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1 東 海 大 學 食 品 科 學 研 究 所 Graduate Institute of Food Science TUNGHAI UNIVERSITY 食 品 科 技 組 Food Technology Section 碩 士 論 文 Master Thesis 指 導 教 授 : 阮 進 惠 博 士 Advisor:Jin-Hewi Rwan, Ph. D. 分 離 大 豆 蛋 白 質 水 解 物 奈 米 顆 粒 之 製 備 及 特 性 之 研 究 Preparation and Characterization of Isolated Soy Protein Hydrolysate Nanoparticles 研 究 生 : 孫 百 秀 撰 Graduate Student:Pai-Hsiu Sun 中 華 民 國 九 十 九 年 十 月 October, 2010

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4 謝 誌 研 修 碩 士 學 位 期 間, 承 蒙 恩 師 阮 進 惠 博 士 於 研 究 上 給 予 悉 心 指 導 並 全 力 支 持, 使 本 論 文 得 以 順 利 進 行 在 論 文 撰 寫 期 間, 感 謝 恩 師 不 厭 其 煩 詳 閱 批 改 及 給 予 建 議, 讓 學 生 得 以 順 利 通 過 學 位 口 試 師 恩 浩 蕩, 永 誌 不 忘, 對 恩 師 敬 上 最 深 的 謝 意 論 文 口 試 期 間, 承 蒙 靜 宜 大 學 食 品 營 養 學 系 張 珍 田 博 士 及 本 研 究 所 蔡 正 宗 博 士, 撥 冗 審 閱 及 詳 加 斧 正, 提 供 寶 貴 意 見, 使 本 論 文 內 容 更 為 周 詳, 在 此 深 表 由 衷 感 謝 在 研 究 所 期 間, 感 謝 系 所 所 有 老 師 和 助 教 在 專 業 領 域 上 的 知 識 傳 授 及 協 助, 也 感 謝 本 校 化 材 系 張 有 義 及 李 國 禎 老 師 慷 慨 借 儀 器 及 協 助, 使 實 驗 得 以 順 利 進 行 ; 感 謝 靜 玫 欣 樺 怡 如 美 燕 慧 文 及 琪 雅 學 姐 在 實 驗 上 的 關 懷 與 指 導 ; 感 謝 同 窗 好 友 豪 駿 怡 樺 佑 年 青 蓉 韋 任 沂 璉 永 翰 展 維 綱 存 及 柏 村, 謝 謝 你 們 的 扶 持 與 打 氣, 總 是 能 在 我 遇 到 瓶 頸 時 給 予 最 有 用 的 建 議 ; 感 謝 希 奇 及 書 平 學 妹, 謝 謝 你 們 的 尊 重 與 陪 伴, 讓 我 能 專 注 於 我 的 研 究 上 ; 感 謝 好 友 采 凌 想 嵐 和 婉 君 對 我 的 關 心, 讓 我 感 到 無 限 溫 暖 研 究 所 期 間 得 到 太 多 人 的 幫 助, 無 法 一 一 詳 列, 在 此 一 併 致 謝, 謝 謝 你 們 的 一 路 相 挺 最 後, 感 謝 我 最 親 愛 的 爸 爸 和 媽 媽, 給 我 最 大 的 支 持 和 鼓 勵, 讓 我 無 後 顧 之 憂 下 完 成 學 業 ; 也 感 謝 姊 姊 和 弟 弟 包 容 我 的 任 性 將 此 論 文 獻 我 最 親 愛 的 家 人, 一 起 分 享 我 的 成 長 與 喜 悅 孫 百 秀 謹 致 於 東 海 大 學 食 品 科 學 研 究 所 中 華 民 國 九 十 九 年 十 月 4

5 目 錄 頁 數 中 文 摘 要......Ⅰ 英 文 摘 要.....Ⅲ 壹 前 言...1 貳 文 獻 整 理 一 腸 道 的 通 透 機 制 二 胜 肽 和 蛋 白 質 於 吸 收 上 的 障 礙 三 幾 丁 質 與 幾 丁 聚 醣...5 ( 一 ) 幾 丁 質 (chitin) 與 幾 丁 聚 醣 (chitosan) 簡 介...5 ( 二 ) 幾 丁 質 與 幾 丁 聚 醣 結 構...5 ( 三 ) 幾 丁 聚 醣 物 化 特 性...7 ( 四 ) 幾 丁 聚 醣 之 製 備...9 ( 五 ) 低 分 子 量 幾 丁 聚 醣 之 製 備...9 ( 六 ) 幾 丁 聚 醣 之 物 性 分 析...11 ( 七 ) 幾 丁 聚 醣 安 全 性 與 法 規...13 四 幾 丁 聚 醣 之 應 用...15 ( 一 ) 食 品 加 工 之 應 用...15 ( 二 ) 生 醫 材 料 之 應 用...15 ( 三 ) 藥 物 控 制 釋 放 之 應 用...17 ( 四 ) 幾 丁 聚 醣 有 助 於 物 質 在 腸 道 吸 收 之 因 素...19 五 奈 米 科 技 發 展...24 ( 一 ) 奈 米 科 技...24 ( 二 ) 奈 米 在 食 品 之 應 用...24 ( 三 ) 奈 米 在 藥 物 之 應 用...26 ( 四 ) 奈 米 顆 粒 (Nanoparticles)...27 六 幾 丁 聚 醣 奈 米 顆 粒...32 ( 一 ) 常 見 幾 丁 聚 醣 微 / 奈 米 級 顆 粒 的 製 備 方 法...32 ( 二 ) 幾 丁 聚 醣 - 三 聚 磷 酸 鈉 (CS-TPP) 包 覆 蛋 白 質 之 機 制 ( 三 ) 幾 丁 聚 醣 - 三 聚 磷 酸 鈉 (CS-TPP) 奈 米 顆 粒 之 應 用...42 ( 四 ) 幾 丁 聚 醣 顆 粒 之 特 性 分 析...44 七 分 離 大 豆 蛋 白 質 水 解 物 (isolate soy protein hydrolysates,isph)...47 ( 一 ) 大 豆 蛋 白 質 之 生 理 功 能...47 ( 二 ) 大 豆 蛋 白 質 水 解 物 之 生 理 功 能...48 ( 三 ) 分 離 大 豆 蛋 白 質 水 解 物 之 生 理 功 能...48 參 材 料 與 方 法...51 一 實 驗 材 料...51 I

