动脉粥样硬化 (, ) 是心脑血管 疾病最常见的基本病因, 严重影响人类的生活质量 [ ] 和健康水平 其病理生理过程是由多种危险因子 导致血管内皮损伤, 刺激多种细胞 ( 包括淋巴细胞 巨噬细胞 内皮细胞和血管平滑肌细胞等 ) 参与局部 脂质和糖类积聚 纤维组织增生和钙质沉着形成斑 块, 并伴有动

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1 中国病理生理杂志, ( ): - [ 文章编号 ] - ( ) - - 阿托伐他汀对 基因敲除小鼠动脉粥样硬化病变中 * 表达的影响 齐洁, 徐芳, 马慧, 崔建国, 张清潭 ( 滨州医学院附属医院老年内科, 山东滨州 ; 滨州医学院病理生理教研室, 山东烟台 ) [ 摘要 ] 目的 : 观察载脂蛋白 基因敲除 ( ) 小鼠动脉粥样硬化斑块形成过程中血管平滑肌细胞 瞬时受体电位通道 ( ) 蛋白的表达变化, 以及阿托伐他汀药物干预对 的影响并探讨其作用机制 方 法 : 将 只 周龄雄性 干预组给予阿托伐他汀 ( 小鼠随机分为模型组和他汀干预组, 高脂饲料喂养建立动脉粥样硬化模型 他汀 ) 灌胃, 模型组给予等量生理盐水灌胃 只同龄雄性野生型 小鼠给予普通饲料喂养作为正常对照组 各组小鼠分别喂养至 和 周龄, 分别取 只取血并处死 取主动脉根部做石蜡切片行 染色形态学观察, 测量并计算斑块相对面积 ; 免疫组织化学染色检测各组小鼠 蛋白表达变化 取胸腹段主动脉行实时荧光定量, 检测主动脉中 通道蛋白 的表达水平 结果 : 与模型组相比, 阿托伐他汀干预组的血脂明显下降, 斑块总面积明显减小, 蛋白水平及 含量明显下降 ; 周龄模型组的 蛋白表达稍高于 周龄模型组, 但差异无统计学意义 ; 周干预组较 周干预组相比, 水平有降低趋势且差异有统计学意义 结论 : 阿托伐他汀可能通过下调 蛋白表达从而延缓动脉粥样硬化进程 [ 关键词 ] ; 载脂蛋白 ; 动脉粥样硬化 ; 血管平滑肌细胞 ; 阿托伐他汀 [ 中图分类号 ]. ; + [ 文献标志码 ] : - - -,,, -, - (,,, ;,,, - ) [ ] : ( ) ( ) - ( : ),,,,, - - :,, - -, -, - -, - :, [ ] ; ; ; ; [ 收稿日期 ] - - [ 修回日期 ] - - *[ 基金项目 ] 国家自然科学基金资助项目 ( ); 滨州医学院科研启动基金资助项目 ( ) 通讯作者 : - ; -

