 小 (Mima et al., 1983) 2. 去 乙 醯 度 的 測 定 幾 丁 質 和 幾 丁 聚 醣 最 大 區 別 在 去 乙 醯 度, 一 般 幾 丁 聚 醣 去 乙 醯 程 度 介 於 65%~99% 不 等, 而 以 70~90% 最 常 見, 去 乙 醯 度 愈 高, 其 結 構 上 的 胺 基 愈 多, 在 酸 性 下 所 帶 的 正 電 荷 愈 多, 因 此 能 吸 附 的 陰 離 子 重 金 屬 或 其 他 小 分 子 愈 多 ; 國 際 及 大 陸 對 於 用 作 保 健 食 品 原 料 之 幾 丁 聚 醣, 去 乙 醯 程 度 必 須 達 85% 以 上, 常 見 去 乙 醯 度 的 測 定 方 法 有 : 紅 外 光 譜 分 析 法 紫 外 光 光 譜 分 析 (Muzzarelli, 1985;Tan et al., 1998) 光 譜 分 析 法 (Domard, 1987) 氣 相 層 析 法 (Holan and Voyruba, 1980) 高 效 液 相 層 析 法 (Niola et al., 1993) 酵 素 法 (Nanjo, 1991) 滴 定 法 (Toei and Kohara, 1976) 熱 分 析 法 (Alonso et al., 1983) 比 色 11

表 二 纖 維 素 酶 水 解 幾 丁 聚 醣 之 特 性 Table 2. Properties of cellulases on chitosan hydrolysis. Vmax Viscosity Source/name Molecular Optimum Optimum pi Km for Distribution of reaction mass (kda) temperature ( ) ph chitosan g L -1 reduction (%) products Bacillus cereus D-11 41 (SDS) 60 6.0 ND 7.5 2.15 10-7 mol/mg/s 90 Chitobiose, chitotriose, and chitoriose Lysobacter sp. IB-9374 41 (SDS) 60 5.0, 7.0 ND ND ND 91 Dimer, trimer, tetramer Bacillus sp. S65 45 (SDS) 65 6.0 6.0 ND ND NA NA Trichoderma viride 66 (SDS) 60 5.2 4.55 0.746 0.0268 mg/ ml min 80 Dimer, trimer, tetramer and glucosamine Special type ND 58 5.3 ND NA NA ND dp2 12 oligomers (commercialcellulase) a Pseudomona sp. H3 33.8 (SDS) 40 5.0 <6.0 3.59 3.8 mg/ml ND ND min Bacillus sp. MET 1299 52 (SDS) 60 5.5 ND ND ND 99 Dimer, trimer, tetramer Trichoderma viride ND 30-40 5.0-6.0 ND 9.4 10-2 ND 93 Chito-oligosaccharides Japanese cellulase(commercial) a ND 40 4.0 ND NA NA 62.41 Dimer, trimer, tetramer and glucosamine Commercial cellulase a ND 50 5.6 ND ND ND 50 18,000 Commercial cellulase a ND 50 5.4 ND 1.68 1.24 mg/ml ND NA min Streptomyces griseus 34 (SDS) 60 6.0-9.0 ND ND ND NA Dimer, trimer, tetramer HUT 6037 Bacillus cereus S1 45 (SDS) 60 6.0 ND ND ND NA Dimer, trimer, tetramer T. reesei ND 45-55 5.0 ND ND ND 98 Oligomers T. viride Myxobacter AL-1 32 (SDS) 70 5.0 6.8 ND 0.75 10-9 mol/l min ND Glucosamine ND: not determined; NA: no data shown; GF: gel filtration; SDS: SDS PAGE electrophoresis. a The source unknown. (Xia et. al, 2008) 12

分 析 法 (Davies and Hayes, 1988) 核 磁 共 振 光 譜 分 析 法 (Saito, 1987) Nihydrin 呈 色 定 量 游 離 胺 基 法 (Curotto and Aros, 1993) 本 實 驗 採 用 滴 定 法, 其 方 法 為 利 用 多 陰 離 子 試 劑 P.V.S.K. (Potassium polyvinyl sulfate) 滴 定 待 測 溶 液, 並 以 toluidine blue 為 指 示 劑, 當 滴 定 達 終 點 時, 會 由 藍 色 轉 變 為 紅 紫 色, 再 與 標 準 品 比 對 滴 定 量 則 可 測 得 去 乙 醯 度 (Toei and Kohara, 1976) ( 七 ) 幾 丁 聚 醣 安 全 性 與 法 規 幾 丁 聚 醣 是 公 認 無 毒 性 且 具 高 度 生 物 相 容 性 的 聚 合 物, 其 已 被 廣 泛 地 利 用 在 食 品 上, 並 通 過 許 多 安 全 認 證, 其 安 全 性 評 估 及 應 用 如 下 : 1983 年 : 日 本 將 幾 丁 聚 醣 列 入 食 品 添 加 劑 (Japanese Natural Additive List) 1986 年 :AAFCO(Association of American Feed Control Officials) 允 許 幾 丁 聚 醣 作 為 動 物 飼 料, 含 量 以 飼 料 總 含 量 的 0.1% 為 限 1989 年 : 日 本 將 幾 丁 質 及 幾 丁 聚 醣 在 List of Food Additives other thanchemical Synthetics 列 為 合 法 的 安 定 劑 (stabilizers) 及 增 稠 劑 (thickeners) 1991 年 : 美 國 食 品 藥 物 管 理 局 (USFDA,United States Food and Drug Administration) 允 許 幾 丁 聚 醣 為 一 合 法 的 食 品 及 飼 料 添 加 物 幾 丁 聚 醣 及 其 衍 生 物 可 用 來 當 作 食 品 加 工 蔬 果 的 蛋 白 質 沈 澱 劑 2002 年 : 在 台 灣, 行 政 院 衛 生 署 於 衛 生 署 核 發 健 康 食 品 許 可 證 一 覽 13

表 中, 列 出 金 車 甲 殼 素 複 方 膠 囊 為 核 可 健 康 食 品, 其 內 容 物 主 要 成 分 包 含 了 幾 丁 聚 醣, 且 標 示 出 其 保 健 功 效 : 降 低 血 中 總 膽 固 醇 量 可 降 低 血 中 低 密 度 脂 蛋 白 膽 固 醇 可 減 少 動 脈 硬 化 之 危 險 因 子 ( 台 灣 行 政 院 衛 生 署 ) 14

四 幾 丁 聚 醣 之 應 用 幾 丁 聚 醣 及 其 衍 生 物 已 被 廣 泛 應 用 在 各 個 領 域, 如 醫 療 保 健 食 品 加 工 農 業 化 工 廢 水 處 理 紡 織 工 業 生 化 工 業 生 醫 材 料 及 藥 物 控 制 釋 放 等 以 下 就 幾 丁 聚 醣 在 食 品 加 工 生 醫 材 料 及 藥 物 控 制 釋 放 之 應 用 加 以 敘 述 : ( 一 ) 食 品 加 工 之 應 用 幾 丁 聚 醣 結 構 上 具 有 帶 正 電 的 胺 基, 使 其 擁 有 許 多 良 好 的 生 物 活 性 (Bioactivity) 由 於 幾 丁 聚 醣 具 有 增 黏 性 吸 附 性 抑 菌 性 等 特 質, 故 可 作 為 天 然 食 品 添 加 劑 幾 丁 聚 醣 在 食 品 工 業 應 用 最 常 被 探 討 的 是 其 抗 菌 性 目 前 已 知 幾 丁 聚 醣 抗 菌 模 式 有 兩 種 :(1) 幾 丁 聚 醣 在 酸 性 環 境 下 結 構 上 的 胺 基 (NH 2 ) 會 轉 變 成 帶 有 正 電 荷 (NH + 3 ) 的 胺 基, 因 此 可 吸 附 於 細 胞 表 面 上 帶 有 負 電 之 官 能 基, 干 擾 或 改 變 細 胞 膜 之 通 透 性, 使 得 菌 體 內 物 質 流 失 而 導 致 細 胞 死 亡 ;(2) 幾 丁 聚 醣 可 與 DNA 結 合 抑 制 mrna 合 成, 因 此 小 分 子 量 之 幾 丁 聚 醣 進 入 菌 體 內 會 抑 制 RNA 生 成 並 降 低 細 胞 活 性 進 而 達 到 抑 菌 效 果 ( 陳,2000) ( 二 ) 生 醫 材 料 之 應 用 幾 丁 聚 醣 屬 於 天 然 生 物 製 品, 其 無 毒 性, 對 於 生 物 細 胞 具 有 良 好 的 生 物 相 容 性 (biocompatible) 生 物 可 分 解 性 (biodegradable) 可 恢 復 性 (renewable), 具 有 成 膜 性 高 度 保 水 性, 可 被 人 體 溶 菌 酶 所 分 解 以 及 具 有 良 好 的 抗 菌 性 ( 細 菌 病 毒 黴 菌 等 ) 等 優 點, 因 此 被 廣 泛 應 用 在 生 物 醫 學 材 料 方 面 如 表 三 所 示, 幾 丁 聚 醣 及 其 衍 生 物 多 應 用 於 外 科 縫 合 牙 齒 移 植 人 工 皮 膚 骨 骼 修 護 隱 型 眼 鏡 藥 物 控 制 釋 放 或 膠 囊 外 材 等 15

表 三 幾 丁 聚 醣 在 生 醫 材 料 主 要 特 性 及 其 應 用 Table 3. Principal properties of chitosan in relation to its use in biomedical applications. 生 醫 材 料 方 面 的 應 用 外 科 縫 合 牙 齒 移 植 人 工 皮 膚 骨 骼 重 建 隱 形 眼 鏡 藥 物 控 制 釋 放 膠 囊 材 料 主 要 特 性 生 物 相 容 性 生 物 可 分 解 性 修 復 功 能 成 膜 性 保 水 性 無 毒 性, 生 物 耐 受 性 可 被 溶 菌 酶 分 解 具 有 治 療 特 性 具 抗 細 菌 病 毒 真 菌 效 果 (Rinaudo, 2006) 16

( 三 ) 藥 物 控 制 釋 放 之 應 用 許 多 研 究 指 出, 幾 丁 聚 醣 具 有 高 度 正 電 荷 及 可 形 成 膠 體 和 薄 膜 的 特 性, 故 可 應 用 於 藥 物 控 制 釋 放 方 面 ( 陳,2000) 文 獻 指 出 幾 丁 聚 醣 具 有 提 高 藥 物 運 輸 (enhance the transport)(illum et al., 1994), 增 加 藥 物 在 腸 道 吸 收 ( absorption enhancer ) ( Tengamnuay and Mitra,1997) 提 高 藥 物 生 體 利 用 率 (improve the bioavailibility) (Luessen et al.,1996), 並 可 有 效 的 黏 附 在 黏 膜 上, 打 開 控 制 物 質 進 入 細 胞 內 之 緊 密 連 接 (tight junctions) 通 道 等 特 性 (Artursson et al.,1994), 這 些 特 性 一 方 面 能 控 制 藥 物 釋 放 和 延 長 有 效 治 療 時 間 ; 另 一 方 面 更 可 以 把 藥 物 送 到 特 定 位 置, 故 可 用 於 藥 物 釋 放 技 術 已 有 許 多 文 獻 利 用 幾 丁 聚 醣 與 藥 物 結 合, 製 備 成 微 米 粒 子 微 脂 粒 口 錠 溶 液 膠 囊 薄 膜 或 乾 燥 粒 子 等, 並 將 其 運 用 在 口 服 非 腸 胃 鼻 部 眼 部 及 基 因 等 治 療 方 面 ( 見 表 四 ) 以 幾 丁 聚 醣 作 為 藥 物 基 材 時, 其 應 用 性 及 特 性 會 受 到 幾 丁 聚 醣 之 顆 粒 大 小 密 度 黏 度 去 乙 醯 程 度 及 分 子 量 等 影 響 而 文 獻 指 出 幾 丁 聚 醣 在 藥 物 運 送 上 有 下 列 優 點 : 1. 穩 定 藥 物 中 的 成 分 因 為 幾 丁 聚 醣 具 有 正 電 荷 可 與 藥 物 中 帶 負 電 荷 游 離 脂 肪 酸 交 互 作 用 形 成 乳 劑 狀, 依 此 形 式 幾 丁 聚 醣 與 脂 肪 酸 能 形 成 聚 合 物 (co-polymer) 達 到 保 護 脂 肪 功 能 性, 避 免 藥 物 中 脂 肪 酸 成 分 在 高 溫 滅 菌 過 程 遭 受 破 壞 (Junaa and Muller, 1999) 2. 促 進 藥 物 吸 收 文 獻 指 出 一 些 不 易 被 消 化 吸 收 的 藥 物 如 atenolol 與 幾 丁 聚 醣 混 合 後, 經 實 驗 證 實 幾 丁 聚 醣 可 提 升 atenolol 被 腸 道 細 胞 Caco-2 的 吸 收 度 17

表 四 幾 丁 聚 醣 在 藥 物 學 上 的 應 用 及 其 藥 物 傳 遞 形 式 Table 4. Pharmaceutical applications and delivery system of chitosan. Route of administration Oral Delivery system Microparticulate Liposomes Buccal disk Solution Vesicle Film coating Tablets Spray dried particles capsules Parenteral Microspheres Solution Nasal Ocular Solution Suspension Gene therapy Other Gel systems (Dodane and Vilivalam, 1998) 18

率 達 10~15 倍 (Schipper,et al., 1999) 3. 延 緩 或 控 制 藥 物 溶 解 速 度 有 些 藥 物 屬 於 水 溶 性 或 是 遇 到 酸 即 溶 解, 使 得 這 些 藥 物 無 法 順 利 到 達 腸 道 被 吸 收 而 喪 失 其 功 效, 而 幾 丁 聚 醣 可 作 為 口 服 藥 無 傳 遞 載 體, 具 有 延 緩 或 控 制 藥 物 溶 解 速 度 (Brine, 1989;Felt et al., 1999; Ganza-Gonzalez et al.,1999) 4. 幫 助 藥 物 送 達 目 的 器 官 幾 丁 聚 醣 同 時 具 有 疏 水 基 和 親 水 基, 可 與 紫 杉 醇 (toxol) 形 成 小 於 100nm 小 顆 粒 膠 粒 (micell), 研 究 證 實 依 此 形 式 紫 杉 醇 能 更 有 效 地 被 送 達 至 腫 瘤 部 位, 且 紫 杉 醇 與 幾 丁 聚 醣 之 混 合 物 對 腫 瘤 細 胞 的 抑 制 能 力 比 游 離 的 紫 杉 醇 佳 (Miwa et al., 1999) ( 四 ) 幾 丁 聚 醣 有 助 於 物 質 在 腸 道 吸 收 之 因 素 1. 幾 丁 聚 醣 具 生 物 黏 著 性 許 多 文 獻 指 出 幾 丁 聚 醣 擁 有 良 好 黏 膜 黏 著 性 (mucoadhesive)(lehr et al., 1992; Needleman and Smales,1995; Rillosi and Buckton, 1995; He et al., 1998;Shimoda et al., 2001; Kockisch et al., 2003) 這 是 因 為 幾 丁 聚 醣 有 高 度 正 電 荷, 可 透 過 分 子 間 靜 電 吸 引 作 用 力, 黏 附 在 帶 負 電 之 黏 膜 表 面, 有 此 特 性 歸 因 於 幾 丁 聚 醣 有 : (1) 強 的 氫 鍵 鍵 結 基 團 如 OH, COOH(Schipper et al., 1997); (2) 高 度 電 荷 (Dodane et al., 1999); (3) 高 度 分 子 量 (Schipper et al., 1996; Kotze et al., 1998); 19

(4) 鏈 具 有 良 好 的 伸 展 性 (He et al., 1998); (5) 表 面 能 量 特 性 可 支 持 幾 丁 聚 醣 滲 透 至 黏 膜 (Lueβen et al., 1994) 2. 幾 丁 聚 醣 具 可 逆 性 地 調 控 腸 道 上 皮 細 胞 之 緊 密 連 接 (tight junction) 開 合 之 能 力 緊 密 連 接 是 一 種 封 閉 連 接, 主 要 存 在 上 皮 細 胞 和 內 皮 細 胞 間, 如 消 化 道 上 皮 膀 胱 上 皮 腦 毛 細 管 內 皮 以 及 睪 丸 支 持 細 胞 之 間 等 緊 密 連 接 是 由 occuldin claudin 及 cytoplasmic plague 蛋 白 質 所 組 成 的 錯 合 物, 而 cytoplasmic plague proteins 又 是 由 Zonula Occludens-1 (ZO-1) Zonula Occludens-2(ZO-2) Zonula Occludens-3(ZO-3) 及 cingulin 等 蛋 白 質 所 構 成, 如 圖 三 ZO-1 位 於 occuldin 與 cytoskeleton 間, 在 調 控 細 胞 間 隙 上 的 緊 密 連 接 之 緊 密 度 扮 演 重 要 的 角 色 (Furuse et al., 1994;Yamamoto et al., 1997) 秦 (2005) 指 出 腸 道 上 皮 細 胞 緊 密 連 接 主 要 功 能 為 (a) 選 擇 性 屏 障 : 腸 道 上 皮 細 胞 緊 密 連 接 區 為 一 動 態 通 透 性 屏 障, 其 具 有 雙 重 功 能, 能 阻 止 潛 在 有 害 物 質 或 病 原 菌 進 入 體 內, 同 時 能 允 許 營 養 物 質 進 入 體 內 ;(b) 維 持 柵 欄 功 能 : 已 知 緊 密 連 接 是 由 圍 繞 在 上 皮 細 胞 頂 端 的 跨 膜 蛋 白 (Occludin Claudins 等 ) 所 構 成, 因 此 限 制 了 以 緊 密 連 接 區 為 界 的 上 皮 細 胞 頂 側 膜 和 底 側 膜 兩 部 份 細 胞 膜 上 的 脂 質 流 動 ( 即 柵 欄 功 能 ) 文 獻 指 出 幾 丁 聚 醣 的 衍 生 物 具 有 促 進 胜 肽 類 藥 物 在 腸 道 內 釋 放 及 吸 收 的 效 果 (Kotze et al.,1998) 原 因 是 其 具 有 可 逆 性 調 控 腸 道 上 皮 細 胞 間 的 緊 密 連 接 開 合 的 功 能, 讓 藥 物 或 營 養 物 質 順 利 通 過 腸 到 進 入 血 液 中 被 吸 收 Dodane 等 人 (1999) 指 出 幾 丁 聚 醣 調 控 腸 道 上 皮 細 胞 緊 密 連 接 開 合 是 因 為 幾 丁 聚 醣 帶 有 正 電 荷, 能 夠 黏 附 在 腸 道 上 皮 細 胞 上, 與 調 控 20

圖 三 緊 密 連 接 蛋 白 錯 合 物 之 概 略 結 構 Figure 3. Schematic representation of interactions among tight junction proteins. (Ward et al., 2000) 21

緊 密 連 接 開 合 的 蛋 白 產 生 作 用, 如 減 少 ZO-1 蛋 白 質 量, 使 細 胞 支 架 (cytoskeleton) 中 的 F-Actin 由 絲 狀 轉 變 成 球 狀 以 穿 透 式 電 顯 微 鏡 觀 察 腸 道 上 皮 細 胞 之 結 構 ( 圖 四 ), 指 出 細 胞 具 有 連 續 的 頂 端 膜 正 常 微 絨 毛 ( ) 及 緊 密 的 緊 密 連 接 的 結 構 (a); 將 細 胞 以 0.1 % chitosan 處 理 30 分 鐘 後, 發 現 細 胞 出 現 許 多 大 的 細 胞 內 空 泡 (V) 及 腫 脹 的 網 狀 結 構 ( ), 在 ( ) 位 置 也 可 觀 察 到 微 絨 毛 經 由 幾 丁 聚 醣 處 理 後 呈 不 規 則 的 排 列 (b) 之 後, 做 回 復 處 理, 將 培 養 液 中 的 幾 丁 聚 醣 移 除, 繼 續 培 養 24 小 時, 觀 察 發 現 細 胞 結 構 可 恢 復 到 未 處 理 前 相 似 (c) 因 此 證 實 幾 丁 聚 醣 能 夠 可 逆 性 調 控 上 皮 細 胞 之 細 胞 間 和 細 胞 內 路 徑, 來 增 加 物 質 的 滲 透 性 另 外 藉 由 測 量 上 皮 細 胞 之 穿 透 電 阻 (transepithelial electrical resistance,teer) 可 觀 察 到 幾 丁 聚 醣 對 緊 密 連 接 的 調 控 Lin 等 人 (2007) 以 幾 丁 聚 醣 與 聚 麩 胺 酸 (poly(γ-glutamic acid), γ-pga) 合 成 100~200nm 直 徑 的 奈 米 微 粒 載 體 並 包 覆 胰 島 素, 而 後 將 其 通 過 胃 到 達 小 腸, 其 研 究 結 果 指 出 幾 丁 聚 醣 可 藉 由 與 小 腸 黏 膜 之 黏 附 作 用 打 開 上 皮 細 胞 間 之 緊 密 連 接, 再 將 胰 島 素 釋 出, 使 胰 島 素 能 順 利 通 過 小 腸 壁 進 入 血 液 循 環, 提 升 胰 島 素 生 體 利 用 率 (bioavailability) 進 而 達 到 降 血 糖 之 效 果 22

圖 四 以 穿 透 電 子 顯 微 鏡 觀 察 幾 丁 聚 醣 對 腸 道 上 皮 細 胞 之 影 響,(a) 為 Caco-2 細 胞 正 常 型 態,(b) 為 經 由 0.1% 幾 丁 聚 醣 處 理 30 分 鐘 後 之 細 胞 (c) 為 將 幾 丁 聚 醣 移 除 後, 繼 續 培 養 24 小 時 後 之 細 胞 Figure 4. Transmission electron micrographs of Caco-2 cells before(a), or after 30 min of 0.1% chitosan treatment(b)and 24 h recovery following 0.1% chitosan treatment(c). 30,000. (Dodane et al., 1999) 23

五 奈 米 科 技 發 展 ( 一 ) 奈 米 科 技 奈 米 是 一 種 長 度 單 位,1 奈 米 為 百 萬 分 之 一 公 釐 ; 也 就 是 十 億 分 之 一 公 尺 (10-9 公 尺 ), 是 10 個 氫 原 子 並 排 起 來 的 長 度 奈 米 技 術 是 在 奈 米 尺 度 (<100nm) 理 解 控 制 與 操 縱 物 質 的 科 學 技 術, 包 含 基 礎 與 應 用 研 究 基 本 上, 奈 米 材 料 具 有 特 殊 的 表 面 體 積 與 量 子 效 應, 可 能 會 表 現 新 的 特 性 與 功 效, 因 此 奈 米 技 術 的 目 標 是 利 用 奈 米 結 構 所 具 有 的 特 性 開 發 具 有 特 定 功 能 的 產 品 ( 二 ) 奈 米 在 食 品 之 應 用 1. 食 品 加 工 方 面 食 品 原 料 經 過 奈 米 化 過 程 改 變 物 質 的 粒 徑 大 小 時, 能 夠 創 造 出 異 於 常 態 之 新 特 性 產 品 在 食 品 加 工 應 用 方 面 當 食 品 經 過 微 膜 微 膠 囊 微 乳 化 微 脂 粒 微 球 等 各 種 技 術 處 理 之 後 可 改 變 其 原 先 之 物 理 性 質, 如 : (1) 提 高 溶 解 度 : 將 食 品 奈 米 化 後, 可 使 食 品 粒 徑 變 小 比 表 面 積 增 加, 溶 解 度 隨 之 增 加, 如 植 物 固 醇 難 溶 於 水 或 脂 肪, 經 由 奈 米 化 後 容 易 溶 解 於 水 或 油 相 ; 珍 珠 粉 經 由 奈 米 化 後 可 提 高 胺 基 酸 溶 出 量 及 溶 解 速 度 (Guan et al.,2006); 或 者 在 奈 米 包 覆 傳 遞 系 統, 將 奈 米 顆 粒 內 部 空 間 填 裝 一 些 非 極 性 分 子, 如 油 脂 類 香 料 抗 菌 劑 抗 氧 化 劑 及 維 生 素 等, 以 提 高 溶 解 度 (Chen et al., 2006a) (2) 改 善 感 官 品 質 : 如 將 澱 粉 奈 米 化 後 可 將 澱 粉 產 生 類 似 脂 肪 的 爽 24

滑 細 膩 口 感, 因 此 可 利 用 奈 米 化 後 的 澱 粉 取 代 部 分 脂 肪 類 成 分, 製 成 低 脂 食 品 (Zhu et al., 2006) (3) 延 長 保 存 期 限 : 利 用 奈 米 包 覆 技 術, 將 營 養 物 質 裝 載 於 核 心 部 位, 與 外 界 環 境 做 隔 離, 達 到 保 護 作 用 (Chen et al., 2006b) 2. 保 健 食 品 方 面 食 品 經 由 奈 米 化 製 程 後 會 使 營 養 性 成 分 在 體 內 產 生 不 同 於 常 態 食 品 的 分 布 與 運 轉 方 式, 因 此 具 有 以 下 特 性 : (1) 提 高 吸 收 率 : 降 低 粒 徑 形 成 非 離 子 分 子, 皆 有 助 於 提 高 營 養 物 質 在 腸 道 之 吸 收 率, 對 增 加 物 質 再 生 體 組 織 上 的 滲 透 傳 輸 及 吸 收 (Chen et al., 2006b and Medina et al., 2007) (2) 提 高 生 體 利 用 率 : 利 用 奈 米 包 覆 技 術, 裝 載 脂 溶 性 維 生 素, 使 其 容 易 溶 於 水 且 提 高 生 體 利 用 率 ; 或 者 包 覆 極 性 與 非 極 性 分 子, 如 蛋 白 質, 可 以 提 高 其 穿 透 細 胞 膜 之 能 力, 協 助 傳 遞 至 標 的 細 胞 (Chen et al., 2006a) (3) 增 進 保 健 功 效 : 利 用 奈 米 包 覆 技 術, 可 將 營 養 物 質 做 包 覆, 可 保 護 營 養 物 質 不 受 腸 道 溫 度 ph 值 變 化 酵 素 作 用 等 影 響, 增 加 營 養 物 質 可 利 用 率, 同 時 在 奈 米 載 體 的 保 護 下, 營 養 物 質 能 迅 速 靠 近 腸 道 而 被 吸 收, 延 長 營 養 物 質 在 腸 道 保 留 濃 度 及 滯 留 時 間, 有 效 發 揮 其 生 理 功 效 (Chen et al., 2006b) 25

