RESEARCH & DEVELOPMENT 有 相 當 大 的 商 機 在 保 健 功 效 方 面, 由 目 前 通 過 認 證 的 乳 酸 菌 商 品 中, 多 數 為 改 善 腸 道 菌 相 或 增 加 腸 內 益 生 菌, 只 有 以 下 幾 件 標 榜 其 他 特 定 功 效, 如 景 岳

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1 研 發 創 新 乳 酸 菌 載 體 表 現 系 統 之 研 究 現 況 與 趨 勢 撰 文 / 林 志 侯 乳 酸 菌 簡 介 乳 酸 菌 是 指 一 群 能 夠 將 醣 類 代 謝 成 乳 酸 的 微 生 物 乳 酸 菌 可 被 分 為 21 個 屬, 其 中 常 應 用 在 傳 統 發 酵 食 品 的 乳 酸 菌 有 : 乳 酸 桿 菌 屬 (Lactobacillus) 乳 酸 球 菌 屬 (Lactococcus) 雙 歧 桿 菌 屬 (Bifidobacterium) 明 串 球 菌 屬 (Leuconostoc), 足 球 菌 屬 (Pediococcus) 嗜 熱 鏈 球 菌 (Streptococcus thermophilus) 等, 這 些 是 被 公 認 為 安 全 的 菌 種 (generally regard as safe, GRAS ) 其 中 又 以 乳 酸 桿 菌 屬 最 被 廣 為 使 用 一 般 來 說 乳 酸 菌 會 有 以 下 共 同 的 特 性 :(1) 為 革 蘭 氏 陽 性 球 菌 或 桿 菌 無 運 動 性 不 產 生 孢 子 耐 酸 性 環 境 ;(2) 營 養 需 求 複 雜, 需 有 碳 水 化 合 物 胺 基 酸 核 酸 衍 生 物 維 生 素 及 多 種 生 長 素 等 養 分 方 可 生 長 ;(3) 通 常 缺 乏 過 氧 化 氫 酵 素 (catalase) 活 性, 為 厭 氧 微 好 氧 或 兼 性 厭 氧 菌 乳 酸 菌 是 腸 內 最 具 代 表 性 的 有 益 菌, 也 是 益 生 菌 (probiotics) 中 最 重 要 的 一 群, 益 生 菌 的 定 義 為 可 以 改 善 內 生 微 生 物 相 的 平 衡, 有 助 益 於 宿 主 的 活 菌 依 據 國 內 外 研 究 報 告, 乳 酸 菌 對 人 類 健 康 的 好 處 有 :(1) 抑 制 有 害 菌 生 長 維 持 腸 道 菌 群 平 衡 腸 道 中 保 持 適 量 的 乳 酸 菌 可 以 與 有 害 菌 競 爭 生 長 空 間, 乳 酸 菌 會 形 成 生 物 膜 (biofilm), 造 成 屏 障 以 防 止 有 害 菌 黏 附 於 腸 道 細 胞, 並 可 以 抵 抗 環 境 或 藥 物 的 傷 害 以 及 增 加 乳 酸 菌 吸 附 於 腸 道 的 能 力 ;(2) 乳 酸 菌 可 以 產 生 乳 酸 醋 酸 過 氧 化 氫 (hydrogen peroxide) 丁 二 酮 (diacetyl), 這 類 代 謝 產 物 的 蓄 積 皆 不 利 於 其 他 細 菌 的 生 長, 可 藉 此 達 到 抗 菌 的 效 果 另 外, 乳 酸 菌 可 產 生 抑 菌 素 (bacteriocin), 是 細 菌 產 生 的 一 種 含 蛋 白 質 之 物 質, 可 以 抑 制 腸 內 有 害 菌 的 生 長 ;(3) 去 膽 鹽 及 降 膽 固 醇 作 用 : 膽 固 醇 經 氫 氧 化 後 產 生 膽 鹽, 常 與 醣 類 或 胺 基 酸 形 成 結 合 式 膽 鹽, 經 由 消 化 道 中 乳 酸 菌 分 解 後, 形 成 去 結 合 式 膽 鹽, 於 ph6.0 以 下 會 與 膽 固 醇 沉 澱 而 被 排 出, 降 低 膽 固 醇 的 吸 收 另 外, 乳 酸 菌 可 以 吸 附 腸 道 內 的 膽 固 醇, 避 免 被 人 體 吸 收, 並 且 可 降 低 膽 固 醇 合 成 酵 素 (HMG-CoA reductase) 的 活 性, 因 而 具 有 降 膽 固 醇 的 作 用 ;(4) 活 化 免 疫 功 能 : 研 究 顯 示 乳 酸 菌 細 胞 壁 上 的 多 醣 成 分 ( 如 Peptidoglycan 及 Teichoic acid), 可 以 誘 發 宿 主 免 疫 系 統 的 活 化, 增 加 介 白 素 (interleukin) 和 腫 瘤 壞 死 因 子 (TNF) 等 蛋 白 基 因 的 表 現, 這 些 物 質 可 以 活 化 巨 噬 細 胞, 因 而 增 進 免 疫 功 能 ;(5) 營 養 價 值 : 乳 酸 菌 可 合 成 胺 基 酸 葉 酸 及 維 他 命 B 群 和 K 以 供 宿 主 利 用, 並 促 進 鈣 鐵 鉀 及 其 它 營 養 被 宿 主 消 化 吸 收 乳 酸 菌 產 品 與 研 發 趨 勢 除 了 傳 統 的 發 酵 食 品 例 如 乳 酪 香 腸 泡 菜 之 外, 目 前 台 灣 市 面 上 所 販 售 的 乳 酸 菌 相 關 產 品, 大 致 分 為 發 酵 乳 製 品 與 活 菌 錠 劑 或 粉 末 其 中 通 過 衛 生 署 健 康 食 品 認 證 的 共 有 36 種, 約 占 所 有 案 件 兩 成 ( 總 件 數 182 件 ), 顯 示 乳 酸 菌 在 健 康 食 品 市 場 上 食 品 生 技 2010 NO.23 29

2 RESEARCH & DEVELOPMENT 有 相 當 大 的 商 機 在 保 健 功 效 方 面, 由 目 前 通 過 認 證 的 乳 酸 菌 商 品 中, 多 數 為 改 善 腸 道 菌 相 或 增 加 腸 內 益 生 菌, 只 有 以 下 幾 件 標 榜 其 他 特 定 功 效, 如 景 岳 生 技 的 樂 亦 康, 使 用 Lactobacillus paracasei 33, 經 動 物 實 驗 結 果 證 實 有 助 於 減 少 血 清 中 特 異 性 IgE 抗 體 之 生 成, 以 及 降 低 脾 臟 細 胞 IL-5 分 泌 量 葡 萄 王 生 技 的 衛 傑 膠 囊, 使 用 Lactobacillus acidophilus Lactobacillus gasseri, 有 助 於 減 少 胃 幽 門 螺 旋 桿 菌 之 數 量 光 泉 牧 場 的 LS99 機 能 優 酪 乳, 使 用 Lactobacillus salivarius, 經 動 物 實 驗 結 果 證 實, 有 助 於 降 低 血 清 中 特 異 性 IgE 抗 體 之 生 成 因 此, 未 來 乳 酸 菌 商 品 研 發 的 趨 勢, 除 了 篩 選 具 有 特 異 性 的 乳 酸 菌 之 外, 透 過 基 因 工 程 技 術 改 良, 也 是 目 前 許 多 實 驗 室 所 著 重 的 一 環 基 因 工 程 技 術 是 利 用 載 體, 將 功 能 性 基 因 導 入 乳 酸 菌 中, 將 可 提 升 乳 酸 菌 產 品 的 附 加 價 值 基 因 工 程 技 術 改 良 菌 種 亦 有 下 列 優 點 :(1) 可 增 加 乳 酸 菌 抵 抗 噬 菌 體 的 能 力, 以 改 善 發 酵 製 程 穩 定 性 ;(2) 透 過 醣 類 代 謝 基 因 的 研 究, 改 變 發 酵 途 徑, 可 增 進 發 酵 效 率, 縮 短 製 程 ;(3) 導 入 抑 菌 素 基 因, 可 取 代 防 腐 劑 的 使 用 ;(4) 透 過 突 變 篩 選, 去 除 不 良 性 狀 ;(5) 導 入 抗 原 基 因 片 段, 可 研 發 乳 酸 菌 口 服 疫 苗 ;(6) 導 入 代 醣 合 成 基 因, 如 山 梨 醣 醇 合 成 酶, 可 生 產 代 糖 研 究 人 員 已 