2 动脉粥样硬化 (, ) 是心脑血管 疾病最常见的基本病因, 严重影响人类的生活质量 [ ] 和健康水平 其病理生理过程是由多种危险因子 导致血管内皮损伤, 刺激多种细胞 ( 包括淋巴细胞 巨噬细胞 内皮细胞和血管平滑肌细胞等 ) 参与局部 脂质和糖类积聚 纤维组织增生和钙质沉着形成斑 块, 并伴有动脉血管中层退变 血管平滑肌细胞 (, ) 增殖与凋亡是 [ - ] 决定动脉粥样硬化斑块发生发展的重要环节 其中, 瞬时受体电位通道 (, ) 介导血管平滑肌细胞 血管内皮细 胞 巨噬细胞等多种细胞参与了 的病理生理过 [ ] 程, 且已有研究发现 家族成员之一的 - 蛋白表达主要位于血管平滑肌细胞, 参与其收 [ ] 缩 肥大 增殖和迁移等生理及病理过程, 能够促 进 的发展 本实验拟通过载脂蛋白 基因敲除 ( -, ) 小鼠建立 模型, 观察 病程中不同时点主动脉 内 - 蛋白表达的改变, 以及阿托伐他汀干预治疗后 对该蛋白表达的影响, 探讨阿托伐他汀抗 的作用 机制 动物与试剂 材料和方法 实验组选取 周龄 雄性小鼠 ( 品系 ) 只, 正常对照组为同周龄 雄 性小鼠 只, 均购自北京大学医学部实验动物中 心, 合格证编号为 ( 京 ) - 小鼠体重 ~, 饲养条件为二级, 室温控制在 ~, 相对湿度 % ~ %, 光照时间 : ~ :, 自由 饮水及进食 阿托伐他汀由美国辉瑞公司惠赠 ( 药 物批号 : 国药准字 ), 用. % 氯化钠溶解 抗体购自 ; 试剂盒购自福州迈新生 物技术开发有限公司 ; 反转录试剂盒和 荧光试剂盒为 产品 ; 其它相关试剂 均由滨州医学院医药研究中心提供 方法 动物分组与模型制备选取 只 周龄 雄性小鼠给予高脂饮食 ( 基础饲料. % + 脂肪 % + 胆固醇. %), 随机分为模型组 ( 生 理盐水,. ~., ) 和阿托伐他汀干预组 ( 阿 托伐他汀, ), 每组 只 同时 选取 只同龄 雄性小鼠作为正常对照 组, 给予普通饲料饮食 标本处理每组小鼠喂养至 周龄和 周 龄时各取 只处死, 处死前禁食不禁水 无菌 条件下取出心脏和主动脉根部, % 多聚甲醛固定处 理后石蜡包埋, 制成 μ 连续切片用于 染色以 及 的免疫组织化学染色 分离出主动脉胸腹 段于 冻存, 抽提主动脉总, 反转录后采 用 实时荧光定量 的表达 血清学指标测定全血以 检测 低温 离心, 取血清, 应用全自动生化分析仪检测甘油 三酯 (, ) 总胆固醇 (, ) 高密度脂蛋白胆固醇 ( -, - ) 和低密度脂蛋白胆固醇 ( - -, - ) 含量 病理组织学图像测量和分析主动脉根部石 蜡切片行 染色, 用 -. 形态计量 学测算斑块面积及血管内外膜长度, 回归标准圆形 后计算斑块面积与血管管腔面积相对比值 免疫组 化染色检测 阳性染色积分吸光度值 (, )( 显色为棕褐色 ) 缓冲液 代替 Ⅰ 抗作为空白对照 结果判定 : 光镜下, 阳性表 达的细胞围绕蓝色细胞核的胞浆呈棕褐色 每个标 本共取 张切片染色, 同一切片在相同环境下测量 次, 取平均值作为测量结果 的提取和逆转录反应采用 两步 法抽提主动脉的总, 按照 的反转录试剂 盒要求反转录提取总, μ 反应体系如下 : μ, μ,. μ, ( μ ). μ, ( μ ). μ, 去 酶水. μ 反应条件为,, 个循环后最后得到的, 保存备用 - 检测主动脉血管中 的表达采用实时荧光定量 检测 的表达, 内参照基因为, 由大连宝生 物设计引物序列 的上游引物为 - -, 下游引物为 - - ; 的上 游引物为 - -, 下游 引物为 - - 反应体系如下 : ( ) μ, 上游引物 ( μ ). μ, 下游引物 ( μ ). μ, ( ). μ, 模板 μ,. μ

3 反应条件为 ; 然后, 共 个循环 反应结束, 设定最佳阈值, 得到 值 用 ΔΔ 法计算 实验重复 次 统计学处理计量资料以均数 ± 标准差 ( ± ) 表示, 所有统计分析均使用. 统计软件处理 组间均数比较采用单因素方差分析, 两两比较采用 检验, 以 <. 为差异有统计学意义 结果 不同周龄各组小鼠血脂水平 小鼠血脂可自发性升高, 高脂饮食能加 速血脂增高速度 与对照组比较, 模型组血清的 和 - 均升高 ( <. ), 以 和 - 增高最为明显, 且随周龄增加而增高 ; 而 - 有所下降 ( <. ) 给予阿托伐他汀后血清 和 - 均降低 ( <. ), 且以 和 - 下降最为显著, - 水平有所升高 ( <. ) 周龄干预组与 周龄干预组比较, 和 - 有下降趋势, - 有升高趋势, 但差异均无统计学意义, 见表 表 各组小鼠血脂水平的比较 ( ± = ) - - ± ± ± ± ± * ± * ± * ± * ± *# ± *# ± *# ± *# ± ± ± ± ± * ± * ± * ± * ± *# ± *# ± *# ± *# * <. ; # <. ; <. 不同周龄小鼠主动脉粥样硬化斑块的病理学观察 小鼠正常组可见主动脉壁厚薄均匀, 内膜完整, 无动脉粥样硬化斑块形成, 血管中层 亦未见明显病理变化 周龄 小鼠 模型组主动脉内膜明显增厚, 局部可见明显腔内凸起的纤维斑块, 纤维帽较完整, 内含脂质中心及泡沫 细胞, 平滑肌细胞 弹力纤维及胶原组织构成纤维帽主要结构 ; 干预组内膜不完整, 无连续性, 局部内膜明显增厚, 并有泡沫细胞聚集 周龄模型组 斑块弥漫血管全管腔, 纤维肌性成分减少, 有坏死中心形成, 斑块底部有柳叶状的胆固醇结晶 ; 干预组斑块面积及病变程度较模型组显著减轻, 见图 (, ) 图 光镜下观察各组小鼠主动脉

