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峰惠
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1 CNIC NLNM-0005 以凝血酶为血栓形成体内定位靶的放射显像条件研究 ASSESSMENT OF THROMBUS IMAGING POTENCY OF THROMBIN-TARGETING RECOMBINANT HIRUDIN IN VITRO AND IN VIVO (In Chinese) 中国核情报中心 China Nuclear Information Centre 299

2 CNIC NLNM-0005 以凝血酶为血栓形成体内定位靶的放射显像条件研究谭成张荣军万卫星蔡刚明俞惠新蒋孟军张莲芬沈国平范益军陶永辉金坚 ( 江苏省原子医学研究所, 无锡,214063) 摘要文章涉及一种凝血酶 (Th) 的有效抑制剂重组水蛭素 (rhhv2), 评价其作为血栓形成诊断工具的可能性采用氯胺 -T 法制备了 125 I-rHHV2 和 125 I-Th, 标记率分别为 86.64% 和 62.20%, 放化纯分别为 89.70% 和 91.22%, 比放射性分别为 22.4 和 94.3 TBq/mmol 于预包被纤维蛋白原或 Th 的塑料小珠上进行放射性竞争分析显示,Th- 纤维蛋白复合物的形成不影响 rhhv2 与其上的 Th 结合 ; 在 rhhv2,th 和纤维蛋白原形成的三元复合物中, 其分子比为 14:14:1 99m Tc-rHHV2 的制备采用亚氨基噻吩盐酸盐修饰法, 标记率为 90.81%, 放化纯为 93.9%, 比放射性为 2.30 TBq/mmol, 犬和兔血栓模型显像用量为 30 µg/kg SPECT 显像分析表明血栓清晰可见, 且动静脉血栓显像结果差异明显动脉血栓在给药后 45 min 显像清晰, 随后影像逐渐减退 ; 静脉血栓在给药后 30 min 开始显像, 并随时间的延长影像趋于清晰小鼠体内分布证明 rhhv2 主要从泌尿系统排泄这些结果说明靶向 Th- 纤维蛋白复合物中 Th 的 99m Tc-rHHV2 可望成为一种新的血栓显像剂关键词 : 血栓显像剂重组水蛭素凝血酶 300

3 Assessment of Thrombus Imaging Potency of Thrombin-targeting Recombinant Hirudin in vitro and in vivo (In Chinese) TAN Cheng ZHANG Rongjun WAN Weixing CAI Gangming YU Huixin JIANG Mengjun ZHANG Lianfen SHENG Guoping FAN Yijun TAO Yonghui JIN Jian (Jiangsu Institute of Nuclear Medicine, Wuxi, ) ABSTRACT The purpose of this study is to evaluate the effect of recombinant hirudin HV2 (rhhv2) as a thrombus imaging agent. 125 I-rHHV2 and 125 I-Th were prepared with Chloramine method, the labeling rate were 86.64% and 62.20%, with the radioactive purity of 89.70% and 91.22%, with the specific activity of 22.4 TBq/mmol and TBq/mmol respectively. The competitive radioassays showed that the Th-fibrin complex formation did not affect the ability of rhhv2 binding with Th. In the complex, the molecular binding ratio of rhhv2 to Th and fibrinogen was 14:14:1. 99m Tc-rHHV2 was prepared by 2-iminothiolane modified method, the labeled rate was 94%, with the radioactive purity of 93.90%, with the specific activity of 2.30 TBq/mmol. It was used to image fresh thrombi on arteries and veins of dog or rabbit (30 µg/kg). In SPECT images, all thrombin were clearly visible, arterial thrombosis imaging can be seen clearly within 45 min after injection and fade away slowly, venous thrombosis imaging also can be seen within 30 min after injection and quantitative imaging ratios between the thrombus and opposite vessel increased following the time. Biodistribution studies in mouse demonstrated that rhhv2 was excreted from kidneys. These data indicate that Th in Th-fibrin complex could be a potent target for diagnosis of thrombus and 99m Tc-rHHV2 could be a new thrombotic imaging agent. Key words: Thrombus imaging agent, Recombinant hirudin, Thrombin 301