發 展 出 食 品 級 選 殖 (food grade cloning) 與 自 體 選 殖 (self-cloning) 系 統, 用 以 建 構 食 品 級 基 因 改 造 微 生 物 經 由 食 品 級 選 殖 所 得 之 基 因 改 造 微 生 物 僅 含 有 從 GRAS 微 生 物 而 來 之 DNA, 大 小 約 在 1-50 kbp 之 間 自 體 選 殖 是 將 一 DNA 片 段 從 生 物 體 取 出 經 過 酵 素 化 學 或 物 理 法 處 理 後, 再 重 新 殖 入 該 生 物 體 內 的 改 造 過 程, 經 由 自 體 選 殖 所 得 之 基 因 改 造 微 生 物 體 內 無 外 來 DNA 食 品 級 選 殖 與 自 體 選 殖 的 開 發 應 用, 使 基 因 改 造 微 生 物 發 酵 產 品 在 美 國 成 功 上 市 販 售, 將 是 未 來 基 因 改 造 微 生 物 食 品 發 展 之 主 流 質 體 與 複 製 模 式 基 因 工 程 技 術, 多 數 是 利 用 表 現 載 體 (expression vector) 來 運 送 同 源 基 因 或 異 源 基 因, 所 以 乳 酸 菌 表 現 載 體 的 開 發, 便 成 了 最 基 礎 與 優 先 的 一 項 工 作 乳 酸 菌 載 體 多 數 來 自 於 乳 酸 菌 的 原 生 性 質 體 (plasmid), 質 體 是 獨 立 於 染 色 體 外 的 DNA 片 段, 通 常 是 雙 股 可 複 製 的 環 狀 結 構 過 去 數 十 年 來, 在 各 種 乳 酸 菌 中 發 現 了 許 多 質 體, 大 小 介 於 1.5 至 600kb, 在 這 些 質 體 上 所 帶 的 DNA 序 列, 除 了 與 複 製 相 關 的 序 列 之 外, 部 分 會 帶 有 一 些 生 長 非 必 要 的 基 因, 例 如 : 醣 類 代 謝 胺 基 酸 代 謝 抗 藥 性 基 因 抑 菌 素 基 因 等 (Osborn, et al., 2000;Takala and Saris, 2002) 此 外, 有 許 多 質 體 屬 於 無 性 狀 質 體 (cryptic plasmid), 意 指 此 質 體 並 無 顯 著 的 功 能, 其 對 於 乳 酸 菌 宿 主 的 顯 性 特 徵 也 無 影 響 (von Wright and Sibakov, 1998) 無 性 狀 質 體 通 常 較 小, 多 數 在 10kb 以 下, 因 此 是 作 為 開 發 表 現 載 體 的 最 佳 選 擇 研 究 質 體 的 第 一 步, 是 將 這 些 原 生 質 體 最 小 化, 只 保 留 其 複 製 功 能, 換 句 話 說, 就 是 定 義 出 複 製 子 (replicon) 的 範 圍 複 製 子 通 常 包 含 :(1) 複 製 源 (ori);(2) 調 控 複 製 起 始 的 基 因 (cop/inc gene);(3) 複 製 時 所 需 的 複 製 蛋 白 基 因 (rep gene) (Osborn, et al., 2000) 複 製 子 決 定 了 一 個 質 體 的 特 性, 其 中 最 重 要 的 就 是 在 不 同 菌 種 之 間 複 製 的 能 力, 意 即 宿 主 的 廣 泛 性 廣 宿 主 性 (broad host-range ) 的 質 體 適 合 應 用 於 分 生 研 究 機 能 性 蛋 白 表 現 等, 而 窄 宿 主 性 (narrow host-range ) 的 質 體 則 適 合 應 用 於 細 菌 疫 苗 的 開 發 其 他 評 估 一 個 質 體 的 特 性 通 常 有 : 質 體 大 小 複 製 方 式 複 製 數 量 穩 定 度 承 載 外 來 基 因 能 力 以 及 轉 型 效 率 等 根 據 質 體 複 製 的 方 式 可 大 致 分 為 兩 類 :θ 型 複 製 (theta replication) 和 滾 動 環 狀 型 複 製 (rolling-circle replication, RCR) 兩 者 最 大 的 區 別 在 於 RCR 型 複 製 模 式 在 複 製 過 程 中, 有 單 股 DNA 的 中 間 產 物 形 成, 而 θ 型 複 製 模 式 則 沒 有 30 農 業 生 技 產 業 季 刊

3 研 發 創 新 RCR 型 複 製 模 式 較 常 見 於 小 型 的 質 體, 大 小 介 於 1.3 至 10 kb 之 間 此 類 質 體 呈 現 高 複 製 數 量 (high copy number) 及 複 製 後 分 離 較 不 穩 定 之 特 性 通 常 在 同 一 個 宿 主 中, 只 會 有 一 個 RCR 型 的 質 體 存 在 根 據 質 體 結 構 上 的 相 似 性 等 特 徵, 革 蘭 氏 陽 性 菌 的 RCR 大 致 可 分 為 五 種 :pmv158/pe194 pc194 pt181 psn2 和 ptx14-3 (Khan, 1997) 革 蘭 氏 陽 性 菌 的 質 體 大 多 為 RCR 型 複 製, 但 幾 十 年 來 也 發 現 了 許 多 θ 型 複 製 質 體, 這 些 質 體 通 常 很 巨 大 (>10kb), 且 常 帶 有 功 能 性 的 基 因, 例 如 噬 菌 體 抗 性 生 產 胞 外 多 醣 抑 菌 素 乳 糖 酶 此 類 型 質 體 有 以 下 特 性 :(1) 多 數 呈 現 低 複 製 數 量 (low copy number);(2) 複 製 後 分 離 (segregation) 穩 定 ;(3) 在 同 一 個 宿 主 中, 可 同 時 存 在 二 個 以 上 不 同 的 θ 型 質 體 ;(4) 能 夠 承 載 較 大 片 段 的 外 來 DNA 在 乳 酸 菌 中 也 發 現 了 一 些 θ 型 複 製 的 無 性 狀 質 體, 這 些 質 體 較 小, 又 具 有 θ 型 的 優 點, 故 這 類 型 的 質 體 較 適 合 用 來 建 構 成 表 現 載 體 乳 酸 菌 中 的 質 體 ( 一 ) 乳 酸 球 菌 (Lactococcus;L.) 乳 酸 球 菌 屬 中 最 具 代 表 的 是 乳 酸 乳 球 菌 (Lactococcus lactis), 也 是 被 研 究 最 多 的 乳 酸 菌, 可 分 為 四 個 亞 種, 為 L. lacti subsp. cremoris subsp. lactis subsp. hordniae 和 subsp. diacetylactis 乳 酸 乳 球 菌 多 數 含 有 4-7 個 質 體, 大 小 從 3 到 130kb( Davidson et al., 1996) 乳 酸 乳 球 菌 的 原 生 質 體 在 食 品 發 酵 工 業 上 很 重 要, 因 為 質 體 上 常 帶 有 醣 類 代 謝 基 因 噬 菌 體 抗 性 接 合 生 殖 能 力 (conjugation) 以 及 生 產 抑 菌 素 的 基 因 乳 酸 乳 球 菌 也 有 一 些 無 性 狀 的 質 體, 表 一 中 列 舉 了 乳 酸 乳 球 菌 中 所 發 現 的 質 體 以 及 其 分 類 (Shareck et al., 2004) ( 二 ) 乳 酸 桿 菌 (Lactobacillus;Lb.) 