6 ( 一 ) 原 料...51 ( 二 ) 藥 品...51 二 實 驗 儀 器...52 三 材 料 準 備...54 ( 一 ) 幾 丁 聚 醣...54 ( 二 ) 不 同 分 子 量 幾 丁 聚 醣 之 製 備...54 ( 三 ) 10~30kDa 分 離 大 豆 蛋 白 質 水 解 物 之 製 備...55 四 實 驗 方 法...57 ( 一 ) 幾 丁 聚 醣 - 分 離 大 豆 蛋 白 質 水 解 物 - 三 聚 磷 酸 鈉 (CS-ISPH-TPP) 奈 米 顆 粒 之 製 備...57 ( 二 )CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 特 性 之 影 響 因 子...57 ( 三 )CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 在 胃 腸 液 中 之 安 定 性 之 影 響 因 子...59 五 分 析 方 法...61 ( 一 ) 幾 丁 聚 醣 去 乙 醯 度 之 測 定...61 ( 二 ) 幾 丁 聚 醣 水 解 物 之 分 子 量 分 析...61 ( 三 )10~30kDa 分 離 大 豆 蛋 白 質 水 解 物 分 子 量 分 析...62 ( 四 ) 蛋 白 質 定 量...63 ( 五 ) 包 覆 率 裝 載 率 及 產 率 之 分 析...63 ( 六 ) 奈 米 顆 粒 粒 徑 和 表 面 電 荷 之 測 定...64 ( 七 ) 安 定 性 之 分 析...64 ( 八 ) 蛋 白 質 電 泳 分 析...65 ( 九 ) 傅 立 葉 轉 換 紅 外 線 光 譜 儀 (FTIR) 分 析...66 ( 十 ) 掃 描 式 電 子 顯 微 鏡 (SEM) 觀 察...66 ( 十 一 ) 統 計 分 析...66 肆 結 果 與 討 論...67 一 樣 品 製 備...67 ( 一 ) 幾 丁 聚 醣 之 製 備...67 ( 二 ) 不 同 分 子 量 幾 丁 聚 醣 之 製 備...67 ( 三 ) 10~30kDa 分 離 大 豆 蛋 白 質 水 解 物 之 區 分...70 二 分 離 大 豆 蛋 白 質 水 解 物 濃 度 幾 丁 聚 醣 分 子 量 及 幾 丁 聚 醣 - 三 聚 磷 酸 鈉 重 量 比 對 幾 丁 聚 醣 - 分 離 大 豆 蛋 白 質 水 解 物 - 三 聚 磷 酸 鈉 (CS-ISPH-TPP) 奈 米 顆 粒 特 性 之 影 響...72 ( 一 )ISPH 濃 度 之 影 響...72 ( 二 ) 幾 丁 聚 醣 分 子 量 之 影 響 ( 三 )CS/TPP 重 量 比 之 影 響...82 三 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 於 胃 腸 液 中 之 安 定 性 之 影 響 因 子...91 ( 一 )CS/TPP 重 量 比 之 影 響...91 ( 二 ) 幾 丁 聚 醣 分 子 量 之 影 響...95 四 於 胃 腸 液 最 為 安 定 之 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 之 製 備 及 其 特 性...98 ( 一 ) 包 覆 率 裝 載 率 及 產 率 之 分 析...98 ( 二 ) 粒 徑 之 分 析...98 ( 三 ) 表 面 電 位 之 分 析 II

7 ( 四 ) 以 SDS-PAGE 評 估 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 經 過 模 擬 過 胃 腸 道 消 化 試 驗 後 ISPH 分 子 量 之 變 化 五 掃 描 式 電 子 顯 微 鏡 (SEM) 觀 察 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 外 觀 型 態 104 六 傅 立 葉 轉 換 紅 外 線 光 譜 儀 (FTIR) 分 析 CS ISPH 及 TPP 之 鍵 結 情 形.106 伍 結 論 一 不 同 分 子 量 幾 丁 聚 醣 之 製 備 二 幾 丁 聚 醣 - 分 離 大 豆 蛋 白 質 水 解 物 - 三 聚 磷 酸 鈉 (CS-ISPH-TPP) 奈 米 顆 粒 之 製 備 及 特 性 之 影 響 因 子 ( 一 )ISPH 濃 度 之 影 響 ( 二 ) 幾 丁 聚 醣 分 子 量 之 影 響 ( 三 )CS/TPP 重 量 比 之 影 響 三 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 於 胃 腸 液 中 之 安 定 性 之 影 響 因 子 ( 一 )CS/TPP 重 量 比 之 影 響 ( 二 ) 幾 丁 聚 醣 分 子 量 之 影 響 四 於 胃 腸 液 最 為 安 定 之 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 之 製 備 及 其 特 性 五 掃 描 式 電 子 顯 微 鏡 (SEM) 觀 察 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 外 觀 型 態 111 六 傅 立 葉 轉 換 紅 外 線 光 譜 儀 (FTIR) 分 析 CS ISPH 及 TPP 之 鍵 結 情 形.111 七 總 結 陸 參 考 文 獻 柒 附 錄 III

8 圖 目 錄 頁 數 圖 一 營 養 物 質 經 由 腸 上 皮 細 胞 之 三 種 穿 透 模 式...3 圖 二 幾 丁 質 幾 丁 聚 醣 及 纖 維 素 之 基 本 結 構...6 圖 三 緊 密 連 接 蛋 白 錯 合 物 之 概 略 結 構...21 圖 四 以 穿 透 電 子 顯 微 鏡 觀 察 幾 丁 聚 醣 對 腸 道 上 皮 細 胞 之 影 響,(a) 為 Caco-2 細 胞 正 常 型 態,(b) 為 經 由 0.1% 幾 丁 聚 醣 處 理 30 分 鐘 後 之 細 胞 (c) 為 將 幾 丁 聚 醣 移 除 後, 繼 續 培 養 24 小 時 後 之 細 胞...23 圖 五 奈 米 藥 物 傳 遞 系 統...28 圖 六 奈 米 顆 粒 於 腸 道 吸 收 之 優 勢...30 圖 七 幾 丁 聚 醣 與 TPP 之 離 子 交 聯 反 應...37 圖 八 幾 丁 聚 醣 與 三 聚 磷 酸 鈉 在 不 同 ph 值 下 之 鍵 結 情 形...38 圖 九 幾 丁 聚 醣 包 覆 BSA 之 機 制 圖...41 圖 十 膜 反 應 系 統...56 圖 十 一 纖 維 酵 素 濃 度 對 幾 丁 聚 醣 水 解 度 之 影 響...69 圖 十 二 分 離 大 豆 蛋 白 質 水 解 物 (ISPH) 經 30 和 10kDa 濾 膜 區 分 所 得 的 濃 縮 物 分 子 量 分 布 圖...71 圖 十 三 ISPH 濃 度 對 包 覆 率 裝 載 率 及 產 率 之 影 響...74 圖 十 四 ISPH 濃 度 對 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 粒 徑 之 影 響...76 圖 十 五 幾 丁 聚 醣 分 子 量 對 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 粒 徑 之 影 響...81 圖 十 六 CS/TPP 重 量 比 對 CS-TPP 及 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 粒 徑 之 影 響...87 圖 十 七 不 同 ph 值 下 幾 丁 聚 醣 與 帶 負 電 聚 合 物 之 鍵 結 及 澎 潤 情 形...92 圖 十 八 CS/TPP 重 量 比 對 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 在 模 擬 胃 液 中 (ph 1.2 buffer) (a) 及 模 擬 腸 液 中 (ph 7.4 buffer)(b) 之 安 定 性 影 響...94 圖 十 九 幾 丁 聚 醣 分 子 量 對 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 在 模 擬 胃 液 中 (ph 1.2 buffer) (a) 及 模 擬 腸 液 中 (ph 7.4 buffer)(b) 之 安 定 性 影 響...97 圖 二 十 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 於 模 擬 過 胃 腸 液 中 之 SDS-PAGE 電 泳 圖 圖 二 十 一 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 之 掃 瞄 式 電 子 顯 微 鏡 (SEM) 觀 察 圖 二 十 二 幾 丁 聚 醣 (a) 分 離 大 豆 蛋 白 質 水 解 物 (b) CS-TPP 奈 米 顆 粒 (c) 及 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 (d) 之 FTIR 光 譜 圖 IV