4 前言据流行病学统计, 静脉血栓是心肌缺血和中风之后第三位常见的心血管急症, 其发病率及死亡率均较高深静脉血栓是引起血栓和栓塞性疾病的主要原因, 肺栓塞的栓子约 75%~95% 来自下肢深静脉早期治疗可以预防血栓的发展和并发症的出现, 因此对患者的早期诊断具有重要的临床意义然而根据临床症状和体征诊断深静脉血栓和肺栓塞是不可靠的, 不恰当的抗凝治疗又可引起出血等并发症, 为此建立一种客观而可靠的诊断方法是必要的 [1] 理想的诊断方法应是安全, 准确而且无创伤, 并能同时提供解剖和功能信息放射性核素显像的最大优势是可以无创伤性检测器官状况核素静脉显像可判断血管堵塞的存在及性质, 判断血栓性疾病是急性还是慢性, 并可根据血栓性疾病的病理生理特点, 制备参与出血凝血纤溶等不同过程的特异性显像剂进行血栓显像正常生理状态下, 机体的凝血和纤溶系统互相依赖互相拮抗而维持正常的血流状态在病理状态下, 各种原因引起血管内皮损伤, 胶原暴露从而激活血小板, 启动内外源性凝血系统在凝血酶 (thrombin, Th) 作用下, 纤维蛋白 (fibrin, Fn) 和粘连蛋白共同使聚集的血小板牢固地粘附于损伤内膜表面, 形成血小板纤维蛋白血凝块 Th 的生成是凝血瀑布反应的中心环节, 也是凝血反应的中心产物它不仅直接作用于纤维蛋白原 (fibrinogen, Fg) 使其转变成 Fn, 还反馈激活因子 Ⅴ 和因子 Ⅷ 同时,Th 可刺激血小板促凝活性表现通过这些正反馈活化机制,Th 加速和放大凝血瀑布反应作为血栓形成生化瀑布反应中心环节的 Th, 已被广泛用于预防和治疗血栓的药物靶另外, 凝血过程的终末反应产物 Fn 可强烈吸附 Th, 防止后者扩散这种 Fn 形成过程中表面吸附的大量 Th 仍能催化邻近 Fg 转化成 Fn, 即纤溶诱导的血栓形成现象 (Thrombolysis-induced thrombo-genesis) [2] 这些基础研究成果均为以 Th 作为血栓形成的体内定位靶创造了基本的理论依据用于血栓显像的放射性药物应对靶器官的结合具有高度特异性和高亲和力, 结合位点相对稳定, 不受血栓发展和抗凝治疗的影响同时, 它在血液中的清除应较快, 血液本底低, 以便在较短时间内获得较高的血栓 / 血液 (T/B) 比值, 血栓显像清晰近来证实水蛭素是 Th 的强抑制剂, 多种动物模型实验和临床研究表明, 它能有效的阻止血栓形成, 有望成为一种治疗和预防各种血栓形成疾患的有效药物 [3] 我们进行了模拟血栓形成成份分析, 对 Th 作为显像定位靶及其抑制剂重组水蛭素 HV2(recombinant hirudin HV2, rhhv2) [4, 作为显像配基的可能性进行了系统的研究 5] 1 材料与方法 1. 1 材料与试剂主要试剂 rhhv2 由中国科学院生物物理所韩玉珉教授提供 [6] 亚氨基噻吩盐酸盐(2-IT),Th (T 4265 ),Fg,Fn(F 8630 ) 和牛血清白蛋白第五部分 (BSA-Ⅴ) 为 Sigma 产品 Sephadex G-50,Sephadex G-15,PD-10,Sepharose CL-4B, 以及丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺和过硫 302