乳 酸 桿 菌 的 分 支 極 廣, 包 含 Lb. acidophilus 表 一 乳 酸 乳 球 菌 的 質 體 質 體 名 稱 來 源 菌 種 大 小 (kb) 複 製 方 式 pwv01 subsp. cremoris 2.2 RCR pcis3 subsp. cremoris 6.1 Theta pbm02 subsp. cremoris 3.9 RCR pl2 subsp. lactis 5.3 Theta psh RCR PCI2000 subsp. lactis 60 Theta pnd324 subsp. lactis 3.2 Theta pvs40 subsp. lactis 7.8 Theta ps7a subsp. lactis bv. 7.3 Theta ps7b subsp. lactis bv. 7.2 Theta 資 料 來 源 :Shareck et al., Lb.rhamnosus Lb. pentosus Lb. fermentum Lb. reuteri Lb. helveticus Lb. hilgardii Lb. delbrueckii bulgaricus Lb. curvatus Lb. delbrueckii Lb. sakei Lb. delbrueckii lactis 乳 酸 桿 菌 是 最 被 廣 泛 使 用 在 發 酵 食 品 上 的 菌 種, 例 如 乳 製 品 肉 類 植 物 等 台 灣 衛 生 署 核 可 的 健 康 食 品 中 所 使 用 的 菌 種, 幾 乎 是 乳 酸 桿 菌 乳 酸 桿 菌 中 的 質 體 個 數 相 對 較 少, 可 能 只 含 一 至 數 個, 大 小 在 1.2 至 150kb 之 間 至 今 從 乳 酸 桿 菌 中 已 發 現 許 多 質 體, 多 數 為 無 性 狀 質 體, 少 部 分 則 帶 有 乳 糖 代 謝 抗 生 素 抗 性 基 因 抑 菌 素 及 其 免 疫 蛋 白 多 醣 生 產 等 具 有 功 能 的 基 因 表 二 中 列 舉 了 乳 酸 桿 菌 中 所 發 現 的 質 體 以 及 其 分 類 (Shareck et al., 2004) ( 三 ) 雙 歧 桿 菌 (Bifidobacterium;B. ) 雙 歧 桿 菌 在 型 態 與 外 表 特 徵 上 類 似 乳 酸 桿 菌, 但 在 分 類 學 上 比 較 接 近 放 線 菌 科 (Actinomycetaceae) 雙 歧 桿 菌 是 腸 道 中 的 原 生 菌 種, 可 與 腸 道 壞 菌 競 爭, 對 宿 主 健 康 扮 演 重 要 角 食 品 生 技 2010 NO.23 31

4 RESEARCH & DEVELOPMENT 表 二 乳 酸 桿 菌 的 質 體 質 體 名 稱 來 源 菌 種 大 小 (kb) 複 製 方 式 p Theta ppb1 2.9 RCR pxy3 2.9 RCR plfe1 4.0 RCR pd RCR pm4 3.3 RCR pc7 Lb. paraplantarum 2.1 RCR pa1 2.8 RCR p Theta plp1 2.1 RCR p RCR plp RCR plp RCR plks 2.0 Theta plem3 Lb. fermentum 5.7 RCR plf1311 Lb. fermentum 2.4 RCR p353-2 Lb. pentosus 2.3 RCR pkc5b Lb. pentosus 4.4 Theta pgt232 Lb. reuteri 5.1 RCR ptc82 Lb. reuteri 7.0 RCR plab1000 Lb. hilgardii 3.3 RCR plc2 Lb. curvatus 2.6 RCR plbb1 Lb. delbrueckii 8.7 Theta pjbl2 Lb. delbrueckii bulgaricus 8.1 Theta pla103 Lb. acidophilus 14.0 Theta pla105 Lb. acidophilus 3.2 Theta pla106 Lb. acidophilus 2.9 RCR plac1 Lb. acidipiscis 3.5 RCR plj1 Lb. helveticus 11.5 Theta plh1 Lb. helveticus 19.4 Theta plh3 Lb. helveticus 5.7 RCR plh3 Lb. helveticus 3.4 RCR plh4 Lb. helveticus 2.6 RCR pir52-1 Lb. helveticus 6.4 Theta psak1 Lb. sakei 19 Theta prv500 Lb. sakei 13 Theta pyc2 Lb. sakei 1.8 RCR pysi8 Lb. sakei 5.0 RCR ptxw Lb. paracasei 3.2 RCR psf Lb. salivarius 20 Theta psf Lb. salivariu 40 Theta 資 料 來 源 :Shareck et al., 色 臨 床 實 驗 亦 證 實 服 用 含 雙 歧 桿 菌 的 發 酵 乳, 可 以 抑 制 腸 道 腫 瘤 與 促 進 免 疫 功 能 的 效 果 在 部 分 雙 歧 桿 菌 屬 中 也 發 現 了 一 些 質 體 ( 表 三 ), 包 含 B. longum B. globosum B. breve B. asteroides 以 及 B. pseudocatenulatum, 其 中 以 B. longum 最 多, 這 些 質 體 多 數 為 RCR 複 製 型, 大 小 在 5Kb 以 下 (Shareck et al., 2004) ( 四 ) 嗜 熱 鏈 球 菌 (Streptococcus thermophilus) 嗜 熱 鏈 球 菌 屬 於 鏈 球 菌 屬 (streptococcus), 是 此 屬 唯 一 可 用 於 食 品 發 酵 的 菌 種 嗜 熱 鏈 球 菌 可 在 高 溫 下 (52 C) 進 行 醣 類 發 酵, 也 是 目 前 許 多 發 酵 乳 製 品 的 初 步 發 酵 過 程 中 會 使 用 的 菌 種 嗜 熱 鏈 球 菌 中 帶 有 質 體 的 比 例 不 高, 目 前 已 發 現 的 質 體 如 表 四 所 示 (Shareck et al., 2004) 表 三 雙 歧 桿 菌 的 質 體 質 體 名 稱 來 源 菌 種 大 小 (kb) 複 製 方 式 pdojh10l B. longum 10.0 RCR pdojh10s B. longum 3.6 Unknown pmb1 B. longum 1.9 Theta pjk50 B. longum 5.0 RCR pmg1 B. longum 3.9 RCR pblo1 B. longum 3.6 RCR 資 料 來 源 :Shareck et al., 表 四 嗜 熱 鏈 球 菌 的 質 體 質 體 名 稱 來 源 菌 種 大 小 (kb) 複 製 方 式 pst1 S. thermophilus 2.1 RCR per8 S. thermophilus 2.2 RCR per371 S. thermophilus 2.7 RCR per341 S. thermophilus 2.8 RCR pc165st S. thermophilus 6.5 RCR psmq172 S. thermophilus 4.2 RCR 資 料 來 源 :Shareck et al., 農 業 生 技 產 業 季 刊

