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麇兢燕
1 years ago
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1 外泌体分离与鉴定外泌体分离与鉴定项目编号客户姓名客户单位报告出具人报告审核人本报告涉及到 LC Sciences 的公司商业秘密, 请确保本报告内容仅供您个人科研使用, 并承担保密责任. 若擅自向任何第三人或者公司泄露本报告的内容, 根据国家有关法律法规, LC Sciences 公司将有权追究法律责任. 电话 :

2 1. 外泌体简介外泌体 (Exosomes) 产生于细胞中的多泡体, 是活细胞分泌的直径约为 30~150nm 的膜性囊泡, 密度为 g/ml, 有典型的杯盘形态人体中几乎所有类型的细胞均能产生外泌体, 近乎于平均每个人体细胞产生个通常 1ml 血液中存在 1 10^12 个外泌体外泌体具有异质性, 即使是同一种细胞分泌的外泌体都有可能具有很大功能区别外泌体几乎存在于所有的组织细胞间隙体液中, 包括血液唾液尿液和母乳外泌体携带了参与细胞内信号转导的蛋白 mirna lncrna circrna mrna 以及其降解片段, 参与细胞活动的重要调控 ; 在肿瘤转移免疫调控机制疾病发生发展阿兹海默症和免疫疾病等疑难杂症的治疗方面崭露头角, 有望成为多种疾病的早期诊断标志物外泌体的分离方法主要有 : 差速离心密度梯度离心体积排阻色谱法过滤法聚合物沉淀法免疫分离隔离筛选法等但是 CNS 上外泌体研究的文献中主流的分离方法目前还是超速离心的方法超速离心分离可以准确地重复获取外泌体, 同时最大限度减少蛋白质聚集体和其他膜粒子的共纯化目前我司对于外泌体的鉴定主要方法有 : 透射电子显微镜 (TEM) 粒径分析 ( 纳米流式检测仪 ) 蛋白指标检测 (Western Blot FCM) 2. 实验目的采用超速离心法提取外泌体, 并进行透射电镜粒径分析及蛋白指标检测 3. 材料与仪器 3.1 样本情况细胞培养上清 ( 客户提供 ) 3.2 主要试剂与仪器名称品牌货号细胞培养板 Corning 青链霉素混合液 Gibco DMEM Hyclone SH %Trypsin Gibco 名称品牌型号电话 :

3 多功能酶标仪 Thermo VARIOSKAN LUX 生物安全柜 ESCO AC2-4S1 细胞培养箱 ESCO CCL-170B-8 移液器 Eppendorf Research Plus 小型冷冻离心机 Beckman Microfuge 20R 超低温冰箱 Thermo 905 透射电镜 FEI Tecnai Spirit T12 纳米流式检测仪福流生物 Flow NanoAnalyzer 超速离心机 Beckman Optima L-100XP 4. 实验方法 4.1 超速离心法提取外泌体收集培养 48 h 后的细胞上清将上清液移动至一个新的离心管内,2000 g,4,10 min 离心小心地在将上清液移至新的离心管中,10000 g,4,30 min 再次离心, 以去除较大的囊泡小心取上清液至新的离心管中, 选择超速转子,4, g 离心 70 min 去除上清, 用预冷的 1 PBS 重悬后再次 4, g,70 min 超速离心去除上清并且用适量的 1 PBS 重悬提取后的外泌体应该立即检测或者冻存外泌体样品透射电镜观察将通过超速离心分离得到的外泌体, 重悬于 30μL 的 PBS 中吸取样品 10 μl 滴加于铜网上沉淀 1 min, 滤纸吸去浮液醋酸双氧铀 ( 磷钨酸 )10 μl 滴加于铜网上沉淀 1 min, 滤纸吸去浮液常温干燥数分钟 kv 进行电镜检测成像获得透射电镜 (FEI Tecnai Spirit TEM T12) 成像结果 ( 图 1) 电话 :