( 三 ) 奈 米 在 藥 物 之 應 用 大 約 有 95% 的 藥 物 皆 有 動 力 學 差 或 吸 收 不 好 的 問 題 (Brayden, 2003), 要 將 藥 物 有 效 傳 送 到 病 灶 位 置 並 不 影 響 正 常 組 織 器 官, 首 先 需 調 控 的 是 藥 物 在 體 大 小 因 此 奈 米 技 術 隨 之 被 廣 泛 地 應 用 於 藥 物 傳 遞 方 面 Allen 和 Cullis(2004) 指 出 利 用 奈 米 藥 物 傳 輸 可 改 善 藥 物 本 生 欠 缺 的 性 質, 如 下 : 1. 提 高 藥 物 溶 解 度 疏 水 性 藥 物 在 生 理 環 境 下 容 易 析 出 沉 澱, 須 與 賦 型 劑 (excipients) 合 併 使 用 來 增 加 其 溶 解 性, 但 賦 型 劑 通 常 具 有 毒 性 如 Cremphor 若 使 用 微 脂 粒 (lipid micelles) 或 微 胞 (liposomes) 奈 米 藥 物 傳 遞 系 統, 可 同 時 提 供 親 水 基 和 疏 水 基, 增 加 藥 物 的 吸 收 2. 避 免 藥 物 外 滲 造 成 組 織 傷 害 給 藥 時, 具 有 細 胞 毒 性 之 藥 物 若 不 慎 由 血 管 內 流 至 周 邊 組 織, 會 導 致 組 織 損 傷 或 壞 死, 如 doxorubicin( 為 抗 癌 藥 物, 但 容 易 對 心 臟 產 生 累 積 性 的 傷 害 ) 奈 米 藥 物 傳 遞 系 統 可 調 控 藥 物 釋 放, 減 少 藥 物 釋 放 量, 降 低 因 藥 物 外 滲 造 成 的 組 織 傷 害 3. 避 免 藥 物 在 生 物 體 內 快 速 降 解 在 生 理 環 境 ph 下, 藥 物 容 易 失 去 其 活 性, 如 蛋 白 質 或 基 因 等 藥 物 易 受 到 消 化 道 酵 素 破 壞 以 奈 米 藥 物 傳 遞 系 統 則 可 保 護 藥 物 不 被 降 解, 維 持 藥 物 釋 放 量 及 減 少 藥 物 使 用 量 26

4. 改 善 藥 物 動 力 學 差 腎 臟 會 將 藥 物 速 地 清 除, 則 需 以 高 劑 量 或 連 續 的 注 射 方 式 給 藥 奈 米 藥 物 傳 遞 系 統 則 可 改 變 藥 物 的 分 佈 濃 度 及 產 生 緩 慢 釋 放 的 效 果, 可 解 決 小 分 子 物 質 容 易 被 腎 臟 迅 速 清 除 的 問 題 5. 選 擇 性 標 的 到 發 病 組 織 藥 物 在 體 內 分 佈, 恐 影 響 正 常 組 織 或 器 官, 形 成 副 作 用, 因 此 限 制 了 給 藥 濃 度, 但 如 此 一 來 藥 物 濃 度 降 低 反 而 影 響 其 對 發 病 位 置 之 治 療 效 果 奈 米 藥 物 傳 遞 系 統 具 有 標 的 功 能, 能 針 對 病 灶 位 置 增 加 給 藥 濃 度, 如 對 腫 瘤 組 織 產 生 強 通 透 性 及 停 滯 效 果 (EPR effect) 而 梁 (2007) 指 出, 目 前 奈 米 藥 物 傳 遞 系 統 大 致 可 分 為 微 脂 粒 高 分 子 前 驅 藥 物 奈 米 微 胞 奈 米 微 乳 化 樹 狀 高 分 子 及 奈 米 顆 粒 六 類 型, 如 圖 五 所 示 ( 四 ) 奈 米 顆 粒 (Nanoparticles) 一 般 認 定 粒 子 大 小 小 於 1000 nm 為 微 米 ( 次 微 米 ) 顆 粒, 而 奈 米 粒 子 大 小 小 於 100 nm 則 稱 為 奈 米 顆 粒 (Lan et al., 2005; Vo-Dinh, 2005) 然 而 在 藥 學 領 域, 則 認 為 粒 子 大 小 小 於 1µm( 即 1000 nm) 即 可 定 義 為 奈 米 顆 粒 (Kipp, 2004), 因 此 本 文 認 定 奈 米 顆 粒 泛 指 尺 寸 大 小 介 於 數 奈 米 至 數 百 奈 米 之 顆 粒 文 獻 指 出 奈 米 顆 粒 比 微 米 顆 粒 (>1µm) 更 容 易 通 過 腸 道 上 皮 細 胞 (Desai et al.,1996), 當 顆 粒 粒 徑 大 於 1µm 是 無 法 通 過 生 物 屏 障, 而 當 顆 粒 大 小 介 於 100 1000 nm 時, 則 可 改 善 營 養 物 質 之 生 體 利 用 率 27

圖 五 奈 米 藥 物 傳 遞 系 統 Figure 5. Nano-drug delivery system. ( 梁,2007) 28

(Acosta,2009), 且 顆 粒 愈 小, 其 生 體 利 用 率 愈 高 食 品 經 過 奈 米 化 後, 會 延 長 其 在 腸 胃 道 中 排 空 時 間, 可 提 高 其 與 腸 道 上 皮 細 胞 的 接 觸 機 會 或 直 接 被 細 胞 吸 收 ( 圖 六 ), 因 此 可 增 加 營 養 物 質 之 吸 收 與 利 用 (Chen et al., 2006b;Chau et al.,2007) 奈 米 顆 粒 可 利 用 化 學 或 機 械 方 法 所 製 造,Acosta(2009) 指 出 利 用 機 械 方 式 所 製 備 出 之 奈 米 顆 粒 大 小 通 常 介 於 100 1000 nm 之 間 ; 然 而 以 化 學 法 則 可 製 備 出 10 100 nm 之 顆 粒 奈 米 顆 粒 的 中 心 是 由 固 體 所 構 成, 其 可 由 不 同 種 類 的 物 質 所 形 成, 如 高 分 子 脂 質 蛋 白 質 醣 類 聚 電 錯 合 物 (polyelectrolyte) 或 藥 物 本 身 的 奈 米 顆 粒 表 五 為 奈 米 顆 粒 藥 物 傳 遞 系 統 現 況 與 產 品 特 性 ( 梁,2007) 29

圖 六 奈 米 顆 粒 於 腸 道 吸 收 之 優 勢 Figure 6. Schematic representation of different absorption mechanisms of bioactive molecules. (Chen et al., 2006b) 30

表 五 奈 米 顆 粒 藥 物 傳 遞 系 統 現 況 與 產 品 特 性 Table 5. Recent developt of nonoparticle as drug delivery system and its applications. 藥 物 傳 遞 系 統 發 展 現 況 產 品 特 性 目 前 應 用 之 藥 物 奈 米 顆 粒 以 物 理 或 電 荷 吸 引 方 (nanoparticle) 式 將 藥 物 包 覆 在 生 物 高 分 子 動 物 實 驗 可 分 解 的 高 分 子 中, 並 Insulin, 奈 米 顆 粒 形 成 奈 米 顆 粒, 可 用 來 Antisense 包 覆 蛋 白 質 或 基 因 藥 oligonucleotide 白 蛋 白 上 市 物 Paclitaxel 奈 米 顆 粒 (Abraxane ) 藥 物 奈 米 顆 粒 上 市 以 各 種 物 理 方 式 如 研 Sirolimus (NanoCrystal ) 磨 噴 霧 分 散 超 臨 界 (Rapamune ), 等 方 式 將 藥 物 結 晶 切 Fonofibrate 割 成 奈 米 化, 再 以 界 面 (Tricor ), 活 性 劑 加 以 分 散 (< Megestrol 1000 奈 米 ) (Megace ) ( 梁,2007) 31

六 幾 丁 聚 醣 奈 米 顆 粒 ( 一 ) 常 見 幾 丁 聚 醣 微 / 奈 米 級 顆 粒 的 製 備 方 法 以 幾 丁 聚 醣 作 為 基 材 製 備 微 米 及 奈 米 顆 粒 已 被 廣 泛 應 用 在 藥 物 傳 遞 上, 幾 丁 聚 醣 可 透 過 物 理 法 及 化 學 法 將 藥 物 吸 附 於 表 面 或 包 覆 在 微 粒 中, 物 理 法 有 研 磨 法 噴 霧 乾 燥 法 過 篩 法 等, 但 以 物 理 法 製 備 出 之 顆 粒 粒 徑 不 易 達 奈 米 級, 且 粒 徑 分 佈 廣, 再 加 上 只 能 透 過 顆 粒 表 面 吸 附 方 式 攜 帶 藥 物, 故 較 不 適 用 於 藥 物 傳 遞 方 面,Gan 和 Wang 等 人 (2007) 統 整 出 幾 項 近 年 常 被 用 來 幾 丁 聚 醣 奈 米 顆 粒 之 化 學 方 法 及 其 應 用 在 藥 物 蛋 白 質 或 基 因 上 ( 見 表 六 ), 方 法 如 下 : 1. 共 凝 結 及 沉 澱 法 (Coacervation or precipitation) 共 凝 結 及 沉 澱 法 製 作 原 理 是 透 過 幾 丁 聚 醣 在 鹼 性 條 件 下 無 法 溶 解 的 特 性 來 製 備 顆 粒, 造 成 幾 丁 聚 醣 形 成 顆 粒 的 作 用 力 主 要 為 分 子 內 氫 鍵 其 製 備 方 法 是 利 用 附 有 噴 嘴 之 空 氣 壓 縮 機 將 幾 丁 聚 醣 噴 入 鹼 性 溶 液 ( 如 NaOH NaOH-mathanol 或 ethanediamine) 中, 此 時 因 幾 丁 聚 醣 不 溶 於 鹼 性 溶 液 的 特 性, 當 幾 丁 聚 醣 溶 液 接 觸 到 鹼 性 溶 液 後, 會 產 生 有 凝 結 及 沈 澱 的 反 應 將 沉 澱 物, 再 經 過 濾 及 多 次 離 心 水 洗 作 用, 去 除 殘 留 的 鹼 性 溶 液, 即 可 得 幾 丁 聚 醣 微 米 / 奈 米 顆 粒 (Nishimura et al., 1986) Mao 等 人 (2001) 利 用 共 凝 結 法 製 備 幾 丁 聚 醣 -DNA 奈 米 顆 粒, 發 現 備 出 顆 粒 並 不 成 規 則 球 型 顆, 但 顆 粒 粒 徑 可 達 100 250nm, 在 ph<6 時 顆 粒 表 面 電 位 帶 正 電 荷, 約 為 +12 ~+18 mv; 另 外 以 此 方 法 製 備 出 顆 粒 具 有 保 護 DNA 不 受 核 酸 分 解 酵 素 影 響 之 優 點 32

表 六 常 見 幾 丁 聚 醣 奈 米 顆 粒 之 製 備 方 法 及 其 在 藥 物 蛋 白 質 或 基 因 上 的 應 用 Table 6. Summary of preparation method for chitosan nanoparticles. Method of preparation Drugs/proteins/genes Chitosan nanoparticle systems Ionic gelation Coacervation or precipitation Emulsion-droplet coalescence Reverse micellar Self-assembly chemical modification Insulin, BSA, cyclosporin A DNA gadopentetic acid Doxorubicin Deoxycholic acid (Gan and Wang,2007) 33

2. 乳 化 液 滴 接 合 法 (Emulsion-droplet coalescence) 此 方 法 由 Tokumitsu 等 人 (1999) 所 提 出, 其 將 微 乳 化 交 聯 法 及 沉 澱 法 兩 種 方 法 做 結 合, 不 僅 可 以 利 用 交 聯 劑 來 穩 定 顆 粒 結 構 外, 還 藉 由 結 合 幾 丁 聚 醣 液 與 氫 氧 化 鈉 液 滴 所 造 成 之 沉 澱 反 應 來 加 強 顆 粒 結 構 其 製 備 流 程 為 先 個 別 配 置 幾 丁 聚 醣 - 藥 物 乳 化 液 (w/o) 及 幾 丁 聚 醣 NaOH 乳 化 液 (w/o), 而 後 以 高 速 攪 拌 將 兩 者 均 勻, 即 可 產 生 幾 丁 聚 醣 奈 米 顆 粒 此 方 法 已 被 成 功 應 用 在 製 備 幾 丁 聚 醣 - gadopentetic acid 奈 米 顆 粒 上, 可 獲 得 藥 物 裝 載 率 45 %, 平 均 粒 徑 在 452 nm 之 奈 米 顆 粒 3. 離 子 交 聯 法 (Ionic gelation) 離 子 交 聯 成 膠 法 是 常 見 用 來 製 備 幾 丁 聚 醣 奈 米 顆 粒 的 方 法 其 製 備 原 理 是 利 用 幾 丁 聚 醣 的 胺 基 在 酸 性 條 件 下 會 帶 正 電, 這 個 特 性 使 其 易 與 帶 負 電 之 分 子 進 行 離 子 交 聯 而 產 生 奈 米 顆 粒, 最 常 使 用 之 帶 負 電 之 分 子 為 tripolyphosphate(tpp),tpp 為 帶 五 個 負 電 之 分 子, 可 與 幾 丁 聚 醣 產 生 足 夠 強 度 之 作 用 力 而 形 成 奈 米 顆 粒, 這 些 作 用 力 包 括 離 子 鍵 氫 鍵 及 親 疏 水 之 作 用 力 等 (Kawashima et al.,1985a/1985b) Fernández-Urrusuno 等 人 (1999) 利 用 此 方 法 包 覆 胰 島 素, 發 現 以 CS/TPP 重 量 比 6/1 製 備 之 奈 米 顆 粒, 可 製 得 粒 徑 在 300~ 400 nm, 表 面 電 位 為 +54~+25 mv 之 奈 米 顆 粒 而 Xu 及 Du(2003) 利 用 此 方 法 包 覆 BSA, 以 TEM 觀 察 顆 粒, 可 觀 察 到 顆 粒 粒 徑 約 在 20~200 nm 之 間, 形 狀 呈 球 型 之 奈 米 顆 粒 4. 逆 微 胞 法 (Reverse micellar) 此 方 法 是 利 用 水 與 油 及 界 面 活 性 劑 所 組 成 之 熱 力 學 穩 定 混 合 34

物, 以 巨 觀 觀 察 此 混 合 物 是 均 勻 的, 而 以 微 觀 來 看 水 相 及 油 相 則 是 被 界 面 活 性 劑 形 成 的 薄 膜 隔 開 (Leong and Candau, 1982) 此 方 法 製 作 流 程 是 先 將 介 面 活 性 劑 與 有 機 溶 劑 混 合, 再 加 入 幾 丁 聚 醣 及 交 聯 劑 後, 之 後 去 除 有 機 溶 劑 和 介 面 活 性 劑, 即 可 得 幾 丁 聚 醣 微 米 / 奈 米 顆 粒 Mitra 等 人 (2001) 利 用 此 方 法 來 包 覆 抗 癌 藥 物 Doxorubicin, 經 由 quasi-elastic light scattering 測 量 顆 粒 粒 徑, 得 知 粒 徑 大 小 約 100±10 nm, 已 知 此 大 小 之 藥 物 顆 粒 對 於 腫 瘤 細 胞 具 有 良 好 滲 透 性 和 較 長 之 滯 留 效 果 5. 化 學 修 飾 自 我 組 裝 法 (Self-assembly chemical modification) 幾 丁 聚 醣 自 我 組 裝 顆 粒 原 理 是 利 用 同 時 具 有 親 水 性 及 疏 水 性 機 團 的 兩 性 分 子 鏈, 在 溶 液 中 藉 由 親 疏 水 性 的 作 用 力 而 形 自 我 組 裝 顆 粒 方 法 為 將 幾 丁 聚 醣 經 化 學 交 聯 接 上 疏 水 鏈, 而 得 具 兩 性 分 子 性 質 之 幾 丁 聚 醣 衍 生 物 ; 高 分 子 鏈 上 之 親 水 基 與 疏 水 基 具 有 自 我 組 裝 的 特 性 故 可 形 成 奈 米 顆 粒 Lee 等 人 (1998) 利 用 疏 水 基 團 Deoxycholic acid 修 飾 水 溶 性 幾 丁 聚 醣, 接 著 將 幾 丁 聚 醣 -Deoxycholic acid 置 於 ph 7.2 之 磷 酸 緩 衝 溶 液 中, 則 可 自 我 組 裝 成 平 均 粒 徑 大 小 在 160 nm 之 奈 米 微 囊 所 形 成 之 奈 米 微 囊 又 可 以 離 子 鍵 結 方 式 與 DNA 結 合, 形 成 幾 丁 聚 醣 自 我 組 裝 DNA 複 合 體 ( 平 均 粒 徑 大 小 在 300nm), 複 合 體 能 有 效 的 將 DNA 轉 送 至 COS-1 細 胞 上 進 行 表 現 35

( 二 ) 幾 丁 聚 醣 - 三 聚 磷 酸 鈉 (CS-TPP) 包 覆 蛋 白 質 之 機 制 1. 幾 丁 聚 醣 結 構 幾 丁 聚 醣 在 酸 性 溶 液 中 或 小 於 其 pka(ph~6.3) 時 其 結 構 C 2 上 所 帶 的 胺 基 (NH 2 ) 會 轉 變 成 帶 有 正 電 荷 (NH 3 + ) 的 胺 基 ( 圖 七 a) 2. 三 聚 磷 酸 鈉 結 構 三 聚 磷 酸 鈉 (sodium tripolyphosphate,tpp) 是 由 三 個 磷 酸 組 合 而 5- 成 的 多 元 體, 帶 有 多 種 負 電 離 子 ( 如 P 3 O 10 離 子 OH - 及 HP 3 O 4-10 ), 當 三 聚 磷 酸 鈉 溶 於 水 中 磷 酸 鹽 會 分 解 出 鈉 離 子, 而 使 五 個 磷 酸 根 分 別 帶 負 電 荷 ( 圖 七 b) 3. 幾 丁 聚 醣 - 三 聚 磷 酸 鈉 反 應 機 制 三 聚 磷 酸 鈉 之 負 電 荷 -P 3 O10 5- -HP 3 O10 4- 及 -OH - group 會 與 幾 丁 聚 醣 之 -NH 3 + 互 相 競 爭 產 生 離 子 交 聯 作 用 (ionic-crosslinking) 而 形 成 網 狀 結 構 之 膠 體 顆 粒 ( 圖 七 c) 在 不 同 ph 下, 幾 丁 聚 醣 與 三 聚 磷 酸 鈉 的 鍵 結 會 有 所 差 異 幾 丁 聚 + 醣 在 酸 性 下 (ph <4.5) 帶 有 -NH 3 較 多, 分 子 之 間 會 有 靜 電 排 斥 作 用, 所 形 成 的 chitosan-tpp 顆 粒 結 構 較 延 長, 骨 架 呈 現 梯 形 狀 態 (ladder) + ( 圖 八 a); 而 在 ph>4.5 環 境 中, 幾 丁 聚 醣 帶 有 -NH 3 較 少, 分 子 之 間 靜 電 排 斥 作 用 較 少, 所 形 成 CS-TPP 顆 粒 為 環 狀 結 構 (loop)( 圖 八 b), 幾 丁 聚 醣 與 TPP 之 鍵 結 是 以 環 狀 結 構 較 為 安 定 另 外, 幾 丁 聚 醣 溶 液 + 之 ph 接 近 其 pka~6.3 時, 其 結 構 上 的 -NH 3 會 再 度 被 質 子 化 轉 變 為 -NH 2, 故 需 將 幾 丁 聚 醣 溶 液 ph 調 控 在 4.5~6.3 之 間 最 為 理 想 TPP 在 36

(a) 幾 丁 聚 醣 溶 於 酸 性 溶 液 中 (b) 三 聚 磷 酸 鈉 (TPP) (c) Chitosan-TPP 交 聯 反 應 圖 七 幾 丁 聚 醣 與 TPP 之 離 子 交 聯 反 應 Figure 7. Molecular structure of chitosan in acid solution ( a ) and tripolyphosphate(tpp)(b). Ionic crosslinking between chitosan and TPP(C). (Hsieh et al., 2008) 37

圖 八 幾 丁 聚 醣 與 三 聚 磷 酸 鈉 在 不 同 ph 值 下 之 鍵 結 情 形 Figure 8. Ladder-loop transition of chitosan-tpp complex structures:(a) ladder type;(b)loop type. (Mi et al., 1999) 38

ph 9.0 時, 其 溶 液 呈 現 負 電 荷 為 -OH - -P 3 O 10 5- 及 -HP 3 O 10 4- ; 當 TPP 溶 液 在 ph 5.0 時, 則 呈 現 -P 3 O 10 5- 及 -HP 3 O 10 4- ; 而 TPP 溶 液 在 ph 3.0 時, 完 全 解 離 為 -P 3 O 10 5-, 因 此 TPP 溶 液 ph 因 選 擇 在 9.0 最 為 理 想 而 楊 (2008) 比 較 三 種 不 同 ph 之 幾 丁 聚 醣 溶 液 (ph 3.4 4.7 6.0) 與 三 種 不 同 ph 之 TPP 溶 液 (ph 3.0 6.0 9.0) 反 應 製 備 奈 米 顆 粒, 發 現, 以 幾 丁 聚 醣 溶 液 ph 4.7 與 TPP 溶 液 ph 9.0 下 製 備 出 之 奈 米 顆 粒 懸 浮 液 較 佳 且 其 顆 粒 為 奈 米 級 因 此 本 文 選 定 幾 丁 聚 醣 與 TPP 溶 液 分 別 為 ph 4.7 與 ph 9.0 4. 幾 丁 聚 醣 - 蛋 白 質 - 三 聚 磷 酸 鈉 反 應 機 制 Luangtana-ana 等 人 (2005) 利 用 幾 丁 聚 醣 包 覆 BSA, 實 驗 結 果 發 現 幾 丁 聚 醣 與 BSA 之 間 的 作 用 力 除 了 離 子 交 聯 鍵 結 之 外 幾 丁 聚 醣 與 TPP 鍵 結 過 程 中, 亦 會 將 BSA 包 覆 進 去 其 作 用 機 制 可 分 為 以 下 兩 種 ( 見 圖 九 ): (1) 離 子 交 互 作 用 : 以 牛 血 清 白 蛋 白 (bovine serum albumin,bsa) 為 例,BSA pi 值 為 4.8, 當 溶 液 ph >4.8 ( 一 般 製 備 幾 丁 聚 醣 奈 米 顆 粒 溶 液 ph 值 為 4.5-5.0), 蛋 白 質 結 構 帶 負 電 荷 (-COO - ) 會 與 幾 丁 聚 醣 的 正 電 荷 (-NH + 3 ) 產 生 離 子 交 互 作 用, 因 此 蛋 白 質 可 藉 由 此 方 式 鍵 結 在 幾 丁 聚 醣 - 三 聚 磷 酸 膠 體 顆 粒 表 面 或 內 部 (2) 物 理 包 覆 : 幾 丁 聚 醣 與 三 聚 磷 酸 鈉 以 離 子 交 聯 (ionic-crosslinking) 方 式 形 成 凝 膠 時 可 將 帶 電 或 不 帶 電 之 物 質 包 埋 在 其 網 狀 結 構 內 部 ( 如 圖 九 ) 39

Janes 等 人 (2001) 指 出, 使 用 幾 丁 聚 醣 與 三 聚 磷 酸 鈉 反 應 機 制 來 製 備 奈 米 顆 粒 之 優 缺 點 為 : 1) 反 應 條 件 溫 和 且 簡 單, 且 不 使 用 毒 性 較 高 的 化 學 交 聯 劑, 但 由 於 此 粒 子 成 型 的 機 制 是 透 過 離 子 鍵 結, 所 以 容 易 因 溶 液 環 境 之 變 化 而 使 粒 子 無 法 形 成 ;2) 可 藉 由 操 控 條 件 調 整, 產 生 所 希 望 得 到 的 粒 徑, 粒 徑 大 小 介 於 100 到 1000 之 間 ;3) 在 某 些 製 備 條 件 下 所 得 顆 粒 之 表 面 仍 帶 高 度 正 電 荷 ;4) 對 蛋 白 質 疫 苗 質 體 DNA 等 物 質, 具 極 佳 的 包 覆 效 果 顆 粒 的 組 成 會 影 響 釋 放 速 率 ;5) 經 冷 凍 乾 燥 程 序 後, 仍 維 持 包 覆 物 之 活 性 及 顆 粒 之 完 整 性 40

離 子 交 互 作 用 物 理 包 覆 圖 九 幾 丁 聚 醣 包 覆 BSA 之 機 制 圖 Figure 9. Schematic of chitosan encapsulation mechanism of BSA. (Luangtana-anan et al., 2005) 41

( 三 ) 幾 丁 聚 醣 - 三 聚 磷 酸 鈉 (CS-TPP) 奈 米 顆 粒 之 應 用 Ko 等 人 (2002) 透 過 幾 丁 聚 醣 與 TPP 之 離 子 交 聯 作 用 來 製 備 微 奈 米 顆 粒, 結 果 可 得 利 徑 大 小 介 於 500 ~ 710 mm 之 顆 粒, 且 對 felodipine 之 包 覆 率 高 達 90% 其 指 出 當 降 低 TPP 溶 液 之 ph 值 及 增 加 幾 丁 聚 醣 分 子 量 時, 可 獲 得 表 面 平 滑 且 呈 球 狀 之 微 / 奈 米 顆 粒 ; 而 以 低 ph 或 高 濃 度 之 TPP 溶 液 製 備 幾 丁 聚 醣 微 / 奈 米 顆 粒 時, 可 降 低 felodipine 之 釋 放 ; 當 增 加 幾 丁 聚 醣 分 子 量 及 濃 度 時, 會 使 felodipine 釋 放 顯 著 地 減 少 Xu 和 Du(2003) 以 幾 丁 聚 醣 -TPP 包 覆 BSA 製 備 奈 米 顆 粒, 並 探 討 幾 丁 聚 醣 結 構 對 奈 米 顆 粒 特 性 之 影 響 透 過 其 方 法 可 製 備 出 粒 徑 介 於 20~200 nm 之 奈 米 顆 粒 ( 以 TEM 觀 察 ), 其 以 FTIR 進 一 步 證 實 幾 丁 聚 醣 是 透 過 其 結 構 上 之 胺 基 與 TPP 產 生 交 聯 反 應 其 並 指 出 幾 丁 聚 醣 奈 米 顆 粒 之 特 性 會 受 到 幾 丁 聚 醣 之 去 乙 醯 度 分 子 量 濃 度 以 及 BSA 之 添 加 量 等 因 素 影 響, 隨 幾 丁 聚 醣 分 子 量 的 增 加 (10~210 kda), 幾 丁 聚 醣 對 BSA 包 覆 率 隨 之 增 加, 而 釋 放 率 隨 之 下 降 (73.9~17.6%); 幾 丁 聚 醣 去 乙 醯 度 增 加 (75.5~92%), 包 覆 率 會 隨 之 增 加 而 釋 放 率 隨 之 減 少 ; 隨 著 幾 丁 聚 醣 與 BSA 濃 度 的 增 加, 其 包 覆 率 有 降 低 之 趨 勢, 而 幾 丁 聚 醣 對 BSA 裝 載 率 愈 高, 釋 放 速 率 愈 快 Gan 等 人 (2005) 將 幾 丁 聚 醣 -TPP 奈 米 顆 粒 應 用 基 因 傳 遞 上, 結 果 可 獲 得 粒 徑 大 小 介 於 100 250 nm 且 表 面 具 有 正 高 度 電 荷 之 奈 米 顆 粒 其 指 出 CS/TPP 重 量 比 對 奈 米 顆 粒 之 粒 徑 大 小 及 表 面 電 位 有 重 大 之 影 響, 當 CS/TPP 重 量 比 增 加, 奈 米 顆 粒 之 粒 徑 大 小 及 表 面 電 位 皆 會 隨 之 增 加 ; 而 當 CS/TPP 重 量 比 固 定, 奈 米 顆 粒 之 表 面 電 位 皆 會 隨 幾 丁 聚 醣 濃 度 增 加 而 減 少 42

