中国畜牧兽医 3 " 贵州部分地区猪源大肠杆菌耐药性分析及 -% 基因型检测 曹 敏 谭艾娟 吕世明 常 鑫 丁昌庆 陈 婷 王珍燕 贵州大学药学院 贵阳 贵州大学生命科学学院 贵阳 贵州大学动物科学学院 贵阳 摘 要 为了解贵州地区规模养猪场大肠杆菌菌株耐药情况和. 基因型的流行情况 试验采用 推荐的方法对采自贵州省 个地区规模养猪场的 株大肠杆菌进行药物敏感性试验和产. 菌的检测 并用 % 方法对."3 和.3" 种常见 基因进行检测 结果显示 株大肠杆菌对 种常用抗菌药物耐药率分别是头孢噻呋 <A 氨苄西林 <A 四环素 <A 庆大霉素 <A 链霉素 <A 多黏菌素 <A 环丙沙星 <A 卡那霉素 <A 金霉素 <A 和氟苯尼考 <A 且大多为多重耐药 其中检测出. 阳性菌株 株 阳性率为 <A 各个地区的检出率不同 株产. 大肠杆菌中."3 和.3," 基因的检出率分别为 <A<A<A 和 <A 且多为复合基因型耐药菌株 各地区的各种基因检出率不同 试验结果表明 贵州部分地区的猪源大肠杆菌耐药现象严重. 菌株的检出率很高 耐药基因的检出率也极高 且多为复合基因型耐药菌株 应加强当地产酶耐药菌的监测和研究 有效防制此类细菌引发的疾病 关键词 猪源大肠杆菌 耐药性. 基因型中图分类号 < 文献标识码 ' 文章编号 %%&&%%&',&&-%'& *&&%&%,/)& ' '& '3/ ) '&9 &/.& '& :+/ & &-*%&+* & & *%&+* & &*%&+* %3,,+-3-+,/+/,+,-3,/-+/*++. +,+ &,-/ /*+/-) 33,+/,)-/* 3+,*,&,-/ +-++,+-)+',++,+. / +,+/+,+-)+,//-)+,&' / /)*+/,++,+ -3-+,/+*/ ). +-+//*+%+-+3*, +,/,,+-3-+,/+-/,+ &,-/,,+ /,)-/*/+, +-++3-A/)*A,+,-/*+<A +,/)A,-+,)A*)A-*/A//) A*-,+,-/*+A /*-+*A-++,+*/ ),+) +-+ )3*,*+-3-+,/+,-/ 3-,+-++-+,-/.,++,+, -/,+/ A/,++,+,-/,+ -+ +-++-+,++,+,-/,+." 收稿日期 基金项目 贵州省科技厅农业攻关计划项目 生鲜乳安全保障关键技术集成与示范 黔科合 &: 字 号 贵州大学研究生创新基金项目 黄酮类化合物对耐药大肠杆菌抗菌增敏作用及机制研究 研农 作者简介 曹 敏 女 贵州毕节人 硕士生 研究方向 细菌耐药性.)/*) 通信作者 吕世明 男 贵州铜仁人 博士 教授 硕士生导师 研究方向 药理学及毒理学.)/*** ))
期 曹 敏等 贵州部分地区猪源大肠杆菌耐药性分析及. 基因型检测.3" / 3 ++.-3 &,-/ +-+ <A AA /A-++,+*',++,+,-/,+ +-+/-3 -+ +-+3*, +,/,,+-3-+,/+&,-/ -) /*+/-) / +-3 33/,++,+,-/,+.,-/ / +-,+-3-+,/++++,+, -/,+/ +,-+)+*/ ),-3-+,/+,-/ +-+,+),++,+-3 -+,/,-++,/3-+*/* +,+-/-*++,+*+ 3*-+-+ ),-/,3/3,,+.