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誌謝本論文之完成, 首先感謝恩師洪敏元及洪千雅教授於二年研究所生涯期間視如己出般細心的指導及關愛, 使論文得以順利完成文稿初成, 承蒙東海大學食品科學系蘇正德教授於百忙之中詳閱學生之初稿, 並給予釜正與建議, 使本論文內容更加充實與完整, 謹此致上由衷之謝意研究期間, 感謝姜泰安老師葉怡玲老師廖東南老師林士民老師湯雅理老師於研究上給予指導與協助此外, 感謝南投名間鄉桂花森林提供所需研究材料成功大學王志堯教授實驗室南海檢驗所吳學長福明奇美醫院病理部林主任靖南及李醫師健隆在病理組織切片上之協助與判讀, 方使得研究能順利進行兩年的研究生活, 感謝敬愛的精神領袖國玉學姊慈敏學姐及筱青學姐提供各方面之所需, 使得實驗室充滿家的感覺基因重組研究室琬甯學姊芳怡小畢逸諠柏淵湘庭, 正妹系列 : 分子診斷實驗室思听 ; 遺傳檢驗實驗室競文綉雲 ; 食品保健營養研究室慧珊學姐采玲培倫小白 ; 生科所辦雅筑學姐 ; 食營系辦全體人員於實驗技術及場所與各項事務上給予協助學業終成, 感謝之人眾多, 無法一一道盡謝意, 在此一併致謝與祝福最後要感謝支持我的帥老爸靓老媽, 謝謝你們的用心栽培, 小犬以此論文致上感恩之心終於畢業了!~ 真 ~ 爽 ~! i

總目錄圖次...v 表次...vii 中文摘要...viii 英文摘要...x Abbreviation...xii 第一章文獻整理一自由基與抗氧化...1 二過敏性氣喘...3 ( 一 ) 氣喘定義...4 ( 二 ) 氣喘反應機轉...4 ( 三 ) 氣喘成因與症狀...5 ( 四 ) 氣喘與氧化壓力.. 6 ( 五 ) 氣喘治療..6 三 Acetaminophen (APAP)....7 ( 一 ) Acetaminophen 毒性機制....7 ( 二 ) Acetaminophen 毒性與氧化壓力...8 四桂花相關之研究 10 五研究目的...13 六研究架構...14 第二章桂花萃取物及 rutin 安全性評估一摘要...16 二材料與方法...17 ( 一 ) 桂花 75 % 乙醇萃取物製備.17 ( 二 ) 動物實驗設計 ( 急性毒性試驗慢性毒性試驗 )...17 ( 三 ) 動物犧牲及實驗檢體收集與分析.21 ( 四 ) 統計分析.....25 三結果與討論....26 ( 一 ) 實驗劑量之選擇....26 ( 二 ) 臨床症狀.27 ( 三 ) 試驗期間小鼠體重變化.27 ii

( 四 ) 臟器重量變化 28 ( 五 ) 血液分析 28 ( 六 ) 肺沖洗液血球變化 29 ( 七 ) 臟器組織病理檢查 30 ( 八 ) 臟器脂質過氧化 30 四結論 31 第三章桂花萃取物及 rutin 抗致敏氣喘功能之評估一摘要 46 二材料與方法 47 ( 一 ) 桂花 75 % 乙醇萃取物製備.47 ( 二 ) 動物實驗設計.47 ( 三 ) 動物犧牲及實驗檢體收集與分析.50 ( 四 ) 統計分析. 58 三結果與討論.59 ( 一 ) 試驗期間小鼠體重變化..59 ( 二 ) 臟器重量變化..59 ( 三 ) OVA 特異性抗體 IgE IgG1 IgG2a 分析.59 ( 四 ) 肺沖洗液血球變化...60 ( 五 ) 呼吸道阻力..60 ( 六 ) 臟器組織病理檢查..61 ( 七 ) 臟器脂質過氧化..61 四結論.63 第四章桂花萃取物及 rutin 護肝功能之評估一摘要 79 二材料與方法 80 ( 一 ) 桂花 75 % 乙醇萃取物製備.80 ( 二 ) 動物實驗設計.80 ( 三 ) 動物犧牲及實驗檢體收集與分析.82 ( 四 ) 統計分析.85 三結果與討論...86 ( 一 ) 試驗期間小鼠體重變化.86 ( 二 ) 臟器重量變化.86 ( 三 ) 血液分析.86 iii