Wu(2005) 利 用 幾 丁 聚 醣 -TPP 奈 米 顆 粒 包 覆 甘 草 酸 銨 (ammonium glycyrrhizinate), 結 果 可 得 表 面 具 有 正 電 荷 之 奈 米 顆 粒, 且 對 甘 草 酸 銨 有 良 好 之 包 覆 效 果, 濃 度 高 達 0.5 mg/ml 其 利 用 TEM 可 觀 察 到 大 小 介 於 20 80 nm 奈 米 顆 粒 ; 而 利 用 DLS 方 法 觀 察, 得 知 顆 粒 置 於 水 中 其 粒 徑 會 大 於 120 nm Grenha 等 人 (2005) 將 幾 丁 聚 醣 奈 米 顆 粒 應 用 於 肺 蛋 白 傳 遞 上, 其 指 出 幾 丁 聚 醣 奈 米 顆 粒 對 蛋 白 質 有 良 好 之 裝 載 率 (65 80%), 有 75 80% 的 胰 島 素 會 可 在 15 分 鐘 內 被 釋 出 體 外, 而 在 水 溶 液 中 奈 米 顆 粒 之 粒 徑 及 表 面 電 位 不 會 受 到 改 變 Gan 及 Wang (2007) 以 幾 丁 聚 醣 -TPP 奈 米 顆 粒 包 覆 牛 血 清 白 蛋 白 (bovine serum albumin,bsa) 時, 結 果 可 得 粒 徑 大 小 介 於 200 580 nm 及 表 面 帶 有 高 度 正 電 荷 之 chitosan-bsa-tpp 奈 米 顆 粒 其 指 出 當 幾 丁 聚 醣 分 子 量 愈 高 濃 度 愈 低,CS/TPP 重 量 比 愈 低,BSA 濃 度 愈 高, 對 BSA 有 較 高 之 包 覆 率 Jang 等 人 (2008) 探 討 包 覆 L-Ascorbic Acid(AA) 之 幾 丁 聚 醣 奈 米 顆 粒 在 水 溶 液 中 加 熱 處 理 之 安 定 性 其 指 出 當 幾 丁 聚 醣 及 TPP 濃 度 分 別 在 1.5 及 0.6 mg/ml 時, 可 獲 得 粒 徑 大 小 在 170 nm 之 奈 米 顆 粒 ; 當 AA 濃 度 由 0.1 mg/ml 增 加 至 0.3 mg/ml 時, 顆 粒 粒 徑 會 隨 之 增 加, 表 面 電 位 則 隨 之 下 降, 另 外 依 其 方 法 可 獲 得 穩 定 之 包 覆 率 (10 12%) Liu 等 人 (2009) 研 究 指 出 離 子 交 聯 法 來 製 備 幾 丁 聚 醣 奈 米 顆 粒 時, 可 藉 由 調 控 各 種 因 子 如 chitosan/tpp 比 例 濃 度 ph 值 和 鹽 類 之 添 加 等 來 調 整 奈 米 顆 粒 之 粒 徑 大 小 及 表 面 電 位 其 指 出 幾 丁 聚 醣 奈 米 顆 粒 來 包 覆 ciprofloxacin(ch) 時, 在 ph 4.8 下, 幾 丁 聚 醣 與 TPP 濃 度 分 別 在 2 和 1 mg/ml 時 可 獲 得 粒 徑 大 小 約 300nm 之 奈 米 顆 粒, 且 當 43

固 定 幾 丁 聚 醣 濃 度 時, 提 高 TPP 可 降 低 顆 粒 之 粒 徑 Yang 等 人 (2009) 探 討 幾 丁 聚 醣 分 子 量 對 於 幾 丁 聚 醣 奈 米 顆 粒 在 藥 物 傳 遞 上 及 應 用 性 之 影 響 其 指 出 之 會 當 幾 丁 聚 醣 分 子 量 愈 低 其 對 藥 物 包 覆 率 愈 佳, 以 55 kda 之 幾 丁 聚 醣 包 覆 fluorouracil(5fu) 時, 可 獲 得 粒 徑 大 小 為 70.6 nm 之 奈 米 顆 粒, 且 裝 載 率 達 66% Dudhani 及 Kosaraju(2010) 利 用 幾 丁 聚 醣 -TPP 包 覆 catechin 以 製 備 具 生 物 黏 著 性 之 奈 米 顆 粒, 並 探 討 其 特 性, 指 出 在 ph 5.5 下, chitosan/tpp 比 例 為 2/1 時, 幾 丁 聚 醣 奈 米 顆 粒 對 catechin 時 包 覆 率 可 達 90%; 在 模 擬 體 外 腸 道 環 境 累 積 釋 放 試 驗, 結 果 顯 示 在 24 小 時 後 catechin 在 腸 液 累 積 釋 放 量 為 32%; 而 利 用 螢 光 標 記 來 觀 察 奈 米 顆 粒 之 生 物 黏 著 性, 結 果 得 知 包 覆 及 未 包 覆 有 catechin 之 奈 米 顆 粒 具 分 別 具 有 40% 及 32% 黏 膜 黏 著 力, 因 此 證 實 幾 丁 聚 醣 具 有 良 好 之 生 物 黏 著 性 及 控 制 catechin 在 腸 胃 道 中 之 釋 放 能 力 由 以 上 文 獻 可 得 知 幾 丁 聚 醣 奈 米 顆 粒 已 被 廣 泛 地 應 用 在 藥 物 蛋 白 質 或 基 因 上, 而 其 特 性 會 受 到 許 多 因 素 所 影 響, 因 此 本 研 究 將 進 一 步 詳 細 探 討 對 分 離 大 豆 蛋 白 質 水 解 物 濃 度 幾 丁 聚 醣 分 子 量 及 幾 丁 聚 醣 /TPP 重 量 比 等 影 響 因 子 對 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 之 包 覆 率 裝 載 率 產 率 粒 徑 大 小 表 面 電 位 及 在 不 同 ph 下 之 安 定 性 之 影 響 ( 四 ) 幾 丁 聚 醣 顆 粒 之 特 性 分 析 幾 丁 聚 醣 奈 米 顆 粒 之 特 性 分 析 主 要 包 括 了 顆 粒 型 態 觀 察 粒 徑 分 析 及 表 面 電 位 分 析 等 三 個 部 份 依 不 同 置 備 方 法 所 得 的 奈 米 顆 粒 的 歷 經 大 小 及 分 佈 決 定 了 奈 米 顆 粒 品 質 的 優 劣 44

1. 顆 粒 型 態 觀 察 利 用 電 子 顯 微 鏡 ( 如 SEM TEM) 可 直 接 觀 察 粒 子 的 型 態 及 大 小, 但 由 此 方 法 所 測 量 出 粒 子 之 實 際 粒 徑 可 能 侷 限 於 局 部, 只 能 判 定 一 次 粒 子, 但 對 聚 集 態 的 大 小 則 判 定 不 易, 無 法 代 表 整 個 溶 液 中 所 有 粒 子 的 狀 態, 再 加 上 其 操 作 過 程 複 雜 及 成 本 高 等 缺 點, 所 以 比 較 少 使 用 此 方 來 測 量 粒 子 粒 徑 大 小 2. 粒 徑 分 析 奈 米 粒 徑 測 量 大 多 採 用 雷 射 光 散 射 法 (DLS), 此 方 法 是 透 過 測 量 粒 子 在 溶 液 中 會 因 受 到 周 圍 溶 劑 分 子 的 碰 撞 使 顆 粒 產 生 隨 機 運 動, 又 稱 布 朗 運 動, 大 粒 子 布 朗 運 動 慢, 小 粒 子 布 朗 運 動 快, 所 以 當 雷 色 光 源 打 向 奈 米 顆 粒 會 產 生 散 射, 光 散 色 角 度 會 因 遇 到 粒 子 粒 徑 大 小 不 同 而 有 所 差 異, 再 經 由 數 學 方 程 式 Stokes-Einstein equation 公 式 轉 換 而 求 得 粒 徑 大 小 及 分 佈 平 均 粒 徑 ( 稱 為 z- 均 值 ) 是 基 於 光 散 射 強 度 權 重 的 平 均 值, 為 一 種 動 態 光 散 射 所 有 的 平 均 值 多 Stokes-Einstein equation: d(h) = kt 3πηD d(h) = 粒 子 的 水 力 直 徑 D = 待 測 粒 子 的 擴 散 係 數 k = 波 茲 曼 常 數 T = 測 量 時 溶 液 的 絕 對 溫 度 η= 溶 劑 的 黏 度 45

3. 表 面 電 位 表 面 電 位 是 與 一 個 顆 粒 在 某 一 特 定 介 質 中 所 帶 的 總 電 荷 有 關, 確 切 地 來 說, 是 顆 粒 在 剪 切 面 處 的 電 位, 可 用 來 預 測 膠 體 系 統 的 穩 定 性, 如 果 顆 粒 帶 有 很 多 負 的 或 正 的 電 荷, 也 就 是 說 很 高 的 Zeta 電 位, 它 們 會 相 互 排 斥, 從 而 達 到 整 個 體 系 的 穩 定 性 ; 如 果 顆 粒 帶 有 很 少 負 的 或 正 的 電 荷, 也 就 是 說 它 的 Zeta 電 位 很 低, 它 們 會 相 互 吸 引, 從 而 達 到 整 個 體 系 的 不 穩 定 性 奈 米 顆 粒 之 表 面 電 位 會 影 響 顆 粒 的 穩 定 性 外, 當 顆 粒 應 用 於 藥 物 傳 遞 時, 表 面 電 位 更 會 影 響 藥 物 的 輸 送 及 釋 放 一 般 表 面 電 位 是 使 用 雷 射 都 普 勒 電 泳 法, 在 電 場 中, 表 面 帶 有 電 荷 的 奈 米 顆 粒 會 產 生 電 泳 動 現 象, 利 用 儀 器 偵 測 此 泳 動 距 離, 即 可 進 一 步 計 算 出 顆 粒 表 面 電 位 所 帶 有 之 電 量 表 面 電 位 愈 高, 顆 粒 的 分 散 體 系 愈 穩 定, 水 相 中 顆 粒 分 散 穩 定 性 的 分 界 線 一 般 認 為 在 +30 mv 或 -30 mv 46

七 分 離 大 豆 蛋 白 質 水 解 物 ( isolate soy protein hydrolysates,isph) ( 一 ) 大 豆 蛋 白 質 之 生 理 功 能 食 品 蛋 白 質 在 人 體 新 陳 代 謝 過 程 中 為 一 重 要 營 養 來 源 具 有 提 供 人 體 所 需 胺 基 酸 及 能 量 供 給 等 功 能, 而 許 多 蛋 白 質 隱 含 著 活 性 片 段 通 過 腸 胃 道 後 具 有 特 殊 之 生 理 調 節 作 用 (Choi et al., 2001) 大 豆 是 一 種 含 蛋 白 質 及 多 種 營 養 素 之 食 品, 食 品 加 工 中 常 見 的 大 豆 原 料 包 有 三 種 : 脫 脂 大 豆 蛋 白 粉 (defatted soy bean flour) 濃 縮 大 豆 蛋 白 質 (soybean protein concentrate, SPC) 分 離 大 豆 蛋 白 質 (isolate soy protein, ISP) 脫 脂 大 豆 其 蛋 白 質 含 量 約 50%, 是 將 大 豆 碾 碎 進 行 脫 脂 後 再 經 適 當 地 處 理 成 細 粉 之 產 品 ;SPC 是 將 脫 脂 大 豆 蛋 白 質 粉 去 除 水 溶 性 多 醣 灰 分 等 成 分 後 的 製 品, 其 蛋 白 質 含 量 約 65~70%; 而 ISP 為 濃 縮 大 豆 粉 用 水 或 稀 鹼 液 抽 出 蛋 白 質, 過 濾 加 酸 至 大 豆 蛋 白 質 等 電 點 (ph 4.5), 除 去 大 多 非 蛋 白 質 成 分 的 產 品, 其 蛋 白 質 含 量 85~95% (Anson, 1957) 由 於 一 般 大 豆 製 品 中 都 含 有 豐 富 之 纖 維 質, 會 妨 礙 大 豆 蛋 白 之 消 化 吸 收 與 利 用, 而 經 萃 取 後 的 ISP 除 了 蛋 白 質 含 量 高 達, 也 去 除 不 好 的 膽 固 醇 油 脂 及 植 物 固 醇 等, 屬 無 色 無 香 無 味 及 安 定 性 高 之 產 品, 且 不 含 蛋 白 酶 抑 制 因 子 (trypsin inhibitor), 其 蛋 白 質 的 含 量 與 酪 蛋 白 分 離 物 相 近, 不 僅 可 以 促 進 人 體 的 利 用 還 可 減 輕 代 謝 的 負 擔, 因 此 具 有 高 度 之 營 養 及 經 濟 價 值 47

( 二 ) 大 豆 蛋 白 水 質 解 物 之 生 理 功 能 蛋 白 質 的 水 解 是 由 於 肽 鍵 的 斷 裂, 而 產 生 不 同 分 子 量 大 小 的 胜 肽 和 游 離 胺 基 酸, 其 可 透 過 酸 鹼 或 酵 素 的 作 用 來 進 行 然 而, 酸 鹼 的 化 學 水 解 作 用 較 不 易 控 制, 且 容 易 破 壞 L 型 胺 基 酸 反 而 成 為 D 型, 或 形 成 lysinoalanine 等 有 毒 物 質 而 影 響 產 品 之 營 養 價 值 因 此 一 般 加 工 操 作 上 會 選 擇 溫 和 條 件 下 即 可 進 行 的 酵 素 水 解 法 研 究 指 出 蛋 白 質 經 由 酵 素 水 解 後, 所 分 解 出 具 有 生 物 活 性 的 胜 肽 可 更 加 提 升 原 有 蛋 白 質 的 機 能 性, 即 使 經 由 消 化 系 統 作 用 後 仍 具 有 不 同 生 理 功 能 (Pihlanto-Leppälä, 2001) 而 已 有 許 多 文 獻 採 用 酵 素 來 水 解 大 豆 蛋 白, 並 指 出 大 豆 蛋 白 質 經 由 不 同 酵 素 水 解 產 生 之 水 解 物 具 有 不 同 生 理 功 能, 這 些 生 理 活 性 包 括 : 降 血 脂 及 降 膽 固 醇 特 性 (Yasuyuki and Yoshikawa, 2000) 抗 氧 化 活 性 (Chen et al., 1995a, Chen et al., 1995b and Moure et al., 2006) 降 血 壓 (Wu and Ding, 2001and Chiang et al., 2006) 改 善 動 脈 順 應 性 及 血 管 內 皮 功 能 (Ringseis et al., 2005) 減 輕 胰 島 素 阻 抗 和 減 重 效 果 (Hermansen et al., 2001 and Gibbs et al., 2004) 等 ( 三 ) 分 離 大 豆 蛋 白 質 水 解 物 之 生 理 功 能 膜 反 應 系 統 是 利 用 不 同 孔 徑 大 小 濾 膜 管 柱 進 行 區 分, 可 產 出 不 同 分 子 量 之 產 物 並 可 提 升 產 物 之 功 能 性 蛋 白 質 食 品 中 均 含 有 一 些 功 能 性 胜 肽 片 段, 但 在 體 內 消 化 時 間 不 夠 或 攝 取 量 不 足, 不 一 定 能 水 解 出 足 夠 的 需 求 濃 度, 在 預 防 保 健 的 觀 點 下, 膳 食 的 機 能 性 成 分 胜 肽 濃 度 在 到 達 某 程 度 時 才 能 有 效 預 防 疾 病 因 此, 利 用 濾 膜 區 分 可 控 制 水 解 產 物 的 分 子 量 分 布 濃 度 及 品 質, 大 量 並 持 續 生 產 出 具 有 機 能 性 之 小 48

分 子 量 之 蛋 白 質 或 胜 肽 產 品 (Pihlanto-Leppälä, 2001) 以 下 為 近 年 來 利 用 酵 素 及 連 續 膜 反 應 系 統 來 生 產 具 有 特 殊 生 理 功 能 性 之 大 豆 蛋 白 質 水 解 物 之 相 關 文 獻 : Chiang 等 人 (1999) 指 出 將 分 離 大 豆 蛋 白 質 經 由 alcalas 及 flavourzyme 反 應 後, 再 利 用 膜 過 濾 系 統 進 行 區 分 與 濃 縮 後, 結 果 可 得 到 具 高 度 抗 氧 化 活 性 之 分 離 大 豆 蛋 白 質 水 解 物 ( 水 解 物 分 子 量 介 於 3~30kDa) Chiang 等 人 (2006) 指 出 利 用 alcalase 水 解 分 離 大 豆 蛋 白 質, 而 後 利 用 膜 過 濾 系 統 進 行 區 分 與 濃 縮 後, 成 功 生 產 出 具 高 度 降 血 壓 效 果 之 分 離 大 豆 蛋 白 質 水 解 物 ( 水 解 物 分 子 量 介 於 1~10kDa) 趙 (2009) 指 出 分 離 大 豆 蛋 白 質 經 由 neutrase 反 應 的 水 解 物, 利 用 膜 過 濾 系 統 進 行 區 分 與 濃 縮 後, 分 子 量 10~30 kda 水 解 物 具 有 有 顯 著 促 進 脂 肪 分 解 活 性 ; 而 經 由 flavourzyme 反 應 的 水 解 物, 利 用 膜 過 濾 系 統 進 行 區 分 與 濃 縮 後, 則 是 分 子 量 在 1~10 kda 水 解 物 具 有 有 顯 著 促 進 脂 脂 肪 分 解 活 性 Tsou 等 人 (2010) 指 出 分 離 大 豆 蛋 白 質 經 由 neutrase 反 應 的 水 解 物, 利 用 膜 過 濾 系 統 進 行 區 分 與 濃 縮 後, 可 得 到 具 有 抑 制 脂 質 生 成 的 分 離 大 豆 蛋 白 質 水 解 物 ( 分 子 量 介 於 1.3~2.2 kda) 本 研 究 選 用 的 分 離 大 豆 蛋 白 質 水 解 物 是 經 由 neutrase 反 應 過 的 水 解 物, 再 透 連 續 過 膜 反 應 系 統, 從 水 解 物 篩 選 出 10~30kDa 之 分 離 大 豆 蛋 白 水 質 解 物, 因 此 片 段 水 解 物 已 通 透 過 細 胞 (3T3-L1 脂 肪 細 胞 ) 測 試, 證 實 其 具 有 良 好 促 進 脂 肪 分 解 活 性, 為 具 有 顯 著 減 脂 功 能 的 蛋 白 質 水 解 物, 但 由 於 此 片 段 之 蛋 白 質 水 解 物 分 子 量 大, 不 易 被 完 整 吸 收, 49

且 在 消 化 過 程 中 容 易 受 到 腸 胃 道 酵 素 破 壞 及 水 解, 使 其 功 能 性 片 段 喪 失 因 此 本 文 嘗 試 以 幾 丁 聚 醣 作 為 壁 材, 三 聚 磷 酸 鈉 作 交 聯 劑, 將 此 大 分 子 分 離 大 豆 蛋 白 質 水 解 物 包 覆 或 吸 附 在 其 結 構 中, 並 將 其 製 備 成 奈 米 級 顆 粒, 希 望 透 過 此 方 式 來 包 覆 分 離 大 豆 蛋 白 質 水 解 物 及 穩 定 其 活 性 成 分 50

參 材 料 與 方 法 一 實 驗 材 料 ( 一 ) 原 料 粗 幾 丁 質 ( 蟹 殼,Chitin)( 高 雄 應 化 公 司, 高 雄 台 灣 ) 分 離 大 豆 蛋 白 質 水 解 物 (ISPH)( 由 東 海 大 學 江 文 德 老 師 實 驗 室 提 供 ) ( 二 ) 藥 品 1. 去 乙 醯 度 分 析 : Potassium polyvinyl sulfate solution( 和 光 純 藥, 日 本 ) Toluidine blue(sigma, 美 國 ) 2. 幾 丁 聚 醣 水 解 酵 素 : 纖 維 酵 素 (Cellulase from Trichoderma reesei ATCC,6.9 units/mg solid)(sigma, 美 國 ) 3. 幾 丁 聚 醣 分 子 量 分 析 : Sodium acetate(ferak, 德 國 ) 標 準 品 :Pullulan(Shodex, 日 本 ) 4. 蛋 白 質 分 子 量 分 析 : 標 準 品 :cytochrome C Aprotinin Gastrin I (Gly) 3 及 Glycine (Sigma, 美 國 ) 5. 蛋 白 質 定 量 分 析 : Coomassie Plus TM - The Better Bradford Assay Kit ( Pierce Biotechnology, 美 國 ) 6. 安 定 性 試 驗 : Hydrochioric acid( 聯 工 化 學 廠 股 份 有 限 公 司, 台 灣 ) 51

Sodium Chloride(Panreac Quimca Sa, 西 班 牙 ) Potassium Dihydrogen Phosphate( 石 津 製 藥 株 式 會 社, 日 本 ) 7. 蛋 白 質 電 泳 分 析 : N,N,N,N, -Tetramethylethylenediamine Coomasssie Brilliant Blue R-250 Bronophenol blue(sigma, 美 國 ) Sodium dodecyl sulfate(sds)(bio-rad, 美 國 ) Glycine(Panreac Quimca Sa, 西 班 牙 ) Acryamide-bisFertiglosung 40%(Merck, 德 國 ) Ammoniumperoxodisulfate(APS)(GERBU, 德 國 ) Tris(hydroxymethyl)aminomethane(Tris)(Mallinckrodt Baker, 美 國 ) BlueRAY Prestained Protein Ladder(GeneDireX, 比 利 時 ) 8. 其 他 : Sodium tripolyphosphate( 和 光 純 藥, 日 本 ) Acetic acid Sodium hydroxide( 聯 工 化 學 廠 股 份 有 限 公 司, 台 灣 ) 二 實 驗 儀 器 1. 磨 粉 機 :1hp 型 ( 群 策 電 機 工 業 股 份 有 限 公 司, 台 灣 ) 2. 分 析 篩 網 :Tyler 標 準 規 格 篩 網 (Endecotts, 英 國 ) 3. 電 磁 式 過 篩 機 :OCTAGONDIGITAL 2000 型 (Endecotts, 英 國 ) 4. ph meter:sp701 型 (Suntex, 台 灣 ) 5. 真 空 冷 凍 乾 燥 機 :EYELAFD-5N 型 (Tokyo, 日 本 ) 6. 高 速 低 溫 離 心 機 :CR22GII 型 (Hitachi, 日 本 ) 7. 微 量 超 高 速 離 心 機 :CS 120GX 型 (Hitachi, 日 本 ) 8. 高 效 率 液 相 層 析 儀 (1): A. L-6000 pump(hitachi, 日 本 ) 52

B. RI-Deterctor 8110(Bischoff, 德 國 ) C. D-2500 chromatointegrator 積 分 儀 (Hitachi, 日 本 ) 9. 高 效 率 液 相 層 析 儀 (2): A. 765 HPLC compact pump(alcott, 美 國 ) B. UV-VIS Deterctor /S-3702(Soma, 日 本 ) C. Chromatocorder 21 積 分 儀 (System Instruments, 日 本 ) 10. 膜 反 應 系 統 A. 捲 式 膜 (Polyethersulfone spiral-wound membrane): 分 子 量 限 值 (Molecular weight cutoff) 分 別 為 30 和 10 kda (kilo Daltons) (Osmonics Inc., 美 國 ) B. 膜 分 離 系 統 (Membrane reactor system)( 邁 先 生 物 技 術 股 份 有 限 公 司, 台 灣 ) 11. Microplate reader:mrⅡ 型 (DYNEX, 美 國 ) 12. 雷 射 奈 米 粒 徑 及 界 面 電 位 分 析 儀 : Zetasizer Nano 3000HS 型 (Malvern Instrument, 英 國 ) 13. 細 胞 粉 碎 機 :XL-2020 型 (Misonix, 美 國 ) 14. 往 復 式 恆 溫 震 盪 器 :BT-350 型 (Yih Der, 台 灣 ) 15. 蛋 白 質 電 泳 分 析 : A. 鑄 膠 套 件 電 泳 套 件 : Versatile Mini-PROTEAN 3 Electerophresis Cell(Bio-Rad, 美 國 ) B. 電 源 供 應 器 :MP-250(MAJOR SCIENCE, 台 灣 ) 16. 掃 描 式 電 子 顯 微 鏡 :JSM 7000F 型 (Jeol, 日 本 ) 17. 傅 立 葉 轉 換 紅 外 線 光 譜 儀 :IR Prestige-21 型 (Shimadzu, 日 本 ) 53