9 表 目 錄 頁 數 表 一 幾 丁 質 三 種 晶 型 架 構 與 特 性...8 表 二 纖 維 素 酶 水 解 幾 丁 聚 醣 之 特 性...12 表 三 幾 丁 聚 醣 在 生 醫 材 料 主 要 特 性 及 其 應 用...16 表 四 幾 丁 聚 醣 在 藥 物 學 上 的 應 用 及 其 藥 物 傳 遞 形 式...18 表 五 奈 米 顆 粒 藥 物 傳 遞 系 統 現 況 與 產 品 特 性...31 表 六 常 見 幾 丁 聚 醣 奈 米 顆 粒 之 製 備 方 法 及 其 在 藥 物 蛋 白 質 或 基 因 上 的 應 用..33 表 七 ISPH 濃 度 對 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 表 面 電 荷 之 影 響...77 表 八 幾 丁 聚 醣 分 子 量 對 包 覆 率 裝 載 率 及 產 率 之 影 響...79 表 九 幾 丁 聚 醣 分 子 量 對 CS-TPP 及 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 表 面 電 位 之 影 響...83 表 十 CS/TPP 重 量 比 對 包 覆 率 裝 載 率 及 產 率 之 影 響...85 表 十 一 CS/TPP 重 量 比 對 CS-TPP 及 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 表 面 電 位 之 影 響...90 表 十 二 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 之 包 覆 率 裝 載 率 及 產 率 分 析...99 表 十 三 CS-TPP 及 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 之 粒 徑 及 表 面 電 位 分 析 V

10 中 文 摘 要 本 研 究 以 帶 正 電 之 幾 丁 聚 醣 (chitosan,cs, 去 乙 醯 度 85%) 及 帶 負 電 之 三 聚 磷 酸 鈉 (sodium tripolyphosphate,tpp) 利 用 離 子 交 聯 作 用 來 包 覆 分 離 大 豆 蛋 白 質 水 解 物 ( isolated soy protein hydrolysate,isph, 分 子 量 :10~30kDa) 並 製 成 奈 米 級 之 顆 粒, 以 包 覆 及 穩 定 ISPH 活 性 成 分 為 目 的 首 先 以 纖 維 酵 素 水 解 CS 至 高 分 子 量 (HMW kda, 未 水 解 者 ) 中 分 子 量 (MMW kda) 和 低 分 子 量 (LMW kda) 之 CS, 並 分 別 溶 於 1% 醋 酸 溶 液 及 調 ph 值 至 4.7 接 著 於 不 同 濃 度 之 CS 溶 液 個 別 加 入 不 同 濃 度 (1~9 mg/ml) 之 ISPH 溶 液, 再 加 入 TPP(pH 9.0) 溶 液 混 合 均 勻 以 製 備 幾 丁 聚 醣 - 分 離 大 豆 蛋 白 質 水 解 物 - 三 聚 磷 酸 鈉 (CS-ISPH-TPP) 奈 米 顆 粒 探 討 ISPH 濃 度 CS 分 子 量 及 CS/TPP 重 量 比 對 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 之 包 覆 率 裝 載 率 產 率 粒 徑 大 小 表 面 電 荷 及 安 定 性 ( 模 擬 胃 腸 液 之 ph, 即 ph 1.2 和 ph 7.4) 之 影 響 之 後, 利 用 FTIR 分 析 CS TPP 及 ISPH 之 間 的 交 互 作 用, 並 以 掃 瞄 式 電 子 顯 微 鏡 (SEM) 照 相 觀 察 顆 粒 外 觀 結 果 顯 示, 在 包 覆 率 方 面,ISPH 濃 度 愈 低 CS/TPP 重 量 比 為 3/1 及 4/1 時 可 獲 得 較 高 之 包 覆 率 裝 載 率 方 面, ISPH 濃 度 及 CS/TPP 重 量 比 愈 高, 裝 載 率 愈 高 產 率 方 面,CS/TPP 重 量 比 愈 低, 產 率 愈 高 ; 粒 徑 方 面,ISPH 濃 度 及 CS 分 子 量 愈 低, 顆 粒 粒 徑 愈 小 表 面 電 位 方 面, 顆 粒 表 面 皆 帶 正 電 荷, 而 當 CS/TPP 重 量 比 減 少 至 2/1 時, 顆 粒 表 面 電 位 會 出 現 驟 降 之 情 形 ( 由 mv 減 至 mv) 安 定 性 方 面, 幾 丁 聚 醣 分 子 量 愈 高 CS/TPP 重 量 比 愈 低, 安 定 性 愈 佳 ; 而 以 高 分 子 量 之 CS,CS/TPP 重 量 比 3/1,ISPH 濃 度 5mg/mL 所 製 備 之 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 具 有 最 佳 之 安 定 性 ; 由 SDS-PAGE 分 析 證 I

11 實 CS-TPP 可 以 包 覆 及 保 護 ISPH, 避 免 其 遭 受 胃 腸 道 環 境 破 壞 此 外, 應 用 低 分 子 量 之 CS,CS/TPP 重 量 比 3/1,ISPH 濃 度 5mg/mL 所 製 備 之 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 以 SEM 觀 察, 可 見 奈 米 顆 粒 之 粒 徑 均 小 於 100 nm( 乾 燥 後 ) 且 呈 球 型 ; 由 FTIR 分 析 可 得 知 CS 之 胺 基 (-NH ) 會 與 TPP 之 離 子 (-P 3 O 10 及 -HP 3 O 4-10 ) 及 ISPH 之 羧 基 (-COO - ) 產 生 鍵 結 反 應 ; 且 CS-TPP 對 ISPH 之 包 覆 屬 於 物 理 性 ( 無 化 學 鍵 結 產 生 ) 關 鍵 字 : 幾 丁 聚 醣 水 解 物 分 離 大 豆 蛋 白 質 水 解 物 三 聚 磷 酸 鈉 奈 米 顆 粒 安 定 性 II