5 研 發 創 新 乳 酸 菌 複 製 型 表 現 載 體 一 個 複 製 型 表 現 載 體 通 常 要 具 有 以 下 特 性 :(1) 複 製 源 (replication ori);(2) 篩 選 標 記, 通 常 為 抗 生 素 抗 性 基 因 ( 但 食 品 級 載 體 避 免 使 用 ), 以 方 便 挑 選 轉 型 基 因 ;(3) 具 有 一 個 以 上 的 限 制 酶 切 位 (multiple cloning site), 以 利 選 殖 目 標 基 因 ;(4) 整 個 載 體 大 小 不 要 太 大 ;(5) 在 無 篩 選 壓 力 下 ( 不 添 加 抗 生 素 ), 載 體 在 宿 主 中 維 持 的 穩 定 度 目 前 在 分 子 生 物 學 上 使 用 的 乳 酸 菌 載 體, 有 一 部 分 是 源 自 於 pip501 與 pamβ1, 分 別 來 至 Streptococcus 和 Enterococcus 此 類 載 體 為 θ 型 質 體, 它 們 結 構 穩 定, 且 可 以 在 其 他 乳 酸 菌 中 複 製, 例 如 Lactococcus spp. lactobacillus spp. 和 Pediococcus spp.(de Vos and Simons, 1994), 但 是 Streptococci 和 Enterococci 並 非 GRAS 的 菌 種, 因 此 並 不 適 合 應 用 於 食 品 工 業 因 此, 各 種 乳 酸 菌 來 源 的 無 性 狀 質 體, 也 陸 陸 續 續 被 建 構 成 表 現 載 體 ( 表 五 ) 例 如 pgk 系 列 載 體, 源 自 於 乳 酸 乳 球 菌 的 無 性 狀 質 體 pwv01, 可 以 在 Lb. acidophilus Lb. brevis Lb. fermentum Lb. helveticus 等 乳 酸 桿 菌 中 複 製 ( Posno et al., 1991), 此 類 型 載 體 為 RCR 複 製 型, 複 製 後 分 離 較 不 穩 定, 但 用 來 表 現 小 片 段 DNA 還 是 有 其 可 用 之 處 另 外, 有 些 乳 酸 桿 菌 質 體 的 複 製 子 可 以 在 大 腸 桿 菌 (E. coli) 中 複 製, 例 如 的 pa1 因 此 利 用 pa1 建 構 的 載 體 可 作 為 穿 梭 載 體, 方 便 在 大 腸 桿 菌 操 作 (Vujcic and Topisirovic, 1993) 有 些 載 體 源 自 於 窄 宿 主 性 質 體, 例 如 Lb. fermentum 的 plem5, 只 能 在 原 始 宿 主 中 複 製 (Fons et al., 1997) 這 類 型 的 載 體 很 適 合 用 於 基 因 改 造 乳 酸 菌, 因 為 這 類 載 體 不 會 在 宿 主 體 內 或 環 境 中 傳 遞 給 其 他 菌 種, 尤 其 適 合 應 用 在 細 菌 疫 苗 的 開 發 由 於 複 製 型 態 的 特 性,RCR 型 質 體 複 製 過 程 中 會 產 生 單 股 DNA, 相 形 之 下 θ 型 質 體 具 有 較 高 的 質 體 穩 定 度, 因 此 較 適 合 被 用 來 建 構 表 現 載 體 但 多 數 θ 型 質 體 的 複 製 數 目 較 少, 所 以 透 過 篩 選 找 出 複 製 數 目 較 多 的 θ 型 質 體, 也 是 未 來 篩 選 質 體 的 目 標 之 一 另 外, 透 過 嵌 入 型 表 現 載 體 將 目 標 基 因 嵌 入 乳 酸 菌 的 染 色 體 中, 也 是 解 決 穩 定 度 的 一 個 好 方 法 乳 酸 菌 嵌 入 型 表 現 載 體 使 用 複 製 型 載 體 的 最 大 缺 點 即 為 載 體 的 穩 定 性 不 佳, 當 在 沒 有 篩 選 抗 生 素 的 壓 力 下, 宿 主 繼 代 之 後, 載 體 非 均 勻 的 分 配 至 子 代 而 導 致 子 代 逐 漸 失 去 載 體, 載 體 上 功 能 基 因 的 表 現 總 量 逐 漸 變 少, 而 解 決 此 問 題 之 方 法 為 將 載 體 上 的 篩 選 或 功 能 基 因 嵌 入 宿 主 的 染 色 體 上, 則 此 基 因 會 隨 著 宿 主 繼 代 而 傳 至 下 一 代 目 前 所 知 將 基 因 嵌 入 染 色 體 的 方 法 有 三 種 : 轉 位 插 入 (transposition) 特 定 位 點 重 組 (sitespecific recombination) 及 同 源 基 因 或 相 似 序 列 重 組 (homologous recombination) 轉 位 嵌 入 是 利 用 轉 位 子 來 進 行, 轉 位 子 依 其 大 小 可 分 為 transposon (Tn) 及 insertion sequences (IS), 在 適 當 條 件 下 轉 位 子 會 隨 機 嵌 入 宿 主 染 色 體, 並 將 載 體 上 的 基 因 也 一 併 嵌 入, 目 前 在 乳 酸 菌 已 有 找 到 不 少 的 轉 位 子, 例 如 :Tn916 Tn917 IS1191 IS1201 IS1223 ISS1 ISLre1 等 (Gury, Barthelmebs and Cavin, 2004;Jang et al., 2003), 但 是 實 際 可 作 用 於 異 種 乳 酸 菌 的 轉 位 子 並 不 多, 因 為 大 部 分 轉 位 子 有 其 宿 主 專 一 性 之 特 性, 在 他 種 乳 酸 菌 中 容 易 失 去 活 性 轉 位 子 型 載 體 又 依 其 轉 位 機 制 可 分 為 複 製 型 及 非 複 製 型, 非 複 製 型 只 有 一 套 轉 位 子, 將 基 因 送 至 染 色 體 的 目 標 位 置, 複 製 型 的 載 體 上 則 有 兩 套 ; 大 部 分 轉 位 子 型 載 體 主 要 功 能 是 利 用 轉 位 子 隨 機 嵌 入 及 跳 出 的 特 性, 建 構 隨 機 突 變 系 統, 以 此 工 具 來 研 究 宿 主 的 代 謝 及 生 理 作 用 機 制 特 定 位 點 重 組 是 使 用 噬 菌 體 嵌 入 酶 (integrase) 作 用, 嵌 入 酶 會 辨 認 噬 菌 體 上 的 attp 位 置, 與 宿 主 染 色 體 上 的 attb 位 置, 此 兩 個 位 置 有 一 段 很 短 的 相 同 序 列 (core site), 嵌 入 酶 可 利 用 此 相 同 序 列 進 行 重 組 將 載 體 嵌 入 宿 主 染 色 體, 有 些 嵌 入 酶 還 需 有 宿 主 因 子 同 時 參 與 才 可 進 行 重 組 目 前 在 乳 酸 菌 中 食 品 生 技 2010 NO.23 33

6 RESEARCH & DEVELOPMENT 表 五 乳 酸 菌 的 複 製 型 表 現 載 體 載 體 名 稱 複 製 子 來 源 菌 種 篩 選 標 記 大 小 (kb) 宿 主 範 圍 pgk12 pwv01 subsp. Cm r Em r 4.4 B. subtilis Lb.acidophilus Lb. brevis Lb. delbrueckii Lb. fermentum Lb. helveticus Lb. pentosus Lb. reuteri pgkv210 pwv01 subsp. Cm r Em r 4.4 B. subtilis Lb. johnsonii Lb. reuteri pnz11 psh71 subsp. Cm r Km r 4.9 pnz12 psh71 subsp. Cm r Km r 4.1 pcp12 pwc1 subsp. Cm r 3.9 B. subtilis E. coli B. subtilis E. coli Lb. curvatus Lb. sakei L. garviae S. thermophilus En. faecalis Sp. aureus pfx1 pd125 subsp. Cm r 5.5 p21-22 pbm02 subsp. AP r Em r NA B. subtilis pci3340 pci305 subsp. Cm r 5.7 pulp8 plp1 AP r Em r 6.6 plpv106 p256 AP r Em r NA pa1 pa1 Cm r 4.0 B. bacillus Lb. sakei E. coli Lb. delbrueckii ( 待 續 ) 34 農 業 生 技 產 業 季 刊