三 材 料 準 備 ( 一 ) 幾 丁 聚 醣 參 考 沈 (2004) 方 法, 將 片 狀 粗 幾 丁 質 以 粉 碎 機 磨 碎 後, 用 40 和 60 mesh 篩 網 ( 大 小 介 於 0.25~0.42mm) 過 篩, 取 介 於 40-60 mesh 之 間 顆 粒 之 幾 丁 質 加 入 57%(w/v)NaOH 溶 液 中 (20 ml NaOH / g chitin), 以 100±2 進 行 加 熱 攪 拌 處 理 後, 取 出 幾 丁 聚 醣 並 以 大 量 蒸 餾 水 沖 洗, 直 到 NaOH 完 全 被 沖 洗,pH 達 中 性, 置 入 烘 箱 乾 燥 (80 8 小 時 ) 而 後 使 用 滴 定 方 法 (Toei and Kohara, 1976) 及 配 合 標 準 品 來 測 定 幾 丁 聚 醣 之 去 乙 醯 度, 並 取 得 大 於 85% 去 乙 醯 度 之 幾 丁 聚 醣 作 為 實 驗 之 用 ( 二 ) 不 同 分 子 量 幾 丁 聚 醣 之 製 備 參 考 Qin 等 人 (2004) 及 Lin 等 人 (2005) 以 纖 維 酵 素 水 解 幾 丁 聚 醣 之 實 驗 方 法 取 1g 之 幾 丁 聚 醣 (Mw 475.5 kda) 溶 解 於 100 ml 之 0.2M 醋 酸 溶 液 中, 配 置 1 % (w/v) 幾 丁 聚 醣 溶 液, 攪 拌 24 小 時 後, 以 過 濾 器 (PET 材 質 ) 將 幾 丁 聚 醣 溶 液 做 粗 過 濾, 去 除 溶 液 中 較 大 的 雜 質 及 鹽 類, 而 後 以 10N 或 1N NaOH 溶 液 調 ph 至 5.0, 接 著 加 入 不 同 濃 度 之 纖 維 酵 素 (cellulase,6.9 units/mg solid)(0 2 4 6 8 及 10 mg/g chitosan), 於 37 恆 溫 水 浴 震 盪 反 應 12 小 時, 立 刻 加 熱 (100,15 min) 使 酵 素 失 活, 待 溶 液 冷 卻 至 室 溫, 以 1 號 及 4 號 濾 紙 過 濾 溶 液, 再 用 10N 或 1N NaOH 溶 液 調 ph 至 7.0, 使 幾 丁 聚 醣 析 出, 析 出 物 再 經 過 三 次 高 速 離 心 (21000 g,30 min) 水 洗 去 除 鹽 類 後, 以 冷 凍 乾 燥 收 集 其 粉 末 而 後 利 用 膠 體 層 析 管 柱 ( Gel Permeation Chromatography,GPC) 來 測 定 其 分 子 量, 並 取 未 水 解 幾 丁 聚 醣 (Mw 475.5 kda) 及 2 種 幾 丁 聚 醣 水 解 物 (chitosan hydrolysates,cs), 其 分 子 量 分 別 為 231.5 及 131.1 kda 54

( 三 )10~30kDa 分 離 大 豆 蛋 白 質 水 解 物 之 製 備 本 實 驗 所 選 用 之 分 離 大 豆 蛋 白 質 10~30kDa 水 解 物 是 經 由 30 和 10 kda 兩 種 不 同 分 子 量 限 值 (molecular weight cutoff,mwco) 濾 膜 對 水 解 物 進 行 區 分 濾 膜 對 區 分 其 原 理 為 使 用 不 同 分 子 量 限 值 之 濾 膜 進 行 水 解 物 的 分 離 及 純 化, 膜 反 應 系 統 如 圖 十 所 示 參 考 Chiang 等 人 (2006) 方 法 稍 作 修 改, 首 先 使 30kDa MWCO 濾 膜 對 水 解 物 進 行 處 理, 方 法 為 將 水 解 物 之 置 於 反 應 槽, 由 幫 浦 將 水 解 物 經 管 A 輸 送 至 捲 式 膜 內, 此 時 調 整 管 C 上 的 流 速 控 制 閥, 對 捲 式 膜 進 行 加 壓, 於 是 分 子 量 小 於 濾 膜 MWCO 的 分 子, 則 會 通 過 濾 膜 經 由 管 B 收 集 為 濾 液 (permeate), 即 分 子 量 小 於 30kDa 之 水 解 物 ; 接 著 將 小 於 30kDa 之 水 解 物 再 經 10kDa MWCO 濾 膜 處 理, 則 得 到 分 子 量 介 於 10~30kDa 之 水 解 物 55

圖 十 膜 反 應 系 統 Figure 10. Membrane reactor system. 56

四 實 驗 方 法 ( 一 ) 幾 丁 聚 醣 - 分 離 大 豆 蛋 白 質 水 解 物 - 三 聚 磷 酸 鈉 (CS-ISPH-TPP) 奈 米 顆 粒 之 製 備 參 考 楊 (2008) 之 研 究 結 果, 其 指 出 幾 丁 聚 醣 溶 液 在 ph 4.7 下, CS-TPP 之 懸 浮 液 中 幾 丁 聚 醣 顆 粒 為 奈 米 級, 而 TPP 溶 液 於 ph 9.0 時 有 三 種 負 電 荷 (-OH - 5- -P 3 O 10 及 -HP 3 O 4-10 ), 能 有 效 地 與 幾 丁 聚 醣 之 + -NH 3 發 生 作 用 產 生 更 多 CS-TPP 奈 米 顆 粒 ( 霧 狀 較 濃 ), 且 以 CS/TPP 重 量 比 6/1 條 件 下 包 覆 表 沒 食 子 兒 茶 素 沒 食 子 酸 酯 (epigallocatechin gallate,egcg), 所 製 備 出 之 CS-TPP-EGCG 奈 米 顆 粒 對 EGCG 具 有 較 高 的 包 覆 效 力 粒 徑 較 小 顆 粒 表 面 帶 有 高 度 之 正 電 荷 及 在 胃 液 或 腸 液 中 具 有 高 度 之 安 定 性 等 優 點, 故 本 文 參 照 其 結 果 稍 作 修 改 來 製 備 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 而 CS ISPH 及 TPP 三 者 之 添 加 次 序 則 參 考 吳 (2008) 之 研 究 結 果, 其 指 出 先 將 牛 血 清 白 蛋 白 (bovine serum albumin,bsa) 加 入 幾 丁 聚 醣 溶 液 中 而 後 再 加 入 TPP 溶 液 可 得 高 度 之 包 覆 率, 且 可 將 BSA 包 覆 於 CS-TPP 網 狀 結 構 中 ( 二 )CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 特 性 之 影 響 因 子 參 考 吳 (2008) 及 楊 (2008) 之 方 法, 將 不 同 分 子 量 幾 丁 聚 醣 (CS) 溶 於 1 %(v/v) 之 醋 酸 溶 液 中 至 2 mg/ml 之 濃 度, 調 ph 至 4.7; 將 不 同 濃 度 之 三 聚 磷 酸 鈉 (TPP) 溶 於 去 離 子 水 中, 調 ph 至 9.0; 將 不 同 濃 度 之 分 離 大 豆 蛋 白 質 水 解 物 (ISPH) 溶 於 去 離 子 水 中 樣 品 添 加 次 序 為 先 將 ISPH 加 入 CS 溶 液 中 攪 拌, 再 加 入 TPP 溶 液 中 攪 拌 ( 註 : 在 攪 拌 過 程 皆 置 於 冰 上 以 維 持 樣 品 低 溫, 目 的 是 為 保 鮮 ) 1. ISPH 濃 度 之 影 響 57

將 1 ml 不 同 濃 度 (1 3 5 7 9 mg/ml) 之 ISPH 溶 液 加 至 5 ml 幾 丁 聚 醣 溶 液 中 (Mw 131.1 kda,2mg/ml,ph 4.7) 攪 拌 10min, 再 將 前 者 緩 慢 滴 入 2 ml TPP 溶 液 (0.84mg/mL,pH 9.0) 攪 拌 15min, 使 得 混 合 液 中 CS/TPP 重 量 比 為 6/1, 而 後 添 加 20μL glycerol 攪 拌 5min ( 目 的 : 避 免 奈 米 顆 粒 互 相 黏 附 ), 最 後 離 心 30 min(48,000 g,15 ), 可 得 沈 澱 物 即 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 之 後 分 析 其 包 覆 率 裝 載 率 及 產 率, 測 定 奈 米 顆 粒 之 粒 徑 大 小 及 表 面 電 位 2. 幾 丁 聚 醣 分 子 量 之 影 響 將 1 ml ISPH 溶 液 (5 mg/ml) 加 至 5 ml 不 同 分 子 量 (Mw 475.5 231.5 及 131.1 kda,2mg/ml,ph 4.7) 幾 丁 聚 醣 溶 液 中 攪 拌 10min, 再 將 前 者 緩 慢 滴 入 2 ml TPP 溶 液 (0.84mg/mL,pH 9.0) 攪 拌 15min, 使 得 混 合 液 中 CS/TPP 重 量 比 為 6/1, 而 後 添 加 20μL glycerol 攪 拌 5min ( 目 的 : 避 免 奈 米 顆 粒 互 相 黏 附 ), 最 後 離 心 30 min(48,000 g,15 ), 可 得 沈 澱 物 即 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒, 之 後 分 析 其 包 覆 率 裝 載 率 及 產 率, 測 定 奈 米 顆 粒 之 粒 徑 大 小 及 表 面 電 位 3. CS/TPP 重 量 比 之 影 響 將 1 ml ISPH 溶 液 (5mg/mL) 加 至 5 ml CS 溶 液 中 (Mw 131.1 kda,2mg/ml,ph 4.7), 再 將 前 者 緩 慢 滴 入 2 ml 不 同 濃 度 (0.84 1.00 1.25 1.67 2.50 mg/ml,ph 9.0) 之 TPP 溶 液 攪 拌, 使 得 混 合 液 中 CS/TPP 重 量 比 分 別 為 6/1 5/1 4/1 3/1 及 2/1, 而 後 添 加 20μ L glycerol 攪 拌 5min( 目 的 : 避 免 奈 米 顆 粒 互 相 黏 附 ), 最 後 離 心 30 min (48,000 g,15 ), 可 得 沈 澱 物 即 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 之 後 分 析 其 包 覆 率 裝 載 率 及 產 率, 並 測 定 奈 米 顆 粒 之 粒 徑 大 小 及 表 面 電 位 58

( 三 )CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 在 胃 腸 液 中 之 安 定 性 之 影 響 因 子 1. CS/TPP 重 量 比 影 響 將 1 ml ISPH 溶 液 (5mg/mL) 加 至 5 ml CS 溶 液 中 (Mw 131.1 kda,2 mg/ml,ph 4.7), 再 將 前 者 緩 慢 滴 入 2 ml 不 同 濃 度 (0.84 1 1.25 1.67 2.5 5 mg/ml) 之 TPP 溶 液 (ph 9.0), 使 得 混 合 液 中 CS/TPP 重 量 比 分 別 為 6/1 5/1 4/1 3/1 及 2/1, 而 後 添 加 20μL glycerol 攪 拌 5min, 最 後 離 心 30 min(48,000 g,15 ), 可 得 沈 澱 物 即 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒, 並 取 上 清 液 測 定 ISPH 含 量, 計 算 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 中 ISPH 含 量 而 後 參 考 Zhang 及 Kosaraju (2007) 方 法, 將 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 分 別 置 於 6mL 之 ph 1.2 之 鹽 酸 緩 衝 溶 液 (1g NaCl,3.5mL HCl(36%), 去 離 子 水 定 量 至 500 ml,hcl 調 整 ph 至 1.2) 2 小 時 及 ph 7.4 之 磷 酸 緩 衝 溶 液 (25mL O.2M KH 2 PO 4,7.7mL O.2M NaOH, 去 離 子 水 定 量 至 100 ml,o.2m NaOH 調 整 ph 至 7.4) 6 小 時, 以 模 擬 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 在 胃 腸 液 中 之 安 定 性 2. 幾 丁 聚 醣 分 子 量 對 安 定 性 之 影 響 將 1 ml ISPH 溶 液 (5mg/mL) 加 至 5 ml 不 同 分 子 量 (475.5 231.5 及 131.1 kda) 之 CS 溶 液 中 (2 mg/ml,ph 4.7), 再 將 前 者 緩 慢 滴 入 2 ml TPP 溶 液 (1.67mg/mL,pH 9.0), 使 得 混 合 液 中 CS/TPP 重 量 比 為 3/1, 而 後 添 加 20µL glycerol 攪 拌 5min, 最 後 離 心 30 min(48,000 g, 15 ), 可 得 沈 澱 物 即 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒, 並 取 上 清 液 測 ISPH 含 量, 計 算 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 中 ISPH 含 量 而 後 參 考 Zhang 及 Kosaraju (2007) 方 法, 將 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 分 別 置 於 6mL 之 ph 1.2 之 鹽 酸 緩 衝 溶 液 (1g NaCl,3.5mL HCl(36%), 去 離 子 水 定 量 至 500 59

ml,hcl 調 整 ph 至 1.2)2 小 時 及 ph 7.4 之 磷 酸 緩 衝 溶 液 (25mL O.2M KH 2 PO 4,7.7mL O.2M NaOH, 去 離 子 水 定 量 至 100 ml,o.2m NaOH 調 整 ph 至 7.4)6 小 時, 以 模 擬 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 在 胃 腸 液 中 之 安 定 性 3. 以 SDS-PAGE 評 估 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 經 過 模 擬 胃 腸 道 消 化 試 驗 後 ISPH 分 子 量 之 變 化 將 1 ml ISPH 溶 液 (5mg/mL) 加 至 5 ml CS 溶 液 中 (Mw 475.5 kda, 2 mg/ml, ph 4.7), 再 將 前 者 緩 慢 滴 入 2 ml TPP 溶 液 (1.67mg/mL,pH 9.0), 使 得 混 合 液 中 CS/TPP 重 量 比 為 3/1, 而 後 離 心 (48,000 g,15,30 min), 得 沈 澱 物 即 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 而 後 參 考 Wu 與 Ding(2002) 的 試 驗 方 法, 將 200mg 分 離 大 豆 蛋 白 質 水 解 物 及 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 溶 於 20mL 之 0.1M KCl-HCl 緩 衝 溶 液 (ph 2.0), 於 37 下 震 盪 培 養 4 小 時, 以 模 擬 胃 部 的 環 境, 之 後 以 2N NaOH 調 整 其 ph 至 7.0, 取 部 分 樣 品 備 用 剩 餘 樣 品 繼 續 於 37 震 盪 培 養 4 小 時, 以 模 擬 腸 道 的 環 境, 實 驗 終 了 取 部 分 樣 品 備 用 最 後 利 用 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) 來 評 估 蛋 白 質 之 分 子 量 60

五 分 析 方 法 ( 一 ) 幾 丁 聚 醣 去 乙 醯 度 之 測 定 參 考 Toei 與 Kohara (1976) 方 法, 精 稱 0.02g 幾 丁 聚 醣 樣 品 及 標 準 品 並 記 錄 其 重 量 將 樣 品 及 標 準 品 溶 於 10mL 之 0.1M 醋 酸 溶 液 中, 置 於 室 溫 下 攪 拌 一 小 時 待 其 溶 解, 再 以 蒸 餾 水 定 量 至 50mL 接 著, 取 5mL 樣 品 及 標 準 品 溶 液 於 三 角 錐 形 瓶 中, 加 入 0.05mL toluidine blue 指 示 劑 後, 以 N / 400 potassium polyvinyl sulfate solution(p.v.s.k) 進 行 滴 定, 滴 定 至 溶 液 由 藍 色 變 成 紅 紫 色, 此 為 其 滴 定 終 點, 利 用 標 準 品 滴 定 量 與 重 量 和 樣 品 之 重 量 及 滴 定 量 做 計 算 即 可 得 知 去 乙 醯 度 ( 二 ) 幾 丁 聚 醣 水 解 物 之 分 子 量 分 析 參 考 吳 (2008) 之 方 法, 精 稱 10mg 幾 丁 聚 醣 水 解 物 及 pullulan 標 準 品, 分 別 溶 於 10mL 1% 醋 酸 溶 液 及 去 離 子 水 中, 靜 置 冰 箱 隔 夜 後, 以 0.45µm filter 進 行 過 濾 利 用 Gel Permeation Chromatography(GPC) 方 法 分 析 幾 丁 聚 醣 水 解 物 之 分 子 量 以 pullulan 標 準 品 建 立 檢 量 線 ( 附 錄 一 ) Pullulan 標 準 品 分 子 量 分 別 為 11800 22800 47300 112000 212000 404000 及 788000 Dalton 測 定 樣 品 遲 滯 時 間 (retention time) 並 與 檢 量 線 相 互 對 照, 即 可 推 算 幾 丁 聚 醣 水 解 物 之 重 量 平 均 分 子 量 系 統 :L-6000 pump D-2500 chromatointegrator 積 分 儀 (Hitach 公 司, 日 本 ) 偵 測 器 :RI-Deterctor 8110(Bischoff, 德 國 ) 管 柱 :HSp gel AQ5.0(Waters ; 6.0mm * 150 mm) 移 動 相 :0.2M 醋 酸 /0.1M 醋 酸 鈉 流 速 : 為 0.6 ml/min 61

溫 度 :45 樣 品 濃 度 :1 mg/ml 注 射 量 :20 µl 偵 測 時 間 :15 min ( 三 )10~30kDa 分 離 大 豆 蛋 白 質 水 解 物 分 子 量 分 析 參 考 Chiang 等 人 (1999) 方 法, 樣 品 以 去 離 子 水 配 製 成 5mg/mL, 以 0.22µm filter 進 行 過 濾 利 用 HPLC 方 法 分 析 10~30kDa 分 離 大 豆 蛋 白 質 水 解 物 分 子 量 分 布 情 形 由 標 準 品 定 義 分 子 量 標 準 品 與 分 子 量 如 下 : cytochrome C(12588 Da) Aprotinin(6512.42 Da) Gastrin I (2080.16 Da) Gly- Gly- Gly(189.2 Da) 及 Glycine(75.07 Da) 測 定 樣 品 遲 滯 時 間 (retention time) 並 與 標 準 品 遲 滯 時 間 相 互 對 照, 即 可 推 算 出 離 大 豆 蛋 白 質 水 解 物 分 子 量 分 布 情 形 系 統 :765 HPLC compact pump(alcott, 美 國 ) Chromatocorder 21 積 分 儀 (System Instruments, 日 本 ) 偵 測 器 :UV-VIS Deterctor /S-3702(Soma, 日 本 ) 管 柱 :Superdex TM peptide 10/300GL(GH Healthcare, Sweden) 管 柱 體 積 :24 ml 流 速 :0.4 ml/min 移 動 相 :0.25M NaCl/0.02M phosphate buffer,ph 7.2 偵 測 波 長 :214 nm 注 射 量 :20 µl 樣 品 濃 度 :5 mg/ml 偵 測 時 間 :60 min 62

( 四 ) 蛋 白 質 定 量 利 用 蛋 白 質 套 組 (Coomassie Plus TM -The Better Bradford Assay Kit, Pierce Biotechnology, USA) 進 行 定 量 步 驟 如 下, 將 蛋 白 質 經 適 當 稀 釋 後, 取 出 10 µl 稀 釋 樣 品 與 300µl 的 試 劑 混 合 均 勻 於 室 溫 下 反 應 十 分 鐘, 隨 後 測 量 595nm 下 的 吸 光 值 (DYNEX MRⅡmicroplate reader, USA) (Bradford, 1976;Zor and Selinger, 1996) ( 五 ) 包 覆 率 裝 載 率 及 產 率 之 分 析 於 製 備 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 時, 將 CS-ISPH-TPP 反 應 液 離 心, 取 上 清 液, 利 用 Bradford Method 測 定 其 ISPH 含 量, 計 算 其 包 覆 率 (encapsulation efficiency %) 標 準 曲 線 (ISPH 濃 度 vs 吸 光 值 ) 為 ISPH 之 稀 釋 溶 液 ( 附 錄 二 ) 接 著 將 離 心 後 所 得 之 沈 澱 物 即 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒, 利 用 烘 箱 烘 乾 秤 重, 至 衡 重, 即 可 得 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 之 乾 重, 並 計 算 其 裝 載 率 (loading capacity %) 產 率 (process yield %) 分 析 則 以 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 之 乾 重 除 以 添 加 入 固 形 物 重 量, 即 CS ISPH 及 TPP 起 始 配 置 之 重 量 (w/w) 所 得 63

( 六 ) 奈 米 顆 粒 粒 徑 和 表 面 電 荷 之 測 定 使 用 雷 射 光 散 射 法 粒 徑 及 界 面 電 位 分 析 儀 (Zetasizer 3000HS, Malvern,UK) 測 定 奈 米 顆 粒 大 小 及 表 面 電 荷 為 了 避 免 偵 測 到 灰 塵 等 顆 粒 較 大 的 雜 質, 實 驗 前 所 有 樣 品 等 溶 液 先 以 0.45 µm 過 濾 膜 過 濾 再 製 備 奈 米 顆 粒 將 CS-TPP 及 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 懸 浮 於 去 離 子 水 中, 使 用 超 音 波 細 胞 粉 碎 機 將 聚 集 顆 粒 震 碎 (40% duty cycle,20 secs), 靜 置 10-15 min 後, 取 上 層 溶 液, 以 動 態 光 散 射 法 (dynamic light scattering method) 測 定 粒 子 粒 徑 大 小 另 外, 將 CS-TPP 及 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 以 去 離 子 水 稀 釋 至 適 當 濃 度, 測 定 其 表 面 電 荷 所 有 樣 品 皆 測 定 三 次, 求 其 平 均 值 (mean ±SD) ( 七 ) 安 定 性 之 分 析 1. 模 擬 胃 液 中 (ph 1.2) 之 安 定 性 參 考 Zhang 與 Kosaraju(2007) 方 法, 將 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 置 於 6 ml 鹽 酸 緩 衝 溶 液 (ph 1.2) 之 50 ml 三 角 錐 形 瓶, 於 恆 溫 水 浴 槽 中 震 盪 (37,75 rpm), 按 0.5 1 1.5 及 2 小 時 取 出 0.5 ml 溶 液 樣 品, 利 用 Bradford Method 測 定 ISPH 含 量 ( 標 準 曲 線 參 照 附 錄 三 (a)) 並 以 下 列 公 式 計 算 其 時 間 累 積 ISPH 之 釋 放 率, 同 時 再 加 回 0.5 ml 鹽 酸 緩 衝 溶 液, 使 瓶 內 維 持 一 定 體 積 計 算 方 式 如 下 : Wn = Cn V + Vs Σ[C (a-1) ] Wn / W 100 = 時 間 累 積 ISPH 釋 放 率 (%) Wn: 時 間 累 積 ISPH 總 含 量 W:CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 中 ISPH 總 含 量 64

n,a: 取 樣 次 數 C: 測 定 ISPH 之 濃 度 V: 總 溶 液 體 積 Vs: 採 取 樣 品 體 積 2. 模 擬 腸 液 中 (ph 7.4) 之 安 定 性 參 考 Zhang 與 Kosaraju(2007) 方 法, 將 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 置 於 6 ml 磷 酸 緩 衝 溶 液 (ph 7.4) 之 50 ml 三 角 錐 形 瓶 於 恆 溫 水 浴 槽 中 震 盪 (37,75 rpm ), 按 0.5 1 2 3 4 5 及 6 小 時 取 出 0.5 ml 溶 液 樣 品, 利 用 Bradford Method 測 定 ISPH 含 量 ( 標 準 曲 線 參 照 附 錄 三 (b)) 並 以 上 述 公 式 計 算 其 時 間 累 積 ISPH 之 釋 放 率, 同 時 再 加 回 0.5 ml 磷 酸 緩 衝 溶 液, 使 瓶 內 維 持 一 定 體 積, 計 算 方 式 同 上 ( 八 ) 蛋 白 質 電 泳 分 析 蛋 白 質 電 泳 分 析 是 利 用 SDS-PAGE ( sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) 來 評 估 蛋 白 質 之 分 子 量 於 迷 你 電 泳 裝 置 鑄 膠 器 中 注 入 10% SDS-PAGE 分 離 膠 體 溶 液 (separating gel, 含 4.13 ml d.d.h 2 O,2.5 ml 1.5M Tris-HCl(pH8.8),100 µl 10% SDS, 80µL APS,3 ml Acryamide,8 µl TEMED), 待 其 凝 固 後, 於 其 上 覆 蓋 5% 聚 集 膠 體 溶 液 (stacking gel, 含 1.98 ml d.d.h 2 O,312.5 µl 0.5M Tris-HCl(pH6.8),50 µl 10% SDS,30 µl APS,250 µl Acryamide, 4 µl TEMED), 待 其 凝 固 後 將 其 置 於 迷 你 電 泳 裝 置 內 於 迷 你 電 泳 裝 置 內 加 入 1X 電 泳 緩 衝 液 (electrode buffer,ph8.3, 含 25mM Tris,0.2M glycine,0.1% SDS) 備 用 取 25µL 樣 品 與 5µL 追 蹤 染 劑 (bromophenol blue) 混 合 後 以 95 加 熱 5min, 冷 卻 後 即 可 注 入 樣 品 槽, 並 加 入 蛋 白 質 標 準 溶 液 做 對 照 先 以 電 壓 70 伏 特 跑 上 膠, 再 改 變 電 壓 為 100 伏 特 65

跑 下 膠, 待 樣 品 溶 液 之 追 蹤 染 劑 跑 至 膠 底 時 即 停 止, 取 出 膠 片, 以 Coomasssie Brilliant Blue R-250 進 行 染 色 染 色 完 畢 後 使 用 脫 色 液 或 水 沖 洗 膠 片 數 次, 至 其 背 景 透 明 後 即 可 利 用 玻 璃 紙 進 行 封 膠 ( 九 ) 傅 立 葉 轉 換 紅 外 線 光 譜 儀 (FTIR) 分 析 CS CS-TPP 奈 米 顆 粒 及 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 經 冷 凍 乾 燥, 取 得 其 粉 末 顆 粒, 儲 存 備 用 將 CS 粉 末 CS-TPP 奈 米 顆 粒 粉 末 及 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 粉 末 分 別 與 KBr 以 1:99 比 例 研 磨 混 和 後 壓 成 薄 片, 利 用 傅 利 葉 轉 換 紅 外 線 光 譜 儀 (FTIR) 測 量 波 數 400-4000 cm -1 之 間 的 吸 收 光 譜 ( 十 ) 掃 描 式 電 子 顯 微 鏡 (SEM) 觀 察 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 以 去 離 子 水 多 次 反 覆 離 心 水 洗 作 用, 以 去 除 樣 品 中 的 鹽 類, 將 顆 粒 覆 懸 於 1 ml 去 離 子 水 中, 利 用 超 音 波 細 胞 粉 碎 機 分 散 樣 品 後, 將 樣 品 滴 在 鋁 箔 片 上 置 於 70 烘 箱 烘 乾 24 小 時, 再 以 離 子 附 膜 機 將 樣 品 鍍 上 一 層 適 當 厚 度 的 白 金 後, 以 熱 場 發 射 掃 描 式 電 子 顯 微 鏡 觀 察 幾 丁 聚 醣 顆 粒 表 面 型 態 ( 十 一 ) 統 計 分 析 本 實 驗 數 據 皆 以 平 均 ± 標 準 誤 差 (means±sem) 表 示 所 有 組 別 之 試 驗 數 據 皆 利 用 SAS 9.1 套 裝 軟 體 進 行 全 隨 機 設 計 (completely randomized desigin) 變 異 分 析 (ANOVA) 及 Duncan s new multiple Range test 分 析, 當 機 率 值 小 於 0.05(p < 0.05) 表 示 各 組 於 統 計 上 有 顯 著 差 異 並 使 用 SigmaPlot 10.0(Systat software, USA) 軟 體 進 行 作 圖 66