12 英 文 摘 要 ABSTRACT Chitosan (Mw kda, deacetylation 85%) and its hydrolysates (Mw and kda, hydrolyzed by cellulase), were dissolved in 1% acetic acid solution and adjusted to ph 4.7, and added with isolated soy protein hydrolysate (ISPH) solutions (Mw 10~30 kda molecular weights, 1~9 mg/ml concentrations) before mixing with sodium tripolyphosphate (TPP) solution (ph 9.0) to prepare CS-TPP-ISPH nanoparticles. Such effective factors as chitosan molecular weight, ISPH concentration and chitosan / TPP mass ratio on the encapsulation efficiency (EE), loading capacity (LC), process yield (PY), particle size, zeta potential and stability (at ph 1.2 and 7.4) of the nanoparticles were investigated. Cross linking among CS, TPP and ISPH, and SEM of the nanoparticles were also determined. As a result, a high EE obtained in the low ISPH concentration, CS/TPP mass ratio at 3/1 and 4/1. LC increased in increasing ISPH concentration and CS/TPP mass ratio. A high PY obtained in the low CS/TPP mass ratio. CS-ISPH-TPP particle size decreased as CS Mw and ISPH concentration decreased. All nanoparticles showed positive charge, but when CS/TPP mass ratio at 2/1 the zeta potential will reduced from mv to +24.0mV. The stable increased in increasing CS MW and decreasing CS/TPP mass ratio. ISPH was kept more stable in case of applying CS Mw at kda, CS/TPP mass ratio at 3/1 and ISPH concentration at 5 mg/ml. In a additional, the particle size <100nm III

13 (SEM) and spherical in shape when prepared by CS Mw at kda, CS/TPP mass ratio at 3/1 and ISPH concentration at 5 mg/ml. FTIR analysis showed that the tripolyphosphoic groups of TPP and the carboxyl groups of ISPH were linked with amino groups of chitosan in nanoparticles, and ISPH physically absorbed by CS-TPP(no band shifts). Key word: Chitosan hydrolysate ( CS ), Isolated soy protein hydrolysate(isph), Sodium tripolyphosphate(tpp), Nanoparticles, stability. IV

14 壹 前 言 胜 肽 和 蛋 白 質 屬 大 分 子 量 物 質 ( 分 子 量 >500Da), 具 有 高 度 的 親 水 性, 分 子 量 大 小 和 極 性 常 常 使 它 們 無 法 藉 由 一 般 擴 散 作 用 (transcellular transport pathway) 通 過 細 胞 膜, 導 致 它 們 的 吸 收 率 和 生 物 利 用 率 差 (Lee, 1991), 且 在 消 化 吸 收 過 程 中 容 易 受 到 腸 胃 道 酵 素 降 解, 失 去 其 功 能 活 性, 故 它 們 需 要 被 保 護 文 獻 指 出, 以 幾 丁 聚 醣 包 覆 藥 物 或 活 性 物 質 (bioactive agents) 時 可 降 低 其 在 胃 腸 內 之 強 酸 或 有 關 酵 素 破 壞 ; 幾 丁 聚 醣 可 隔 離 其 與 胃 腸 內 之 其 他 物 質 產 生 結 合 而 保 護 其 活 性 ; 利 用 幾 丁 聚 醣 之 黏 性 黏 附 在 腸 膜 壁 上, 可 延 長 其 在 腸 黏 膜 上 接 觸 之 時 間, 有 助 於 其 吸 收 性 (Tengamnuay and Mitra,1997); 幾 丁 聚 醣 可 暫 時 性 地 打 開 腸 膜 細 胞 之 緊 密 連 接 (tight junctions,tj) 通 道, 讓 其 易 於 進 入 細 胞 內 (Artursson et al.,1994); 另 外, 將 其 製 成 奈 米 顆 粒 可 促 進 其 進 入 腸 細 胞 內 上 述 這 些 特 性 具 有 提 高 藥 物 或 生 物 活 性 物 質 之 運 輸 及 吸 收 分 離 大 豆 蛋 白 質 水 解 物 (isolate soy protein hydrolysates,isph) 具 有 一 些 生 物 活 性 如 抗 氧 化 (Chiang et al.,1999) 降 血 壓 (Chiang et al., 2006) 促 進 脂 肪 分 解 ( 趙,2009) 抑 制 脂 質 生 成 (Tsou et al., 2010) 等, 但 經 由 胃 酸 及 胃 蛋 白 酶 作 用 會 將 其 水 解 至 更 小 的 胜 肽 或 於 消 化 道 系 統 中 與 其 他 食 物 成 分 結 合, 使 其 失 去 上 述 之 生 理 活 性 因 此, 本 研 究 嘗 試 以 幾 丁 聚 醣 作 為 壁 材, 將 大 分 子 分 離 大 豆 蛋 白 質 水 解 物 包 覆 或 吸 附 在 其 結 構 中, 並 將 其 製 備 成 奈 米 級 顆 粒, 希 望 透 過 此 方 式 能 增 加 水 解 物 或 大 分 子 胜 肽 物 質 在 腸 胃 道 之 安 定 性, 且 更 有 效 地 被 吸 收 及 利 用 1

15 一 腸 道 的 通 透 機 制 貳 文 獻 整 理 當 藥 物 或 營 養 物 質 經 由 口 服 方 式 進 入 體 內, 會 經 過 食 道 胃, 接 著 進 入 腸 內, 藥 物 或 營 養 物 質 分 子 經 由 腸 腔 (intestinal lumen) 穿 過 腸 道 上 皮 細 胞 (intestinal epithelium,>200m 2 ), 進 入 血 液 循 環 系 統 吸 收 利 用 分 子 通 過 腸 道 上 皮 細 胞 進 入 血 液 會 透 過 三 種 主 要 的 路 徑 ( 圖 一 ):(1) 被 動 擴 散 通 過 細 胞 膜 (transcellular pathway),(2) 被 動 擴 散 通 過 相 鄰 細 胞 間 隙 (paracellular pathway), 以 及 (3) 載 體 調 控 運 輸 (carrier-mediated transcellular pathway) 由 於 細 胞 的 細 胞 膜 主 要 是 由 脂 質 雙 層 膜 所 構 成, 故 親 脂 性 分 子 可 輕 易 透 過 細 胞 間 轉 運 擴 散 (transcellular diffusion) 方 式 通 過 細 胞 膜 ; 相 反 地, 親 水 性 分 子 是 無 法 被 細 胞 膜 上 載 體 辨 認, 無 法 通 過 疏 水 性 的 細 胞 膜, 因 此 其 要 通 過 上 皮 細 胞 之 阻 隔 則 須 透 過 相 鄰 細 胞 間 隙 (paracellular pathway) 運 輸 方 式, 將 物 質 運 送 到 細 胞 膜 內 然 而 透 過 相 鄰 細 胞 間 隙 運 輸 之 親 水 性 分 子 會 受 到 上 皮 細 胞 之 緊 密 連 接 (tight junction) 嚴 格 限 制 (ward et al., 2000) 決 定 分 子 穿 過 細 胞 膜 的 速 率 受 幾 個 因 素 影 響 :(1) 分 子 大 小 : 通 常 分 子 愈 大 通 透 速 度 愈 慢 ;(2) 分 子 對 脂 質 的 溶 解 度 : 因 細 胞 膜 為 磷 脂 雙 層 所 構 成, 故 物 質 對 脂 質 的 溶 解 度 愈 大, 穿 透 愈 快 ;(3) 物 質 之 極 性 : 非 極 性 物 質 易 穿 透 細 胞 膜, 極 性 物 質 則 不 易 穿 過 細 胞 膜 ;(4) 離 子 電 價 (ionic charge): 通 常 帶 正 電 比 帶 負 電 穿 透 快 ; (5) 分 子 形 狀 : 球 型 通 透 速 度 較 快 ( 陳,2004) 2

