复旦学报 医学版 - $ 2 系统在现代生物学研究和临床试验中的应用 史 云 综述 于 敏 莫 炜 审校 复旦大学基础医学院生物化学与分子生物学系 & 复旦大学代谢和分子医学教育部重点实验室 上海 摘要 规律成簇间隔短回文重复结构!# " #!!$#' #!* * * * 相关蛋白 * *&!! ##! 系统在生物医学研究中被广泛应用于基因编辑及探索基因的功能 这种基因编辑技术越来越多地运用在人类疾病的治疗中 包括巴斯综合征 杜氏肌萎缩症 血友病 地中海贫血和囊性纤维化 * *! 基因编辑系统可以在体外细胞实验和体内动物实验上修复突变的,() 序列 也能改变 * ) +*. 等基因序列 用于控制 病毒的入侵及提高肿瘤免疫治疗的疗效 该技术还被运用于诱导多能干细胞 # #!# '! 分化 形成某些具有功能的器官用于器官移植 本文综述了 * *! 系统的来源 结构和作用原理 以及其在现代生物学研究和基因治疗领域的应用 关键词 * *! 系统 基因编辑技术 基因治疗 中图分类号 0* 文献标识码 8 1!!& $"" &$# - $ 2! # % &$ $ & $ &&$#$ :: ; "'! &"$& & ' " & "!"& ""')% ' % &! &"$&!"',!$" $! ' # $&#!# " #!!$#' #! * *!#$!#! #!$#' ##!# # * *&!! ##!!* * # #! +$ * *!!!# '!3! # #" '!$# 2 #$ "# * ##$ " #"#$4! 3! #$ $'!!!#$ " #$! '$'!!# $ $ ' $ # '!#!! * *!!!# ',()! 4 #! $" #$ * ) +*. "! 4 #!! # # #$!! '#$ #' ''#$ #* *!!!# ' $!! # #!# '! "### "!3$ $ 3! ## #" #!## +$! #!''#$!!# # '$!' * *!!!# '#!##$ ' " "#$ *!+ * *!!!# '" #"#$ " "#$ 国家自然科学基金面上项目! "#$ %&' 3 '!$'
复旦学报 医学版 年 月 + +$ ""#!#8 $ $%,$#$,$#$-&&. $# $/:1 02/ 基因编辑技术是对基因组,() 进行特异的修饰 使,() 发生定点突变 多位点同时突变 基因插入以及基因缺失等 并在,() 分子水平进行准确的编辑 目前 在基因组定点修饰方面已有了突破性进展 发现了一种新的基因组定点编辑技术 规律成簇间隔短回文重复结构!# " #!!$# ' #! * ** * 相关蛋白 * *&!! # #! 系统 利用 *() 指导核酸! 对基因组,() 进行定点修饰 这种基因编辑技术已被广泛应用于人体细胞 斑马鱼 小鼠及植物等物 种的功能基因组学研究 * *! 基因组编辑技术不受生物体干细胞系的影响 理论上在任何种类生物中都能实现定向 准确的基因改造 在分子生物学研究领域 该技术可以快速构建动物和细胞模型 在农业研究领域中 这项技术可以用于改造植物基因组,() 序列 使其满足人们的需求 如改良玉米 水稻等农作物 在临床医疗中 * *! 基因编辑技术可以更加精准而深入地探索疾病发病机制 研究靶基因的生物功能 提高基因治疗的疗效 因此 * *! 系统基因编辑技术具有非常广阔的应用价值 本文综述了 * *! 系统的来源 结构 作用原理和其在现代生物学研究和基因治疗领域的应用 - $ 2 系统的发现!$ 等 于 年首次在 5 大肠埃希菌," & 的碱性磷酸酶基因附近发现了功能尚不明确的重复间隔,() 序列 随后 大量的相似重复间隔,() 序列陆续被发现 年! 与 1 将这些相似重复间隔,() 序列命名为 * * 并首次提 出了! 概念 报道指出有. 的细菌基因组和. 