肆 結 果 與 討 論 一 樣 品 製 備 ( 一 ) 幾 丁 聚 醣 之 製 備 幾 丁 質 經 過 高 溫 及 強 鹼 處 理 後, 會 使 得 其 結 構 上 的 乙 醯 基 (-NHCOCH 3,acetyl group) 被 脫 去, 轉 變 成 胺 基 (-NH 2,amino group), 當 去 乙 醯 度 到 達 一 定 的 程 度 之 後 ( 各 文 獻 定 義 不 同 ) 即 可 稱 為 幾 丁 聚 醣 本 實 驗 參 考 沈 (2004) 實 驗 方 法, 欲 製 備 大 於 85 % 去 乙 醯 度 之 幾 丁 聚 醣, 其 條 件 為 : 將 40-60 mesh 之 幾 丁 質 置 於 100±2 的 57%(w/v) NaOH 溶 液 中 (20 ml NaOH / g chitin) 攪 拌 130 min, 結 果 可 得 去 乙 醯 度 大 於 85 % 之 幾 丁 聚 醣 幾 丁 聚 醣 去 乙 醯 度 是 決 定 幾 丁 聚 醣 應 用 功 能 性 之 ㄧ 大 因 素, 在 藥 物 傳 遞 方 面, 由 於 高 去 乙 醯 度 幾 丁 聚 醣 溶 解 在 酸 性 溶 液 中 時, 具 有 高 度 陽 離 子 之 特 性, 可 以 提 高 對 腸 黏 膜 的 吸 附 力 以 及 可 暫 時 性 的 打 開 腸 黏 膜 上 的 緊 密 連 接 (tight junctions), 有 利 於 藥 物 營 養 物 質 等 滲 透 吸 收 (Huang et al., 2004;Lin et al., 2005) 且 在 Wu 及 Du(2003) 研 究 亦 指 出 增 加 幾 丁 聚 醣 去 乙 醯 度 愈 高 (75.5 92 %), 對 牛 血 清 白 蛋 白 (bovine serum albumin,bsa) 之 包 覆 率 愈 佳 及 可 降 低 BSA 的 釋 放 速 率 因 此 本 文 選 定 去 乙 醯 度 大 於 85 % 之 幾 丁 聚 醣 來 做 研 究 ( 二 ) 不 同 分 子 量 幾 丁 聚 醣 之 製 備 以 纖 維 酵 素 水 解 幾 丁 聚 醣 可 得 不 同 分 子 量 之 幾 丁 聚 醣, 其 優 點 為 專 一 性 高, 產 率 高, 且 反 應 效 果 佳 本 實 驗 使 用 去 乙 醯 度 大 於 85% 之 幾 丁 聚 醣 (Mw 475.5 kda) 經 不 同 濃 度 之 纖 維 酵 素 (6.9 units/mg solid) 67

(2 4 6 8 及 10 mg/g chitosan) 於 37 水 解 12 小 時 後, 可 得 出 不 同 分 子 量 之 幾 丁 聚 醣, 分 子 量 分 別 為 375.8 231.4 187.2 131.1 及 81.6 kda( 圖 十 一 ) 其 反 應 之 專 一 性 及 再 現 性 高, 可 製 出 低 分 子 量 之 幾 丁 聚 醣 水 解 物 (chitosan hydrolysates,cs) 至 81.6 kda 而 已 有 文 獻 指 出 利 用 纖 維 酵 酶 所 製 備 出 之 低 分 子 量 幾 丁 聚 醣 水 解 物 具 有 良 好 抗 菌 活 性 (Tsai et al.,2004) 抗 腫 瘤 活 性 (Qin et al., 2004) 及 免 疫 活 性 (Wu and Tsai, 2004) 等 功 效 在 藥 物 傳 遞 方 面, 幾 丁 聚 醣 分 子 量 對 於 奈 米 顆 粒 特 性 及 形 成 有 重 要 的 影 響, 包 括 調 控 顆 粒 之 粒 徑 大 小 包 覆 率 裝 載 率 釋 放 率 安 定 性 表 面 電 荷 等 Gan 及 Wang(2007) 指 出 使 用 不 同 分 子 量 幾 丁 聚 醣 在 製 備 奈 米 顆 後, 發 現 幾 丁 聚 醣 分 子 量 對 BSA 的 包 覆 率 及 其 體 外 釋 放 量 是 有 影 響 的, 分 子 量 愈 高, 包 覆 率 愈 高 另 外, 幾 丁 聚 醣 分 子 量 也 會 影 響 奈 米 顆 粒 粒 徑 及 表 面 電 位, 分 子 量 愈 高, 粒 徑 愈 大, 表 面 電 荷 愈 高 ; 分 子 量 愈 低, 溶 解 性 愈 佳, 有 助 於 奈 米 顆 粒 膠 體 在 溶 液 中 之 的 穩 定 性 (Fernández-Urrusuno et al., 1999), 且 製 備 出 之 奈 米 顆 粒 粒 徑 愈 小, 其 在 腸 胃 道 中 排 空 時 間 延 長, 可 提 高 其 與 腸 道 上 皮 細 胞 的 接 觸 機 會 或 直 接 被 細 胞 吸 收, 可 增 加 營 養 物 質 之 吸 收 與 利 用 (Chen et al., 2006b;Chau et al.,2007) 因 此 本 文 將 選 定 三 種 不 同 分 子 量 幾 丁 聚 醣 : 低 分 子 量 (LMW,131.1 kda) 中 分 子 量 (MMW,231.4 kda) 及 高 分 子 量 (HMW,475.5 kda, 即 未 水 解 ) 來 包 覆 分 離 大 豆 蛋 白 質 水 解 物 並 對 其 物 理 化 學 特 性 做 一 探 討 68

500 Chitosan molecular weight ( kda ) 400 300 200 100 0 0 2 4 6 8 10 12 Cellulase concentration (mg/g chitosan) 圖 十 一 纖 維 酵 素 濃 度 對 幾 丁 聚 醣 水 解 度 之 影 響 Figure 11. Effect of cellulase concentration on the degree of chitosan hydrolysis. 69

( 三 )10~30kDa 分 離 大 豆 蛋 白 質 水 解 物 之 區 分 大 豆 蛋 白 質 經 由 不 同 酵 素 水 解 產 生 之 水 解 物 具 有 不 同 生 理 功 能 趙 (2009) 指 出 分 離 大 豆 蛋 白 質 經 由 Neutrase 反 應 的 水 解 物, 利 用 膜 過 濾 系 統 進 行 區 分 與 濃 縮 後, 分 子 量 10~30 kda 水 解 物 具 有 顯 著 促 進 脂 肪 分 解 活 性, 為 具 有 顯 著 減 脂 功 能 的 蛋 白 質 水 解 物 本 實 驗 所 獲 得 之 分 離 大 豆 蛋 白 質 水 解 物 是 以 Neutrase 酵 素 進 行 特 定 時 間 水 解 後 所 得 之 水 解 物, 其 中 含 有 不 同 大 小 分 子 片 段 的 蛋 白 質 及 胜 肽, 而 本 實 驗 只 欲 收 集 10~30 kda 之 分 離 大 豆 蛋 白 質 水 解 物 作 蛋 白 質 水 解 物 模 型, 故 使 用 膜 反 應 系 統 將 特 定 片 段 加 以 區 隔 分 離 本 實 驗 使 用 了 兩 種 不 同 限 值 之 濾 膜 (30 kda 和 10kDa MWCO) 對 水 解 物 進 行 分 離 及 純 化, 而 後 再 以 HPLC 方 法 分 析 水 解 物 分 子 量 結 果 由 圖 十 二 所 示, 其 水 解 物 分 子 量 大 多 集 中 在 12,588 Da 附 近, 本 文 將 此 水 解 物 定 義 為 10~30 kda 分 離 大 豆 蛋 白 質 水 解 物 ( 即 大 於 10 kda 且 小 於 30 kda ) 70

圖 十 二 分 離 大 豆 蛋 白 質 水 解 物 (ISPH) 經 30 和 10kDa 濾 膜 區 分 所 得 的 濃 縮 物 分 子 量 分 布 圖 Figure 12. Molecular weight distribution of isolate soy protein hydrolysates produced from 30 and 10 kda MWCO membrane. 71

二 分 離 大 豆 蛋 白 質 水 解 物 (ISPH) 濃 度 幾 丁 聚 醣 (CS) 分 子 量 及 幾 丁 聚 醣 - 三 聚 磷 酸 鈉 (TPP) 重 量 比 對 幾 丁 聚 醣 - 分 離 大 豆 蛋 白 質 水 解 物 - 三 聚 磷 酸 鈉 (CS-ISPH -TPP) 奈 米 顆 粒 特 性 之 影 響 ( 一 )ISPH 濃 度 之 影 響 文 獻 指 出 幾 丁 聚 醣 分 子 量 愈 低, 溶 解 性 愈 佳, 不 僅 有 助 於 奈 米 顆 粒 膠 體 在 溶 液 中 之 的 穩 定 性 (Fernández-Urrusuno et al., 1999) 所 製 備 出 之 奈 米 顆 粒 粒 徑 較 小, 可 增 加 其 與 腸 道 上 皮 細 胞 的 接 觸 機 會 或 直 接 被 細 胞 吸 收, 有 利 於 營 養 物 質 之 吸 收 與 利 用 (Chen et al., 2006b;Chau et al.,2007) 因 此 本 試 驗 先 使 用 分 子 量 131.1 kda 之 幾 丁 聚 醣, 固 定 CS/TPP 重 量 比 為 6/1, 探 討 不 同 濃 度 (1 3 5 7 9 mg/ml) 之 ISPH 對 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 特 性 之 影 響 1. 包 覆 率 裝 載 率 及 產 率 之 影 響 圖 十 三 所 示, 以 低 分 子 量 幾 丁 聚 醣 (131.1 kda) 包 覆 ISPH 時, 低 濃 度 (1mg/mL) 之 ISPH 可 獲 得 較 高 之 包 覆 率 (82%), 隨 著 ISPH 濃 度 增 加 至 大 於 3mg/mL, 其 包 覆 率 均 維 持 在 50%, 推 測 此 為 低 分 子 量 幾 丁 聚 醣 在 溶 液 中 立 體 結 構 障 礙 小, 溶 液 黏 度 較 低, 且 幾 丁 聚 醣 鏈 上 游 離 之 胺 基 多, 於 ISPH 濃 度 較 低 時 可 與 ISPH 充 分 進 行 離 子 鍵 結, 並 且 有 效 地 捕 捉 ISPH 而 在 ISPH 濃 度 高 時, 其 包 覆 率 下 降 之 原 因 為 : Luangtana-ana 等 人 (2005) 指 出, 幾 丁 聚 醣 包 覆 ISPH 的 機 制 有 兩 種 : 一 是 透 過 離 子 鍵 結 方 式, 利 用 幾 丁 聚 醣 鏈 上 帶 正 電 之 胺 基 與 蛋 白 質 上 之 羧 基 (-COO - ) 進 行 鍵 結 ; 其 二 是 透 過 幾 丁 聚 醣 與 與 TPP 能 形 成 網 狀 結 構 之 特 性, 將 ISPH 以 物 理 包 覆 方 式 包 覆 在 其 結 構 中, 因 此 幾 丁 聚 醣 鏈 上 之 胺 基 扮 演 著 重 要 之 角 色, 在 探 討 包 覆 率 時 須 考 慮 到 幾 丁 聚 醣 胺 72

基 與 ISPH 鍵 結 位 多 寡 外, 還 需 考 慮 幾 丁 聚 醣 與 TPP 形 成 之 網 狀 結 構 多 寡, 因 此 可 得 知 幾 丁 聚 醣 對 ISPH 包 覆 能 力 是 有 限 的 當 幾 丁 聚 醣 與 ISPH 鍵 結 達 飽 和 或 幾 丁 聚 醣 與 TPP 形 成 之 網 狀 結 構 少, 多 餘 的 ISPH 就 會 無 法 被 鍵 結 或 包 覆 在 奈 米 顆 粒 上, 因 此 溶 液 中 被 測 得 之 ISPH 量 就 多, 包 覆 率 就 低 在 裝 載 率 方 面, 如 圖 十 三 所 示, 隨 著 ISPH 濃 度 增 加, 低 分 子 量 之 幾 丁 聚 醣 對 ISPH 裝 載 率 有 顯 著 的 增 加 趨 勢 (3~12%) 推 測 因 ISPH 濃 度 較 低 時,ISPH 被 包 覆 進 奈 米 微 粒 的 量 少, 未 達 飽 和 的 裝 載 率, 因 此 雖 有 較 高 包 覆 率, 但 實 際 被 包 入 奈 米 顆 粒 內 的 ISPH 量 是 低 的 Xu 和 Du(2003) 以 幾 丁 聚 醣 (210 kda) 與 TPP 進 行 離 子 交 聯 來 包 覆 BSA, 製 備 奈 米 顆 粒, 指 出 隨 著 BSA 濃 度 的 增 加, 幾 丁 聚 醣 對 BSA 包 覆 率 會 隨 之 下 降, 但 裝 載 率 則 是 隨 BSA 濃 度 增 加 而 增 加 Wu(2005) 以 幾 丁 聚 醣 (200 及 24 kda) 與 TPP 進 行 離 子 交 聯 來 包 覆 甘 草 酸 銨 (ammonium glycyrrhizinate), 製 備 奈 米 顆 粒, 也 指 出 隨 著 甘 草 酸 銨 濃 度 的 增 加, 幾 丁 聚 醣 對 甘 草 酸 銨 之 包 覆 率 會 隨 之 下 降, 裝 載 率 則 是 隨 著 甘 草 酸 銨 濃 度 增 加 而 增 加 在 產 率 方 面, 結 果 如 圖 十 三 所 示 隨 著 ISPH 濃 度 增 加, 低 分 子 量 之 幾 丁 聚 醣 對 產 率 並 無 明 顯 的 差 異 性 及 趨 勢 ( 平 均 為 27%), 推 測 應 是 CS TPP ISPH 三 者 鍵 結 有 一 定 比 率,CS 與 TPP 鍵 結 多, 則 對 ISPH 之 鍵 結 就 少, 反 之 CS 與 ISPH 鍵 結 多, 則 對 TPP 之 鍵 結 就 少, 故 於 產 率 上 差 異 不 大 另 外, 由 於 實 驗 所 製 備 出 之 奈 米 顆 粒 量 很 少, 且 容 易 在 實 驗 操 作 過 程 或 烘 乾 過 程 上 造 成 部 分 樣 品 損 失, 因 此 最 後 再 定 量 上 非 常 困 難, 而 後 改 善 方 法 因 採 大 量 製 備 方 式, 再 來 計 算 其 產 率, 這 樣 才 比 較 能 看 出 其 產 率 上 之 差 異 性 73

40 100 14 12 Process yield (%) 30 20 10 ISPH encapsulation (%) 80 60 40 10 8 6 Loading capacity (%) 4 0 20 0 1 3 5 7 9 2 ISPH concentration(mg/ml) 圖 十 三 ISPH 濃 度 對 包 覆 率 裝 載 率 及 產 率 之 影 響 Figure 13. Effect of ISPH concentration on the encapsulation efficiency ( ), loading capacity( )and process yield( ).(CS molecular weight:131.1kda;cs/tpp mass ratio: 6/1). 74

2. 粒 徑 大 小 之 影 響 圖 十 四 所 示,ISPH 濃 度 對 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 粒 徑 之 影 響 隨 著 ISPH 濃 度 之 增 加,CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 之 粒 徑 有 變 大 的 趨 勢, 推 測 應 是 CS-TPP 包 覆 了 更 多 ISPH 之 緣 故 Wu(2005) 指 出 使 用 分 子 量 為 200 kda 之 幾 丁 聚 醣 包 覆 甘 草 酸 銨 (ammonium glycyrrhizinate) 時, 顆 粒 粒 徑 會 隨 著 甘 草 酸 銨 濃 度 增 加 而 增 加, 但 以 24 kda 之 幾 丁 聚 醣 包 覆 甘 草 酸 銨 時, 其 顆 粒 粒 徑 增 加 不 明 顯, 其 認 為 是 由 於 低 分 子 量 之 幾 丁 聚 醣 其 有 較 高 的 溶 解 性, 因 此 有 助 於 奈 米 顆 粒 膠 體 在 溶 液 中 之 的 穩 定 性 之 故 (Fernández-Urrusuno et al., 1999) Gan 及 Wang(2007) 也 有 相 同 的 指 出, 包 覆 有 BSA 者 之 顆 粒 粒 徑 皆 大 於 未 包 覆 者 3. 表 面 電 位 之 影 響 文 獻 指 出, 幾 丁 聚 醣 上 之 正 電 荷 (NH + 3 ) 可 提 高 其 對 腸 黏 膜 的 吸 附 力 以 及 可 暫 時 性 的 打 開 腸 黏 膜 上 的 緊 密 連 接 (tight junctions) 之 能 力, 有 利 於 藥 物 營 養 物 質 等 滲 透 吸 收,(Huang et al., 2004;Lin et al., 2005) 因 此 本 文 探 討 了 ISPH 濃 度 對 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 表 面 電 位 之 影 響, 如 表 七 所 示, 隨 著 ISPH 濃 度 之 增 加,CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 之 表 面 電 位 並 無 明 顯 改 變, 顆 粒 表 面 均 帶 正 電 荷, 介 於 +42.1~ +43.7 mv 之 間 推 測 應 是 幾 丁 聚 醣 於 酸 溶 液 中, 其 結 構 上 的 NH 2 被 質 子 化 形 成 帶 正 電 的 NH 3 +, 此 時 將 幾 丁 聚 醣 溶 液 滴 入 帶 負 電 荷 的 TPP 溶 液 中, 形 成 中 和 反 應 產 生 幾 丁 聚 醣 奈 米 顆 粒, 而 在 顆 粒 表 面 上 仍 存 在 正 電 荷 及 + 未 與 TPP 離 子 形 成 交 互 作 用 之 NH 3 離 子 Gan 及 Wang(2007) 指 出 當 奈 米 顆 粒 包 覆 BSA 後, 其 表 面 電 位 只 有 輕 微 的 減 少, 其 認 為 有 此 現 象 是 因 為 幾 丁 聚 醣 鏈 上 尚 有 許 多 游 離 之 胺 基 並 未 被 BSA 佔 據, 因 此 蛋 白 質 吸 附 於 幾 丁 聚 醣 表 面 並 不 會 改 變 幾 丁 聚 醣 分 子 之 表 面 電 位 75

340 Particle size (nm) 320 300 280 B B B AB AB A 260 240 0 1 3 5 7 9 ISPH concentration(mg/ml) 圖 十 四 ISPH 濃 度 對 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 粒 徑 之 影 響 Figure 14. Effect of ISPH concentration on the particle size of CS-ISPH-TPP nanoparticles. ( CS molecular weight : 131.1kDa;CS/TPP mass ratio: 6/1). * A-B mean in the same bar ( ISPH concentration ) with different superscripts are significantly different(p < 0.05). 76

表 七 ISPH 濃 度 對 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 表 面 電 荷 之 影 響 Table 7. Effect of ISPH concentration on the zeta potential of CS-TPP-ISPH nanoparticles. ISPH concentration(mg/ml) ζpotential(mv) 0 +42.6±4.5 A 1 +42.2±1.8 A 3 +42.1±1.8 A 5 +43.7±2.0 A 7 +42.3±2.1 A 9 +43.7±1.8 A (CS molecular weight:131.1kda;cs/tpp mass ratio: 6/1). *A mean in the same column(isph concentration)with different superscripts are significantly different(p <0.05). 77

( 二 ) 幾 丁 聚 醣 分 子 量 之 影 響 由 前 實 驗 結 果 得 知 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 之 裝 載 率 及 粒 徑 會 隨 著 ISPH 濃 度 的 增 加 而 增 加, 而 包 覆 率 會 隨 著 ISPH 濃 度 的 增 加 而 下 降, 本 文 欲 獲 得 具 高 度 包 覆 率 裝 載 率 及 產 率 之 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒, 同 時 亦 欲 獲 得 小 粒 徑 之 奈 米 顆 粒, 故 本 文 認 為 當 ISPH 溶 液 濃 度 固 定 為 5mg/mL 時 可 獲 得 穩 定 之 包 覆 率 裝 載 率 及 產 率 之 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 ( 以 低 分 子 量 之 幾 丁 聚 醣 為 例, 其 包 覆 5mg/mL ISPH 時, 包 覆 率 為 52%, 裝 載 率 為 10%, 產 率 為 28%), 且 其 粒 徑 亦 可 控 制 在 奈 米 尺 寸 ( 以 低 分 子 量 之 幾 丁 聚 醣 為 例, 其 包 覆 5mg/mL ISPH 時, 可 得 顆 粒 粒 徑 大 小 為 307.63 nm) 故 本 試 驗 固 定 ISPH 溶 液 濃 度 為 5mg/mL,CS/TPP 重 量 比 為 6/1, 探 討 不 同 分 子 量 (475.5 231.5 及 131.1 kda) 之 幾 丁 聚 醣 對 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 特 性 之 影 響 1. 包 覆 率 裝 載 率 及 產 率 之 影 響 表 八 所 示, 以 不 同 分 子 量 之 幾 丁 聚 醣 來 包 覆 相 同 濃 度 之 ISPH(5 mg/ml) 對 其 包 覆 率 裝 載 率 及 產 率 之 影 響 結 果 顯 示 其 包 覆 率 裝 載 率 及 產 率 皆 無 顯 著 差 異 由 先 前 究 結 果 顯 示, 以 低 分 子 量 之 幾 丁 聚 醣 包 覆 不 同 濃 度 之 ISPH 時, 則 會 隨 ISPH 濃 度 增 加 包 覆 率 有 隨 之 降 低 之 趨 勢, 而 裝 載 率 隨 之 增 加 的 趨 勢 ( 見 圖 十 三 ), 這 顯 示 出 ISPH 之 包 覆 率 裝 載 率 主 要 是 會 受 到 ISPH 濃 度 影 響, 而 不 受 幾 丁 聚 醣 之 分 子 量 影 響 78

表 八 幾 丁 聚 醣 分 子 量 對 包 覆 率 裝 載 率 及 產 率 之 影 響 Table 8. Effect of chitosan molecular weight on the encapsulation efficiency, loading capacity and process yield. CS MW Encapsulation efficiency% Loading capacity% Process yield% 475.5 54.07±4.53 A 10.97±0.90 A 30.88±1.73 A 231.5 52.04±4.26 A 9.57±0.65 A 28.18±2.08 A 131.1 51.70±3.96 A 9.60±0.40 A 27.58±0.00 A (CS/TPP mass ratio: 6/1;ISPH concentration:5mg/ml). *A mean in the same column(chitosan MW)with different superscripts are significantly different(p < 0.05). 79

Wu(2005) 以 幾 丁 聚 醣 (200 及 24 kda) 與 TPP 進 行 離 子 交 聯 來 包 覆 甘 草 酸 銨, 製 備 奈 米 顆 粒, 指 出 高 分 子 量 之 幾 丁 聚 醣 (200 kda) 對 甘 草 酸 銨 之 包 覆 率 及 裝 載 率 皆 優 於 低 分 子 量 之 幾 丁 聚 醣 (24 kda), 其 認 為 是 由 於 幾 丁 聚 醣 分 子 量 愈 高 其 鏈 上 胺 基 愈 多, 能 與 TPP 形 成 交 聯 位 置 愈 多, 對 甘 草 酸 銨 之 捕 捉 能 力 愈 佳 之 故 而 Yang 等 人 (2009) 卻 有 不 同 之 見 解, 其 比 較 不 同 分 子 量 幾 丁 聚 醣 (550 110 及 55 kda) 對 fluorouracil(5-fu) 的 包 覆 率, 指 出 幾 丁 聚 醣 分 子 量 愈 低 對 5-FU 包 覆 效 率 愈 佳, 其 認 為 是 由 於 低 分 量 之 幾 丁 聚 醣 其 鏈 短, 具 有 更 多 的 游 離 胺 基, 因 此 能 產 生 更 多 離 子 交 聯 作 用 來 吸 附 5-FU, 因 此 包 覆 率 增 加 2. 粒 徑 之 影 響 圖 十 五 所 示, 以 不 同 分 子 量 之 幾 丁 聚 醣 製 備 CS-TPP 及 CS-ISPH -TPP 奈 米 顆 粒, 結 果 隨 著 幾 丁 聚 醣 分 子 量 增 加,CS-TPP 及 CS-ISPH- TPP 奈 米 顆 粒 之 粒 徑 隨 之 增 加, 且 包 覆 有 ISPH 者 粒 徑 皆 大 於 未 包 覆 者, 推 測 是 由 於 幾 丁 聚 醣 分 子 量 愈 大, 其 鏈 愈 長, 因 此 鏈 與 鏈 之 立 體 空 間 障 礙 大, 所 以 奈 米 顆 粒 粒 徑 就 較 大 Wu(2005) 指 出 隨 著 幾 丁 聚 醣 分 子 量 的 增 加, 其 粒 徑 有 跟 著 增 加 之 趨 勢 ; 而 比 較 200 及 24 kda 之 幾 丁 聚 醣 包 覆 不 同 濃 度 之 甘 草 酸 銨 時, 其 指 出 當 以 分 子 量 200 kda 之 幾 丁 聚 醣 包 覆 甘 草 酸 銨 時, 顆 粒 粒 徑 會 隨 著 甘 草 酸 銨 濃 度 增 加 而 增 加, 但 以 24 kda 之 幾 丁 聚 醣 包 覆 甘 草 酸 銨 時, 其 顆 粒 粒 徑 增 加 並 不 明 顯, 其 認 為 是 由 於 低 分 子 量 之 幾 丁 聚 醣 其 有 較 高 的 溶 解 性, 因 此 有 助 於 奈 米 顆 粒 膠 體 在 溶 液 中 之 的 穩 定 性 之 故 (Fernandez-Urrusuno et al., 1999) Gan 及 Wang(2007) 也 有 相 同 的 指 出, 隨 幾 丁 聚 醣 分 子 量 增 加 奈 米 顆 粒 粒 徑 有 增 加 之 趨 勢, 而 包 覆 有 BSA 者 之 顆 粒 粒 徑 皆 大 於 未 包 覆 者 80

