水 生 生 物 学 报 卷 试验溶液每天更换一次 暴露 各取 尾 鱼测量体长 体重 并于 保存 用于测定鱼体总甲状腺素 和卵黄蛋白原 含量 其余 的鱼转入自动循环缸 清水饲养 个月后取 尾测 其体长 体重及 含量 从对照组和 暴 露组随机取 尾雄鱼与 尾雌鱼配对 观察每对鱼的产卵情况 从第一次产卵开

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1 第 卷第 期水生生物学报 年 月 钟雪萍 徐 盈 梁 勇 廖 涛 王剑伟 中国科学院水生生物研究所 淡水生态与生物技术国家重点实验室 武汉 研究了己烯雌酚 对稀有 鲫 生命早期暴露的影响 经 和 己烯雌酚暴 露 后 稀有 鲫死亡率升高 生长发育迟缓 鱼体内卵黄蛋白原 的诱导明显 经过一段时间清水养殖后 暴露组中雌鱼比例增加 雌雄鱼生长较对照组有显著变化 雌鱼性腺发育及产卵量与对照组相比虽无显著差异 但暴露组成鱼所繁育后代与对照组相比受精率 孵化率显著下降 死亡率 畸形率明显上升 这些结果说明己烯雌 酚生命早期暴露影响稀有 鲫的生长发育及生殖 稀有 鲫生命早期暴露实验可以用于评价水生态系统中内分泌 干扰物的生态影响 稀有 鲫 己烯雌酚 生命早期 内分泌干扰物 环境雌激素是指环境中存在的 能通过模仿天然荷尔蒙的作用而干扰人类或野生动物内分泌系统 诸环节并导致异常效应的物质 环境雌激素的种类较多 包括有机氯农药 表面活性剂 增塑剂及一些 人工合成雌激素等 随着环境污染的加剧 这些物质从相应的生产过程不断释放 通过饮食 接触等途 径进入生物体内 对人类的健康及生物的生存产生巨大影响 近年来 人们认为许多现象的发生均与 环境雌激素有关 例如 人类隐睾症与尿道下裂等疾病发病率提高 男性平均精子数量减少 女性不孕明显上升 水生动物出现雌性化现象 及某些鸟类出现 行为反常和生育能力丧失 鉴于环境雌激素深 远的负面效应 有关环境雌激素的污染监控及其生态环境安全评价已成为当今环境科学研究的前沿和 热点 己烯雌酚 是一种医用人工雌激素 早期 被用于治疗流产 前列腺癌等疾病 后来由于与阴道癌 子宫癌和乳腺癌等的发生有关而在许多国家被 禁止使用 但是 在国内一些地区的淡水养殖中 仍被用作生长促进剂 并且在生活污水中该化 合物可被检出 因此 的污染监控及生态环境安全评价研究具有重要意义 稀有鲫 是中国特有的一种 小型鲤科鱼类 具有生命力强 饲养简便 性成熟快 周年产卵等优点 目前 已有研究表明他是一种敏感的实验动物 因此 本文选择 作为模 型化合物 以稀有鲫作为受试动物 利用鱼类生殖生长的相关指标以及卵黄蛋白原 甲状腺激素等生 物标志物 研究环境雌激素生命早期暴露对水生生物生命各时期和后代的影响 同时也为稀有鲫成 为筛选和评价内分泌干扰物的活体实验模型提供一些实验依据 稀有 鲫的繁育在实验室内进行 鱼卵孵出后 开始暴露 实验温度控制在 光暗比 日本 冷冻高 速离心机 美国安捷伦公司 分光光度计 美国 酶标仪 美国 全自动免疫发光仪 和 乙炔基雌二醇 购于 公司 购于 公司 辣根过氧化物酶标记的羊抗兔 购于华美公司 溶解于乙醇 设置 个浓度 和 对照组仅加入乙醇 终浓度 试验容器采用 玻璃缸 鱼卵收集 后即分为 组 每组 个平行 每个平行 颗卵 国家自然科学基金 科技部 项目 资助 钟雪萍 女 河南信阳人 博士研究生 研究方向为水生态毒理学 徐盈