5 酸铵为 Pharmacia 产品转移电泳用硝酸纤维素膜为 Amersham 产品低分子量标准 (17.5~ 94 ku) 为中国科学院上海东风试剂厂产品氯胺 -T 为 Merck 产品 Na 125 I 和 Mo-Tc 发生器为中国核动力研究设计院产品牛血清白蛋白 (BSA) 为卫生部上海生物制品所产品葡庚糖酸钠 (GH) 为江苏省原子医学研究所产品其余试剂均为国产分析纯主要材料医用生物粘合胶为北京瞬康生物胶制品厂产品固相材料为北京富裕兴化工厂产品 NIH 小鼠新西兰大耳兔和实验用犬由江苏省原子医学研究所 ( 苏动质 97028, 苏动环 97020) 提供主要仪器显像仪器采用德国 Siemens 公司 DIACAM/VAX3300 SPECT 仪, 准直器为低能通用型美国 PAKARD 公司 C5002 伽玛计数仪美国 Backman 公司 DU-650 紫外分光光度计美国 Victoreen 公司放射性活度仪 1. 2 固相化合物的制备 BSA-Ⅴ, Th, Fn 固相化小珠的制备 [7] 采用聚苯乙烯小珠 (d: 6 mm) 为固相包被材料, 以 20 mmol/l NaHCO 3 -Na 2 CO 3 ph 9.6 为包被液, 包被液浓度为 10 mg/l, 分别 4 放置过夜包被 BSA-Ⅴ, Th, Fn 弃去包被液, 蒸馏水冲洗三次, 加含 3 g/l BSA 的包被缓冲液封闭,4 放置过夜弃去封闭液,-20 冷冻保存备用 BSA-Ⅴ-, Th-, Fn-SepharoseCL-4B 的制备用 CNBr 活化法制备活化的 SepharoseCL-4B 后, 于 100 mmol/l NaHCO 3 -Na 2 HCO 3 ph 9.5 中加入 BSA-Ⅴ 或 Th 或 Fn,4 反应过夜次日经洗涤后装柱备用产品偶联率约为 12% I-rHHV2 和 125 I-Th 的制备采用氯胺 -T 法标记氯胺 -T 及 Na 2 S 2 O 5 溶液以 50 mmol/l PBS ph 7.5 用前配制 10 µl (1 mg/ml, 0.2 mol/l PB ph 8.0)rHHV2 中加入 3 µl Na 125 I( 约 37 MBq), 加入氯胺 -T 10 µl (30 µg), 室温反应 40 s, 立即加入 Na 2 S 2 O 5 20 µl(100 µg) 中止反应以 SephadexG-15 分离纯化 125 I-rHHV2, 平衡及洗脱液同上 125 I-rHHV2 的活性分析采用 Western-blot 转移电泳法, 硝酸纤维素膜点杂交法和放射性配体分析法 [9] 同法制备 125 I-Th m [10] Tc-rHHV2 的制备 rhhv2 的化学修饰采用 2-IT 法修饰 rhhv2, 反应条件为 0.2 mol/l PB ph 7.0, 反应摩尔比 n(2-it):n(rhhv2)=50:1 修饰后用 PD-10 柱纯化, 去除未反应的 2-IT 洗脱缓冲液为 20 mmol/l PBS ph 7.0 纯化后实验的回收率大于 95% 放射性 99m Tc 标记采用配体交换法, 将标记好的 99m Tc-GH 加入修饰后的 rhhv2 中, 两者的体积比 99m Tc-GH:IT-rHHV2 不大于 1 用聚酰胺-66 分别测定过柱前后 99m Tc-rHHV2 的放化纯放射性比活度采用紫外法测定蛋白浓度, 再用活度仪测定标记物的活度, 以求出比活度用 Th 包被小珠体外放射结合分析判断 99m Tc-rHHV2 的生物活性 [8] 303