450 400 Ab Aa Unoladed ISPH-loaded Particle size (nm) 350 300 Bb Ba Cab Ca 250 200 475.5 231.5 131.1 Chitosan molecular weight (kda) 圖 十 五 幾 丁 聚 醣 分 子 量 對 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 粒 徑 之 影 響 Figure 15. Effect of chitosan molecular weight on the particle size of CS-ISPH-TPP nanoparticles.(cs/tpp mass ratio: 6/1;ISPH concentration:5mg/ml). *A-C mean in the same bar(chitosan molecular weight)with different superscripts are significantly different(p < 0.05). * a-b mean in the same bar( Type of nanoparticle) with different superscripts are significantly different(p < 0.05). 81

3. 表 面 電 位 之 影 響 表 九 所 示, 觀 察 三 種 不 同 分 子 量 之 幾 丁 聚 醣 (475.5 231.5 及 131.1 kda) 奈 米 顆 粒 有 未 包 覆 及 包 覆 ISPH 對 顆 粒 之 表 面 電 荷 影 響, 得 知 CS-TPP 及 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 表 面 電 荷 均 為 帶 正 電, 且 包 覆 ISPH 後, 其 表 面 電 位 並 無 明 顯 改 變, 表 面 電 位 介 於 +41.9~+44.2 mv 之 間, 是 為 幾 丁 聚 醣 鏈 上 尚 有 許 多 游 離 之 胺 基 並 未 被 ISPH 鍵 結 之 故 Wu (2005) 指 出 隨 著 幾 丁 聚 醣 分 子 量 的 增 加, 顆 粒 表 面 電 位 差 異 不 大, 且 其 表 面 電 位 亦 介 於 +45 mv 左 右 ( 三 )CS/TPP 重 量 比 之 影 響 Liu 與 Gao(2009) 研 究 指 出 以 不 同 濃 度 (1~4 mg/ml) 之 幾 丁 聚 醣 (Mw 650 kda) 對 不 同 濃 度 (0.25~2.5 mg/ml) 之 TPP 製 備 CS-TPP 奈 米 顆 粒 時, 當 幾 丁 聚 醣 濃 度 為 2mg/mL,TPP 濃 度 為 2.5 mg/ml 時 ( 即 本 實 驗 條 件 CS/TPP 重 量 為 2/1), 所 製 備 出 之 CS-TPP 奈 米 顆 粒 會 產 生 絮 集 現 象, 為 了 避 免 此 現 象 發 生, 故 本 試 驗 僅 使 用 低 分 子 量 幾 丁 聚 醣 (Mw 131.1 kda) 來 做 試 驗 本 試 驗 使 用 5mL 相 同 濃 度 (2 mg/ml) 之 低 分 子 量 CS 溶 液 (Mw 131.1 kda) 對 2mL 不 同 濃 度 (0.84~2.5 mg/ml) 之 TPP 溶 液 製 備 CS-TPP 奈 米 顆 粒, 並 包 覆 1mL 相 同 濃 度 (5mg/mL) 之 ISPH 溶 液, 探 討 不 同 CS/TPP 重 量 比 (6/1 5/1 4/1 3/1 及 2/1) 對 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 特 性 之 影 響 1. 包 覆 率 裝 載 率 及 產 率 之 影 響 82

表 九 幾 丁 聚 醣 分 子 量 對 CS-TPP 及 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 表 面 電 位 之 影 響 Table 9. Effect of chitosan molecular weight on the zeta potential of CS-TPP and CS-ISPH-TPP nanoparticles. Type of nanoparticle CS MW(kDa) Unloaded ISPH-loaded ζpotential(mv) 475.5 +42.3±2.4 Aa +44.2±3.3 Aa 231.5 +41.9±0.9 Aa +42.4±3.2 Aa 131.1 +42.6±4.5 Aa +43.7±2.0 Aa (CS/TPP mass ratio: 6/1;ISPH concentration:5mg/ml). *A mean in the same column (CS MW) with different superscripts are significantly different(p < 0.05). *a mean in the same column (type of nanoparticle) with different superscripts are significantly different(p < 0.05). 83

如 表 十 所 示, 利 用 低 分 子 量 之 幾 丁 聚 醣 (131.1 kda) 來 製 備 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒, 發 現 以 CS/TPP 重 量 比 為 3/1 及 4/1 可 獲 得 較 高 之 包 覆 率, 分 別 為 64.61% 及 64.93%, 此 為 較 低 之 CS/TPP 重 量 比 ( 即 TPP 含 量 較 多 ), 幾 丁 聚 醣 其 結 構 上 的 胺 基 與 TPP 產 生 離 子 交 聯 程 度 及 機 會 增 加, 因 此 能 形 成 較 多 的 網 狀 結 構 來 包 覆 ISPH, 使 包 覆 率 提 升 ; 而 CS/TPP 重 量 比 為 5/1 及 6/1 時 幾 丁 聚 醣 與 TPP 之 離 子 反 應 結 合 不 如 CS/TPP 重 量 比 3/1 及 4/1 緊 密, 對 ISPH 捕 捉 能 力 有 限, 故 包 覆 率 明 顯 低 於 CS/TPP 重 量 比 為 3/1 及 4/1 組 別 ; 而 CS/TPP 重 量 比 為 2/1 時, 其 包 覆 率 亦 明 顯 低 於 CS/TPP 重 量 比 為 3/1 及 4/1 之 組 別, 此 為 過 多 之 + TPP 會 使 得 幾 丁 聚 醣 的 胺 基 傾 向 TPP 鍵 結, 一 方 面 NH 3 量 減 少, 一 方 面 形 成 更 緊 密 之 CS-TPP 鍵 結, 使 得 奈 米 顆 粒 對 ISPH 容 納 量 減 少, 因 此 造 成 ISPH 包 覆 率 下 降 在 裝 載 率 方 面, 如 表 十 所 示, 發 現 CS/TPP 重 量 比 愈 低 (6/1~2/1) 其 裝 載 率 愈 低 (9.60%~3.22%), 當 CS/TPP 重 量 比 為 2/1 時, 其 裝 載 率 只 有 3.22%, 此 由 於 CS/TPP 重 量 比 的 減 少 ( 即 TPP 含 量 增 加 ), 會 使 + 得 幾 丁 聚 醣 的 胺 基 傾 向 TPP 鍵 結, 一 方 面 NH 3 量 減 少, 一 方 面 形 成 更 緊 密 之 CS-TPP 鍵 結, 使 得 奈 米 顆 粒 對 ISPH 容 納 量 減 少,ISPH 被 包 覆 進 奈 米 顆 粒 的 量 少, 裝 載 率 就 低 在 產 率 方 面, 如 表 十 所 示, 發 現 CS/TPP 重 量 比 愈 低 ( 即 TPP 含 量 較 多 ) 其 產 率 愈 高,CS/TPP 重 量 比 為 2/1 時, 其 產 率 可 達 46%, 這 是 因 為 TPP 含 量 愈 多, 其 與 幾 丁 聚 醣 產 生 交 聯 之 機 會 愈 多, 所 形 成 的 CS-TPP 及 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 量 就 愈 多 Grenha 等 人 (2005) 比 較 CS/TPP 重 量 比 6/1~3.6/1 對 產 率 之 影 響,CS/TPP 重 量 比 愈 低, 幾 丁 聚 醣 與 TPP 鍵 結 愈 多, 其 產 率 愈 高 (12~60%), 此 結 果 與 本 研 究 相 似 84

表 十 CS/TPP 重 量 比 對 包 覆 率 裝 載 率 及 產 率 之 影 響 Table 10. Effect of CS/TPP mass ratio on the encapsulation efficiency, loading capacity and process yield. CS/TPP mass ratio Encapsulation efficiency% Loading capacity% Process yield% 2/1 49.49±2.14 B 3.22±0.06 C 46.00±2.00 A 3/1 64.61±3.26 A 5.60±0.45 B 37.26±3.19 B 4/1 64.93±2.01 A 6.00±0.18 B 36.76±1.75 B 5/1 51.52±2.14 B 5.57±0.13 B 31.85±0.47 C 6/1 51.70±3.96 B 9.60±0.40 A 27.58±0.00 D (CS molecular weight:131.1kda ;ISPH concentration:5mg/ml). *A-D mean in the same column(cs/tpp mass ratio)with different superscripts are significantly different(p < 0.05). 85

2. 粒 徑 之 影 響 如 圖 十 六 所 示, 奈 米 顆 粒 之 粒 徑 會 受 到 CS/TPP 重 量 比 影 響 而 改 變, 當 幾 丁 聚 醣 分 子 量 固 定 為 131.1kDa,CS/TPP 重 量 比 由 6/1 減 少 至 4/1 時, 顆 粒 粒 徑 會 隨 之 增 加, 推 測 此 為 TPP 含 量 增 加, 幾 丁 聚 醣 的 胺 基 與 TPP 產 生 鍵 結 機 會 變 多, 能 形 成 更 多 的 網 狀 結 構, 因 此 粒 徑 隨 之 增 加 ; 而 當 CS/TPP 之 重 量 比 由 4/1 減 少 至 2/1 時, 其 粒 徑 則 呈 現 變 小 的 趨 勢, 是 由 於 TPP 含 量 增 加 幾 丁 聚 醣 鏈 上 的 胺 基 幾 乎 都 鍵 結 上 TPP, 因 此 幾 丁 聚 醣 鏈 與 鏈 之 間 的 斥 力 減 低, 立 體 空 間 障 礙 便 少, 因 此 粒 徑 變 小 另 外, 有 包 覆 ISPH 組 別 之 粒 徑 皆 大 於 未 包 覆 組 別, 此 為 ISPH 被 鍵 結 或 包 覆 進 幾 丁 聚 醣 -TPP 奈 米 顆 粒 中 之 故 Grenha 等 人 (2005) 指 出 當 CS/TPP 重 量 比 由 3.6/1 增 加 至 6/1 製 備 奈 米 顆 粒 時, 其 粒 徑 隨 之 增 加 (300~390 nm), 其 認 為 是 由 於 幾 丁 聚 醣 與 TPP 之 間 鍵 結 增 加 之 故 ; 而 其 以 CS/TPP 重 量 比 6/1 及 5/1 來 包 覆 有 胰 島 素 時, 包 覆 有 胰 島 素 組 別 之 粒 徑 皆 大 於 未 包 覆 組 別, 是 由 於 胰 島 素 被 包 覆 到 其 結 構 中 所 致 Gan(2005) 使 用 三 種 不 同 分 子 量 之 幾 丁 聚 醣 對 不 同 比 例 之 TPP 製 備 奈 米 顆 粒 (CS/TPP 重 量 比 為 3/1~7/1), 其 指 出 奈 米 顆 粒 粒 徑 會 隨 著 幾 丁 聚 醣 分 子 量 增 加 及 CS/TPP 重 量 提 高 而 跟 著 增 加 (100~250 nm) Liu 與 Gao(2008) 指 出 提 高 濃 度 之 TPP 製 備 奈 米 顆 粒 時 可 得 到 較 小 之 粒 徑 ( 約 210 nm), 包 覆 有 ciprofloxacin (CH) 組 別 之 粒 徑 皆 大 於 未 包 覆 組 別 本 文 結 果 與 文 獻 之 結 果 略 有 差 異, 本 文 認 為 當 TPP 含 量 增 加 會 使 幾 丁 聚 醣 之 網 狀 結 構 變 多, 同 時 導 致 顆 粒 粒 徑 增 加, 故 在 增 加 CS/TPP 重 量 比 (5/1 及 6/1) 亦 有 可 能 使 顆 粒 粒 徑 變 小 86

Particle size(nm) 360 340 320 300 280 260 Db Ea Bb Ba Ab Aa Ba Ca Unloaded ISPH-loaded Cb Da 240 220 200 2:1 3:1 4:1 5:1 6:1 CS/TPP mass ratio 圖 十 六 CS/TPP 重 量 比 對 CS-TPP 及 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 粒 徑 之 影 響 Figure 16. Effect of CS/TPP mass ratio on the particle size of CS-TPP and CS-ISPH-TPP nanoparticles. ( CS molecular weight : 131.1kDa;ISPH concentration:5mg/ml). * A-E mean in the same bar ( CS/TPP mass ratio ) with different superscripts are significantly different(p < 0.05). * a-b mean in the same bar ( type of nanoparticle ) with different superscripts are significantly different(p < 0.05). 87

3. 表 面 電 位 之 影 響 如 表 十 一 所 示, 不 同 CS/TPP 重 量 比 對 未 包 覆 及 有 包 覆 ISPH 奈 米 顆 粒 之 表 面 電 位 的 影 響, 當 CS/TPP 重 量 比 由 6/1 減 少 至 3/1 時, 其 表 面 電 位 雖 有 些 許 差 異, 但 顆 粒 表 面 皆 帶 有 高 度 之 正 電 荷 ( 未 包 覆 42.6~46.7 mv; 有 包 覆 43.7~47.6 mv) 研 究 發 現, 當 CS/TPP 重 量 比 減 少 至 2/1 時, 未 包 覆 及 有 包 覆 ISPH 組 別 其 顆 粒 表 面 電 位 均 出 現 驟 降 之 情 形 ( 未 包 覆 組 : 由 46.7 mv 減 至 26.6 mv; 包 覆 ISPH 組 別 : 由 +47.6 mv 減 至 +24.0 mv), 此 由 於 CS/TPP 重 量 比 減 少 至 2/1 時,TPP 含 量 大 幅 增 加, 因 此 TPP 易 與 幾 丁 聚 醣 鏈 上 的 胺 基 產 生 鍵 結, 使 得 幾 丁 聚 + 醣 之 NH 3 部 位 變 少, 表 面 電 位 降 低 許 多 文 獻 皆 指 出 CS-TPP 奈 米 顆 粒 之 表 面 電 位 會 受 到 TPP 的 濃 度 及 包 覆 物 質 濃 度 等 因 素 影 響 而 降 低 Grenha 等 人 (2005) 指 出 當 CS/TPP 重 量 比 由 6/1 減 低 至 3.6/1 製 備 奈 米 顆 粒 時, 其 表 面 電 位 會 由 +45 mv 減 至 +34 mv; 當 CS-TPP 奈 米 顆 粒 包 覆 胰 島 素 後 其 表 面 電 位 跟 著 會 降 低, 其 表 面 電 位 亦 會 降 低 Gan(2005) 指 出 當 CS/TPP 重 量 比 由 7/1 減 至 3/1 時, 其 表 面 電 位 跟 著 遞 減 ( 約 +45 mv 減 至 +30 mv) Liu 與 Gao(2009) 亦 指 出 隨 著 TPP 濃 度 的 增 加 (0.75~1.75 mg/ml), 其 奈 米 顆 粒 表 面 電 位 皆 有 有 隨 之 下 降 之 趨 勢 ( 約 +45 mv 減 至 +32 mv) 許 多 文 獻 指 出 因 幾 丁 聚 醣 具 有 高 度 正 電 荷, 故 其 擁 有 良 好 黏 膜 黏 著 性 (mucoadhesive)(lehr et al., 1992; Needleman and Smales,1995; Rillosi and Buckton, 1995; He et al., 1998;Shimoda et al., 2001; Kockisch et al., 2003);Dodane 等 人 (1999) 也 指 出 幾 丁 聚 醣 具 有 調 控 腸 道 上 皮 細 胞 之 緊 密 連 接 (tight junction) 開 合 是 因 為 幾 丁 聚 醣 帶 有 正 電 荷, 但 本 實 驗 發 現 當 CS/TPP 重 量 比 減 少 至 2/1 時, 未 包 覆 及 有 包 覆 組 別 之 顆 88

粒 表 面 電 位 均 會 出 現 驟 降 之 情 形, 恐 影 響 幾 丁 聚 醣 之 生 物 特 性 ( 如 生 物 黏 著 性 ) 及 其 對 腸 道 上 皮 細 胞 之 緊 密 連 接 調 控 之 能 力, 故 本 文 認 為 在 製 備 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 時 CS/TPP 重 量 不 宜 低 於 3/1 89

表 十 一 CS/TPP 重 量 比 對 CS-TPP 及 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 表 面 電 位 之 影 響 Table 11. Zeta potential of CS-TPP and CS-ISPH-TPP nanoparticles prepared with different CS/TPP mass ratio. Type of nanoparticle CS/TPP mass ratio Unloaded ζpotential(mv) ISPH-loaded 2/1 +26.6±2.3 Cb +24.0±1.4 Da 3/1 +44.3±1.3 ABa +44.8±1.6 BCa 4/1 +46.7±1.4 Aa +47.6±1.4 Aa 5/1 +44.6±1.4 ABb +46.4±2.0 ABa 6/1 +42.6±4.5 Ba +43.7±2.0 Ca (CS molecular weight:131.1kda ;ISPH concentration:5mg/ml). *A-D mean in the same column(cs/tpp mass ratio)with different superscripts are significantly different(p < 0.05). *a-b mean in the same column(type of nanoparticle)with different superscripts are significantly different(p < 0.05). 90

三 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 於 胃 腸 液 中 之 安 定 性 之 影 響 因 子 Berger (2004) 所 指 出, 當 幾 丁 聚 醣 在 中 性 環 境 ( 其 ph~=6.0) + 時, 其 利 用 帶 正 電 荷 NH 3 與 帶 負 電 之 加 入 物 質 ( 如 TPP 之 P0 4 -) 產 生 良 好 的 離 子 交 聯 鍵 結 (crosslinking), 使 其 聯 結 構 造 緊 密 且 完 整 當 降 低 環 境 之 ph 值 ( 酸 性 下 ), 幾 丁 聚 醣 上 更 多 的 NH 2 被 質 子 化 變 為 NH 3 +, 形 成 高 度 帶 正 電 之 分 子 鏈, 使 幾 丁 聚 醣 鏈 與 鏈 之 間 產 生 排 斥 作 用, 而 不 利 於 帶 負 電 之 物 質 將 幾 丁 聚 醣 鏈 進 行 聯 結 作 用, 如 此, 其 聯 結 構 造 會 鬆 散 當 環 境 ph 值 偏 鹼 性 (ph>7) 時, 幾 丁 聚 醣 之 NH 3 + 變 為 NH 2 (pka~6.3), 而 降 低 與 帶 負 電 荷 物 質 作 用, 亦 其 聯 結 構 造 鬆 散 如 此, 於 酸 性 或 鹼 性 下 均 造 成 幾 丁 聚 醣 間 之 聯 結 作 用 不 穩 固 而 影 響 其 包 覆 作 用 ( 見 圖 十 七 ) 另 外,Zhang 與 Kosaraju(2007) 指 出 當 環 境 中 ph 太 高 或 太 低, 都 會 造 成 幾 丁 聚 醣 與 TPP 之 間 離 子 交 聯 鍵 結 特 性 改 變, 導 致 奈 米 顆 粒 奈 米 顆 粒 不 安 定 或 瓦 解, 因 此 本 文 分 別 探 討 了 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 在 模 擬 胃 液 (ph 1.2) 及 腸 液 (ph7.4) 下 之 安 定 性 ( 一 )CS/TPP 重 量 比 之 影 響 本 試 驗 使 用 低 分 子 量 幾 丁 聚 醣 (Mw 131.1 kda), 固 定 ISPH 濃 度 為 5mg/mL, 探 討 不 同 CS/TPP 重 量 比 (6/1 5/1 4/1 3/1 及 2/1) 對 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 安 定 性 之 影 響 於 試 驗 中,ISPH 若 能 被 穩 定 的 包 覆 在 奈 米 顆 粒 中, 其 於 胃 腸 液 中 之 時 間 累 積 釋 放 量 (Cumulative release,cr) 愈 低, 則 表 示 其 安 定 性 愈 佳 1. 模 擬 胃 液 中 (ph 1.2) 之 安 定 性 91

圖 十 七 不 同 ph 值 下 幾 丁 聚 醣 與 帶 負 電 聚 合 物 之 鍵 結 及 澎 潤 情 形 Figure 17. Structure and ph-sensitive swelling of a polyelectrolyte complex containing chitosan;, negative charge of the additional polymer; +, positive charge of chitosan;. (Berger et al., 2004) 92

如 圖 十 八 a,cs-isph-tpp 奈 米 顆 粒 置 於 ph 1.2 緩 衝 溶 液 下 2 小 時, 測 定 時 間 累 積 ISPH 之 釋 放 率 發 現 當 幾 丁 聚 醣 分 子 量 固 定,CS/TPP 重 量 比 由 6/1 減 少 至 2/1 時, 時 間 累 積 ISPH 之 釋 放 率 隨 之 降 低, 表 示 從 顆 粒 中 釋 放 出 ISPH 減 少, 奈 米 顆 粒 之 安 定 性 增 加 此 由 於 CS/TPP 重 量 比 減 少 (TPP 含 量 增 加 ) 時, 幾 丁 聚 醣 之 胺 基 (NH 3+ ) 與 TPP 之 - P0 4 結 合 良 好, 所 形 成 的 網 狀 鍵 結 更 緊 密, 使 得 ISPH 不 易 被 釋 放 2. 模 擬 腸 液 中 (ph 7.4) 之 安 定 性 如 圖 十 八 b,cs-isph-tpp 奈 米 顆 粒 置 於 ph 7.4 緩 衝 溶 液 下 6 小 時 內, 測 試 其 時 間 累 積 釋 放 率 發 現 時 間 累 積 ISPH 之 釋 放 率 與 在 酸 性 環 境 下 有 相 似 情 形 當 幾 丁 聚 醣 分 子 量 固 定,CS/TPP 重 量 比 由 6/1 減 少 至 2/1 時, 其 奈 米 顆 粒 之 ISPH 釋 放 率 隨 之 減 少, 表 示 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 之 安 定 性 增 加, 此 原 因 與 上 述 相 同 Carmen(1997) 以 幾 丁 聚 醣 -TPP 製 備 薄 膜, 包 覆 cholrpheniramine maleate 和 guaifenesin 時, 指 出 增 加 TPP 濃 度 可 有 效 降 低 藥 物 釋 放 量 Ko 等 人 (2002) 亦 指 出 當 提 升 TPP 濃 度 可 有 較 降 低 felodipine 釋 放 量 由 本 實 驗 結 果 得 知,CS/TPP 重 量 比 為 2/1 時,CS -ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 具 極 佳 的 安 定 性, 於 ph 1.2 下 2 小 時 及 ph 7.4 下 6 小 時,ISPH 之 時 間 累 積 釋 放 率 分 別 為 35% 及 17% 但 此 CS/TPP 重 量 比 會 造 成 顆 粒 之 表 面 電 位 呈 現 驟 降 之 情 況 ( 表 十 ), 而 影 響 其 奈 米 顆 粒 在 腸 內 之 吸 收 許 多 文 獻 (Lehr et al., 1992; Needleman and Smales,1995; Rillosi and Buckton, 1995; He et al., 1998; Dodane et al., 1999;Shimoda et al., 2001; Kockisch et al., 2003) 指 出 幾 丁 聚 醣 奈 米 顆 粒 表 面 之 正 電 荷 較 多 時, 有 利 於 顆 粒 與 帶 負 電 之 腸 道 上 皮 細 胞 膜 做 結 合, 可 增 加 顆 粒 在 腸 道 之 滯 留 時 間, 增 加 物 質 之 吸 收, 亦 有 利 於 打 開 腸 膜 上 皮 細 胞 之 緊 密 連 接, 93

(a)in the ph 1.2 buffer Cumulative release ( CR,%) 70 60 50 40 30 2:1 3:1 4:1 5:1 6:1 20 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 Time (hr) (b)in the ph 7.4 buffer 80 2:1 3:1 4:1 5:1 6:1 Cumulative release ( CR,%) 60 40 20 0 0 1 2 3 4 5 6 Time (hours) 圖 十 八 CS/TPP 重 量 比 對 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 在 模 擬 胃 液 中 (ph 1.2 buffer)(a) 及 模 擬 腸 液 中 (ph 7.4 buffer)(b) 之 安 定 性 影 響 Figure 18. Effect of CS/TPP mass ratio on the stability of CS-ISPH-TPP nanoparticles in the ph 1.2 buffer(a)and ph 7.4 buffer(b). ( CS molecular weight 131.1kDa ; ISPH concentration : 5mg/mL). 94

讓 物 質 易 進 入 血 液 內 ( 二 ) 幾 丁 聚 醣 分 子 量 之 影 響 依 前 述 結 果, 後 續 實 驗 將 選 擇 CS/TPP 重 量 比 3/1 作 為 最 佳 比 例, 因 此 本 實 驗 固 定 ISPH 濃 度 為 5mg/mL,CS/TPP 重 量 比 為 3/1, 探 討 不 同 分 子 量 (475.5 231.5 及 131.1 kda) 之 幾 丁 聚 醣 對 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 於 模 擬 胃 液 (ph 1.2) 及 腸 液 (ph7.4) 中 安 定 性 之 影 響 1. 模 擬 胃 液 中 (ph 1.2) 之 安 定 性 如 圖 十 九 a 所 示, 不 同 分 子 量 之 幾 丁 聚 醣 對 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 於 模 擬 胃 液 (ph 1.2) 在 2 小 時 內 安 定 性 之 影 響 幾 丁 聚 醣 之 分 子 量 為 475.5 231.5 及 131.1 kda, 其 時 間 累 積 之 ISPH 釋 放 率 分 別 為 30 36 及 40% 此 表 示 隨 著 CS 分 子 量 之 增 加, 奈 米 顆 粒 更 為 安 定 此 應 由 於 低 分 子 量 之 幾 丁 聚 醣 在 溶 液 中 溶 解 性 較 高, 其 溶 液 黏 度 較 低, 且 鏈 子 短, 鏈 子 間 之 排 斥 力 較 大 使 其 聯 結 構 造 (CS-TPP) 較 不 穩 固, 釋 放 ISPH 較 多 ; 而 高 分 子 量 者 之 鏈 子 較 長, 其 溶 液 黏 度 亦 較 高, 因 而 鏈 子 間 排 斥 力 有 某 程 度 受 阻, 使 其 聯 結 構 造 較 安 定 2. 模 擬 腸 液 中 (ph 7.4) 之 安 定 性 如 圖 十 九 b 所 示, 不 同 分 子 量 之 幾 丁 聚 醣 對 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 於 模 擬 腸 液 (ph 7.4) 在 6 小 時 內 安 定 性 之 情 形 結 果 與 上 述 有 類 似 之 情 形, 及 CS 分 子 量 較 高, 其 奈 米 顆 粒 安 定 性 較 佳 幾 丁 聚 醣 之 分 子 量 為 475.5 231.5 及 131.1 kda, 在 6 小 時, 時 間 累 積 之 ISPH 釋 放 率 分 別 為 39 42 及 45% 此 由 於 高 分 子 量 幾 丁 聚 醣 之 鏈 子 較 長, 其 溶 液 較 黏, 有 助 於 包 覆 ISPH 作 用 之 關 係 Xu 和 Du(2003) 指 出 幾 丁 聚 醣 分 子 量 增 加 95