7 研 發 創 新 表 五 乳 酸 菌 的 複 製 型 表 現 載 體 載 體 名 稱 複 製 子 來 源 菌 種 篩 選 標 記 大 小 (kb) 宿 主 範 圍 plp825 p AP r Cm r 7.6 Lb. curvatus Lb. acidophilus Lb. brevid Lb. fermentum Lb. helveticus Lb. pentosus plem5 plem3 Lb. fermentum Em r 3.4 Lb. fermentum plfvm2 plf1311 Lb. fermentum Cm r 5.0 Lb. buchneri En. faecalis En. faecium B. subtilis B. thuringiensis subsp. galleriae B. thuringiensis subsp. kurstaki B. thuringiensis subsp. finitimus B. flavum E. coli psp1 pkc5b Lb. pentosus Em r 9.4 Lb. fermentum Lb. jensenii Lb. spp. Lb. gasseri Lb. crispatus Lb. johnsonii Lb. salivarius S. mutans S. gordonii S. sanguis plp3537 p353-2 Lb. pentosus AP r Em r 6.3 Lb acidophilu Lb. pentosus pnckh 104 pgt232 Lb. reuteri Em r 5.7 Lb. reuteri plab1102 plab 1000 Lb. hilgardii AP r Cm r 7.5 B. bacillus En. Faecalis pjk352 plc2 Lb. curvatus AP r Cm r 5.9 B. bacillus plhr plj1 Lb. helveticus AP r Em r 8.5 Lb. helveticus ( 待 續 ) 食 品 生 技 2010 NO.23 35

8 RESEARCH & DEVELOPMENT 表 五 乳 酸 菌 的 複 製 型 表 現 載 體 載 體 名 稱 複 製 子 來 源 菌 種 篩 選 標 記 大 小 (kb) 宿 主 範 圍 pula105e pla105 Lb. acidophilus AP r Em r 7.8 pla106pvem pla106 Lb. acidophilus Em r 3.6 prv566 prv500 Lb. sakei AP r Em r 7.3 pls203 psf Lb. salivarius Em r NA plf5 pmb1 B. longum Cm r Ap r 7.3 Lb. acidophilus Lb. acidophilus E. coli Lb. sakei Lb. curvatus, Lb. fermentum Lb. salivarius B. animalis B. bifidum B. infantis B. longum B. magnum pbkj50f/r pjk50 B. longum Cm r Ap r 8.1 B. animalis pbes2 pmg1 B. longum Cm r Ap r 7.6 B. longum plav pmb1 B. longum Cm r 4.3 B. animalis pmeu5 per8 S. thermophilus AP r Em r 5.7 S. thermophilus psmq172 cat psmq172 S. thermophilus Cm r 5.7 S. thermophilus pnd913 pnd103 S. thermophilus AP r Em r 6.4 S. thermophilus phrm1 pst08 S. thermophilus shsp 6.4 S. thermophilus Cm r : chloramphenicol resistance. Em r : erythromycin-resistance. AP r : ampicillin-resistance. Shsp: small heat shock protein ( 小 型 熱 休 克 蛋 白 ) NA: not available. 資 料 來 源 :Shareck et al., 已 發 現 多 種 溫 和 型 噬 菌 體, 例 如 :TP901-1 mv4 ΦLC3 ΦA2 ΦAT3( Alvarez, Herrero and Suarez, 1998;Lo et al., 2005), 多 種 前 述 噬 菌 體 之 嵌 入 酶 已 被 用 來 建 構 嵌 入 載 體, 載 體 上 需 有 嵌 入 酶 基 因 及 attp 序 列, 而 宿 主 需 有 相 對 應 之 attb 序 列 及 宿 主 因 子, 因 此 attb 序 列 之 相 似 性 與 宿 主 因 子 有 無, 影 響 載 體 應 用 的 宿 主 範 圍 利 用 同 源 或 相 似 基 因 重 組 方 式 所 建 構 之 嵌 入 型 載 體, 可 用 來 進 行 基 因 剔 除, 擴 增, 置 換 及 插 入 此 種 載 體 可 用 單 一 交 換 或 是 二 次 交 換 重 組 方 式 將 基 因 嵌 入 宿 主 染 色 體 ; 單 一 交 換 重 組 是 載 體 上 有 一 個 同 源 性 序 列 區 域, 此 片 段 與 宿 主 染 色 體 上 基 因 或 序 列 有 高 相 似 性, 經 由 同 源 性 重 組 將 整 個 載 體 嵌 入 宿 主 染 色 體 特 定 序 列 內, 因 而 可 用 來 進 行 基 因 插 入 或 破 壞, 又 此 種 重 組 方 式 是 可 逆 的, 所 以 需 要 篩 選 條 件 以 維 持 載 體 嵌 入 宿 主 染 色 體 之 穩 定 性 而 二 次 36 農 業 生 技 產 業 季 刊

9 研 發 創 新 載 體 名 稱 交 換 重 組 是 載 體 上 有 二 個 同 源 性 序 列 區 域, 經 由 同 源 性 重 組 將 載 體 上 二 個 同 源 性 序 列 區 域 內 的 基 因 片 段 與 宿 主 染 色 體 上 的 交 換, 因 而 造 成 宿 主 特 定 基 因 的 剔 除 或 插 入, 此 種 重 組 方 式 是 極 穩 定 的, 在 沒 有 篩 選 條 件 下, 仍 可 保 持 載 體 與 宿 主 染 色 體 序 列 交 換 的 結 果 (Goh et al., 2009;Rossi, Capodaglio and Dellaglio, 2008;Russell and Klaenhammer, 2001) 表 六 列 舉 使 用 上 述 三 種 方 法 所 建 構 的 嵌 入 重 組 載 體 轉 位 嵌 入 載 體 pjc4 轉 位 子 / 嵌 入 酶 來 源 / 同 源 基 因 IS1223 pgh9:is ISS1 S1 特 定 位 點 重 組 載 體 TP901-1 from pbc143 Lc. cremoris mv4 from Lb. delbrueckii pmc1 subsp. bulgaricus. pem40 ΦA2 