2 水 生 生 物 学 报 卷 试验溶液每天更换一次 暴露 各取 尾 鱼测量体长 体重 并于 保存 用于测定鱼体总甲状腺素 和卵黄蛋白原 含量 其余 的鱼转入自动循环缸 清水饲养 个月后取 尾测 其体长 体重及 含量 从对照组和 暴 露组随机取 尾雄鱼与 尾雌鱼配对 观察每对鱼的产卵情况 从第一次产卵开始 收集 内所产 卵 孵化 计算受精率和孵化率及 代幼鱼的存活 率和畸形率 实验鱼轻 度麻醉后 按 体重的剂量将溶于豆油中的 注入鱼的腹腔 诱导 后 用注射器从鱼的 尾脊柱处穿刺取血 血液在 条件下静置 于 离心 取上清 通过 阴离子交换液相层析柱技术来分 离和纯化卵黄蛋白原 称取 卵黄蛋白原冻干粉 溶于 蒸馏水中 加入 弗氏完全佐剂 乳化后于新西兰大白兔背部皮内多 点注射 进行初次免疫 在 加强免疫一 次 免疫剂量和免疫方式同前 但采用弗氏不完全佐剂乳化抗原溶液 后 从兔耳缘静脉抽取少量 血液测量抗体滴度 如果抗体效价较低 可再加强 免疫一次 如果抗体效价高 则从兔颈动脉放血 制 备卵黄蛋白原抗血清 将鱼解冻后 加入 预 冷的磷酸盐缓冲液 于冰浴下匀浆 匀浆液 离心 采用间接 测定上清液中 含量 具体操作 步骤如下 用鲤的 作标准蛋白 用鲤 抗体 作为第一抗体 在 孔酶标板中加入 稀释的 稀有 鲫整体匀浆液 标准样品 阴性标准品及 试剂空白样品 包被过夜 次日加入封闭液 封闭孵育过夜 用洗涤 液洗板后加入稀释液稀释的鲤 抗体 孵育 弃去酶标板中 抗体 洗涤 液洗板后加入稀释液稀释的酶标记羊抗兔 抗体 孵育 弃去酶标记羊抗兔 抗体 洗涤液洗板后加入显色底物 室 温暗处反应 待标准品呈现明显黄色后 加入 反应终止液 终止反应 用酶标仪在 处检测样品的吸光度 根据样品的吸收强度 通过标准曲线计算 浓度 体 含量 采用化学发光免疫技术测定鱼 固定液中固定鱼性腺 按常规方法包埋 切片 染色后在显微镜下观察 用 对数据进 行统计分析 差异显著 定义为对照组和暴露组之间 用稀有鲫受精未满 的卵进行实验 所得 孵化率 死亡率结果见表 从表 可知 稀有 卵的孵化率不受 暴露影响 但稀有鲫幼鱼存活率则随 浓度的升高显著下降 在暴露 后 幼鱼的生长明显受到抑制 和 暴 露组幼鱼体长 体重显著下降 鲫 水平显著升高 采用间接 测定各组鱼体 含量 结果发现经 暴露 后 和 暴露组幼鱼 体内 均有明显诱导 图 参数 浓度 孵化率 存活率 体长 体重 在清水养殖期间 各组死亡鱼数均较少 在清 水养殖 个月后 性腺的形态学观察及组织切片观 察发现 在 和 暴露组中雌鱼比例较 对照组明显增加 暴露组雌雄鱼的生长发生明显变 化 暴露组雄鱼体长 体重显著下降 而雌

3 期钟雪萍等 稀有鲫生命早期的己烯雌酚暴露对生长发育与繁殖的影响 变化 图 图 早期暴露对稀有 鲫幼鱼体内卵黄蛋白原含量的影响 鱼体长 体重显著升高 表 采用间接 测定各组肝脏 含量 结果发现除 暴露组雌鱼外 各暴露组肝脏 含量与对照相比无明显 图 早期暴露对稀有鲫成鱼体内卵黄蛋白原含量的影响 参数 浓度 体长 雄鱼 体重 性腺指数 体长 雌鱼 体重 性腺指数 性比 雄 雌 从对照组和 暴露组中各取 尾雄鱼和 尾雌鱼配对 从第一次产卵开始 收集 内所产 的卵 每对鱼每天所产卵数及每对鱼每批所产卵数见图 从图中可知暴露组的产卵量与对照组相比 没有明显差异 对照组和暴露组卵的受精率 孵化 率 存活率及形态学变化结果见图 从图中可知 暴露组较对照组卵的受精率和孵化率明显降低 幼鱼的死亡率和畸形率明显升高 进一步研究表明 早期暴露使 长 体重显著下降 代雌鱼比例明显增加 雌鱼体 图 己烯雌酚生命早期暴露对稀有鲫产卵量的影响