( 四 ) 臟器組織病理檢查.87 ( 五 ) 臟器脂質過氧化.87 四結論 88 第五章參考文獻 101 附錄 ( 已發表之桂花相關研究 ) 一桂花萃取物對 acetaminophen 誘導 BALB/c 小鼠肝毒性影響之研究 111 二桂花市售製品抗氧化能力總多酚含量及抗氧化指標成分 verbascoside 及 rutin 之含量分析...124 iv

圖次圖一本研究使用之桂花材料及 rutin 圖片...xiv 圖 1-1 氧化壓力造成細胞傷害機制...2 圖 1-2 Acetaminophen (APAP) 毒性機制...9 圖 2-1 BALB/c 小鼠管餵食桂花萃取物及 rutin 72 小時後之肝臟病理切片觀察...33 圖 2-2 管餵桂花萃取物對 BALB/c 小鼠肝臟組織 TBARs 值之影響...34 圖 2-3 桂花萃取物及 rutin 管餵食期間各組小鼠之體重變化...35 圖 2-4 管餵食桂花萃取物及 rutin 28 天 BALB/c 小鼠肺氣管沖洗液之分析細胞群...38 圖 2-5 BALB/c 小鼠管餵食桂花萃取物及 rutin 28 天肝臟病理切片觀察...39 圖 2-6 BALB/c 小鼠管餵食桂花萃取物及 rutin 28 天脾臟病理切片觀察...40 圖 2-7 BALB/c 小鼠管餵食桂花萃取物及 rutin 28 天肺臟病理切片觀察...41 圖 2-8 BALB/c 小鼠管餵食桂花萃取物及 rutin 28 天腎臟病理切片觀察...42 圖 2-9 管餵食桂花萃取物及 rutin 28 天對 BALB/c 小鼠肝臟組織 TBARs 值之影響...43 圖 2-10 管餵食桂花萃取物及 rutin 28 天對 BALB/c 小鼠腎臟組織 TBARs 值之影響...44 圖 3-1 致敏氣喘模式下管餵食桂花萃取物及 rutin 對 OVA 致敏 BALB/c 小鼠體重之影響...64 圖 3-2 致敏氣喘模式下管餵食桂花萃取物及 rutin 對 OVA 致敏 BALB/c 小鼠血清特異性抗體 IgE 之影響...66 圖 3-3 致敏氣喘模式下管餵食桂花萃取物及 rutin 對 OVA 致敏 BALB/c 小鼠血清特異性抗體 IgG1 之影響...67 圖 3-4 致敏氣喘模式下管餵食桂花萃取物及 rutin 對 OVA 致敏 BALB/c 小鼠血清特異性抗體 IgG2a 之影響...68 圖 3-5 致敏氣喘模式下管餵食桂花萃取物及 rutin 對 OVA 致敏 BALB/c 小鼠肺氣管沖洗液各細胞總數 (Eosinophil Lymphocyte Neutrophil Monocyte) 之影響...69 圖 3-6 致敏氣喘模式下管餵食桂花萃取物及 rutin 對 OVA 致敏 BALB/c 小鼠肺氣管沖洗液各細胞總數 (Eosinophil Lymphocyte Neutrophil Monocyte) 之影響...70 圖 3-7 致敏氣喘模式下管餵食桂花萃取物及 rutin 對 OVA 致敏 BALB/c 小鼠肺氣管沖洗液各細胞總數 (Eosinophil Lymphocyte Neutrophil v

Monocyte) 之影響...71 圖 3-8 致敏氣喘模式下管餵食桂花萃取物及 rutin 對 OVA 致敏 BALB/c 小鼠肺氣管沖洗液各細胞總數 (Eosinophil Lymphocyte Neutrophil Monocyte) 之影響...72 圖 3-9 致敏氣喘模式下管餵食桂花萃取物及 rutin 對 OVA 致敏 BALB/c 小鼠呼吸道阻力之影響...73 圖 3-10 致敏氣喘模式下管餵食桂花萃取物及 rutin 對 OVA 致敏 BALB/c 小鼠肺臟組織之影響...75 圖 3-11 致敏氣喘模式下管餵食桂花萃取物及 rutin 對 OVA 致敏 BALB/c 小鼠肺臟組織 TBARs 值之影響...76 圖 3-12 致敏氣喘模式下管餵食桂花萃取物及 rutin 對 OVA 致敏 BALB/c 小鼠肝臟組織 TBARs 值之影響...77 圖 4-1 桂花萃取物及 rutin 管餵食期間各組小鼠之體重變化...89 圖 4-2 BALB/c 小鼠經管餵食桂花萃取物及 rutin 對腹腔內注射 APAP 之肝臟病理切片觀察...93 圖 4-3 BALB/c 小鼠經管餵食桂花萃取物及 rutin 對腹腔內注射 APAP 之肺臟病理切片觀察...95 圖 4-4 BALB/c 小鼠經管餵食桂花萃取物及 rutin 對腹腔內注射 APAP 之腎臟病理切片觀察...97 圖 4-5 BALB/c 小鼠經管餵食桂花萃取物及 rutin 對腹腔內注射 APAP 之肝臟組織 TBARs 值之影響...98 圖 4-6 BALB/c 小鼠經管餵食桂花萃取物及 rutin 對腹腔內注射 APAP 之肺臟組織 TBARs 值之影響...99 圖 4-7 BALB/c 小鼠經管餵食桂花萃取物及 rutin 對腹腔內注射 APAP 之腎臟組織 TBARs 值之影響...100 vi