-3-3-+,/+/,+-/ *'% +&-3-+,/+. +,+ 细菌对 内酰胺类抗菌药物耐药的重要是由于产超广谱 内酰胺酶. 的产生 其使药物 内酰胺环水解而失去抗菌活性 该酶主要由大肠埃希菌等革兰氏阴性菌产生 通过质粒编码 能以接合 转化和转导等方式在细菌间传播耐药基因 肠道大肠杆菌是多种耐药基因的传播媒介和贮存库 随着抗菌药物的不规范使用甚至滥用 如药物长期添加于饲料中 致使肠道大肠杆菌对一些抗菌药 物的耐药性越来越严重 耐药率逐渐增高 致病 性大肠杆菌是导致仔猪腹泻的主要原因之一 抵抗力较低的仔猪一旦被耐药致病性菌感染 很难医 治 死亡率高 给养猪业带来极大的经济损失. 引起的耐药性已成为临床治疗的突出问 题 本试验从贵州 个地区采集 株猪源大肠杆菌为试验菌株 测其对 种抗菌药物的敏感性并检测. 菌 用 % 扩增方法检测 种 基因 以期为当地兽医临床正确选用抗菌药物和控制 基因的快速传播提供依据 材料与方法 + 材料 样品来源 年从贵州遵义 安顺 铜仁和黔南 个地区的 个规模养猪场的健康猪肛门拭子和猪场排污口分别分离获得 和 株 共计 株猪源大肠杆菌菌株 质控菌株 大肠埃希菌 ' 和肺炎克雷伯菌 ' 均购自中国兽药监察所 抗菌药物与药敏纸片 抗菌药物 氨苄西林 头孢噻呋 多黏菌素 链霉素 金霉素 卡那霉素 环丙沙星 四环素 庆大霉素和氟苯尼考均购自美仑生物技术有限公司 药敏纸片 头孢他啶 片 头孢噻肟 片 头孢他啶 克拉维酸 片 和头孢噻肟 克拉维酸 片 均购自杭州微生物试剂有限公司 培养基与试剂 肉汤购自青岛高科园海博生物技术有限公司 米勒 海顿肉汤 购自 */- 公司 琼脂购自上海博微生物科技有限公司?.. /,+- 和 &' /-+- 均购自北京康为世纪生物科技有限公司 主要仪器与设备 超净工作台购自苏州市华宇净化设备有限公司 % 仪购自基因有限公司 凝胶成像系统购自美国 %/ 公司 + 方法 产. 菌的检测 按 推荐方 法进行操作和判读 初筛试验 将受试菌株均匀涂布于 琼脂平板 贴头孢他啶 片 和头孢噻肟 片 培养 当两个药物抑菌圈直径满足以下任一条件 头孢他啶 )) 头孢噻肟 )) 判定为疑产. 菌株 需进一步作确证试验 以大肠埃希菌 ' 作阴性对照 同时以肺炎克雷伯菌 ' 作阳性对照 确证试验 将受试菌株均匀涂布于 琼脂平板 分别贴头孢他啶 ) 和头孢他啶 克拉维酸 片 及头孢噻肟和头孢噻肟 克拉维酸 片 两组纸片 培养 对两个中任何一个药物 加克拉维酸后抑菌圈直径与不加克拉维酸的抑菌圈相比 增大值 )) 时 判定为产. 菌株 药物敏感性试验 按照 推荐方法 采用微量肉汤稀释法测定 株猪源大肠杆菌对 种抗菌药物的敏感性 % 法检测 种 基因 引物设计与合成 根据 +/ 公布的 基因序列 用 -)+-.-+ 软件分别设计."3, 和.3" 种基因的特异性引物 引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成 引物信息见表