16 圖 一 營 養 物 質 經 由 腸 上 皮 細 胞 之 三 種 穿 透 模 式 Figure 1. Transport across intestinal epithelium. Molecules cross the intestinal epithelium into the blood primarily by three pathways : passive diffusion across the cell membranes ( transcellular pathway); passive diffusion between adjacent cells ( paracellular pathway); and carrier-mediated transport ( carrier-mediated pathway). (Ward et al., 2000) 3

17 二 胜 肽 和 蛋 白 質 於 吸 收 上 的 障 礙 大 分 子 物 質 由 於 分 子 量 大 及 溶 解 度 的 問 題 導 致 其 生 體 利 用 率 低 在 分 子 量 方 面, 分 子 量 低 於 500~700 daltons 者, 其 生 體 利 用 率 不 會 受 到 分 子 量 的 影 響 ; 然 而 分 子 量 大 於 500~700 daltons 者, 生 體 可 利 用 率 就 會 顯 著 降 低 在 溶 解 度 方 面, 藥 物 於 吸 收 過 程 中 需 具 備 足 夠 脂 溶 性 (lipophilicity), 才 能 透 過 transcellular pathway 以 被 動 擴 散 通 過 細 胞 膜 ; 若 脂 溶 性 不 足, 分 子 量 在 100~200 daltons 之 物 質 則 可 藉 由 過 相 鄰 細 胞 間 隙 (paracellular pathway) 運 輸 方 式 進 入 細 胞 膜 內 作 進 一 步 的 吸 收, 然 而 大 分 子 物 質 因 為 分 子 量 較 大, 因 此 無 法 藉 由 此 途 徑 通 過 腸 黏 膜, 造 成 吸 收 阻 礙 ( 羅,2007) 胜 肽 和 蛋 白 質 屬 大 分 子 量 物 質 ( 分 子 量 >500Da) 且 具 有 高 度 的 親 水 性 因 為 它 們 的 大 小 和 極 性 常 常 使 它 們 無 法 藉 由 一 般 擴 散 作 用 (the transcellular transport pathway) 通 過 細 胞 膜, 導 致 它 們 的 吸 收 率 和 生 物 利 用 率 差 (Lee, 1991) 蛋 白 質 等 大 分 子 物 質, 因 本 身 分 子 量 太 大 容 易 受 到 酵 素 分 解 半 衰 期 短 腸 黏 膜 滲 透 性 不 佳 等 因 素 的 影 響, 使 得 生 體 利 用 率 (bioavailability) 差, 因 此 常 以 侵 入 性 給 藥 方 式 ( 如 靜 脈 注 射 ) 才 能 獲 得 較 佳 的 治 療 及 吸 收 效 果 若 能 透 過 幾 丁 聚 醣 作 為 壁 材, 將 大 分 子 之 蛋 白 質 及 胜 肽 做 包 覆 或 吸 附 在 其 結 構 中, 並 將 其 製 備 成 奈 米 級 顆 粒, 此 方 式 不 僅 可 幫 助 蛋 白 質 或 胜 肽 大 分 子 物 質 能 避 開 酵 素 分 解 作 用, 還 可 透 過 幾 丁 聚 醣 特 殊 之 之 生 物 黏 著 性 (mucoadhesiveness), 將 顆 粒 黏 附 於 腸 黏 膜 上, 延 長 顆 粒 在 腸 道 的 滯 留 時 間, 增 加 蛋 白 質 或 胜 肽 等 大 分 子 物 質 在 腸 道 吸 收 的 機 會, 另 外 幾 丁 聚 醣 能 暫 時 性 的 打 開 腸 道 上 皮 細 胞 上 之 緊 密 連 接 (tight junction) 讓 包 覆 有 蛋 白 質 之 奈 米 顆 粒 能 被 完 整 吸 收, 增 加 蛋 4

18 白 質 之 生 體 利 用 率 三 幾 丁 質 與 幾 丁 聚 醣 ( 一 ) 幾 丁 質 (chitin) 與 幾 丁 聚 醣 (chitosan) 簡 介 幾 丁 質 又 名 甲 殼 質 甲 殼 素, 一 般 成 淡 黃 色 至 褐 色 的 棉 絮 狀 或 絲 狀 固 體, 具 有 高 度 彈 性 及 延 展 性 早 於 1811 年 法 國 植 物 學 家 Braconno 以 氫 氧 化 鈉 的 稀 溶 液 加 熱 處 理 洋 菇 時 發 現 有 不 溶 物, 當 時 命 名 為 Fungine,1823 年 法 國 科 學 家 Odier 在 昆 蟲 表 面 發 現 類 似 物 質, 而 將 其 命 名 為 Chitin, 希 臘 語 意 為 包 裹 物, 中 譯 名 為 幾 丁 質 幾 丁 聚 醣 一 般 成 白 色 帶 淡 黃 色 的 粉 末 狀 固 體 於 1859 年 Rouget 將 幾 丁 質 置 於 氫 氧 化 鈉 溶 液 中 加 熱, 發 現 其 可 溶 於 有 機 酸, 稱 之 為 幾 丁 酸 ;1894 年 Hoppe-Seyler 將 此 物 正 式 命 名 為 幾 丁 聚 醣 (chitosan)( 陳,1999) 幾 丁 質 廣 泛 分 布 在 自 然 界 中, 主 要 存 在 於 甲 殼 動 物 ( 蝦 蟹 等 ) 的 外 殼 節 肢 動 物 ( 如 昆 蟲 ) 的 外 皮 軟 體 動 物 ( 烏 賊 ) 的 外 殼 和 內 骨 骼, 以 及 真 菌 或 酵 母 菌 等 微 生 物 的 細 胞 壁 中, 為 一 非 常 具 有 價 值 且 值 得 開 發 之 原 料 而 幾 丁 聚 醣 是 由 幾 丁 質 經 過 去 乙 醯 基 (deacetylation) 後 所 得 的 產 物 總 稱 ( 二 ) 幾 丁 質 與 幾 丁 聚 醣 結 構 纖 維 素 (cellulose) 幾 丁 質 (chitin) 與 幾 丁 聚 醣 (chitosan) 三 者 具 有 相 似 之 結 構, 如 圖 二 纖 維 素 的 基 本 組 成 單 位 為 葡 萄 糖, 幾 丁 質 則 由 1000~3000 個 乙 醯 葡 萄 糖 胺 殘 基 相 互 連 接 組 成 的 聚 合 物, 基 本 組 成 單 位 為 乙 醯 葡 萄 糖 胺 ( acetylglucosamin ), 分 子 量 通 常 在 10 5 ~10 7 之 間 ; 按 化 學 結 構 是 為 聚 -N- 乙 醯 - 葡 萄 糖 胺 (poly-n-acetyl- 5

19 圖 二 幾 丁 質 幾 丁 聚 醣 及 纖 維 素 之 基 本 結 構 Figure 2. Structure of chitin, chitosan and cellulose. (Krajewska, 2004) 6