的古细菌基因组中含有这些重复序列 年 研究者又发现 * * 系统中的很多间隔序列与宿主菌染色体外的遗传物质高度同源 推测细菌可能通过 * * 系统以类似于真核生物的 *() 干扰 *()#*() 方式抵抗外源核酸序列的入侵 ** 基因能够被转录 并且 基因可以编码具有核酸酶功能和解旋酶结构域的蛋 白质 年 8 " 等首次发现并证明细菌可能利用 * * 系统抵抗噬菌体入侵 年 等又发现细菌 * * 系统能阻止外源质粒的转移 首次利用实验验证了 * *! 系统的免疫功能 年 研究者首次利用 * * 系统对人 + 细胞, 4 ' #!! $'2 和 2+) ' 基因以及小鼠来源神经瘤母细胞 '!!#'(!( ) 和酪氨酸羟化酶 #! $ 2! +$ 进行了定点突变 * * 系统能高效编辑基因序列 已分别在人类细胞 小鼠细胞和斑马鱼中成功对部分基因进 行编辑 - $ 2 系统的结构 * * 是一个多样性的,() 序列家族 它们具有相同的结构 即由一系列长度为 的重复序列 # 串联 中间被一系列长度为 的特殊序列! 隔开 构成 #&! & # 的结构模式 * *! 系统可分为 个亚型 每个亚型包含 个不同的特异性 基因 其中有 个核心 基因 广泛存在于这些 亚型中 但是只有 和 存在于所有 * * 系统中 还是一个普遍的标志基因 研究者在! 蛋白质上发现了核酸外切酶和内切酶结构域以及解旋酶 *() 和,() 结合转录调控结构 域等 - $ 2 系统的作用机制 目前已发现 种类型的 * * 系统 其中研究较深入的是第 种类型 * * 基因座首先转录出 & *() &* *& *() 和 # *() #!& ##"*()& *() 由 *(! 和一些未知的酶催化为成熟 *() * *& *() 后者通过碱基配对与 # *() 结合形成 # *() *() 复合物 即!"&" *()!" *()! 是一种双链,() 核酸酶!"*() 通过碱基互补配对原则定位到,() 上的特定位点 招募! 核酸酶切割,() 切断的,() 被细胞内修复系统修复的过程中会产生突变 从而达到定点改变基因组的目的 即形成双链断裂
史 云 等 * *! 系统在现代生物学研究和临床试验学中的应用!#-, 8 引发生物内源的非同源末端连接 &$' "! 1"( % 修复或同源重组 $' "! ' # * 修复 在缺乏同源性染色体模板时,() 损伤主要通过 ( % 进行修复 这是一种差错率非常高的修复 会导致在修复位点或修复位点附近产生碱基的插入或缺失 如果突变发生在目的基因的编码区 就会使目的基因发生移码突变 从而达到敲除目的基 因的效果 第 种方式是在同源性染色体模板存在情况下 通过 * 的方式进行精确修复 也可以对特定的核苷酸位点进行替换 从而实现插入特定基因序列的目的 - $ 2 的应用建立细胞模型 最近 * *! 基因编辑技术与诱导多能干细胞 # #!# '! 重编程技术已经成为近年来生命科学领域两大热门技术 诱导 转化的成功极大地促进了转化研究 诱导细胞重编程有多种策略 最新的策略包括 " 基因 转录因子 2 原癌基因 " '" 和 5 样因子 抑癌基因 & 这 种转录因子基因引入细胞 诱导其转化成 产生 的 与胚胎干细胞相似 可作为药物开发 和高通量复合物筛选的实验模型细胞 先进的,() 测序技术能够测出患者体内突变的基因序列 而 * *! 基因编辑技术能够验证该突变基因与疾病的相关性 研究证明 * *! 基因编辑技术可用于对某些遗传病患者的 进行基因修复 修复后的 经诱导 定向分化成目的组织或器官 从而逐渐取代病变组织或器官 这种策略已被应用到巴斯综合征的研究 这是一种由 染色体遗传的心脏病 由. 基因突变造成. 基因编码线粒体酰基转移酶 参与合成的双磷脂酰甘油对心脏结构和功能及其他 器官都具有重要作用 ;" 等已经研究出能生成巴斯综合征的 诱导多能性 细胞 然后通过 $ #&&& $ 模型系统 发现. 基因突变影响心肌细胞的组装和收缩 这些基因突变的因果效应验证了 来源于健康捐赠者的细胞用 * *! 编辑后 生成了. 基因突变体的 该细胞与巴斯综合征来源的 产生类 似作用 此外 可作为巴斯综合征测试的候选治疗药物 建立动物模型 为了在动物体内模仿人类疾病 模型 科学家们使用 * *! 