6 1. 5 rhhv2-th-fn 结合复合物的系统优化和定量分析系统环境优化以含 0.3% BSA 的 50 mmol/l Tris-HCL ph 7.4 为反应缓冲液,Th 和 Fn 固相化小珠为反应底物, 125 I-rHHV2 或 125 I-Th 为示踪化合物, 分析系统的 Ca 2+ 离子依赖性系统定量分析以含 2.5 mmol/l Ca 2+ 和 0.3% BSA 的 50 mmol/l Tris-HCL ph 7.4 为反应缓冲液, 采用放射性配体竟争分析法分析系统的结合定量参数 [11] 1. 6 体内分布实验取 NIH 小白鼠 ( 美国国立卫生研究院培养的封闭群小鼠 )25 只 ( 约 20 g/ 只 ) 随机分成五组, 每只小鼠都由尾静脉注入 99m Tc-rHHV2 1.9 MBq( 约 1 µg rhhv2) 后, 分别于 5, 15,30,60,120 min 不同时相处死, 取血心肝脾肺肾脑, 用伽玛计数仪测定各脏器及血的放射性, 计算各脏器及血的放射性分布 (% ID) [12] [13] 1. 7 实验动物犬和兔血栓模型的建立实验雄性犬 2 只 ( 约 15 kg),2% 硫贲妥钠肌肉注射麻醉后, 腹股沟区剪毛后消毒皮肤沿股动脉走向行切开皮肤约 8 cm, 钝性分离皮下及肌肉, 充分暴露股动脉或股静脉 ( 约 7 cm 长 ) 从暴露的股动脉近心端向远心方向安插自制单股螺旋钢丝( 直径 0.5 cm, 长度 1.5 cm), 进入血管内腔后, 行血管缝合术, 再用医用生物粘合胶粘合去动脉夹, 确定血管再度充盈和手术视野无渗血后, 逐层缝合, 术毕兔血栓模型的建立方法类同 1. 8 显像方法血栓动物模型在麻醉状态下, 前后位固定于显像床上, 经舌下静脉注入 99m Tc-rHHV2 185 MBq, 连续以 60 帧 / s 的速度采集 30 min 30,45,60,120 min 行局部血栓部位显像, 并于 120 min 再作全身显像使用仪器为 SIEMENS DIACAM/VAX3300 SPECT 仪, 准直器为低能通用型, 采集矩阵 , 局部图像每帧计数由计算机在连续 30 min 的动态显像上分别勾划心肺肝肾 ROI( 感兴趣区 ), 获取相应器官的时间 - 放射性曲线局部图像上勾划血栓影像的 ROI 和对侧相应部位的 ROI, 计算两者的放射性比值 (T/B) 在 120 min 的全身显像图上勾划双肾及膀胱的 ROI, 其计数除以全身放射性计数, 计算经肾排泄的 % ID [14] 2 结果 2. 1 放射性标记化合物的理化鉴定 I-rHHV2 的理化鉴定 125 I-rHHV2 的标记率为 86.64%, 放射性比活度为 Bq/µg Th 经聚丙烯酰胺凝胶 (PAGE) 电泳后转移到硝酸纤维素膜上, 用 125 I-rHHV2 孵育结合 (4 ), 放射自显影呈单一条带, 说明 125 I-rHHV2 结合 Th 的活性未改变, 采用膜斑点杂交分析, 也得到类似的结果 ( 如图 1 所示 ) I-Th 的理化鉴定 125 I-Th 的标记率为 62.20%, 放射性比活度为 Bq/µg 膜斑点杂交分析显示 304

7 125 I-Th 结合 Fg 的活性保持完整 m Tc-rHHV2 的理化鉴定 99m Tc-rHHV2 的标记率为 90.81%,PD-10 过柱前后 99m Tc-rHHV2 放化纯分别为 88.8% 和 93.9%, 终产物放射性比活度为 2.30 TBq/mmol, 制备的 99m Tc-rHHV2 体外稳定性在室温下保持 4 h 以上采用 Th 包被小珠体外放射结合分析, 99m Tc-rHHV2 的结合率达 11.4%, 说明 99m Tc-rHHV2 未丧失结合 Th 的活性 Th BSA 图 I-rH 的活性测定 ( 膜斑点杂交实验 ) 2. 2 rhhv2 与 Th 结合反应的 Ca 2+ 离子浓度依赖性分析以 BSA-Ⅴ 包被珠为对照, 在不同的 Ca 2+ 环境下分别将 125 I-rHHV2 与 Th 包被珠孵育过夜 (4 ) 结果显示 2.5 mmol/l 的 Ca 2+ 环境是 rhhv2 与 Th 结合反应的最适 Ca 2+ 离子条件 ( 如图 2 所示 ) 10 3 计数 /min cpm(10 3 ) I-Th-Fn I-Th-Fn I-rH-Th I-rH-Th 图 2 rh 图 Th 图 Ca Ca /mmol L 2+ mmol/l 图 Th 图 Fn图图图 2+ Ca 图 2 rh 和离离 Th 以及离离离离离 Th 与 Fn 结合与 Ca 2+ 离子浓度的关系 Fig2 The relation of Ca 2+ ion concentration in the combine of rh with Th and Th with Fn 305