(80~210 kda),bsa 在 ph 7.4 之 phosphate buffer saline(pbs) 釋 放 率 由 73.9 減 至 17.6%, 分 子 量 高 釋 放 速 率 愈 低 Gan 及 Wang(2007) 比 較 三 種 不 同 分 子 量 幾 丁 聚 醣 (HMW MMW 及 LMW) 包 覆 BSA 後, 置 於 ph 7.4 之 PBS 中 6 小 時, 其 指 出 BSA 之 釋 放 會 隨 著 CS 分 子 量 的 增 加 而 降 低 ;Yang 等 人 (2009) 以 不 同 分 子 量 幾 丁 聚 醣 (550 110 及 55 kda) 來 包 覆 fluorouracil(5-fu), 其 也 有 相 同 的 指 出,5-FU 之 釋 放 會 隨 著 CS 分 子 量 的 增 加 而 降 低 96

(a)in the ph 1.2 buffer 45 Cumulative release ( CR,%) 40 35 30 25 HMW(475.5 kda) MMW(231.5 kda) LMW(131.1 kda) 20 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 Time (hours) (b)in the ph 7.4 buffer 50 45 Cumulative release ( CR,%) 40 35 30 25 HMW(475.5 kda) MMW(231.5 kda) LMW(131.1 kda) 20 0 1 2 3 4 5 6 Time (hours) 圖 十 九 幾 丁 聚 醣 分 子 量 對 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 在 模 擬 胃 液 中 (ph 1.2 buffer)(a) 及 模 擬 腸 液 中 (ph 7.4 buffer)(b) 之 安 定 性 影 響 Figure 19. Effect of chitosan molecular weight on the stability of CS-ISPH-TPP nanoparticles in the ph 1.2 buffer(a)and ph 7.4 buffer(b).(cs/tpp mass ratio: 3/1;ISPH concentration: 5mg/mL). 97

四 於 胃 腸 液 最 為 安 定 之 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 之 製 備 及 其 特 性 依 前 述 研 究 結 果 顯 示, 以 高 分 子 量 之 幾 丁 聚 醣 製 備 之 CS-ISPH -TPP 奈 米 顆 粒 安 定 性 最 佳, 因 此 本 試 驗 以 分 子 量 為 475.5 kda 之 幾 丁 聚 醣,ISPH 濃 度 5mg/,mL 及 CS/TPP 重 量 比 為 3/1 來 製 備 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 後, 分 析 其 對 ISPH 之 包 覆 率 裝 載 率 及 產 率 粒 徑 大 小 及 表 面 電 位 ( 一 ) 包 覆 率 裝 載 率 及 產 率 之 分 析 當 固 定 幾 丁 聚 醣 三 聚 磷 酸 鈉 重 量 比 為 3/1 時, 高 分 子 量 之 幾 丁 聚 醣 對 ISPH 包 覆 率 約 為 69%, 裝 載 率 約 為 5%,CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 產 率 約 為 43%( 表 十 二 ) 幾 丁 聚 醣 分 子 量 愈 高 其 鏈 上 胺 基 愈 多, 能 與 TPP 形 成 交 聯 位 置 愈 多, 對 ISPH 有 良 好 之 捕 捉 能 力 ( 二 ) 粒 徑 分 析 固 定 CS/TPP 重 量 比 為 3/1 時, 以 高 分 子 量 之 幾 丁 聚 醣 製 備 CS-TPP 及 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒, 利 用 粒 徑 分 析 儀 (Zetasizer 3000HS) 測 定 奈 米 顆 粒 在 水 相 中 之 粒 徑 大 小, 其 粒 徑 分 別 為 402 及 446 nm, 包 覆 有 ISPH 組 別 之 粒 徑 顯 著 大 於 未 包 覆 組 別 ( 表 十 三 ), 此 結 果 皆 與 前 述 相 同, 幾 丁 聚 醣 分 子 量 愈 大, 其 鏈 愈 長, 因 此 鏈 與 鏈 之 立 體 空 間 障 礙 大, 所 以 奈 米 顆 粒 粒 徑 就 較 大 ; 而 ISPH 被 鍵 結 或 包 覆 進 CS-TPP 奈 米 顆 粒 時 會 導 致 顆 粒 粒 徑 增 加 98

表 十 二 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 之 包 覆 率 裝 載 率 及 產 率 分 析 Table 12. The encapsulation efficiency, loading capacity and process yield of CS-ISPH-TPP nanoparticles. CS MW(kDa) Encapsulation efficiency % Loading capacity % Process yield% 475.5 69.05±1.27 5.33±0.41 42.89±2.58 (CS molecular weight: 475.5kDa;CS/TPP mass ratio: 3/1;ISPH concentration:5mg/ml). 99

( 三 ) 表 面 電 位 固 定 幾 丁 聚 醣 三 聚 磷 酸 鈉 重 量 比 為 3/1 時, 以 高 分 子 量 之 幾 丁 聚 醣 製 備 之 CS-TPP 及 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 表 面 均 為 帶 正 電, 而 包 覆 ISPH 組 別 其 表 面 電 荷 比 未 包 覆 者 低 ( 表 十 三 ), 推 測 可 能 是 幾 丁 聚 醣 分 子 量 愈 高 能 與 TPP 形 成 之 鍵 結 愈 多 也 可 容 納 較 多 之 ISPH, 因 此 表 面 電 位 較 低 ( 四 ) 以 SDS-PAGE 評 估 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 經 過 模 擬 胃 腸 道 消 化 試 驗 後 ISPH 分 子 量 之 變 化 將 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 分 別 經 由 三 種 處 理 :1) 放 入 蒸 餾 水 ; 2) 放 入 ph 2.0 緩 衝 溶 液, 於 37 下 震 盪 4 小 時 ;3) 將 顆 粒 經 ph 2.0 緩 衝 溶 液 處 理 4 小 時 後, 再 調 整 溶 液 之 ph 至 7.0, 於 37 下 再 震 盪 4 小 時 處 理 後 離 心 (10,000 g,10min), 取 其 上 層 液 與 沉 澱 奈 米 顆 粒 以 SDS-PAGE ( sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) 鑑 定 ISPH 之 存 在, 以 確 定 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 之 安 定 性 圖 二 十 顯 示, 以 SDS-PAGE 分 析 ISPH 之 分 子 量 ( 溶 於 蒸 餾 水 ), 得 知 ISPH 平 均 分 子 量 分 布 在 10~ 32kDa 左 右 (A 及 a) CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 於 蒸 餾 水, 其 上 層 液 未 出 現 ISPH bend(b), 但 奈 米 顆 粒 中 ( 沉 澱 物 ) 有 出 現 ISPH bend(b), 這 表 示 ISPH 被 穩 固 地 包 覆 在 奈 米 顆 粒 中, 無 法 釋 放 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 於 ph 2.0 緩 衝 溶 液 處 理 4 小 時 後, 其 上 層 液 出 現 較 小 片 段 之 ISPH bend(c), 這 表 示 由 奈 米 顆 粒 游 離 出 之 少 量 ISPH 因 受 到 酸 性 ph 影 響 而 降 解 ; 但 奈 米 顆 粒 中 仍 有 ISPH bend(c), 此 表 示 存 在 奈 米 顆 粒 中 之 ISPH 可 被 幾 丁 聚 醣 保 護 不 被 降 解 另 外,CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 於 ph 2.0 處 理 4 小 100

表 十 三 CS-TPP 及 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 之 粒 徑 及 表 面 電 位 分 析 Table 13. The particle size and zeta potential of CS-TPP and CS-ISPH-TPP nanoparticles. Type of nanoparticle Particle size(nm) Zeta potential(mv) Unloaded 402.25±6.33 B +43.2±2.2 A ISPH-loaded 445.80±9.81 A +39.8±0.7 B (CS molecular weight: 475.5kDa;CS/TPP mass ratio: 3/1;ISPH concentration:5mg/ml). *A-B mean in the same column (Type of nanoparticle) with different superscripts are significantly different(p < 0.05). 101

M:Protein markers A,a:ISPH in water B,b:CS-ISPH-TPP in water C,c:CS-ISPH-TPP in ph2.0 buffer for 4hr D,d:CS-ISPH-TPP in ph2.0 for 4hr and followed in ph7.0 buffer for 4hr 圖 二 十 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 於 模 擬 過 胃 腸 液 中 之 SDS-PAGE 電 泳 圖 Figure 20. SDS-PAGE profile of the stability of CS-ISPH-TPP nanoparticles in the ph 2.0 buffer and follow ph 7.0 buffer. (CS molecular weight:475.5kda ;ISPH concentration: 5mg/mL;CS/TPP mass ratio: 3/1). 102

時 後 繼 續 於 ph 7.0 處 理 4 小 時 後, 其 上 層 液 一 樣 出 現 較 小 片 段 之 ISPH bend(d), 而 奈 米 顆 粒 中 仍 有 ISPH bend(d), 這 表 示 由 奈 米 顆 粒 中 游 離 出 之 ISPH 會 受 到 酸 性 及 鹼 性 ph 影 響 而 降 解, 而 存 在 奈 米 顆 粒 中 之 ISPH 可 被 幾 丁 聚 醣 保 護 不 被 降 解 以 上 結 果 顯 示 以 CS Mw 475.5kDa,CS/TPP 重 量 比 3/1 及 ISPH 濃 度 5mg/mL 下 製 備 之 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 確 實 可 保 護 ISPH 不 受 環 境 ph 影 響, 維 持 其 安 定 性, 與 前 述 相 符 103

五 掃 描 式 電 子 顯 微 鏡 (SEM) 觀 察 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 外 觀 型 態 如 圖 二 十 一 為 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 之 SEM 圖 在 SEM 圖 中 可 見 奈 米 顆 粒 之 粒 徑 均 小 於 100 nm, 並 且 顆 粒 呈 現 球 型 此 結 果 與 以 粒 徑 分 析 儀 (Zetasizer 3000 HS) 所 測 定 出 之 奈 米 顆 粒 粒 徑 還 要 小, 原 因 是 該 樣 品 有 經 乾 燥 再 以 SEM 照 相 所 致 文 獻 指 出 外 型 成 球 型 之 物 質 通 透 細 胞 膜 較 容 易 且 速 度 較 快 ( 陳,2004), 而 幾 丁 聚 醣 分 子 量 愈 低, 製 備 出 之 奈 米 顆 粒 粒 徑 愈 小, 其 在 腸 胃 道 中 排 空 時 間 延 長, 可 提 高 其 與 腸 道 上 皮 細 胞 的 接 觸 機 會 或 直 接 被 細 胞 吸 收, 因 此 可 增 加 營 養 物 質 之 吸 收 與 利 用, 提 升 營 養 物 質 生 體 利 用 率 (Chen et al., 2006b; Chau et al.,2007) Acosta(2009) 也 指 出 利 用 奈 米 顆 粒 來 傳 遞 營 養 及 保 健 食 品 時, 顆 粒 粒 徑 小 於 500 nm 可 提 高 物 質 之 吸 收 率 及 攝 入 量 ; 當 顆 粒 小 於 100 nm 則 可 顯 著 地 增 加 物 質 之 生 體 利 用 率 因 此 本 試 驗 所 製 備 之 奈 米 顆 粒 具 有 提 高 ISPH 在 腸 道 之 吸 收 及 生 體 利 用 率 104

A B 圖二十一 CS-ISPH-TPP 奈米顆粒之掃瞄式電子顯微鏡 SEM 觀察 Figure 21. SEM of CS-ISPH-TPP nanoparticles. A 60,000 and B 90,000 CS Mw: 131.1 kda; CS/TPP mass ratio: 3/1 ISPH concentration 5mg/mL. 105

六 傅 立 葉 轉 換 紅 外 線 光 譜 儀 (FTIR) 分 析 CS ISPH 及 TPP 之 鍵 結 情 形 本 實 驗 之 構 想 為 CS-TPP 奈 米 顆 粒 構 造 內 由 幾 丁 聚 醣 結 構 上 的 胺 基 (-NH + 5-3 ) 與 TPP 離 子 (-P 3 O 10 及 -HP 3 O 4-10 ) 形 成 離 子 交 聯 反 應, 可 形 成 的 ; 而 CS -ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 方 面, 由 幾 丁 聚 醣 包 覆 ISPH 的 機 制 有 兩 種 : 一 是 透 過 離 子 鍵 結 方 式, 利 用 幾 丁 聚 醣 鏈 上 帶 正 電 之 胺 基 與 蛋 白 質 上 之 羧 基 (-COO - ) 進 行 鍵 結 ; 其 二 是 透 過 幾 丁 聚 醣 與 TPP 能 形 成 網 狀 結 構 之 特 性, 將 ISPH 以 物 理 包 覆 方 式 包 覆 在 其 結 構 中, 我 們 希 望 藉 由 FTIR 光 譜 圖 進 一 步 來 了 解 CS-TPP 及 CS -ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 之 化 學 結 構 特 性 圖 二 十 二 表 示 幾 丁 聚 醣 ISPH CS-TPP 奈 米 顆 粒 及 CS -ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 之 FTIR 光 譜 圖,(a) 為 幾 丁 聚 醣 特 徵 吸 收 波 峰 圖, 在 3425 cm -1 出 現 為 幾 丁 聚 醣 -NH 2 與 -OH 基 之 伸 縮 振 動 (Yu et al.,1999; Wang et al., 2004),1683 cm -1 為 carbonyl ( ) 之 伸 縮 振 動 (amide I band),1558 cm -1 為 胺 基 (-NH 2 ) 之 彎 曲 振 動 (amide II band)(arof et al., 2003; Salokhe et al., 2005;Boonsongrit et al., 2008), 而 1074 cm -1 出 現 之 吸 收 坡 峰 為 saccharine(c-o-c) 的 結 構 (Qi et al., 2004; Wu et al., 2005) ISPH(b) 在 1652 cm -1 出 現 carbonyl 之 伸 縮 振 動, 1530 cm -1 出 現 -NH 2 之 彎 曲 振 動, 在 3377 cm -1 出 現 -NH 2 與 -OH 基 伸 縮 張 振 動 幾 丁 聚 醣 -TPP 奈 米 顆 粒 (c), 原 先 在 3425 cm -1 波 峰 往 前 移 至 3406 cm -1, 且 波 峰 變 寬, 此 可 能 為 幾 丁 聚 醣 與 TPP 之 氫 鍵 結 合 提 升 之 故 (Yu et al., 1999), 而 原 先 幾 丁 聚 醣 在 1683 cm -1 及 1558 cm -1 吸 收 波 峰 消 失, 移 至 1639 及 1554 cm -1, 表 示 幾 丁 聚 醣 的 -NH 2 和 carbonyl 與 TPP 產 生 離 子 產 生 交 聯 反 應, 進 而 提 升 了 分 子 間 與 分 子 內 的 作 用 力 所 致 (Knaul et al., 1999;Xu and Du, 2003) 而 CS -ISPH-TPP 106

(a) (b) 1683 1558 (C) 1652 1530 (d) 1639 1544 1643 1548 4000 3600 3200 2800 2400 2000 1600 1200 800 400 Wavenumber (cm -1 ) 圖 二 十 二 幾 丁 聚 醣 (a) 分 離 大 豆 蛋 白 質 水 解 物 (b) CS-TPP 奈 米 顆 粒 (c) 及 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 (d) 之 FTIR 光 譜 圖 Fig 22. FTIR spectra of CS(a), ISPH(b), CS-TPP nanoparticles(c) and CS-ISPH-TPP nanoparticles(d).(cs Mw: 131.1 kda; CS/TPP mass ratio: 3/1;ISPH concentration:5mg/ml). 107

奈 米 顆 粒 (d), 原 先 幾 丁 聚 醣 在 3425 cm -1 波 峰 也 往 前 移 至 3408 cm -1, 波 峰 也 變 得 更 寬, 其 在 1683 cm -1 及 1558 cm -1 吸 收 波 峰 也 消 失, 位 移 至 1643 及 1548 cm -1, 推 測 幾 丁 聚 醣 的 -NH 2 和 carbonyl 會 與 TPP 及 ISPH 產 生 更 多 鍵 結 之 故 而 比 較 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 與 CS TPP 奈 米 顆 粒 之 波 峰 圖, 發 現 兩 者 十 分 相 似, 推 測 幾 丁 聚 醣 與 ISPH 之 間 交 互 作 用 很 小, 無 化 學 鍵 結 的 反 應 發 生 所 致 Boonsongrit 等 人 (2008) 以 CS TPP 奈 米 顆 粒 來 包 覆 不 同 胰 島 素 時, 也 指 出 相 同 現 象, 幾 丁 聚 醣 與 胰 島 素 交 互 作 用 很 弱 5- 以 上 結 果 與 本 文 推 定 符 合,TPP 離 子 (-P 3 O 10 及 -HP 3 O 4-10 ) 會 與 CS 結 構 上 的 胺 基 (-NH + 3 ) 形 成 離 子 鍵 結 反 應 ; 而 CS 的 胺 基 (-NH + 3 ) 也 會 與 ISPH 之 羧 基 (-COO - ) 進 行 鍵 結 ; 另 外,CS-TPP 會 透 過 其 網 狀 結 構, 以 物 理 性 包 覆 方 式 將 ISPH 包 覆 在 其 結 構 中 ( 無 化 學 鍵 結 之 產 生 ) 108

伍 結 論 一 不 同 分 子 量 幾 丁 聚 醣 之 製 備 利 用 纖 維 酵 素 水 解 幾 丁 聚 醣, 可 有 效 製 備 出 低 分 子 量 之 幾 丁 聚 醣 水 解 物 (chitosan hydrolysates,cs) 至 81.6 kda 利 用 此 方 水 解 幾 丁 聚 醣 不 僅 操 作 簡 單 無 化 學 殘 留 及 廢 液 處 理 問 題, 且 對 幾 丁 聚 醣 之 水 解 專 一 性 及 再 現 性 高 二 幾 丁 聚 醣 - 分 離 大 豆 蛋 白 質 水 解 物 - 三 聚 磷 酸 鈉 (CS-ISPH-TPP) 奈 米 顆 粒 之 製 備 及 特 性 之 影 響 因 子 本 試 驗 利 用 ph 4.7 之 幾 丁 聚 醣 (CS) 溶 液 與 ph 9.0 之 三 聚 磷 酸 鈉 (TPP) 溶 液 反 應, 包 覆 分 離 大 豆 蛋 白 質 水 解 物 (ISPH), 並 各 別 比 較 CS 分 子 量 ISPH 添 加 濃 度 及 CS/TPP 重 量 比 對 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 特 性 之 影 響 ( 一 )ISPH 濃 度 之 影 響 使 用 低 分 子 量 幾 丁 聚 醣 (131.1 kda),cs/tpp 重 量 比 6/1 來 包 覆 不 同 濃 度 (1~9 mg/ml) 之 ISPH 時, 當 ISPH 濃 度 增 加 至 大 於 3mg/mL 其 包 覆 率 均 維 持 在 50%, 而 隨 著 ISPH 濃 度 增 加, 裝 載 率 會 隨 之 增 加 (3~12%), 產 率 則 無 明 顯 的 差 異 性 及 趨 勢 ( 平 均 為 27%), CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 之 粒 徑 亦 有 增 加 的 趨 勢, 表 面 電 位 則 無 明 顯 的 改 變 ( 介 於 +42.1~ +43.7 mv 之 間 ) ( 二 ) 幾 丁 聚 醣 分 子 量 之 影 響 109

使 用 不 同 分 子 量 (475.5 231.5 及 131.1 kda), 固 定 ISPH 濃 度 為 5mg/mL,CS/TPP 重 量 比 6/1 來 製 備 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 時, 隨 CS 分 子 量 的 增 加, 其 包 覆 率 裝 載 率 及 產 率 皆 無 顯 著 差 異, 而 CS-TPP 及 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 之 粒 徑 則 會 隨 之 增 加, 且 包 覆 有 ISPH 者 粒 徑 皆 大 於 未 包 覆 者, 於 表 面 電 位 方 面 則 無 明 顯 改 變 ( 介 於 +41.9~ +44.2mV) ( 三 )CS/TPP 重 量 比 之 影 響 使 用 低 分 子 量 幾 丁 聚 醣 (131.1 kda), 固 定 ISPH 溶 液 濃 度 為 5mg/mL, 探 討 不 同 CS/TPP 重 量 比 (6/1 5/1 4/1 3/1 及 2/1) 對 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 特 性 之 影 響, 結 果 得 知, 以 CS/TPP 重 量 比 為 3/1 及 4/1 可 獲 得 較 高 之 包 覆 率 (64.61% 及 64.93%),CS/TPP 重 量 比 愈 低 (6/1~2/1) 其 裝 載 率 愈 低 (9.60~3.22%), 產 率 愈 高 (28~46%) 粒 徑 方 面,CS/TPP 重 量 比 由 6/1 減 少 至 4/1 時, 顆 粒 粒 徑 會 隨 之 增 加, 而 CS/TPP 重 量 比 由 4/1 減 少 至 2/1 時, 粒 徑 則 呈 現 變 小 的 趨 勢 CS/TPP 重 量 比 由 6/1 減 少 至 3/1 時, 顆 粒 表 面 皆 帶 有 高 度 之 正 電 荷, 而 CS/TPP 重 量 比 減 少 至 2/1 時, 顆 粒 表 面 電 位 會 出 現 驟 降 之 情 形 ( 未 包 覆 組 : 由 +46.7 mv 減 至 +26.6 mv; 包 覆 ISPH 組 別 : 由 +47.6 mv 減 至 +24.0 mv) 三 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 於 胃 腸 液 中 之 安 定 性 之 影 響 因 子 ( 一 )CS/TPP 重 量 比 之 影 響 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 於 胃 液 (ph 1.2) 及 腸 液 (ph7.4) 環 境 下, 其 安 定 性 會 隨 CS/TPP 重 量 比 減 少 (6/1~2/1) 而 增 加 110

( 二 ) 幾 丁 聚 醣 分 子 量 之 影 響 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 在 胃 液 (ph 1.2) 及 腸 液 (ph7.4) 環 境 下, 其 安 定 性 會 隨 著 幾 丁 聚 醣 之 分 子 量 的 增 加 (131.1~475.5kDa) 而 增 加 四 於 模 擬 胃 腸 液 最 為 安 定 之 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 之 製 備 及 其 特 性 以 高 分 子 量 之 幾 丁 聚 醣,CS/TPP 重 量 比 3/1,ISPH 濃 度 5mg/mL 所 製 備 之 備 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 安 定 性 最 佳, 而 其 包 覆 率 約 為 69%, 裝 載 率 約 為 5%, 產 率 約 為 43%, 粒 徑 為 446 nm, 顆 粒 表 面 帶 正 電 (+40 mv) 而 以 SDS-PAGE 評 估 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 經 過 模 擬 胃 腸 道 消 化 試 驗 後 ISPH 分 子 量 之 變 化, 可 得 知 以 CS -TPP 包 覆 ISPH 製 備 成 奈 米 顆 粒 確 實 可 保 護 ISPH 不 受 環 境 ph 影 響, 維 持 其 安 定 性 五 掃 描 式 電 子 顯 微 鏡 (SEM) 觀 察 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 外 觀 型 態 以 低 分 子 量 之 CS(Mw 131.1 kda),cs/tpp 重 量 比 3/1,ISPH 濃 度 5mg/mL 所 製 備 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 以 SEM 觀 察, 可 見 奈 米 顆 粒 之 粒 徑 均 小 於 100 nm, 並 呈 球 型 六 傅 立 葉 轉 換 紅 外 線 光 譜 儀 (FTIR) 分 析 CS ISPH 及 TPP 之 鍵 結 情 形 由 FTIR 分 析 可 得 知 CS 之 胺 基 (-NH 3 + ) 會 與 TPP 之 離 子 (-P 3 O 10 5-111

及 -HP 3 O 10 4- ) 及 ISPH 之 羧 基 (-COO - ) 產 生 鍵 結 反 應 ; 且 CS-TPP 對 ISPH 之 包 覆 屬 於 物 理 性 ( 無 化 學 鍵 結 產 生 ) 七 總 結 以 ph 4.7 之 幾 丁 聚 醣 溶 液 與 ph 9.0 之 TPP 溶 液 混 可 製 備 出 CS -TPP 奈 米 顆 粒, 對 ISPH 具 極 佳 的 包 覆 效 果, 並 可 藉 由 操 控 條 件 調 整 (CS 分 子 量 ISPH 添 加 濃 度 及 CS/TPP 重 量 比 ), 產 生 具 有 高 包 覆 率 裝 載 率 及 產 率 之 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 另 外, 本 試 驗 所 製 備 之 顆 粒 均 屬 奈 米 級, 呈 球 型, 且 顆 粒 表 面 帶 有 高 度 正 電 而 顆 粒 的 組 成 會 影 響 釋 安 定 性, 幾 丁 聚 醣 分 子 量 愈 高,CS/TPP 重 量 比 愈 低, 安 定 性 愈 佳 未 來 可 望 進 一 步 以 動 物 實 驗 或 細 胞 實 驗 來 探 討 CS-ISPH -TPP 奈 米 顆 粒 對 促 進 營 養 物 質 的 吸 收 及 提 高 生 體 利 用 率 的 能 力 112

陸 參 考 文 獻 李 勳 宜 (1988) 草 蝦 幾 丁 聚 醣 之 製 備 及 其 應 用 研 究 國 立 台 灣 大 學 食 品 科 技 研 究 所 碩 士 論 文 吳 靜 玫 (2008) 以 不 同 分 子 量 之 幾 丁 聚 醣 包 覆 牛 血 清 蛋 白 及 舞 菇 多 醣 及 其 奈 米 顆 粒 製 備 之 研 究 私 立 東 海 大 學 食 品 科 學 系 研 究 所 碩 士 論 文 沈 家 弘 (2004) 不 同 去 乙 醯 度 幾 丁 聚 醣 乳 化 性 質 之 比 較 及 應 用 於 沙 拉 醬 之 研 究 私 立 東 海 大 學 食 品 科 學 研 究 所 碩 士 論 文 柯 建 邦 (2006) 不 同 去 乙 醯 度 膠 態 幾 丁 聚 醣 乳 化 性 質 之 比 較 及 應 用 於 沙 拉 醬 之 研 究 私 立 東 海 大 學 食 品 科 學 系 研 究 所 碩 士 論 文 徐 世 昌 (2001) 生 物 性 高 分 子 幾 丁 質 與 幾 丁 聚 醣 之 介 紹 與 應 用 化 工 資 訊,2 : 36-45 梁 祥 發 (2007) 奈 米 藥 物 傳 輸 技 術 在 藥 物 發 展 上 化 工 技 術,11:124-138 莊 仲 揚 (2002) 幾 丁 聚 醣 於 生 醫 產 業 上 的 應 用 化 工 資 訊,4:46-50 楊 欣 樺 (2008) 幾 丁 聚 醣 水 解 物 - 三 聚 磷 酸 鈉 - 表 沒 食 子 兒 茶 素 沒 食 子 酸 酯 奈 米 顆 粒 之 製 備 及 其 特 性 之 研 究 私 立 東 海 大 學 食 品 科 學 系 研 究 所 碩 士 論 文 趙 佳 宏 (2009) 大 豆 蛋 白 水 解 物 對 3T3-L1 脂 肪 細 胞 具 有 促 進 脂 解 活 性 之 研 究 私 立 東 海 大 學 食 品 科 學 系 研 究 所 碩 士 論 文 賴 淑 琪 (1979) 水 產 廢 棄 物 蝦 蟹 外 殼 之 高 度 利 用 食 品 工 業,11:23-28 陳 美 惠 莊 淑 惠 及 吳 志 律 (1999) 幾 丁 聚 醣 的 物 化 特 性 食 品 工 業,31:1-6 陳 美 惠 (2000) 幾 丁 聚 醣 之 抑 菌 作 用 食 品 工 業,32(4),29-38 陳 慶 源 (2000) 幾 丁 聚 醣 在 藥 物 運 送 系 統 上 之 應 用 食 品 工 業,32: 18-28 陳 嘉 芬 (2004) 細 胞 生 物 學 藝 軒 圖 書 出 版 社,p.88 糜 福 龍 (2007) 幾 丁 聚 醣 化 學 改 質 再 生 醫 材 料 的 應 用 化 工 技 術,11,182-195 113