中 国 畜 牧 兽 医 卷 表 种常见 *, 基因的引物序列.%&%&'%*,&% 目的基因 引物序列 @ @ % 产物大小 退火温度 /-+,++ -)+- +3++ -3, + '+/*,+)+-/,3-+." >'' %'' 3, >'' %'' >'''' %'''.3,", >'''''''' %'''' % 扩增 采用 % 法对 株. 阳性菌株进行 种基因检测 利用水煮法提取质粒 &' 作为 % 检测模板 % 反应体系?.. /,+-&' 模板 上 下游引物各 双蒸水 % 反应条件见表 % 产物进行 A 琼脂糖凝胶电泳 将 % 产物送上海生工生物工程技术服务有限公司测序并比对其同源性 以确认所检测的基因 以大肠埃希菌 ' 作阴性对照 表 反应条件.& &'&% 目的基因 预变性 变性 退火 延伸 循环数 个 终延伸 保存温度 /-+,++,/*+/,3-/, +/,3-/, '+/*.,+ *+ >/*+,+ /+,+)+-/,3-+." ) ) ) 3, ) ) ).3,", ) ) ) ) ) ) ) ) 结果与分析 + 产 -% 菌检测结果 株猪源大肠杆菌中检测出 株. 阳性菌 阳性检出率为 A 其中遵义 安顺 铜仁和黔南 个地区. 阳性菌株的检出率分别为 A A A 和 A + 药物敏感性试验结果药物敏感性试验结果见表 由表 可知 株猪源大肠杆菌对 类 种抗菌药物均有不同程度耐药 其耐药率分别为氨苄西林 A 头孢噻呋 A 庆大霉素 <A 链霉素 A 金霉素 A 四环素 A 卡那霉素 A 多黏菌素 <A 环丙 沙星 A 和氟苯尼考 <A 结果表明 个地区的规模养猪场分离的大肠杆菌耐药严重的抗菌药物有 内酰胺类 四环素类和氨基糖苷类 而对氯霉素类相对敏感 对 株猪源大肠杆菌对 种抗菌药物的多重耐药情况进行统计 多重耐药菌株的检出率见图 由图 可知 多重耐药率为十重 A 九重 A 八重 A 七重 A 六重 A 五重 A 四重 A 三重 A 及二重 <A 结果表明 多数耐药菌株为多重耐药株 且多数呈 种以上耐药 其中四重和八重耐药菌株最多 检出率均高于 A 说明被检测菌株耐药很严重 且多为交叉耐药
期 曹 敏等 贵州部分地区猪源大肠杆菌耐药性分析及. 基因型检测 表 贵州部分地区分离的猪源大肠杆菌的耐药率 A.%%&%%%%&,/)& 抗菌药物 遵义 株 安顺 株 铜仁 株 黔南 株 总耐药率 ',)-/*/+, :3 '3 -+ 4//,/*-+,/+-/,+ 氨苄西林 ')* 头孢噻呋 +3- 庆大霉素 +,/) 链霉素,-+,) 金霉素 *-,+,-/*+ 四环素 +,-/*+ 卡那霉素 "//) 多黏菌素 *) 环丙沙星 -*/ 氟苯尼考 >*-+* 图 株猪源大肠杆菌多重耐药菌株检出率 +&'%%&%&% +*, 基因的 检测结果 株产. 猪源大肠杆菌中." 3, 和.3,", 基因的总检出率分别为 AAA 和 A 由表 可知 株同时检测出."3, 和.3, ", 基因 同时含 种基因的复合基因型菌株检出率高达 A 株同时检测出 种基因 株同时检测出 种基因 株仅检测出." 基因 株. 阳性菌未检出这 种基因 部分 基因 % 产物电泳结果见图 表 *, 基因的检出率.&*,& 基因 ++ 检出菌株数 株,-/ 基因检出率 A+,+,-/,+."CC3,C.3"."CC3 3CC.3",."C.3"."C C.3"."C3,." 株. 阳性菌中有 株未检出这 种目的基因 >3-,/-+,++ +-+,+,+,+,-++,-/.-3&,-/