基因编辑技术生成携带突变基因的动物模型 该突变基因的编辑 可用于构造许多人类疾病 包括酪氨酸血症 肺 癌 肌营养不良的小鼠模型和猴模型 这些疾病的动物模型可用于研究致病机制和测试治疗方案 这些动物模型也被用于验证 * *! 基因编辑技术能否修复突变基因 : 等利用尾静脉注射法将带有 * * 和!"*() 的一条单链,() 供体注射到患有 型酪氨酸血症的小鼠体内 以此来探索 * *! 技术能否治愈该种疾病 型酪氨酸血症又称 先天性酪氨酸血症 是一种因延胡索二酰乙酰乙酸水解酶 ' # '### $! $ 基因突变而导致的富马酰乙酰乙酸盐水解酶缺乏引起酪氨酸代谢异常 严重肝损伤及肾小管缺陷的常染色体隐性遗传性临床综合征 作者发现 * *! 系统介导的基因编辑使野生型 基因可以表达 能够挽救部分肝细胞 基因编辑并没有发生在所有肝细胞内 而是随机编辑肝细胞 编辑后的正常肝细胞得以生存 生长 然后重新填充肝 脏 这项研究利用基因编辑技术选择性地进行基因修复 且部分修复成功 这为在体内使用这种技术治疗疾病提供了新思路 * *! 基因编辑技术可能成为一种治疗遗传疾病的方法 杜氏肌营养不良症 $ '!!# $,, 是一种含致命基因的肌肉萎缩性疾病 由 基因制造出一种重要的肌肉萎缩蛋白!# $ 导致骨骼肌不断退化 出 现肌肉无力或萎缩 导致行走不便 % 等 和 )' 等使用腺相关病毒 &!! #!)) 携带 * *! 系统的基因为,, 患病小鼠清除有害的,() 序列并修复 基因 从而恢复心肌细胞和肌肉干细胞的功能 * *! 基因编辑技术已被用于破坏 整合进入宿主的一个至关重要的基因 5$ 等通过尾静脉注射法将 * *! 系统注射到宿主动物体内 用于破坏 感染的一个重要受体途径 * 研究结果显示多器官中 病毒表达量有所下降 这为 * *! 治疗病毒感染疾病提供了新思路 生物疗法 猪的器官 包括心脏 角膜 肝脏 肾等 与人高度相似 被认为是最有可能成为移植到人 体的异种器官 * *! 基因编辑技术能
复旦学报 医学版 年 月 够在生物体内高效敲除多个基因 这种能力使得该 技术运用于各项研究中 $ $ 实验室利用 * *! 技术去除猪体内的 个内源性逆转录病毒基因 从而获得无逆转录病毒器官的猪 使 其适用于异体移植 % # 等证明胶囊包裹的猪胰岛细胞移植到 型糖尿患者体内能够产生胰岛素 经 * *! 基因编辑技术去除内源性逆转录病毒基因的猪可以作为生物疗法的来源 人血清白蛋白可用于治疗休克和肝衰竭 然而昂贵的费用和低产量限制了其在临床上的使用 而经基因编辑的猪有望成为人血清白蛋白的重要来源 当然从猪体内的白蛋白中分离人血清白蛋白还面临很大的 挑战 $" 等利用 * *! 技术编辑将猪体内编辑血清白蛋白的基因换成了人血清白蛋白的,() 经过这种改造的猪虽然只用于为人类提供人血清白蛋白 这也为其他生物疗法提供了策略 如在被驯化的动物体内生产人源化的多克隆抗体 结语 * *! 基因编辑技术编辑的 对人类疾病有巨大的治疗潜力 特别是单基因突变引起的疾病 患者来源的 通过 * *! 基因编辑技术进行编辑后 在体外筛选之后再回输到患者的体内 可取代特异性病变的组织或者器官 此外 * *! 技术对人类器官进行编辑以及再生疗法为生物疗法开辟了新的道路 * *! 基因编辑系统需要病毒载体将携带有! 和!"*() 的基因序列带入细胞或组织 因此需要一个既安全又高效的,() 传递系统 来保证基因编辑的安全性 ) 是一种腺病毒相关的质粒 为基因的传递提供了安全的载体 在 肝脏 肌肉 视网膜中已经得到验证 动物显微注射和细胞转染也获得成功 还需要进一步寻找一种能快速传递 * * 系统到目的器官并具有修复效应的,() 片段 * *! 系统为构建更加安全高效的基因定点修饰技术提供了广阔的平台 虽然尚处于起始阶段 但已表现出巨大的应用潜力 参 考 文 献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
史 云 等 * *! 系统在现代生物学研究和临床试验学中的应用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收稿日期 编辑 段佳