羅 友 文 (2007) 口 服 大 分 子 要 務 之 技 術 探 討 化 工 資 訊 與 商 情,49,32-37 Acosta E. (2009). Bioavailability of nanoparticles in nutrient and nutraceutical delivery. Curr. Opin. Colloid Inter. Sci., 14: 3 15. Aiba S. (1992). Studies on chitosan: 4. Lysozyme hydrolysis of partially N-acetylated chitosan. Int. J. Biol. Macromol., 14: 225-228. Allen T. M. and Cullis P. R. (2004). Drug Delivery Systems: Entering the Mainstream. Science, 303:1818 1822. Alonso I. G., Peniche-Covas C., and Nieto J. M. (1983). Determination of the degree of acetylation of chitin and chitosan by thermal analysis. J. Thermal Analysis., 28:189-193. Anson M. L.(1957). Extraction of soy protein. US Patent, 2:785. Arof A. K. and Osman Z. (2003). FTIR studies of chitosan acetate based polymer electrolytes. Electrochim Acta., 48:993 999. Artursson P., Lindmark T., Davis S. S., Illum L. (1994). Effect of chitosan on permeability of monolayers of intestinal epithelial cells (Caco-2). Pharm. Res., 11:1358 1361. Berger J., Reist M., Mayer J. M., Felt O., Peppas R. and Gurny M.(2004). Structure and interactions in chitosan hydrogels formed by complexation or aggregation for biomedical applications. J. Pharm. Biopharm., 57 : 35 52. Beri R. G., Walker J., Reese E. T. and Rollings J. E. (1993). Characterization of chitosans via coupled size-exclusion chromatography and multiple-angle laser light-scattering technique. Carbohydrate, 238:11-26. Blackwell J. (1988). Physical methods for the determination of chitin structure and conformation. Methods Enzymol., 16:435-442. Boonsongrit Y., Mueller B. W. and Mitrevej A. (2008). Characterization of drug chitosan interaction by H NMR, FTIR and isothermal titration calorimetry. Eur J. Pharm. Biopharm., 69:388-95. 114

Bough W. A., Salter W. L., Wu A. C. M., and Perkins B. E. (1978). Influence of manufacturing variables on the characteristics and effectiveness of chitosan products. II. Coagulation of activated sludge suspensions. Biotechnol Bioeng., 20:1931-1943. Bradford M. M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analyt. Biochem., 72:248 254. Brayden, D. J. (2003). Controlled release technologies for drug delivery. Drug Discov. Today, 8:976 978. Brine C. J. (1989). Controlled release pharmaceutical applications of chitosan. In Chitin and Chitosan. Skjak-Braek G., Anthonsen T. and Sandford P. (eds.), Eisevier Applied Science:679-691. Carmen R. L. and Roland B. (1997). Mechanical water uptake and permeability of properties of crosslinked chitosan glutamate and alginate films, J Control Release., 44:215-225. Chau C. F., Wu S. H. and Yen G. C. (2007). The development of regulations for food nanotechnology. Trends Food Sci. Tech., 18: 269 280. Chen H. M., Muramoto K. and Yamauchi F.(1995a). Structural analysis of antioxidative peptides from soybean b-conglycinin. J. Agric. Food Chem., 43: 574 578. Chen J., Suetsuna K. and Yamauchi F. (1995b). Isolation and characterization of immunostimulative peptides from soybean. J. Nutr. Biochem., 6:310 313. Chen H., Weiss J. and Shahidi F. (2006a). Nanotechnology in nutraceuticals and functional foods. Food Technol., 60:30. Chen L., Remondetto G. E. and Subirade M. (2006b). Food protein-based materials as Nutraceutical delivery systems. Trends Food Sci. Technol. 17: 272 283. Chiang W. D., Shih C. J. and Chu Y. H. (1999). Functional properties of soy protein hydrolysate produced from a continuous membrane reactor system. Food Chem. 115

65:198-194. Chiang W. D., Tsou M. J., Tsai Z. Y. and Tsai T. C. (2006). Angiotensin I-converting enzyme inhibitor derived from soy protein hydrolysate and produced by using membrane reactor. Food Chem., 98:725 732. Choi H. S., Cho H. Y., Yang H. C.,. Ra K. S and Suh H. J. (2001). Angiotensin I-converting enzyme inhibitor from Grifola frondosa. Food Res. Int.,34:177-182. Curotto E. and Aros F. (1993). Quantitative determination of chitosan and the percentage of free amino groups. Anal Biochem., 211: 240-241. Davis D. H. and Hayes E. R. (1988). Determination of the degree of acetylation of chitin and chitosan. Methods Enzymol., 161: 442-446. Desai M. P., Labhasetwar V., Amidon G. L. and Levy R. J. (1996). Gastrointestinal uptake of biodegradable microparticles effect of particle size. Pharm.Res., 13: 1838 1845. Dodane V. and Vilivalam V. D. (1998). Pharmaceutical applications of chitosan. PSTT, 1: 246 253. Dodane V., Khan M. A. and Merwin J. R. (1999). Effect of chitosan on epithelial permeability and structure. Int. J. Pharm. 182:21 32. Domard A. (1987). Determination of N-acetyl content in chitosan samples by C.D. measurements. Int. J. Biol. Macromol., 9: 333-336. Dudhani A. R. and Kosaraju S. L. (2010). Bioadhesive chitosan nanoparticles: Preparation and characterization. Carbohy. Polym., 81:243 251. Felt O., Furrer P., Mayer J. M., Plazonner B., Buri P. and Gurny R. (1999). Topical use of chitosan in ophthalmology: toler-ance assessment and evaluation of precorneal retention. Int. J. Pharm., 180:185-193. Fernández-Urrusuno R., Calvo P., Remuñán-López C., Vila-Jato J. L. and Alonso M. J. (1999). Enhancement of nasal absorption of insulin using chitosan nanoparticles. Pharm. Res., 16: 1576 1581. 116

Furuse M., Itoh M., Hirase T., Nagafuchi A., Yonemura S. and Tsukita S. (1994). Direct association of occluding with ZO-1 and its possible involvement in the localization of occluding at tight junctions. J. Cell Biol., 127 : 1617 26. Gan Q., Wang T., Cochrane C. and McCarron P. (2005). Modulation of surface charge, particle size and morphological properties of chitosan-tpp nanoparticles intended for gene delivery. Colloids Surf B Biointerfaces, 44:65-73. Gan Q. and Wang T. (2007). Chitosan nanoparticle as protein delivery carrier Systematic examination of fabrication conditions for efficient loading and release. Colloids Surf B Biointerfaces, 59:24 34. Ganza-Gonzalez A., Anguiano-Igea S. Otero-Espinar F. J. and Blanco Mendez, J. (1999). Chitosan and Chondroitin microspheres for oral-administration controlled release of metociopramide. Eur. J. Pharm. Biopharm., 48:149-155. Gibbs B.F., Zougman A., Masse R. and Mulligan C. (2004). Production and characterization of bioactive peptides from soy hydrolysate and soy fermented food. Food Res. Int., 37:123 131. Grenha, A., Seijo, B. and Remuñán-López, C. (2005). Microencapsulated chitosan nanoparticles for lung protein delivery. Eur. J. Pharm. Sci., 25:427-437. Guan R. F., Qian B., Ye X. Q. and Hao Y. B. (2006). Recent study of nanotechnology in food science. Food Sci., 27:270. He P., Davis S. S. and Illum L. (1998). In vitro evaluation of the mucoadhesive properties of chitosan microspheres. Int. J. Pharm., 166 : 75-88. Hermansen K., Sondergaard M., Hoie L., Carstensen M. and Brock B. (2001). Beneficial effects of a soy-based dietary supplement on lipid levels and cardiovascular risk markers in type 2 diabetic subjects. Diabetes Care, 24: 228 233. Holan Z. and Voyruba J. (1980). New method of chitin determination based on deacetylation and gas-liquid chromatographic assay of liberated acetic acid. J. Chromatography., 190: 67 76. 117

Hsieh F. M., Huang C., Lin T. F., Chen Y. M. and Lin J. C. (2008). Study of sodium tripolyphosphate-crosslinked chitosan beads entrapped with Pseudomonas putida for phenol degradation. Process Biochemistry, 43 : 83 92. Huang M., Khor E. and Lim L. Y. (2004). Uptake and cytotoxicity of chitosan molecules and nanoparticles: effect of molecular weight and degree of deacetylation. Pharm. Res., 21 : 344-353. Illum L., Farraj N. F. and Davis S. S. (1994). Chitosan as a novel nasal delivery system for peptide drugs. Pharm. Res., 11: 1186 1189. Janes K. A., Calvo P. and Alonso M. J. (2001). Polysaccharide colloidal particles as delivery systems for macromolecules. Adv. Drug Deliv. Rev., 47: 83 97. Jang K. I. and Lee H. G. (2008). Stability of Chitosan Nanoparticles for L-Ascorbic Acid during Heat Treatment in Aqueous Solution. Food Chem., 56:1936 1941. Jumaa M. and Muller B. W. (1999). Physiochemical properties of chitosan-lipid emulsions and their stability. Int. J. Pharm., 183:175-184. Kawashima Y., Handa T., Kasai A., Takananka H., Lin S. Y. and Ando Y. (1985a). Novel method for the preparation of controlled-release theophylline granules coated with a polyelectrolyte complex of sodium polyphosphate-chitosan. J. Pharm. Sci., 74: 264 268. Kawashima Y., Handa T., Kasai A., Takenaka H. and Lin S. Y. (1985b). The effects of thickness and hardness of the coating film on the drug release rate of theophylline granules coated with chitosan-sodium tripolyphosphate complex. Chem. Pharm. Bull., 33: 2469 2474. Kipp J. E. (2004). The role of solid nanoparticle technology in the parenteral delivery of poorly water-soluble drugs. Int. J. Pharm., 284: 109 122. Knaul J. Z., Hudson S. M. and Creber K. A. M. (1999). Improved mechanical properties of chitosan fibers. J. Appl. Polym. Sci., 72:1721 1731. Knorr D. (1984). Use of chitinous polymers in food-a challenge for food research and development. Food Technol., 38: 85 97. 118

Ko J. A., Park H. J., Hwang S. J., Park J. B. and Lee J. S. (2002). Preparation and characterization of chitosan microparticles intended for controlled drug delivery. Int. J. Pharm., 249:165-174. Kockisch S., Rees G. D., Young S. A., Tsibouklis J. and Smart J. D. (2003). Polymeric microspheres for drug delivery to the oral cavity: an in vitro evaluation of mucoadhesive potential. J. Pharm. Sci., 92:1614 1623. Kotze A. F., Lueβen, H.L., de Leeuw B. J., de Boer A. G., Verhoef J. C. and Junginger, H. E. (1998). Comparison of the effect of different chitosan salts and N-trimethyl chitosan chloride on the permeability of intestinal epithelial cells (Caco-2). J. Control Rel., 51:35 46. Krajewska B. (2004). Application of chitin- and chitosan-based materials for enzyme immobilizations: a review. Enzyme Microb Technol., 35: 126 139. Lan E. H., Dunn B. and Zink J. I. (2005). Nanostructure systems for biological materials. In T. Vo-Dinh (Ed.), Protein nanotechnology (New Jersey: Humana Press Inc.):53 80. Lee V. H. L. (1991). Changing needs in drug delivery in the era of peptide and protein drugs. In: Lee, V. H. L. (Ed.), Peptide and Protein Drug Delivery.(Marcel Dekker, New York):1 56. Lee K. Y., Kwon I. C., Kim Y. H., Jo W. H., and Jeong S. Y. (1998). Preparation of chitosan self-aggregates as a gene delivery system. J. Control. Release., 51: 213-20. Lehr C. M., Bouwstra J. A., Schacht E. H., Junginger H. E., (1992). In vitro evaluation of mucoadhesive properties of chitosan and some other natural polymers. Int. J. Pharm.,78:43 48. Leong Y. S. and Candau F. (1982). Inverse microemulsion polymerization. J. Phys. Chem. 86:2269 2271. Lin Y., Tang J., Chen X. and Xin H.(2005). A templating route to nanoporous chitosan materials. Carbohydr. Res., 340 : 2816-2820. 119

Lin Y. H., Mi F. L., Chen C. T., Chang W. C., Peng S. F., Liang H. F. and Sung H. W. ( 2007). Preparation and characterization of nanoparticles shelled with chitosan for oral insulin delivery. Biomacromolecules, 8:146 52. Liu H. and Gaoa C. (2009). Preparation and properties of ionically cross-linked chitosan nanoparticles. Polym. Adv. Technol., 20:613 619. Luangtana-anan M., Opanasopit P., Ngawhirunpat T., Nunthanid J., Sriamornsak P., Limmatvapirat S. and Lim L. Y. (2005). Effect of chitosan salts and molecular weight on a nanoparticulate carrier for therapeutic protein. Pharm. Dev., Technol. 10: 189-96. Lueβen H. L., Lehr C. M., Rentel C. O., Noach A. B. J., de Boer A. G., Verhoef J. C. and Junginger H. E. (1994). Bioadhesive polymers for the peroral delivery of peptide drugs. J. Control Rel., 29:329 338. Luessen H. L., de Leeuw B. J., Langemeÿer M.W., de Boer A. B., Verhoef J. C. and Junginger H. E. (1996). Mucoadhesive polymers in peroral peptide drug delivery. VI. Carbomer and chitosan improve the intestinal absorption of the peptide drug buserelin in vivo. Pharm. Res., 13: 1668 1672. Maghami G. and Roberts A. F. (1988). Evaluation of the viscometric constants for chitosan. Die Makromolekulare Chemie., 189: 195 200. Mao H. Q., Roy K., Troung-Le V. L., Janes K. A., Lin K. Y., Wang Y., August J. T. and Leong K. W. (2001). Chitosan-DNA nanoparticles as gene carriers: synthesis, characterization and transfection efficiency. J. Control. Rel., 70:399 421. Medina C., Santos-Martinez M. J, Radomski A., Corrigan O. I. and Radomski M. W. (2007) Nanoparticles: pharmacological and toxicological significance, Br. J. Pharmacol. 150:552 558. Mi F. L., Shyu S. S., Lee S. H., Wong T. B. (1999). Kinetic study of chitosan-tripolyphosphate complex reaction and acid-resistive properties of thechitosan-tripolyphosphate gel beads prepared by in-liquid curing method. J. Polymer Sci. 37:1551-1564. Mima S., Miya M., Iwamoto R. and Yoshikawa S. (1983). Highly deacetylated 120

chitosan and its properties. J. Applied Polymer Sci., 28: 1909 1917. Mitra S., Gaur U., Ghosh P.C. and Maitra A. N. (2001). Tumor targeted delivery of encapsulated dextran-doxorubicin conjugate using chitosan nanoparticles as carrier. J. Controlled Rel., 74: 317 323. Miwa A., Ishibe A., Nakano M., Yamahira T., Itai S., and Kawa-hara H. (1998). Development of novel chitosan derivatives as micellar carriers of taxol. Pharm. Res., 15:1844-1850. Moure A., Dominguez H. and Parajo J. C. (2006). Antioxidant properties of ultrafiltration-recovered soy protein fractions from industrial effluents and their hydrolysates. Process Biochem., 41:447 456. Muraki E., Yaku F. and Kojuma K. (1993). Preparation and crystallization of D-glucosamine oligosaccharides with dp 6-8. Carbohydr. Res., 239: 227 235. Muzzarelli R. A. A. (1977). Chitin. Oxford: Pergamon, 220 228. Muzzarelli R. A. A. and Rocchetti R. (1985). Determination of the degree of acetylation of chitosans by first derivative ultraviolet spectrophotometry. Carbohydr. Polym., 5: 461 472. Nanjo F., Katsumi R. and Sakai K. (1991). Enzymatic method for determination of the degree of deacetylation of chitosan. Anal. Biochem., 193:164 167. Needleman I.G. and Smales F.C. (1995). In vitro assessment of bioadhesion for periodontal and buccal drug delivery. Biomaterials, 16:617 624. Niola F., Basora N., Chornet E. and Vidal P. F. (1993). A rapid method for the determination of the degree of N-acetylation of chitin-chitosan samples by acid hydrolysis and HPLC. Carbohydr. Res., 238:1 9. Nishimura K., Nishimura S., Seo H., Nishi N., Tokura S. and Azuma I. (1986). Macrophage activation with multi-porous beads prepared from partially deacetylated chitin. J Biomed Mater Res., 20:1359 72. Pantaleone D., Yalpani M. and Scollar M. (1992). Unusual susceptibility of chitosan 121

to enzymic hydrolysis. Carbohydr. Res., 237: 325 332. Pihlanto-Leppälä A. (2001). Bioactive peptides derived from bovine whey proteins: opioid and ace-inhibitory peptides. Rends Food Sci. Technol.,11:347-356. Qin C., Zhou B., Zeng L., Zhang Z., Liu Y., Dub Y. and Xiaob L. (2004). The physicochemical properties and antitumor activity of cellulase-treated chitosan. Food Chem., 84: 107 115. Rillosi M. and Buckton G. (1995). Modelling mucoadhesion by use of surface energy terms obtained from the Lewis acid Lewis base approach. II. Studies on anionic, cationic and unionisable polymers. Pharm. Res., 12:669 675. Rinaudo M. (2006). Chitin and chitosan: Properties and applications. Prog Polym Sci., 31:303-632. Ringseis R., Matthes B., Lehmann V., Becker K., Schops R., Ulbrich-Hofmann R. and Eder K. (2005). Peptides and hydrolysates from casein and soy protein modulate the release of vasoactive substances from human aortic endothelial cells. Biochim. Biophys. Acta, 1721:89 97. Roberts G. A. F. and Domszy J. A.(1982). Determination of viscometric constantsfor chitosan. Int. J. Biol. Marcomol., 4: 373 377. Sabnis S. and Block L. H. (2000). Chitosan as an enabling excipient for drug delivery systems I. Molecular modifications. J. Membrane Sci.,142: 13-26. Saito M., Tabeta R. and Ogawa K. (1987). High-resolution solid-state 13 C NMR study of chitosan and its salts with acid:conformation characterization of polymorph and helical structures as viewed from the conformation-dependent 13 C chemical shifts. Macromol., 20: 2424 2430. Salokhe V. M., Rakshit S. K. and Pranoto Y. (2005). Enhancing antimicrobial activity of chitosan films by incorporating garlic oil, potassium sorbate and nisin, Lebensm.-Wiss. und Technol., 38:859 865. Schipper N. G. M., Varum K. M. and Artursson P. (1996). Chitosan as absorption enhancers for poorly absorbable drugs. 1: Influence of molecular weight and 122

degree of acetylation on drug transport across human epithelial (Caco-2) cells. Schipper N. G. M., Olsson S., Hoogstraate J. A., de Boer A. G., Varum K. M. and Artursson P. (1997). Chitosans as absorption enhancers for poorly absorbable drugs. 2: Mechanism of absorption enhancement. Pharm. Res. 14, 923 929. Pharm. Res., 13:1686 1692. Schipper N. G., Varum K. M., Stenberg P., Ocklind G., Lennernäs H. and Artursson P. (1999). Chitosans as absorption enhancers of poorly absorbable drugs. 3: Influence of mucus on absorption enhancement. Eur. J. Pharm. Sci., 8:335 43. Shimoda J., Onishi H. and Machida Y. (2001). Bioadhesive characteristics of chitosan microspheres to the mucosa of rat small intestine. Drug Dev Ind. Pharm. 27: 567 576. Tan S. C., Khor E., Tan T. K. and Wong S. M. (1998). The degree of deacetylation of chitosan:advocating the first derivative UV-spectrophotometry method of determination. Talanta., 45: 713 719. Tengamnuay S. P. and Mitra A. K. (1997). Chitosans as nasal absorption enhancers of salmon calcitonin: comparison with hydroxypropyl- and dimethyl-b- cyclodextrins. Pharm. Res., 14: S129. Toei K. and Kohara T. (1976). A conductometric method for colloid titrations. Analytica Chimica Acta., 83: 59 65. Tokumitsu H., Ichikawa H. and Fukumori Y. (1999). Chitosan-gadopentetic acid complex nanoparticles for gadolinium neutron-capture therapy of cancer: preparation by novel emulsion-droplet coalescence technique and characterization. Pharm Res., 16: 1830 1835. Tsai G. J., Zhang S. L. and Shieh P. L. (2004). Antimicrobial activity of lowmolecular- weight chitosan obtained from cellulase digestion of chitosan. J. Food Protec., 67:396 398a. Tsou M. J., Lin W. T., Lu H. C., Tsui Y. L. and Chiang W. D. (2010). The effect of limited hydrolysis with Neutrase and ultrafiltration on the anti-adipogenic 123

activity of soy protein. Process Biochem., 45:217 222. Vo-Dinh T. (2005). Protein nanotechnology: The new frontier in biosciences. In T. Vo-Dinh (Ed.), Protein nanotechnology (pp. 1 14). New Jersey: Humana Press Inc. Wang X. H., Du Y. M. and Liu H. (2004). Preparation, characterization and antimicrobial activity of chitosan-zn complex. Carbohydr. Polym., 56: 21 26. Ward P. D., Tippin T. K. and Thakker D. R. (2000). Enhancing paracellular permeability by modulating epithelial tight junctions. Pharm. Sci. Technolo. Today, 3 : 346-358. Wu A. C. M. and Bough W. A. (1976). Determination of molecular weight distribution of chitosan by HPLC. J. Chromatography, 128: 87 92. Wu J., and Ding X. (2001). Hypotensive and physiological effect of angiotensin converting enzyme inhibitory peptides derived from soy protein on spontaneously hypertensive rats. J. Agric. Food Chem., 49:501 506. Wu G. J. and Tsai G. J. (2004). Cellulase degradation of shrimp chitosan for the preparation of a water-soluble hydrolysate with immunoactivity. Fish. Sci., 70 : 1113 1120. Wu Y., Yang W., Wang C., Hu J. and Fu S. (2005). Chitosan nanoparticles as a novel delivery system for ammonium glycyrrhizinate. Int. J. Pharm., 295:235-245. Xia W., Liu P. and Liu J. (2008). Advance in chitosan hydrolysis by non-specific cellulases. Bioresour Technol., 99: 6751 6762. Xu Y. and Du Y. (2003). Effect of molecular structure of chitosan on protein delivery properties of chitosan nanoparticles. Int. J. Pharm., 250: 215 226. Yamamoto T., Harada N., Kano K., Taya S., Canaani E., Matsuura Y., Mizoguchi A., Ide C. and Kaibuchi K. (1997). The ras target AF-6 interacts with ZO-1 and serves as a peripheral component of tight junctions in epithelial cells. J. Cell. Biol., 139 : 785 95. 124

Yang H.C. and Hon M. H. (2009). The effect of the molecular weight of chitosan nanoparticles and its application on drug delivery. Microchemical Journal, 92: 87 91. Yasuyuki T. and Yoshikawa M. (2000). Introduction of enterostatin (VPDPR) and arelated sequence into soybean proglycinin AlaBlb subunit by site directed mutagenesis. Biosci. Biotech. Biochem., 64:2731 2733. Yu J. H., Du Y. M. and Zheng H. (1999). Blend films of chitosan gelation. J. Wuhan Univ. (Nat. Sci. Ed.), 45: 440 444. Zhang L. and Kosaraju S. L. (2007). Biopolymeric delivery system for controlled release of polyphenolic antioxidants. Eur. Polym. J., 43: 2956 2966. Zor T. and Selinger Z. (1996). Linearization of the Bradford protein assay increases its sensitivity: theoretical and experimental studies. Analyt. Biochem., 236: 302 308. 125

柒 附 錄 6.5 6.0 y = -1.3214x + 11.267 R2 = 0.9916 5.5 Log MW 5.0 4.5 4.0 3.5 3.8 4.0 4.2 4.4 4.6 4.8 5.0 5.2 5.4 5.6 Retention Time (min) Shodex STANDARD P-82 Grade MW 10-4 Mw/Mm P-800 78.8 1.23 P-400 40.4 1.13 P-200 21.2 1.13 P-100 11.2 1.12 P-50 4.73 1.06 P-20 2.28 1.07 P-10 1.18 1.10 附 錄 一 Pullulan 之 標 準 曲 線 圖 Appendix 1. Standard curve of Pullulan. 126

0.1385 0.1113 O.D. 595nm 0.0885 0.0625 0.0320 y = 0.2186x + 0.0038 R 2 = 0.9965 0.0000 0.000 0.125 0.250 0.375 0.500 0.625 ISPH concentration (mg/ml) 附 錄 二 ISPH 之 標 準 曲 線 圖 Appendix 2. Standard curve of ISPH. 127

(a)in the ph1.2buffer 0.1405 0.1178 O.D. 595nm 0.0935 0.0645 0.0328 y = 0.1692x + 0.0044 R2 = 0.9944 0.0000 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 ISPH concentration (mg/ml) (b)in the ph7.4 buffer 0.204 0.175 O.D. 595nm 0.133 0.094 0.057 y = 0.2426x + 0.0093 R2 = 0.9922 0.000 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 ISPH concentration (mg/ml) 附 錄 三 ISPH 溶 於 ph1.2 及 ph7.4 緩 衝 溶 液 中 之 標 準 曲 線 圖 Appendix 3. Standard curve of ISPH in the ph1.2 and ph7.4 buffer. 128