8 2. 3 rhhv2 与 Th- Fn 复合物的竟争结合和 Scatchard 分析以 Th- Fn 珠 (234 pmol Th/16.67 pmol Fn 珠 ) 为结合试剂, 125 I-rHHV2 和 rhhv2 互为竟争配基进行竟争结合分析显示,rHHV2 的最大结合量为 µg(297 pmol) 随着 rhhv2 绝对量的增加, 反应结果呈减函数抑制曲线 Scatchard 作图法算得亲和常数 (K a ) 为 L/mol rhhv2 和结合在 Fn 上的 Th 反应分子比约为 1:1, 说明 Th 与 Fn 的结合不影响它与 rhhv2 的结合反应 ( 如图 3, 4 所示 ) 10 3 计数 /min c p m(10 3 ) 125 I-rH-Th-Fn 125 I-rH-Th-Fn 125 I-rh/BSA I-rH/BSA rh (ug) rh/µg 图 3 rh图 125I-rH 图 Th-Fn 图图图离图图图图图图 Fig3 图 3 The rh 与 competitive 125 I-rH 和 Th-Fn curve 复合物的竞争反应曲线 of rh and 125 I-rH binding with Th-Fn complex B/F(%) Y= x, K a= L/mol Y= x,Ka=9.72x10 6 L/mol ( 结合 / 游离 )/% rh离离离 10 (-8) rh 浓度 / 10 mol/l 8 mol L 1 图 4 rh图 Th 图图离图图图图图 Scatchard 图图图图 Fig4 图 4 The rh 与 avidity Th 结合的亲合常数 constant of rh (Scatchard) binding with Th (Scatchard draw method) 306

9 2. 4 rhhv2 与 Th- Fn 复合物反应时间的动力关系以 Th- Fn 珠为结合试剂, 采用定量 125 I-rHHV2 为配体,10 反应不同时间, 分析其结合效果结果表明, 该反应为时间饱和反应, 饱和时间为 45 min, 未见 rhhv2 与 Th-Fn 复合物的结合随时间推移而解离的现象 ( 如图 5 所示 ) cpm (10 3 ) 10 3 计数 /min time/min 时间 /min 图 5 rh图 Th-Fn 图图图图图离图图图图图图图 Fig5 5 rh 对 The Th-Fn time-kinetics 复合物反应的时间动力曲线 curve of rh with Th-Fn complex 99m Tc-rHHV2 的小鼠体内分布 99m Tc-rHHV2 在小鼠体内的分布结果列于表 1 表 1 99m Tc-rHHV2 在小鼠体内的分布结果 (n=5, X=±s) 脏器各时相 /min 血 8.76± ± ± ± ±0.07 心 0.28± ± ± ± ±0.00 肝 2.53± ± ± ± ±0.08 脾 0.16± ± ± ± ±0.01 肺 0.76± ± ± ± ±0.02 肾 49.35± ± ± ± ±3.06 脑 0.11± ± ± ± ±0.00 注 : 体内分布单位为 % ID, 是指整脏器的 % ID 其中血容量按小鼠体重的 7% 计算 2. 6 血栓模型显像模型犬显像注药后 30 min 内连续显像结果显示, 心肺影很快消退, 肝脾未见明显放射性浓聚, 双肾于 5 min 时见大量放射性浓聚, 随后肾影略变淡, 膀胱放射性持续增加动脉血栓于 307

53 图 7 全身显像心脑肺肝脾无明显放射性浓聚, 双肾及膀胱放射性浓聚明显, 其 % ID 为 83.1 显像后分别取出股动静脉处钢丝线圈, 见血栓形成, 动静脉血栓直径分别约为 0.8 和 1.

10 45~60 min 的局部显像图上出现清晰的条索状放射性浓聚影, 长约 3 cm, 宽 1 cm( 如图 6 所示 ),120 min 血栓影变模糊, 两者 T/B 比值分别为 1.47 和 1.26 图 6 静脉血栓于 30 min 显影, 随后各时相血栓影像趋清晰, 长约 2.5 cm( 如图 7 所示 ), 宽 1.3 cm,1 h 和 2 h T/B 比值分别为 1.43 和 1.53 图 7 全身显像心脑肺肝脾无明显放射性浓聚, 双肾及膀胱放射性浓聚明显, 其 % ID 为 83.1 显像后分别取出股动静脉处钢丝线圈, 见血栓形成, 动静脉血栓直径分别约为 0.8 和 1.0 cm, 长约 3.5 和 2.5 cm, 与显像所示血栓大小基本一致经病理证实为混合性血栓, 其血栓与血液放射性比值动脉为 1.92, 静脉为 2.83, 股动脉血栓含有较多的血小板和少量的纤维蛋白, 而股静脉血栓则含有较多的纤维蛋白和较少的血小板 ( 如图 8 和图 9 所示 ) 308