4 不同周龄小鼠主动脉粥样硬化斑块面积定量分 析 周龄模型组 阿托伐他汀干预组与正常对照组 斑块面积 动脉总面积分别为. ±.. ±. 与 ; 周龄模型组 阿托伐他汀干预组 与正常对照组 斑块面积 动脉总面积分别为. ±.. ±. 与 ; 与 周龄模型组比 较, 周龄模型组斑块面积显著增大 ( <. ); 而 同一周龄小鼠斑块面积相比较, 阿托伐他汀干预组 显著小于模型组 ( <. ), 见图 小鼠模型组及阿托伐他汀干预组动脉粥样硬化斑块中的表达明显增高 ( <. ), 且以模型组 增高最为明显 ; 同周龄 小鼠阿托伐他汀干预 组中 蛋白表达较模型组有所下降 ( <. ) 周龄干预组与 周龄干预组相比较呈下 降趋势 ( <. ) 周龄 小鼠模型组与 周龄模型组相比, 周龄 小鼠与 周龄 小鼠比较均无统计学意义 ( >. ), 见图 ~ 不同周龄小鼠主动脉 的表达变化 各时点 小鼠模型组的 水 平显著高于正常组 小鼠 ( <. ), 给药 治疗后明显降低 ( <. ) 周龄正常对照组 小鼠 表达比 周龄正常组略高, 但差异无统计学意义 ( >. ) 周龄时 小鼠模型组 表达稍高于 周 龄模型组, 但差异无统计学意义 ( >. ); 周干预组较 周干预组相比有降低的趋势, 且差异有统计学意义 ( <. ), 见图 讨 论 ± = * <. ; # <. 图 各组小鼠不同周龄斑块面积 管腔面积比值的比较 不同周龄小鼠主动脉 蛋白免疫组化 值的表达变化与正常组 小鼠比较, 蛋白在 [ ] 小鼠是目前公认的研究 发病机制 以及抗 药理学研究等方面最经典的动物模型之 一, 而 小鼠与其具有相同的遗传背景, 因 而常在研究中作为健康对照组 小鼠 的 发病机制是通过影响肝脏对 和乳糜微粒代 谢, 使胆固醇残粒在血浆堆积引起高脂血症, 血脂持 续增高, 大量胆固醇在血管壁沉积形成, 这与人 [ ] 类动脉粥样硬化形成过程相似 小鼠可 以自发形成, 高脂饮食能加速疾病进程 本实验 采用高脂饲喂 小鼠建立 疾病模型, 经观 察发现随时间延长其血脂持续性增高, 周龄时形 成表面的纤维帽, 内含脂质 巨噬细胞 和泡 沫细胞的纤维斑块, 此时病变仅局限于部分血管壁 ; 至 周龄演变为粥样斑块, 且斑块弥漫整个血管横 [ ] 切面, 研究结果与刘剑刚等的研究相一致 动脉粥样硬化始动环节为血管内皮受损, 在内皮下积聚并被自由基氧化, 生成氧化修饰的低 密度脂蛋白 (, - ), - 参与 [ ] 增殖与迁移, 并促进和加速 进展 目 前已证实 的增殖和迁移是决定 及动脉损 [ ] 伤后再狭窄的关键因素 发生发展过程中, 作 为对血管损伤和炎症反应的一部分, 由收缩