4 4.3 外泌体样品粒径分析先用标准品进行仪器性能测试合格后方可进行外泌体样品上样, 注意需进行梯度稀释避免样本堵塞进样针待样本完成检测即可获得 NanoFCM 仪器 ( 福流生物 Flow NanoAnalyzer) 检测外泌体的粒径和浓度信息 ( 图 2) 若外泌体已进行荧光抗体标记也可同时获得 NanoFCM 仪器 ( 福流生物 Flow NanoAnalyzer) 检测表面蛋白指标阳性结果 ( 图 4) 4.4 外泌体样品 WB 蛋白指标检测根据待检测样品蛋白大小配制浓度为 10% 或 15% 的 SDS PAGE 电泳胶 ; 将电泳装置装好后, 加入适量 Running Buffer 取出蛋白样品, 恒温金属浴上煮 3-5 min, 离心甩下 ; 将蛋白样品以及蛋白 Maker 按所需顺序用移液器或上样针加入到电泳胶上的孔内盖上槽盖, 打开电源,80 V 跑胶至样品跑出浓缩胶, 转 100 V 跑胶至溴酚蓝至胶底部电泳完毕后取出电泳胶, 修整胶的大小, 切去边缘与多余的部分, 左下角切角标记 ; 根据修整后胶的尺寸, 裁剪相应大小的 PVDF 膜, 在左下角剪角做标记, 在适量甲醇中活化 20 s, 然后浸泡于预冷的转膜缓冲液中取 8 张滤纸切成 8 cm 10 cm 的尺寸, 同样浸泡在预冷的转膜缓冲液中 ; 按照海绵 - 滤纸 - 电泳胶 - 膜 - 滤纸 - 海绵的顺序制作转膜三明治将转膜缓冲液加入槽中, 组装好转膜装置, 加入浮冰, 将装置埋于冰浴或置于冰箱, 打开电源,300 ma 转膜, 转膜时间依据需检测蛋白的大小确定, 一般规则为 1 kd=1 min 转膜完毕后取出 PVDF 膜, 将膜按蛋白面朝上浸泡于 5% 脱脂牛奶 TBST 电话 :

中, 封闭 1 h 4.4.8 一抗封闭 : 牛奶封闭后的膜按需裁剪, 将膜浸泡于配制好的一抗溶液 (1:1000 ) 中, 4 孵育过夜 4.4.9 回收一抗, 用 20 ml TBST 在室温下洗膜 10 min, 重复三次 4.

4.12 取出 PVDF 膜, 沥干水分, 蛋白面朝上平铺于保鲜膜上, 将等体积混合的 ECL A/B 液混合液滴加到膜上避光反应 5 min; 将膜夹起移入塑封膜中, 蛋白面始终朝上 4.4.13 将膜放在成像仪 (GE LAS4000mini) 中, 设置好参数, 开始曝光 ; 调整好亮度和对比度, 保存图片 ( 如图 3) 5.

5 中, 封闭 1 h 一抗封闭 : 牛奶封闭后的膜按需裁剪, 将膜浸泡于配制好的一抗溶液 (1:1000 ) 中, 4 孵育过夜回收一抗, 用 20 ml TBST 在室温下洗膜 10 min, 重复三次根据一抗选择二抗, 将二抗按 1:5000 配在 5% 脱脂牛奶 TBST 溶液中, 将膜浸泡在二抗溶液中, 室温孵育 1h 左右回收二抗, 用 20 ml TBST 在室温下洗膜 10 min, 重复三次取出 PVDF 膜, 沥干水分, 蛋白面朝上平铺于保鲜膜上, 将等体积混合的 ECL A/B 液混合液滴加到膜上避光反应 5 min; 将膜夹起移入塑封膜中, 蛋白面始终朝上将膜放在成像仪 (GE LAS4000mini) 中, 设置好参数, 开始曝光 ; 调整好亮度和对比度, 保存图片 ( 如图 3) 5. 实验结果 5.1 超速离心法提取细胞上清外泌体电镜图电话 :

xlsx 图 2 纳米流式检测外泌体粒径 5.2.2 浓度结果 : 浓度为 1.