表次表 2-1 BALB/c 小鼠管餵食 5 g 及 10 g 桂花萃取物 72 小時之存活率...32 表 2-2 BALB/c 小鼠經管餵食桂花萃取物及 rutin 28 天之臟器相對重量百分比...36 表 2-3 管餵食桂花萃取物及 rutin 28 天 BALB/c 小鼠血清 GOT GPT 及 BUN 值...37 表 3-1 致敏氣喘模式下管餵食桂花萃取物及 rutin 對 OVA 致敏 BALB/c 小鼠器官相對重量百分比之影響...65 表 4-1 BALB/c 小鼠管餵食桂花萃取物及 rutin 對腹腔內注射 APAP 臟器相對重量百分比...90 表 4-2 BALB/c 小鼠管餵食桂花萃取物及 rutin 對腹腔內注射 APAP 血清 GOT GPT 之影響...91 vii

摘要本研究主要探討台灣產桂花的安全性以及抗致敏性氣喘與抑制 acetaminophen 對肝細胞損傷的效果第二章是桂花萃取物安全性評估, 分為急性毒性試驗及慢性毒性試驗, 急性毒性試驗為 BALB/c 小鼠經管灌分別餵食 5.0 g/kg B.W. (5 g KFE) 及 10.0 g/kg B.W. (10 g KFE) 75 % 乙醇桂花萃取物, 觀察 72 小時實驗結果顯示各實驗組小鼠均無死亡之現象慢性毒性試驗為 BALB/c 小鼠連續 28 天經管灌分別餵食低劑量 100 mg/kg B.W. (LEKF) 中劑量 800 mg/kg B.W. (MEKF) 高劑量 1000 mg/kg B.W. (HEKF) 75 % 乙醇桂花萃取物及低劑量 10 mg/kg B.W. (LR) 高劑量 100 mg/kg B.W. (HR) 抗氧化城分 rutin 實驗結果顯示各實驗組均無死亡之現象, 且無外觀上之中毒現象產生與控制組相比較體重及相對器官重量均無顯著性差異肝臟及腎臟無脂質過氧化現象產生於肝脾肺腎臟組織病理切片中, 發現無特殊之病變發生綜合以上結果顯示, 桂花萃取物及其抗氧化成分 rutin 經管灌餵食 BALB/c 小鼠連續 28 天, 不會造成小鼠中毒之現象, 證實桂花萃取物是無毒性的物質第三章是桂花萃取物抗氣喘能力研究小鼠經抗原誘導產生氣喘時也會造成肺肝臟氧化現象產生 TBARs 值上升連續 28 天管灌餵食 viii

不同劑量 75 % 乙醇桂花萃取物及不同劑量抗氧化成分 rutin, 可以改善經 OVA 抗原刺激誘導 BALB/c 小鼠氣喘症狀的能力實驗結果顯示各實驗組 [ 桂花萃取物組 : 100 mg/kg B.W. + OVA (LEKF) 800 mg/kg B.W. + OVA (MEKF) 1000 mg/kg B.W. + OVA (HEKF);rutin 組 : 10 mg/kg B.W. + OVA (LR) 100 mg/kg B.W. + OVA (HR) ] 與控制組 [Positive control (PS) Negative control (NS) ] 相比較, 體重及相對器官重量均無顯著差異於血清中檢測抗體發現, 實驗組均能明顯降低氣喘發生時 IgE 抗體的產生 Eosinophil 發炎細胞的增生及呼吸道阻力現象, 以及肺細胞與肝細胞脂質氧化現象, 並從肺臟組織病理切片顯示, 能降低氣喘小鼠支氣管黏膜發炎細胞及分泌物沉積使氣喘小鼠有偏走向 Th1 分泌途徑, 而不完全走向導致氣喘之 Th2 分泌途徑第四章是桂花萃取物護肝能力研究,BALB/c 小鼠管灌餵食 75 % 乙醇桂花萃取物 (LEKF MEKF HEKF) 及抗氧化成分 rutin (LR HR), 連續 15 天, 於小鼠犧牲前三小時腹腔注射 acetaminophen (1.0 g/kg B.W. ), 實驗結果顯示, 各實驗組能明顯降低 acetaminophen 所導致 GOT 值的上升, 減少肝臟及肺臟脂質過氧化現象於組織病理切片檢驗中, 實驗組均能明顯降低 acetaminophen 所造成小鼠肝臟組織空泡化之傷害現象綜合以上結果顯示, 桂花及其抗氧化成分 rutin 經管灌餵食 BALB/c 小鼠連續 15 天, 確實能夠降低 acetaminophen 藥物毒性 ix