5 (, ) - 图 免疫组织化学分析主动脉斑块 的表达 ± = * <. ; # <. ; <. 图 各组小鼠主动脉 中 表达的 值比较 表型转变为增殖表型, 不断增殖 迁移到内膜, 释放 大量细胞外基质 (, ), 并参与 纤维斑块的构成 随着 病变发展, 粥样斑块形成 并向复合病变进展时, 发生凋亡并且远大于 增殖效应, 引起斑块易损甚至破裂 经研究发现 家族在 中大量表达, 最普遍的是 和 [ ] 其中 - 通道蛋白具有脂质离子亚型受体特性, 可识别 作为 - 主要成分的溶血磷脂胆碱 ( -, ), 并且被 - 中的 - 磷酸鞘 [ ] 氨醇 ( -, ) 成分激活 本 实验观察发现 : 通道蛋白在正常组 ± = * <. ; # <. ; <. 图 各组小鼠主动脉 的表达小鼠主动脉 中是稳定低表达的 ; 周龄 小鼠主动脉 中表达量明显增高, 至 周龄时 蛋白表达量增加不明显 其机制可能是, 高脂血症引起血管管壁 - 明显增高, 激活了 通道, 促进 内 + 的增加, 并刺激 由收缩表型转变为增殖表型迁移至血管内膜, 吞噬 - 及脂质形成泡沫细胞, 参与纤维斑块形成并促进 进展 随病情进展至粥样斑块时, 由于细胞外基质 各种蛋白酶 多种刺激因子及胞内 + 超负荷等相互作用, 引起细胞损伤和促进 凋亡程序启动, 影响了 蛋白的表达

6 阿托伐他汀属于 - 羟基 - - 甲基戊二酰辅酶 还 原酶抑制剂, 许多研究发现他汀类除调脂作用外, 还 具有改善血管内皮细胞功能 抗炎 抗氧化 抑制 [ ] 增生等其它作用, 并进一步发现他汀可以 [ ] 对多种离子通道进行调控 各种证据亦证明他汀 [ ] 类可以稳定 斑块, 对心脑血管发挥保护作用 年美国心脏病学会与美国心脏协会联合颁布的 最新版降胆固醇治疗降低动脉粥样硬化性心血管疾 病 (, ) 风 [ ] 险指南中亦强调了他汀类药物在 一二级 预防的重要作用, 但目前关于他汀抗 的具体机制 仍不明确 该实验发现阿托伐他汀除了在高脂饲喂 的 小 小鼠中的直接降脂作用外, 还可以显著缩 小鼠主动脉 斑块面积并下调 蛋白的表达, 且随治疗时间延长其抑制作用更明显 可能机制为, 阿托伐他汀一方面通过加速血液中 清除, 减少其被氧化为 - 的机会, 并减少 通道的激活从而抑制 增殖和迁移 ; 另 一方面可以通过降低细胞内活性氧, 减少氧化应激 从而抑制了 蛋白表达 ; 抑制细胞内钙超载, 延 缓了动脉粥样硬化的病理进程 综上所述, 我们发现 在 小鼠 斑块形成的过程中表达上调, 而阿托伐他汀可以下 调 通道表达, 且下调作用随时间延长更为显 著 因此推测阿托伐他汀可能通过减少 表达 来抑制 增殖和迁移, 从而延缓 斑块进展 我们将通过后续实验进一步探讨 在 增殖与迁移过程中的具体分子机制及阿托伐他汀的 作用机制, 为 防治提供新的思路 [ 参考文献 ] [ ],,, - : : - [ ],, ( ): - [ ], [ ],, ( ): - [ ] 陈兆煜, 袁乔, 谈智 系统与平滑肌细胞迁移 : 一种可能的机制 [ ] 中国病理生理杂志,, ( ): - [ ] - : [ ] ( ),, : - [ ] [ ],, : - [ ],,, [ ],, ( ): - [ ],,, - [ ],, ( ): - [ ] 刘剑刚, 董国菊, 史大卓, 等 载脂蛋白 基因敲除小 鼠不同周龄动脉粥样硬化的病理变化 [ ] 中国动脉 硬化杂志,, ( ): - [ ],,,, - + [ ],, ( ): - [ ] [ ] -,, ( ): - [ ],,, : [ ],, ( ): - [ ],,, [ ],, ( ): - [ ],,,, + [ ],, ( ): - [ ],, - : [ ],, ( ): - [ ] 林晓燕, 林秋平, 许昌声, 等 阿托伐他汀通过 α 介 导的抗氧化应激效应抑制高脂喂养糖尿病 鼠动脉粥样硬化的形成 [ ] 中国病理生理杂志,, ( ): - [ ],,, : [ ],, ( ): - 小

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