from Lb. paracasei ΦAT3 from Lb. pskein casei 同 源 基 因 重 組 載 體 pgaf002 Cbh 表 六 嵌 入 重 組 載 體 篩 選 或 功 能 表 現 基 因 Em r cela Cm r pada Em r Em r Em r Em r 宿 主 範 圍 Lb. johnsonii Lb. gasseri Lb. bulgaricus NC8 Lc. cremoris Lc. lactis Lb. casei Lc. cremoris Lb. paracasei Lc. lactis Em r 及 澱 粉 酶 alphaamylase from Lp80 Lb. amylovorus pp7b6ni Cbh Em r 及 nisi Lp80 upp ptrk935 slpx Em r Lb. acidophilus NCFM Cm r : chloramphenicol resistance. Em r : erythromycin-resistance. pada: gene encoding a phenolic acid decarboxylase. Cbh: gene encoding conjugated bile salt hydrolase( 結 合 型 膽 鹽 水 解 酶 ) cela: gene encoding extracellular endoglucanase A of Clostridium thermocellum. nisi: gene encoding nisin immunity gene nisi. slpx: gene encoding S-layer complex. 資 料 來 源 :Gury et al., 2004;Jang et al., 2003;Alvarez et al., 1998;Lo et al., 2005;Goh et al., 2009;Rossi et al., 2008;Russell and Klaenhammer, 可 誘 導 型 載 體 表 現 載 體 另 一 個 重 點 在 於 可 調 控 性 目 的 在 於 使 目 標 基 因 在 宿 主 的 特 定 生 長 期 間 才 表 現 載 體 的 調 控 性 來 自 於 各 式 的 啟 動 子 (promoter), 但 不 是 每 一 種 皆 可 用 於 食 品 工 業, 關 鍵 在 於 啟 動 子 對 應 的 誘 導 物 (inducer) 也 必 須 是 食 品 級 的 目 前 文 獻 中 乳 酸 菌 曾 使 用 的 可 調 控 表 現 系 統, 大 致 可 分 為 下 列 幾 種 ( 表 七 )(Shareck et al., 2004): ( 一 ) 醣 類 基 因 在 乳 酸 菌 中 醣 類 基 因 中, 乳 糖 操 作 組 (lac operon) 的 研 究 最 多, 乳 糖 的 添 加 可 誘 導 lac promoter 下 游 基 因 的 表 現, 而 且 乳 糖 本 身 即 是 乳 酸 菌 發 酵 常 用 的 碳 源, 因 此 作 為 表 現 載 體 的 誘 導 物, 並 無 安 全 之 虞 ( 二 ) 高 溫 誘 導 乳 酸 菌 噬 菌 體 中 的 有 些 基 因 會 受 溫 度 提 升 而 誘 導 其 表 現, 例 如 ΦFSW-TI 的 啟 動 子, 當 溫 度 由 28 C 提 升 到 42 C 時, 會 啟 動 下 由 基 因 的 表 現 ( Binishofer et al., 2002) 另 外 乳 酸 乳 球 菌 中 的 噬 菌 體 基 因 rro 與 tec, 也 具 有 相 似 的 特 性, 這 兩 個 基 因 的 啟 動 子 被 拿 來 建 構 誘 導 型 表 現 載 體, 當 溫 度 由 24 C 提 升 到 42 C 時, 可 得 到 500 倍 的 蛋 白 表 現 量 (Nauta et al., 1996) ( 三 ) 低 溫 誘 導 乳 酸 菌 的 冷 休 克 蛋 白 (cold-shock protein), 可 以 在 16 C 以 下 大 量 表 現, 利 用 此 啟 動 子 可 建 構 低 溫 表 現 蛋 白 系 統 ( Derzelle et al., 2002) 雖 然 低 溫 下 細 菌 生 長 速 度 遲 緩, 需 要 較 長 時 間 來 產 生 蛋 白, 但 低 溫 下 表 現 的 蛋 白 亦 有 摺 疊 較 穩 定 的 特 性, 可 解 決 部 分 摺 疊 錯 誤 造 成 無 法 溶 解 的 問 題 (inclusion body) ( 四 ) 酸 性 環 境 乳 酸 菌 是 可 耐 酸 性 環 境 的 菌 種, 因 此 必 定 有 許 多 基 因 在 酸 性 環 境 下 會 被 誘 導 表 現 根 據 這 個 食 品 生 技 2010 NO.23 37

10 RESEARCH & DEVELOPMENT 想 法, 研 究 發 現 了 GadR 蛋 白, 在 酸 性 環 境 穀 氨 酸 鹽 或 氯 化 物 存 在 時, 會 被 活 化 並 作 為 轉 錄 活 化 子 (transcription activator), 促 使 gadcb 的 基 因 的 轉 錄, 可 達 1000 倍 之 多 (Sanders et al., 1998) 因 此 gad 啟 動 子 便 成 為 建 構 表 現 載 體 的 一 個 好 選 擇 ( 五 ) 誘 導 胜 肽 分 子 (AIP) 目 前 最 佳 的 誘 導 型 表 現 載 體 是 NICE system(nisin controlled expression) Nisin 是 乳 酸 乳 球 菌 所 生 產 的 一 種 抑 菌 素, 也 是 美 國 食 品 與 藥 物 管 理 局 (FDA) 核 可 的 食 品 添 加 劑 Nisin 本 身 除 了 抑 菌 的 功 能 外, 也 是 一 個 誘 導 訊 號 分 子, 透 過 膜 上 的 NisK 蛋 白 接 收 訊 號, 活 化 轉 錄 活 化 子 NisR 蛋 白, 促 使 nisa 啟 動 子 下 游 基 因 的 表 現 ( Henrich et al., 2002) 此 系 統 所 可 誘 導 超 過 1000 倍 的 蛋 白 表 現 除 了 在 乳 酸 乳 球 菌 中 表 現 外, 目 前 這 套 系 統 也 可 以 在 Lactobacillus 與 Leuconostoc 中 表 現 類 似 的 系 統 也 陸 陸 續 續 被 發 表, 例 如 利 用 Lb. sakei 中 所 具 有 的 抑 菌 素 sakacin A 作 為 誘 導 物, 透 過 SapK 和 SapR 的 調 控, 可 活 化 sapa 啟 動 子 下 游 的 基 因 (Axelsson, Lindstad and Naterstad, 2003) 表 七 乳 酸 菌 可 誘 導 型 載 體 乳 酸 菌 種 誘 導 方 法 被 誘 導 元 件 乳 糖 laca,lacr promoter S. thermophilus 乳 糖 lacs-galr Lb. pentosus 木 糖 (xylose) xyla promoter 高 溫 tec promoter 高 溫 ΦFSW-TI promoter 低 溫 cspl promoter Nisin nisa promoter Lb. sakei sakacin A sapa promoter 資 料 來 源 :Shareck et al., 食 品 級 載 體 經 由 基 因 工 程 改 造 的 乳 酸 菌 必 須 要 符 合 GRAS 菌 種 的 規 範, 因 此 建 構 的 表 現 載 體 以 及 表 現 的 目 標 基 因 來 源 