20 glucosamine), 屬 六 碳 糖 多 醣 體, 可 稱 為 動 物 纖 維 素 Muzzarelli(1977) 指 出 幾 丁 質 聚 合 方 式 依 據 三 度 空 間 的 立 體 排 列 可 分 為 α 型 β 型 γ 型 三 種, 其 晶 型 架 構 與 特 性 見 表 一 幾 丁 聚 醣 基 本 構 成 單 位 為 葡 萄 醣 胺 (glucosamine) 的 高 分 子 聚 合 體, 是 一 種 高 分 子 纖 維, 可 由 幾 丁 質 經 由 去 乙 醯 化 (deacetylation) 而 獲 得, 其 構 造 可 依 晶 型 的 不 同 分 成 四 種 :Tendon 型, 屬 斜 方 晶 系 ; Annealed 型, 亦 屬 斜 方 晶 系 ;L-2 型, 屬 單 協 晶 系 ; I-2 型, 屬 單 協 晶 系 目 前 幾 丁 質 和 幾 丁 聚 醣 在 去 乙 醯 程 度 上 的 差 異 並 無 明 顯 的 定 義 將 其 劃 分,Muzzarelli 及 Rocchett 在 1985 年 提 出 總 氮 量 佔 聚 合 物 的 百 分 之 七 (w/w) 以 上 者 為 幾 丁 聚 醣 ; 而 另 外 一 種 說 法 是 以 去 乙 醯 度 大 於 60 % 且 微 溶 於 酸 性 溶 液 者 稱 為 幾 丁 聚 醣 (Aiba, 1992) 幾 丁 聚 醣 結 構 的 可 變 性 大, 包 括 聚 合 長 度 聚 合 的 鍵 結 方 式 等, 通 常 可 製 成 膠 狀 (gel) 纖 維 狀 (fiber) 珠 狀 (bead) 薄 膜 狀 (film) 及 海 綿 狀 (sponge) 等, 以 供 各 式 使 用 (Sabnis and Block, 2000) ( 三 ) 幾 丁 聚 醣 物 化 特 性 1. 陽 離 子 特 性 幾 丁 聚 醣 在 酸 性 溶 液 中 或 小 於 其 pka(ph~6.3) 時 其 結 構 C 2 上 所 帶 的 胺 基 (NH 2 ) 會 轉 變 成 帶 有 正 電 荷 (NH 3 + ) 的 胺 基, 是 目 前 所 發 現 唯 一 具 有 帶 正 電 性 的 天 然 多 醣 ( 糜,2007) 2. 溶 解 性 幾 丁 聚 醣 可 溶 於 酸 性 或 弱 酸 性 的 有 機 酸 或 無 機 酸 中, 例 如 醋 酸 甲 酸 硫 酸 磷 酸 檸 檬 酸 蘋 果 酸 及 琥 珀 酸 等, 其 中 以 甲 酸 為 最 佳 7

21 表 一 幾 丁 質 三 種 晶 型 架 構 與 特 性 Table 1. Three crystal structures of chitin and their propertyes. 形 式 α type β type γ type 晶 系 斜 方 晶 系 單 斜 晶 系 斜 方 晶 系 與 單 斜 晶 系 混 合 (rhombic system) (monoclinic system) 架 構 對 稱 的 兩 股 雙 螺 旋 呈 現 對 稱 的 雙 股 螺 旋 架 構 呈 現 每 兩 個 平 行 長 鏈 就 會 反 向 平 行 (anti-parallel) 同 向 平 行 排 列 (parallel) 有 一 個 反 向 平 行 長 鏈 圖 示 特 性 構 形 緊 密, 質 地 堅 硬 架 構 較 鬆 散, 易 被 幾 丁 質 酶 架 構 緊 密 性 介 於 α type 與 β 自 然 界 中 存 在 最 多 (chitinase) 分 解 type 之 間 自 然 界 中 存 在 昆 蟲 甲 殼 類 動 物 烏 賊 體 內 軟 骨 藻 類 真 菌 類 (Muzzarelli, 1977; 賴,1979;Blackwell, 1988) 8

22 溶 劑, 可 溶 解 近 50% 的 幾 丁 聚 醣 而 醋 酸 常 被 選 用 作 為 測 定 幾 丁 聚 醣 溶 液 系 統 的 溶 劑 (Knorr, 1984), 溶 解 度 可 達 4% 以 上 ; 另 外 幾 丁 聚 醣 也 微 溶 於 鹽 酸 硝 酸 及 磷 酸 等 無 機 酸, 且 具 有 降 解 (degradation) 現 象 的 產 生 (Muzzarelli, 1977) 溶 解 後 的 幾 丁 聚 醣 可 提 供 高 黏 度 性 質, 具 有 黏 性 安 定 作 用, 但 其 不 溶 於 水 及 酒 精 中 3. 親 水 性 幾 丁 聚 醣 之 親 水 性 會 隨 著 其 去 乙 醯 程 度 多 寡 和 溶 液 之 ph 值 不 同 而 改 變 幾 丁 聚 醣 去 乙 醯 度 愈 高, 其 結 構 上 的 氨 基 愈 多 於 酸 性 下, 幾 丁 聚 醣 結 構 之 -NH 2 可 轉 為 -NH + 3 group, 使 其 帶 正 電 荷, 親 水 性 增 強 ; 鹼 性 下, 其 -NH + 3 group 會 轉 為 -NH 2, 使 其 親 水 性 減 弱 ( 四 ) 幾 丁 聚 醣 之 製 備 幾 丁 質 和 幾 丁 聚 醣 最 大 區 別 在 去 乙 醯 度, 目 前 用 來 製 備 幾 丁 聚 醣 的 方 法 有 : 熱 鹼 液 法 ( 徐,2001; 柯,2006) 酵 素 法 ( 徐,2001; 陳 等 人,2000) 和 微 生 物 ( 陳 等 人,2000; 莊,2002) 方 法 而 本 實 驗 使 用 熱 鹼 液 法 來 製 備 幾 丁 聚 醣, 其 具 有 反 應 時 間 短 去 乙 醯 度 較 高 以 及 製 備 成 本 較 低 等 優 點, 也 最 常 被 使 一 般 熱 鹼 液 法 中 最 常 使 用 氫 氧 化 鈉 溶 液 來 去 除 幾 丁 質 之 乙 醯 基, 其 濃 度 約 為 30 ~ 60 %(w/v), 鹼 液 濃 度 愈 高, 其 去 乙 醯 化 程 度 愈 高 ( 李,1988;Bough et al., 1978; Mima et al.,1983) 另 外, 幾 丁 聚 醣 之 去 乙 醯 程 度 亦 會 受 鹼 液 溫 度 鹼 液 作 用 時 間 幾 丁 聚 醣 本 身 的 分 子 量 或 結 構 上 的 差 異 影 響 ( 徐, 2001; 柯,2006) ( 五 ) 低 分 子 量 幾 丁 聚 醣 之 製 備 幾 丁 聚 醣 應 用 範 圍 十 分 廣 泛, 但 因 其 分 子 量 高 溶 解 度 差 黏 度 高, 使 其 應 用 受 到 限 制, 因 此 如 何 製 備 出 低 分 子 量 及 具 高 溶 解 度 之 9