11 图 8 动脉血栓图 9 静脉血栓模型兔显像在 5~10 min 内心肺影很快消退, 肝脾各时相均未见明显的放射性浓聚, 双肾于 5 min 时就见大量放射性浓聚, 肾影持续至 30 min 后略有变淡, 膀胱放射性持续增加股动脉血栓于 60 min 时局部显像上可见一清晰的条状放射性浓聚影 ( 如图 10 所示 ),120 min 时血栓影变模糊,T/B 分别为 2.24 和 2.10 图 10 股静脉血栓于 30 min 就见显影, 并随时相的延迟血栓影像越趋明显, 结果示于 ( 图 11), 1 h 和 2h T/B 分别为 1.95 和 2.16 显像结束后分别取出股动静脉内钢丝线圈, 见血栓形成, 并经病理证实 309

图 11 3 讨论天然水蛭素是 Haycragt 于 1884 年发现的一种抗凝剂, 由于生化纯化步骤繁琐, 水蛭来源匮乏, 饲养水蛭困难, 使水蛭素的研究和临床应用受到限制长达近百年近年因基因工程技术的发展, 已可基因克隆表达 rhhv2, 才使水蛭素的研究和应用工作加快了进程 [15] rhhv2 有 66 个氨基酸, 分子量约 7 ku, 富含二羧基氨基酸, 无精氨酸 (Arg),

12 图 11 3 讨论天然水蛭素是 Haycragt 于 1884 年发现的一种抗凝剂, 由于生化纯化步骤繁琐, 水蛭来源匮乏, 饲养水蛭困难, 使水蛭素的研究和临床应用受到限制长达近百年近年因基因工程技术的发展, 已可基因克隆表达 rhhv2, 才使水蛭素的研究和应用工作加快了进程 [15] rhhv2 有 66 个氨基酸, 分子量约 7 ku, 富含二羧基氨基酸, 无精氨酸 (Arg), 蛋氨酸 (Met) 和色氨酸 (Trp) [16] 水蛭素与 α-th 以等摩尔形成紧密复合物, 其解离常数 K i 很小, 这种结合具有高度的特异性, 不需任何内源性辅因子帮助 [17] 水蛭素-Th 复合物的形成可使 Th 失去裂解 Fg 的能力, 阻止 Fn 凝固 ; 并可阻止 Th 催化的止血反应及其诱导的血小板反应水蛭素作用的特点之一是鉴定的专一性, 只与 Th 作用, 很少有其它反应目前较为肯定的看法是 rhhv2 是通过 (1) 带负电荷的 N- 端与 Th 的纤维蛋白原结合位点相互作用, (2) 其 47 位赖氨酸 (Lys) 在 Th 特异性口袋中的固定及 (3)N- 端疏水区结合于 Th 的极性结合位点上而形成复合物紧密结构 [18] 这种结合物稳定性好, 可封闭 Th 的全部蛋白酶水解功能故 rhhv2 不仅能防止纤维蛋白原的凝固作用, 还能阻断 Th 催化的止血反应本文以 Th 为靶标, 选择己被肯定的, 优于肝素和阿斯匹林的特异 Th 抑制剂 rhhv2 为配体进行血栓显像, 理论上是可行的本文所用的 rhhv2 是在酵母 α 因子表达系统中的表达产物, 其 N- 端氨基酸序列与天然水蛭素完全相同, 并有特异结合 Th 抗凝血和抑制 Th 的活力, 比活力为 6600 ATU/mg [19] rhhv2 是一种非常稳定的蛋白质, 温度升高和 ph 改变不影响其活力, 在某些变性剂 (8 mol/l 尿素 1% 十二烷基磺酸钠和 6 mol/l 盐酸胍 ) 存在的条件下也非常稳定 [20] 采用放射配体结合法分析血栓前体, 我们发现 rhhv2 不能直接与 Fn 结合 (B/T 为 0.82%), 只有当 Th 与 Fn 复合物形成后,rHHV2 才能与该复合物中的 Th 结合形成 rhhv2-th-fn 三元复合物该现象也从酶标板放射结合分析和 BrCN 活化 SepharoseCL-4B 上可形成三元复合物的结果中得到了证实 Scatchard 作图计算 Th 与 Fn 结合的极限量为 310