都 必 須 為 GRAS 菌 種 另 外 為 了 方 便 在 轉 型 (transformation) 過 程 中, 篩 選 轉 型 成 功 的 菌 株, 必 須 使 用 的 篩 選 標 記 (selection marker) 分 子 生 物 學 中 最 常 用 的 篩 選 標 記 是 抗 生 素 的 抗 性 基 因, 但 這 些 抗 生 素 抗 性 基 因 以 及 抗 生 素 是 並 不 符 合 食 品 級 的 規 範, 因 此 無 法 使 用 故 研 究 學 者 便 開 發 出 取 代 的 篩 選 系 統 大 致 可 分 為 三 類 : ( 一 ) 稀 有 醣 類 代 謝 基 因 由 於 大 部 分 乳 酸 菌 可 以 代 謝 多 種 醣 類, 除 了 有 些 罕 見 的 醣 類 之 外, 例 如 木 醣 (xylose) 菊 醣 (inulin) 蜜 二 醣 (melibiose) 等 因 此 從 GRAS 菌 種 找 出 這 些 醣 類 代 謝 基 因, 建 構 在 載 體 上, 可 以 用 來 作 為 篩 選 標 記 ( Posno et al., 1991;Wanker et al., 1995) ( 二 ) 代 謝 基 因 缺 乏 菌 株 部 分 乳 酸 菌 因 天 然 或 人 工 誘 導 突 變, 使 之 缺 乏 某 些 代 謝 基 因, 例 如 乳 糖 胺 基 酸 代 謝 基 因 等 因 此 這 些 基 因 缺 陷 菌 株 在 特 定 營 養 成 分 的 培 養 基 中, 因 無 法 代 謝 而 停 止 生 長 利 用 載 體 表 現 系 統, 將 這 些 代 謝 基 因 建 構 在 載 體 上, 配 合 基 因 缺 陷 菌 株, 便 可 建 構 篩 選 系 統 (Sasaki, Ito and Sasaki, 2004) ( 三 ) 抑 菌 素 系 統 如 前 一 章 節 可 誘 導 型 載 體 第 五 點 所 述, NICE system 中 的 AIP 分 子 Nisin, 同 時 也 是 抑 菌 素 而 宿 主 本 身 之 所 以 不 會 被 Nisin 所 抑 制, 是 因 為 本 身 含 有 免 疫 蛋 白 nisi, 因 此 將 nisi 建 構 於 表 現 載 體 中, 便 可 作 為 篩 選 系 統 的 標 記 ( Takala and Saris, 2002) 結 論 乳 酸 菌 的 質 體 已 有 部 分 被 拿 來 作 為 複 製 型 或 嵌 入 38 農 業 生 技 產 業 季 刊

11 研 發 創 新 型 載 體, 尤 其 是 乳 酸 桿 菌 與 乳 酸 球 菌 未 來 乳 酸 菌 載 體 研 究 發 展 重 點 可 歸 納 為 下 列 數 點 : 1. 尋 找 無 性 狀 質 體 雖 然 已 從 乳 酸 菌 中 找 到 許 多 質 體, 但 不 是 每 個 皆 適 合 作 為 表 現 載 體 因 此 廣 泛 的 尋 找 更 多 無 性 狀 質 體, 是 未 來 研 究 的 首 要 目 標 2. 徹 底 研 究 質 體 的 特 性 許 多 新 發 現 的 質 體 還 未 被 研 究 透 徹, 包 括 其 複 製 子 的 定 義 複 製 方 式 承 載 DNA 片 段 能 力 以 及 穩 定 度 等 3. 建 構 食 品 級 載 體 尋 找 取 代 抗 生 素 的 篩 選 系 統, 以 建 構 食 品 級 的 載 體 4. 建 構 可 誘 導 型 載 體 透 過 啟 動 子 的 研 究, 篩 選 出 可 誘 導 型 的 啟 動 子, 且 其 誘 導 物 需 符 合 GRAS 然 而 透 過 載 體 表 現 系 統 改 良 乳 酸 菌, 即 面 臨 基 因 改 造 食 品 的 問 題 由 於 基 因 改 造 (genetic modification) 一 詞 在 不 同 國 家 有 不 同 之 定 義, 因 此 每 個 國 家 對 於 基 因 改 造 食 品 的 規 範 也 不 盡 相 同, 這 使 得 同 一 個 基 因 改 造 產 品, 在 不 同 國 家 中 卻 有 不 同 的 命 運 例 如 美 國 食 品 與 藥 物 管 理 局 (FDA) 所 核 可 的 發 酵 菌 株 MC010, 是 由 subsp. lactis biovar diacetylactis 所 篩 選 出 的 突 變 株, 其 相 關 發 酵 產 品 在 美 國 已 成 功 上 市, 但 是 依 歐 盟 規 範 則 禁 止 此 商 品 在 歐 洲 地 區 販 售 因 此, 國 際 上 對 於 基 因 改 造 生 物 管 理 規 範 之 調 和, 也 是 未 來 各 國 重 要 之 議 題 AgBIO 林 志 侯 國 立 清 華 大 學 分 子 醫 學 所 教 授 參 考 文 獻 1. Alvarez, M. A., Herrero, M. and Suarez, J. E. (1998) The site-specific recombination system of the Lactobacillus species bacteriophage A2 integrates in gram-positive and gram-negative bacteria. Virology 250(1): Axelsson, L., Lindstad, G. and Naterstad, K. (2003) Development of an inducible gene expression system for Lactobacillus sakei. Lett. Appl. Microbiol. 37(2): Binishofer, B. et al. (2002) Inducible promoter-repressor system from the Lactobacillus casei phage phifsw. Appl. Environ. Microbiol. 68(8): Davidson, B. E. et al. (1996) Genomic organization of lactic acid bacteria. Antonie Van Leeuwenhoek 70(2-4): de Vos, W. M., and Simons, G. (1994) Gene cloning and expression systems in Lactococci, in Genetics and biotechnology of lactic acid bacteria. In: de Vos, W. M. and Gasson, M. J. (Ed.) Chapman & Hall, Glasgow, UK. pp del Solar, G. and Espinosa, M. (2000) Plasmid copy number control: an ever-growing story. Mol. Microbiol. 37(3): Derzelle, S. et al. (2002) Cold shock induction of the cspl gene in Lactobacillus plantarum involves transcriptional regulation. J. Bacteriol. 184(19): Fons, M. et al. (1997) Isolation and characterization of a plasmid from Lactobacillus fermentum conferring erythromycin resistance. Plasmid 37(3): Goh, Y. J. et al. (2009) Development and application of a upp-based counterselective gene replacement system for the study of the S-layer protein SlpX of Lactobacillus acidophilus NCFM. Appl. Environ. Microbiol. 