23 幾 丁 聚 醣, 一 直 是 研 究 幾 丁 聚 醣 的 重 要 目 標 之 一 常 見 製 備 低 分 子 量 之 幾 丁 聚 醣 有 以 下 幾 種 方 法 : 酵 素 法 酸 水 解 法 超 音 波 降 解 法 超 音 波 與 剪 力 降 解 法 高 速 微 射 流 降 解 法 氧 化 劑 降 解 法 等 而 以 酵 素 來 水 解 幾 丁 聚 醣 具 有 專 一 性 高 水 解 條 件 溫 和 水 解 反 應 容 易 控 制 反 應 速 率 快 且 無 化 學 物 質 殘 留 問 題 等 優 點 Pantaleone 等 人 (1992) 指 出 有 10 種 葡 聚 醣 酶 (glycanase) 21 種 蛋 白 分 解 酶 (protease) 5 種 脂 肪 酶 (lipase) 和 1 種 單 寧 酶 (tannase) 具 有 水 解 幾 丁 聚 醣 的 活 性, 其 中 以 木 瓜 酵 素 (papain) 的 專 一 性 最 高, 其 次 分 別 為 脂 肪 酶 (lipase) 半 纖 維 素 酶 (hemicellulase) 和 纖 維 素 酶 (cellulase) 本 實 驗 利 用 酵 素 法 來 製 備 低 分 子 量 幾 丁 聚 醣, 並 選 擇 纖 維 素 酶 作 為 水 解 酵 素 纖 維 素 酶 可 將 纖 維 素 物 質 轉 變 成 葡 萄 糖 而 纖 維 素 酶 可 由 細 菌 真 菌 中 獲 得, 尤 其 是 真 菌 類 如 Trichorma viride 及 T. reesei., 一 般 而 言 纖 維 素 酶 依 水 解 作 用 方 式 可 分 為 三 類 :(1) 內 切 型 纖 維 素 分 解 酵 素 (endo-1,4-β-glucanases)(ec ) 主 要 剪 切 纖 維 素 內 部 之 β-1,4- 配 醣 鍵 (2) 外 切 型 纖 維 素 分 解 酵 素 (exo-β-1,4-d-glucanase) 又 稱 1,4-β-D-cellobiohydrolases ( EC ), 由 非 還 原 端 (non-reducing ends) 將 纖 維 素 以 纖 維 雙 醣 為 單 位 予 以 分 解 (3)β- 葡 萄 糖 酵 素 (1,4-β-D-glycosidases)(EC ), 主 要 將 纖 維 雙 醣 或 短 鏈 之 纖 維 寡 醣 (cellooligosaccharide) 分 解 成 葡 萄 糖 (Xia et al., 2008) 幾 丁 聚 醣 與 纖 維 素 之 結 構 相 似, 已 有 許 多 文 獻 使 用 纖 維 素 酶 來 水 解 幾 丁 聚 醣 Pantaleone 等 人 (1992) 及 Muraki 等 人 (1993) 指 出 市 售 纖 維 素 酶 大 多 具 有 水 解 幾 丁 聚 醣 的 活 性, 其 exo-β-1,4-glucanase 活 性 愈 強 的 纖 維 素 酶, 水 解 幾 丁 聚 醣 的 能 力 也 愈 強 而 Xia 等 人 (2008) 10

24 指 出 以 不 同 來 源 之 纖 維 素 酶 水 解 幾 丁 聚 醣 皆 能 產 生 與 幾 丁 聚 醣 酶 相 當 的 活 性, 見 表 二 ( 六 ) 幾 丁 聚 醣 之 物 性 分 析 1. 分 子 量 的 測 定 不 同 分 子 量 的 幾 丁 聚 醣 有 不 同 的 特 性 及 應 用 範 圍, 常 見 分 析 幾 丁 聚 醣 分 子 量 方 法 有 : 黏 度 平 均 分 子 量 (Maghami and Roberts,1988; Roberts and Domszy, 1982) 高 效 液 相 層 析 法 (Wu and Bough, 1976) 光 散 射 法 量 (Beri et al., 1993) 及 膠 體 過 濾 分 析 法 (Mima et al., 1983) 本 實 驗 採 用 膠 體 過 濾 分 析 法 來 測 定 幾 丁 聚 醣 分 子 量, 其 原 理 為 利 用 分 子 篩 的 作 用 來 將 不 同 分 子 量 之 幾 丁 聚 醣 作 分 離, 分 子 量 較 大 者 滯 留 時 間 短, 分 子 量 小 者 滯 留 時 間 長 方 法 為 在 管 柱 中 填 充 一 定 孔 徑 的 膠 體, 並 以 醋 酸 緩 衝 液 作 為 其 流 動 相, 利 用 其 不 同 分 子 大 小 在 管 柱 內 滯 留 的 時 間 的 不 同, 配 合 RI 偵 測 器 來 偵 測 分 子 量 大 小 (Mima et al., 1983) 2. 去 乙 醯 度 的 測 定 幾 丁 質 和 幾 丁 聚 醣 最 大 區 別 在 去 乙 醯 度, 一 般 幾 丁 聚 醣 去 乙 醯 程 度 介 於 65%~99% 不 等, 而 以 70~90% 最 常 見, 去 乙 醯 度 愈 高, 其 結 構 上 的 胺 基 愈 多, 在 酸 性 下 所 帶 的 正 電 荷 愈 多, 因 此 能 吸 附 的 陰 離 子 重 金 屬 或 其 他 小 分 子 愈 多 ; 國 際 及 大 陸 對 於 用 作 保 健 食 品 原 料 之 幾 丁 聚 醣, 去 乙 醯 程 度 必 須 達 85% 以 上, 常 見 去 乙 醯 度 的 測 定 方 法 有 : 紅 外 光 譜 分 析 法 紫 外 光 光 譜 分 析 (Muzzarelli, 1985;Tan et al., 1998) 光 譜 分 析 法 (Domard, 1987) 氣 相 層 析 法 (Holan and Voyruba, 1980) 高 效 液 相 層 析 法 (Niola et al., 1993) 酵 素 法 (Nanjo, 1991) 滴 定 法 (Toei and Kohara, 1976) 熱 分 析 法 (Alonso et al., 1983) 比 色 11