13 mol/l,rhhv2 与 Th-Fn 复合物结合的极限量为 mol/l 竟争结合分析结果显示前者解离常数 ( mol/l) 大于后者 ( mol/l), 说明 rhhv2 对 Th-Fn 复合物有较高的亲和性定量分析 Th-Fn 复合物中 Th 与 Fn 结合配比, 显示每个 Fn 分子可结合 14 个 Th 分子 (16:67:234 pmol); 三元复合物中各成份结合配比显示 rhhv2:th:fn 的分子比约为 14:14:1(297:234:16.67 pmol) 亲和分析证明 rhhv2 对 Th-Fn 复合物有较高的亲和性时间反应动力学结果显示, 用 rhhv2 作为血栓前体结合配基, 可在 30~45 min 内达到结合平衡这些结果为 rhhv2 作为放射性血栓显像配体可能出现较高的靶本比提供了物质条件 rhhv2 含有一个结构紧密的 N 端核心区和一个无序的 C 端尾部, 其 N 端的 3 个 Lys-Xaa 键均不被胰蛋白酶水解 ; 胃蛋白酶及糜蛋白酶消化后, 分离所得片断, 氨基酸组成分析发现 N 端核心区依然保持很高的抗凝血酶活性, 继续消化 24 h, 核心区不被进一步降解 [21] 本研究的小鼠体内生物分布结果显示, 99m Tc-rHHV2 主要经肾排泄, 血液清除快, 其它脏器无明显摄取, 犬和兔显像结果也与其相似实验模型显像动静脉血栓显示清晰, T/B 比值为 1.47 和 1.53, 表明 99m Tc-rHHV2 与血栓的结合有较高的特异性和亲和性, 这与体外分析结果相吻合犬的动静脉血栓显像略有差别, 动脉血栓较之静脉血栓显影稍迟, 且延迟显像血栓影模糊, 而静脉血栓显影较早, 并随时间的延长血栓更为清晰兔显像也得到类似的结果其原因可能是, 发生在动脉系统的血栓组成主要是大量血小板和少量纤维蛋白, 而静脉系统的血栓则是大量的纤维蛋白和少量血小板组成, 因此, 两种血栓在结合 99m Tc-rHHV2 量上有多寡之分另外, 动脉压力大, 血流速度快, 99m Tc-rHHV2 在血栓处停留时间相对短些, 影响其与血栓的结合反之, 静脉压力低, 血流速度慢, 99m Tc-rHHV2 在血栓处的停留时间相对长, 增加了与血栓结合的机会, 并能逐渐渗透到血栓内部目前血栓显像剂多为形成血栓的成分, 如血小板纤维蛋白原纤维蛋白及其片断或 [22, 其相应的抗体, 近来又有与血小板糖蛋白 Ⅱb/Ⅲa(GPⅡb/Ⅲa) 受体特异结合的肽类 23] 血栓成分的标记率不高, 血小板在标记中易受损 ; 抗体相对分子质量大, 血液清除慢, 制备复杂, 价格昂贵, 显像时间长甚至还会产生过敏反应 ; 标记肽类所得的 T/B 比值较低, 不利于临床应用 99m Tc-rHHV2 相对分子量小, 血液清除快, 在注射后 30~60 min 内就能获得较清晰的图像, 血栓 / 对侧部位及血栓 / 血液比值分别可达 1.47~1.53 和 1.92~2.83 同时, 99m Tc-rHHV2 进行显像的剂量仅为 30 µg/kg, 远小于 1~2 mg/kg 的抗凝治疗剂量, 表明对血栓显像是安全的尤其 99m Tc 来源方便, 制备简便, 标记率高, 不损伤 rhhv2 的生物活性, 更适合于临床应用总之, 99m Tc-rHHV2 血栓显像有可能成为一种快速灵敏安全的血栓显像方法参考文献 1 张晓丽. 国外医学放射医学核医学分册, 1996, 20: 128 (ZHANG Xiaoli. Foreign Medical Sciences Section of Radiation Medicine and Nuclear Medicine, 1996, 20: 128) 2 JIN Jian, WANG Bocheng, FANG Ping. Eur. J. Nucl. Med., 1998, 25:

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材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析生物技术通报黄艳燕黄靖华卢福芝孙靓彭立新周兴黄日波利用的方法从鼠李糖乳杆菌基因组中扩增到乳酸脱氢酶基因并连接到载体上构建表达质粒将重组质粒转化大肠杆菌重组菌株经诱导表达电泳分析表明在大肠杆菌中实现了表达表达产物的分子量约为同时采用紫外分光光度法测定乳酸脱氢酶的酶活测得重组菌株的乳酸脱氢酶活力为最适反应温度为最适乳酸脱氢酶克隆表达鼠李糖乳杆菌