4 水 生 生 物 学 报 卷 内分泌系统的作用是调控人和动物的生长 发 育 生殖及其行为 内分泌系统分泌的激素通过体 液传递信息 调节蛋白质 糖和脂肪以及水盐代谢 促进细胞分裂和分化 促进生殖器官发育和成熟 影 响中枢神经和植物性神经系统的发育和活动 生命 早期是生物体生长发育的敏感阶段 在此阶段易受到内分泌干扰物的干扰 即使是轻微的干扰 引起 生物体内分泌系统紊乱 进而对生物体产生严重影 响 目前 已有相关文献报道了外源化合物生命早期暴露对生物体产生的多种影响 本研究表明 生命早期暴露可明显抑制稀 有鲫幼鱼生长 并使其死亡率显著上升 这与国际上的相关报道非常一致 ¾ 等研究发现 暴露使胖头 幼鱼生长明显受 到抑制 死亡明显增加 同样 暴露也引起青 的死亡 并导致生长迟缓 在本实验中 幼鱼死亡发生在孵化 以后 且死亡率随暴露时间的延长以较高速率增加 而稀有鲫体内 含量 在 暴露 后显著增加 由于在幼鱼阶段进行 合成会消耗大量能量 并由此对肝 肾等器官产生损害 因此 合成可能是引起幼鱼死亡和生长 迟缓的一个重要原因 有研究表明类雌激素可干扰那些调节鱼类生长的荷尔蒙的作用 虹鳟 幼鱼经 暴露后体内三碘甲状腺氨酸 甲状腺素 水平降低 胖头经甲氧氯 和甲 基睾丸酮 暴露后雌二醇 和睾 酮 的分泌紊乱 在本实验中 稀有鲫经过 暴露 后幼鱼体内 水平上升 稀有鲫 生命早期暴露引起雌鱼生长促进 雄鱼生长抑制 以及肝脏内 含量变化 均可能与稀有鲫体内激 素分泌紊乱相关 鱼在孵化数星期后开始性别分化 而性激素在性别分化和发育过程中起重要作用 已有研究表 明 高浓度雌激素生命早期暴露于可导致鱼雌性化 并使性腺发育受损 青和鲤 的生殖细胞即使在性腺分化以后仍然具有双向性 成熟雄鱼暴露于高浓度雌激素仍可出现雌性 化 因此 鱼类性腺发育的可塑性使其对内分泌干扰物更加敏感 在本实验中 两个暴露组稀有 鲫雌鱼的数量分别提高了 和 这说明 生命早期暴露同样也影响稀有 鲫的性别分 化 另外 暴露组雌鱼的产卵量以及雌雄鱼的性腺发育较对照组虽然无显著变化 但暴露组 代孵化 率 受精率显著下降 死亡率 畸形率显著上升 表 由于成功的胚胎孵化和发育依赖于配子的质量 以及卵子内的营养量 因此配子质量下降可能是稀有鲫生殖健康受损的一个重要表现 生命早期暴露对后代也产生了影响 使雌 鱼比例显著增加 且体长 体重显著下降 后代生长 受到抑制可能是内分泌紊乱引起 本实验室已证实长期低剂量暴露可使后代体内的 及性激素 水平发生改变 等也发现 暴露 使虹鳟后代中雌鱼体内睾酮的含量增加 倍 雄鱼 体内雌二醇的含量增加 倍 早期暴露导致后代性比发生明显改变 但具体原因尚不清楚 国外 曾有文献报道亲鱼受到雌激素暴露后后代兼性鱼比 例增加 但多数研究者认为类雌激素暴露不会影响 后代的性别比例 因此 这一问题有待进一步深入探讨 从以上结果可知 生命早期暴露可使稀有 鲫死亡率升高 生长发育迟缓 并通过影响配子质 量而影响稀有鲫的生殖 生命早期是鱼类生长发育的敏感阶段 易受到环境雌激素的干扰 因此稀有 鲫生命早期暴露实验可用于评价水生态系统中内 分泌干扰物的生态影响 刘永梅 陈伟 李敦海 等 三氯杀螨 对大型蚤的毒性和环境雌激素效应 水生生物学报 杜克久 徐晓白 环境雌 激素研究进展 科学通报 李莉 马陶武 吴振斌 生活污水对稀有 性效应研究 水生生物学报 鲫的毒 王剑伟 稀有 报 鲫产卵频次和卵子发育的研究 水生生物学 周永欣

5 期钟雪萍等 稀有鲫生命早期的己烯雌酚暴露对生长发育与繁殖的影响 成水平 胡伟 等 稀有 鲫 一种新的鱼类毒性试验材料 动物学研究 袁秀平 吴文忠 徐盈 等 对稀有 鲫幼体超微结构影响的观察 水生生物学报 梁 勇 徐盈 杨方星 王剑伟 鲤鱼和团头鲂卵黄蛋白原的诱导 纯化及电泳比较 水生生物学报 ¾ Ê

6 水 生 生 物 学 报 卷

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