%%& 中国畜牧兽医 )* 卷 >9 F大 肠 埃 希 菌 9:L? %"?分离菌株 >9 F>? 9:L?%? - 图 A 基因 *)K 扩增结果电泳图 %"P分离菌株 F大 肠 埃 希 菌 9:L? >9 % P - F >? 9:L? >9 图 &>"* 基因 *)K 扩增结果电泳图 *)K+ >A C &*)K+ >>"* C >9 F大 肠 埃 希 菌 9:L? %"分离菌株 >9 F>? 9:L?% - 图 % 基因 *)K 扩增结果电泳图 %*)K+ > C %"P分离菌株 F大 肠 埃 希 菌 9:L? >9 % P - F >? 9:L? >9 图 > * 基因 *)K 扩增结果电泳图 *)K+ >> * C 制度同时较大剂量地使用多种抗菌药致使多重耐 & 讨 论 药菌株大量产生& 药情况非常严重&%) 株大肠杆 菌 对 临 床 疾 病 防 制 内酰胺类药物因抗感染 效果 较好 而 成 为 临 床 ' 治疗感染的首选药物但随着该类药物的广泛使用 最常用的 大类 %& 种 抗 菌 药 物 均 出 现 不 同 程 度 的 特别是不规范使用 和 滥 用在 药 物 的 选 择 压 力 下 致 耐药其中头孢噻 呋'氨 苄 西 林'庆 大 霉 素 和 四 环 素 使大量耐药菌株产生&细菌耐药机制有抗菌药物作 的耐药率均大于 P&e 最 低 为 氟 苯 尼 考" %'?Le 用靶位的改 变'生 物 被 膜 的 形 成'主 动 外 排 系 统 活 其结果与 王 秀 梅 等 )%&*'郭 潇 木 等 )%%*和 林 居 纯 等 )%* 跃'灭活酶或钝化 酶 的 产 生'细 胞 膜 通 透 性 的 改 变' 报道的耐药率相近且多数耐药菌株为多重耐药多 代 谢 途 径 或 代 谢 状 态 的 改 变 等其 中 细 菌 产 生 数呈 ) 种以上耐药其 中 四 重 和 八 重 耐 药 菌 株 检 出 F@HI是病 原 菌 对 ' 内 酰 胺 类 药 物 耐 药 的 主 要 机 率高于 %Le 结果表明被调查的 养 猪 场 抗 菌 药 物 的 制&在贵州 ) 个地区采集分离的 %) 株猪源大肠杆 使用极不规范没有 严 格 执 行 梯 度 用 药 和 轮 换 用 药 菌中 有 %*/ 株 为 F@HI 阳 性 菌 株阳 性 检 出 率 为 规模 养 猪 场 耐 药 性 检 测 结 果 显 示大 肠 杆 菌 耐
期 曹 敏等 贵州部分地区猪源大肠杆菌耐药性分析及. 基因型检测 <A 比 -/- 等 <A 和苑 丽等 <A 报道的检出率均高 明显高于胡功 政等 <A 和付秀玲等 A 的报道结果 这说明被调查养猪场的大肠杆菌中产. 菌的比例较高 而产. 菌主要对 内酰胺类抗菌药物耐药 这与药物敏感试验中测得氨苄西林 <A 和头孢噻呋 <A 的耐药率较高吻合 遵义 安顺 铜仁和黔南 个地区. 阳性 给养殖业带来巨大的经济损失 此外 猪作为动物源食品 这些耐药性大肠杆菌转移到人体后 能在人体肠道中将耐药基因传递给其他病原菌而引发疾病 还可能会直接导致人类疾病治疗失败 因此 为控制和减少耐药菌株的产生 提高动物源食品的整体质量 促进公共卫生安全 在畜禽养殖中 要注意抗菌药物的合理使用和开展广泛的动物源细菌耐药性监测 菌株的检出率最高的为遵义 <A 最低的是安 顺 <A 各个地区的检出率不同 可能与各地的用药习惯 用量和用药时间等因素有关. 菌具有多重耐药和交叉耐药的特点 试验中多数耐药菌株对 种以上抗菌药物耐药 推测 内酰胺类药物在这些规模养猪场的临床治疗效果较差 继续大剂量使用可能会导致治疗失败及药物残留的出现 威胁公共卫生安全 因此 建议这些地区停止使用该类药物 并组织调查当地规模养猪场大肠杆菌的药物敏感性 根据药物敏感性调查结果制定合理的轮换用药方案 编码 内酰胺酶的 基因不断被发现 内酰胺酶引起的耐药性越来越复杂." 