75(10): Gury, J., Barthelmebs, L. and Cavin, J. F. (2004) Random transposon mutagenesis of Lactobacillus plantarum by using the pgh9:is S1 vector to clone genes involved in the regulation of phenolic acid metabolism. Arch. Microbiol. 182(5): Henrich, B. et al. (2002) Food-grade delivery system for controlled gene expression in Lactococcus lactis. Appl. Environ. Microbiol. 68(11): 食 品 生 技 2010 NO.23 39

12 RESEARCH & DEVELOPMENT 參 考 文 獻 12. Jang, S. J. et al, (2003) New integration vector using a cellulase gene as a screening marker for Lactobacillus. FEMS Microbiol. Lett. 224(2): Khan, S. A. (1997) Rolling-circle replication of bacterial plasmids. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 61(4): Lo, T. C. et al. (2005) Complete genomic sequence of the temperate bacteriophage PhiAT3 isolated from Lactobacillus casei ATCC 393. Virology 339(1): Nauta, A. et al. (1996) Inducible gene expression mediated by a repressor-operator system isolated from Lactococcus lactis bacteriophage r1t. Mol. Microbiol. 19(6): Osborn, A. M. et al. (2000) Mosaic plasmids and mosaic replicons: evolutionary lessons from the analysis of genetic diversity in IncFII-related replicons. Microbiology 146(Pt9): Posno, M. et al. (1991) Incompatibility of Lactobacillus Vectors with Replicons Derived from Small Cryptic Lactobacillus Plasmids and Segregational Instability of the Introduced Vectors. Appl. Environ. Microbiol. 57(6): Rossi, F., Capodaglio, A. and Dellaglio, F. (2008) Genetic modification of Lactobacillus plantarum by heterologous gene integration in a not functional region of the chromosome. Appl. Microbiol. Biotechnol. 80(1): Russell, W. M. and Klaenhammer, T. R. (2001) Efficient system for directed integration into the Lactobacillus acidophilus and Lactobacillus gasseri chromosomes via homologous recombination. Appl. Environ. Microbiol. 67(9): Sanders, J. W. et al. (1998) A chloride-inducible acid resistance mechanism in Lactococcus lactis and its regulation. Mol. Microbiol. 27(2): Sasaki, Y., Ito, Y. and Sasaki, T. (2004) ThyA as a selection marker in construction of food-grade host-vector and integration systems for Streptococcus thermophilus. Appl. Environ. Microbiol. 70(3): Shareck, J. et al. (2004) Cloning vectors based on cryptic plasmids isolated from lactic acid bacteria: their characteristics and potential applications in biotechnology. Crit. Rev. Biotechnol. 24(4): Takala, T. M. and Saris, P. E. (2002) A food-grade cloning vector for lactic acid bacteria based on the nisin immunity gene nisi. Appl. Microbiol. Biotechnol. 59(4-5): von Wright, A., and Sibakov, M. (1998) Genetic modification of lactic acid bacteria, in Lactic Acid Bacteria: Microbiology and Functional Aspects, 2nd Ed. In: Salminen, S. and von Wright, A. (Ed.) Marcel Dekker, New York, USA. pp Vujcic, M. and Topisirovic, L. (1993) Molecular analysis of the rolling-circle replicating plasmid pa1 of Lactobacillus plantarum A112. Appl. Environ. Microbiol. 59(1): Wanker, E. et al. (1995) Expression of Bacillus subtilis levanase gene in Lactobacillus plantarum and Lactobacillus casei. Appl. Microbiol. Biotechnol. 43(2): 農 業 生 技 產 業 季 刊