傷害, 達到保護肝細胞的能力 x

Abstract The aim of this study was to investigate the safety, anti-allergy asthma, and hepatic protection of Osmanthus fragrans flower in Taiwan on acetaminophen-induced hepatic damage in BALB/c mice. Chapter 2 was evaluates the acute and the 28 days subacute toxicities of O. fragrans flower extract (Kwei-Fah extract; KFE) by 75 % ethanol. In the acute toxicity study, BALB/c mice were single orally administered with 5.0 g/kg (5g KFE) and 10.0 g/kg B.W. (10g KFE) dosages of Kwei-Fah extract to obtain the LD50 value under 72 hr. According to the definition of acute toxicity, Kwei-Fah extract was practically nontoxic (LD50: >10 g/kg BW). In 28 days subacute toxicity study, the body and visceral organ weights of BALB/c mice administered with 100 mg to 1000 mg/kg B.W. dosages of KFE and its active compounds rutin (10 and 100 mg/kg B.W. mice) did not apparently change. The histopathology of visceral organ and the values of GOT, GPT and BUN in serum did not significantly different from those of the control group. There were no significant changes in lipid peroxidation in liver and kidney. The results suggested that the KFE and rutin had no obvious toxicity on BALB/c mice. Chapter 3 was evaluates the anti-allergic asthma of Kwei-Fah extract by 75 % ethanol in BALB/c mice. Ovalbumin (OVA)-induced asthma of BALB/c mice had significantly increased lung and liver TBARS value. The oral treatment with different dose of KFE (100, 800 and 1000 mg / kg B.W. mice) and rutin (10 and 100 mg/kg B. W. mice) had significantly reduced OVA-specific IgE in serum, the eosinophils percentage of total leukocytes from bronchoalveolar lavage fluid (BALF), methacholine-induced airway hyperresponsiveness (AHR), and decreased xi

lipid peroxidation in lung and liver cell of BALB/c mice. Therefore, the results suggest that KFE and rutin may decrease the Th2-related allergic disease on BALB/c mice. Chapter 4 was evaluates the hepatic protection of 75 % ethanol Kwei-Fah extract on acetaminophen-induced hepatic damage in BALB/c mice. BALB/c mice were single orally administered with different dosages of KFE (100, 800 and 1000 mg / kg B.W. mice) and rutin (10 and 100 mg/kg B. W. mice) for 15 days, and then injected with 1.0 g acetaminophen /kg B.W. (APAP). The result showed that KFE and rutin significantly decreased the GOT level in serum and lipid peroxidation in liver and lung cell. Liver histopathology showed that KEF and rutin reduced the incidence of liver lesions including cytoplasmic vacuolization. The results indicated that KFE and rutin could protect liver against acetaminophen-induced damage. xii

Abbreviation OVA PBS BSA SDS HBSS ABTS BALF ROS GOT GPT BUN Th1 Th2 BALB/c TBARS ELISA AHR PEnh i.p. Ovalbumin Phosphate-buffered saline Bovine serum albumin Sodium dodecyl sulfate Hank, s balanced salt solution 2, 2-azino-bis (3-ethylbenzth-azoline-6-sulfonic acid) Bronchoalveolar larvage fluid Reactive oxygen species Glutamate oxaloacetate transaminase Glutamate pyruvate transaminase Blood urea nitrogen Type 1 helper cell Type 2 helper cell BALB/cByJ Thiobarbituric acid-reactive substances Enzyme-linked immunosorbent assay Airway hyprresponsiveness Enhanced Pause Intra-peritoneal xiii

新鮮桂花乾燥桂花桂花萃取物抗氧化成分 rutin 圖一本研究使用之桂花材料及 rutin Figure 1. The photograph of Osmanthus fragrans flower and rutin. xiv

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