6 图 1 外泌体电镜图 (bar=200nm) 5.2 超速离心法提取细胞上清外泌体粒径分析结果细胞上清外泌体粒径检测 : 平均粒径为 nm,30-150nm 的占总颗粒数的 96.62%, 具体的分布见附件 : 外泌体粒径分布.xlsx 图 2 纳米流式检测外泌体粒径浓度结果 : 浓度为 1.43E+10 个 /ml 电话 :

7 图 3 纳米流式检测外泌体浓度 5.3 超速离心法提取细胞上清外泌体蛋白指标检测结果 BCA 测定外泌体蛋白浓度 : 标准曲线 : 图 4 BCA 法标准曲线电话 :

外泌体蛋白测出的 OD560 为 0.2157, 带入到以上公式算出, 提取出的外泌体总蛋白浓度为 1.

8 外泌体蛋白测出的 OD560 为 , 带入到以上公式算出, 提取出的外泌体总蛋白浓度为 1.88 μg/μl, 总体积为 85 μl, 得提取出的蛋白总质量为 159 μg WB 检测外泌体蛋白表达 : 图 5 WB 检测外泌体标志性蛋白电话 :

9 5.3.3 纳米流式检测仪检测细胞上清外泌体表面蛋白表达 : 图 6 纳米流式仪检测检测外泌体膜蛋白 CD9 的阳性率 5.4 外泌体鉴定结果评判质量参数质控标准评估样本量评估细胞上清总量 20ml 优电镜质量评估外形形态完整球形大小均一优粒径质量评估颗粒浓度 10^9-10 个 /ml 优粒径大小 nm 优提取蛋白浓度阳性指标结果 µg 有优优蛋白质量评估阴性指标结果无优 CD9 蛋白阳性率 >30% 优 CD81 蛋白阳性率 >30% 优注 : 1 2 在 Western Blot 实验上样前采用 BCA 蛋白定量方法, 并通过酶标仪检测蛋白浓度 ; 默认采用纳米流式检测 CD9 和 CD81 两个指标, 根据客户需求会有增减电话 :

10 6. 样品寄送寄送货物清单根据客户要求, 实验产物外泌体 DNA RNA 或蛋白等将与客户原材料采用干冰快递运送的方式寄回若有涉及款项支付将附有对应的发票及合同等货物名称规格编号外泌体 50µL/ 管 1 外泌体提取蛋白 50 µl/ 管 1 表 6.1 实验产物清单货物名称规格编号抗体 50ug 1 管表 6.2 客户原材料清单客户需知 : 一 : 应先检查快递包裹是否完好, 有无破损二 : 其次检查干冰是否挥发完全, 并快速将样品转移至 -80 冰箱保存三 : 低温样品保存应避免反复冻融, 建议分装保存, 用时再取四 : 注意, 本产品只做科研使用, 不得另做它用电话 :

Qubit-DNA RNA 总浓度测定 dsdna BR Assay Kits 各试剂加样量 : Buffer 标准 1 标准 2 样品试剂 ( 荧光染色 ) 总量 ( 溶液体积 ) 50 或 250ml 1 或 5ml 1 或 5ml 待测 250µl 或 1.25ml 原始浓度未知 0 ng

Qubit-DNA RNA 总浓度测定 dsdna BR Assay Kits 各试剂加样量 : 总量 ( 溶液体积 ) 50 或 250ml 1 或 5ml 1 或 5ml 待测 250µl 或 1.25ml 原始浓度未知 0 ng/μl 100 ng/μl 待测 200 测定时要求浓度未知 0 ng/μl 5000ng/ml 0~5000 ng/ml 1 备注 -Buffer:Qubit dsdna