3, 和.3", 基因是编码 内酰胺酶的 个主要质粒基因 对其进行检测有利于掌握这几种基因的流行情况 本研究发现贵州地区. 菌株的."3, 和.3", 基因的检出率都较高 且多数菌株带有两种以上基因 其中." 和 基因为贵州地区产. 大肠杆 菌的流行基因型 与许颖等和杜向党等的检出结果相似 株. 阳性菌未检测出这 种目的基因 可能这 株菌株的. 是由其他基因编码的 而据有关资料显示不同地区流行的基因型不 同 其原因有待进一步研究 综上所述. 菌具有多重耐药的特征 且. 主要由质粒基因编码 质粒基因可通过接 合 转化和转导等方式在细菌间传播耐药基因 这将使很多的敏感菌株携带有这些耐药质粒 在一定的药物选择压力下 携带耐药质粒的敏感菌株会变为. 耐药菌株. 耐药菌株对养殖业有巨大威胁 如抵抗力低下的仔猪感染耐药菌 将会 参考文献 刘玉华 王琳琳 方向红 等 < 鸡源大肠杆菌超广谱 内酰胺酶的检测及耐药性分析 < 中国畜牧兽医 < 张俊丰 黄东璋 陈 琳 等 鸡肠道大肠杆菌的分离鉴定及耐药性分析 中国畜牧兽医 ",+&&+*+%/,- /+ +)*/*/-/,+-, + +/,/*-+ /--+/ -)+3- / +- " ' 岑廷云 断奶仔猪腹泻的病因分析与防治 中国畜牧兽医文摘 郝智慧 肖希龙 邱 梅 等 不同区域鸡大肠杆菌对抗菌药的耐药性比较 中国兽医科学 朱玲云 郑龙龙 毕俊龙 等 曲靖地区仔猪腹泻细菌性病原的分离鉴定与耐药性分析 中国畜牧兽医 汤 电 张浩吉 刘 继 等 广东地区患病食品动物源大肠杆菌. 和 ') 酶流行分布调查 中国兽医学报 */*//-/,-,//-,,3,++--) /+,//- -/,)-/*/*3, 3 +,*,,+, -/,+-/*/,+-)/)/*/ -+,//- '+'*/* //-/,-,//-,,3,+ */*//-/,-,//-,,3,+ +--)/+,//- -/,)-/* 3+,*,,+,,+,+, -)/,/* 3*+)+, ' 王秀梅 蒋红霞 廖晓萍 等 猪源致病性大肠杆菌的
中 国 畜 牧 兽 医 卷 血清型毒力基因及抗菌药耐药性的调查 中国农业科学 郭潇木 杨 铜 贺丹丹 等 广东地区猪源大肠杆菌耐药性及其系统发育群的研究 中国畜牧兽医 林居纯 舒 刚 张辉建 等 健康畜禽肠道大肠杆菌耐药性及整合子 基因盒检测 中国兽医学报 -/-%&///-///" ++*/" +,+,+,++ +,-3)+,/*/,/)/+-)*/* */,+ //+-+-&"&& 苑 丽 刘建华 胡功政 等 株鸡大肠杆菌. 基因型检测鸡耐药性分析 中国预防兽医学报 胡功政 匡秀华 苑 丽 等 产. 鸡肠杆菌科细 ') 酶的检测及药敏分析 华中农业大学学报 3 "/ '++- ' '' 3,/* */ /, +)+-*/,/)/+ /, --+*/,, )*+3*/-,-3,3-+& & 许 颖 李晓庆 江 俊 等 产. 大肠埃希菌耐药基因分型研究 四川医学 杜向党 焦显芹 莫 娟 等 猪源大肠杆菌 9 型的分子检测 华北农学报 +-)-+ /, %/ &+,/* 9/,+/+..3-+ & & 许桂芳 金春光 产超广谱 内酰胺酶大肠埃希菌耐药性及基因同源性研究 中国卫生检验杂志 菌对 种抗菌药的敏感性检测 中国人兽共患病 学报 责任编辑 董晓云 付秀玲 吴 华 陈红英 等 禽致病菌. 和