25 表 二 纖 維 素 酶 水 解 幾 丁 聚 醣 之 特 性 Table 2. Properties of cellulases on chitosan hydrolysis. Vmax Viscosity Source/name Molecular Optimum Optimum pi Km for Distribution of reaction mass (kda) temperature ( ) ph chitosan g L -1 reduction (%) products Bacillus cereus D (SDS) ND mol/mg/s 90 Chitobiose, chitotriose, and chitoriose Lysobacter sp. IB (SDS) , 7.0 ND ND ND 91 Dimer, trimer, tetramer Bacillus sp. S65 45 (SDS) ND ND NA NA Trichoderma viride 66 (SDS) mg/ ml min 80 Dimer, trimer, tetramer and glucosamine Special type ND ND NA NA ND dp2 12 oligomers (commercialcellulase) a Pseudomona sp. H (SDS) < mg/ml ND ND min Bacillus sp. MET (SDS) ND ND ND 99 Dimer, trimer, tetramer Trichoderma viride ND ND ND 93 Chito-oligosaccharides Japanese cellulase(commercial) a ND ND NA NA Dimer, trimer, tetramer and glucosamine Commercial cellulase a ND ND ND ND 50 18,000 Commercial cellulase a ND ND mg/ml ND NA min Streptomyces griseus 34 (SDS) ND ND ND NA Dimer, trimer, tetramer HUT 6037 Bacillus cereus S1 45 (SDS) ND ND ND NA Dimer, trimer, tetramer T. reesei ND ND ND ND 98 Oligomers T. viride Myxobacter AL-1 32 (SDS) ND mol/l min ND Glucosamine ND: not determined; NA: no data shown; GF: gel filtration; SDS: SDS PAGE electrophoresis. a The source unknown. (Xia et. al, 2008) 12

26 分 析 法 (Davies and Hayes, 1988) 核 磁 共 振 光 譜 分 析 法 (Saito, 1987) Nihydrin 呈 色 定 量 游 離 胺 基 法 (Curotto and Aros, 1993) 本 實 驗 採 用 滴 定 法, 其 方 法 為 利 用 多 陰 離 子 試 劑 P.V.S.K. (Potassium polyvinyl sulfate) 滴 定 待 測 溶 液, 並 以 toluidine blue 為 指 示 劑, 當 滴 定 達 終 點 時, 會 由 藍 色 轉 變 為 紅 紫 色, 再 與 標 準 品 比 對 滴 定 量 則 可 測 得 去 乙 醯 度 (Toei and Kohara, 1976) ( 七 ) 幾 丁 聚 醣 安 全 性 與 法 規 幾 丁 聚 醣 是 公 認 無 毒 性 且 具 高 度 生 物 相 容 性 的 聚 合 物, 其 已 被 廣 泛 地 利 用 在 食 品 上, 並 通 過 許 多 安 全 認 證, 其 安 全 性 評 估 及 應 用 如 下 : 1983 年 : 日 本 將 幾 丁 聚 醣 列 入 食 品 添 加 劑 (Japanese Natural Additive List) 1986 年 :AAFCO(Association of American Feed Control Officials) 允 許 幾 丁 聚 醣 作 為 動 物 飼 料, 含 量 以 飼 料 總 含 量 的 0.1% 為 限 1989 年 : 日 本 將 幾 丁 質 及 幾 丁 聚 醣 在 List of Food Additives other thanchemical Synthetics 列 為 合 法 的 安 定 劑 (stabilizers) 及 增 稠 劑 (thickeners) 1991 年 : 美 國 食 品 藥 物 管 理 局 (USFDA,United States Food and Drug Administration) 允 許 幾 丁 聚 醣 為 一 合 法 的 食 品 及 飼 料 添 加 物 幾 丁 聚 醣 及 其 衍 生 物 可 用 來 當 作 食 品 加 工 蔬 果 的 蛋 白 質 沈 澱 劑 2002 年 : 在 台 灣, 行 政 院 衛 生 署 於 衛 生 署 核 發 健 康 食 品 許 可 證 一 覽 13

27 表 中, 列 出 金 車 甲 殼 素 複 方 膠 囊 為 核 可 健 康 食 品, 其 內 容 物 主 要 成 分 包 含 了 幾 丁 聚 醣, 且 標 示 出 其 保 健 功 效 : 降 低 血 中 總 膽 固 醇 量 可 降 低 血 中 低 密 度 脂 蛋 白 膽 固 醇 可 減 少 動 脈 硬 化 之 危 險 因 子 ( 台 灣 行 政 院 衛 生 署 ) 14

28 四 幾 丁 聚 醣 之 應 用 幾 丁 聚 醣 及 其 衍 生 物 已 被 廣 泛 應 用 在 各 個 領 域, 如 醫 療 保 健 食 品 加 工 農 業 化 工 廢 水 處 理 紡 織 工 業 生 化 工 業 生 醫 材 料 及 藥 物 控 制 釋 放 等 以 下 就 幾 丁 聚 醣 在 食 品 加 工 生 醫 材 料 及 藥 物 控 制 釋 放 之 應 用 加 以 敘 述 : ( 一 ) 食 品 加 工 之 應 用 幾 丁 聚 醣 結 構 上 具 有 帶 正 電 的 胺 基, 使 其 擁 有 許 多 良 好 的 生 物 活 性 (Bioactivity) 由 於 幾 丁 聚 醣 具 有 增 黏 性 吸 附 性 抑 菌 性 等 特 質, 故 可 作 為 天 然 食 品 添 加 劑 幾 丁 聚 醣 在 食 品 工 業 應 用 最 常 被 探 討 的 是 其 抗 菌 性 目 前 已 知 幾 丁 聚 醣 抗 菌 模 式 有 兩 種 :(1) 幾 丁 聚 醣 在 酸 性 環 境 下 結 構 上 的 胺 基 (NH 2 ) 會 轉 變 成 帶 有 正 電 荷 (NH + 3 ) 的 胺 基, 因 此 可 吸 附 於 細 胞 表 面 上 帶 有 負 電 之 官 能 基, 干 擾 或 改 變 細 胞 膜 之 通 透 性, 使 得 菌 體 內 物 質 流 失 而 導 致 細 胞 死 亡 ;(2) 幾 丁 聚 醣 可 與 DNA 結 合 抑 制 mrna 合 成, 因 此 小 分 子 量 之 幾 丁 聚 醣 進 入 菌 體 內 會 抑 制 RNA 生 成 並 降 低 細 胞 活 性 進 而 達 到 抑 菌 效 果 ( 陳,2000) ( 二 ) 生 醫 材 料 之 應 用 幾 丁 聚 醣 屬 於 天 然 生 物 製 品, 其 無 毒 性, 對 於 生 物 細 胞 具 有 良 好 的 生 物 相 容 性 (biocompatible) 生 物 可 分 解 性 (biodegradable) 可 恢 復 性 (renewable), 具 有 成 膜 性 高 度 保 水 性, 可 被 人 體 溶 菌 酶 所 分 解 以 及 具 有 良 好 的 抗 菌 性 ( 細 菌 病 毒 黴 菌 等 ) 等 優 點, 因 此 被 廣 泛 應 用 在 生 物 醫 學 材 料 方 面 如 表 三 所 示, 幾 丁 聚 醣 及 其 衍 生 物 多 應 用 於 外 科 縫 合 牙 齒 移 植 人 工 皮 膚 骨 骼 修 護 隱 型 眼 鏡 藥 物 控 制 釋 放 或 膠 囊 外 材 等 15

29 表 三 幾 丁 聚 醣 在 生 醫 材 料 主 要 特 性 及 其 應 用 Table 3. Principal properties of chitosan in relation to its use in biomedical applications. 生 醫 材 料 方 面 的 應 用 外 科 縫 合 牙 齒 移 植 人 工 皮 膚 骨 骼 重 建 隱 形 眼 鏡 藥 物 控 制 釋 放 膠 囊 材 料 主 要 特 性 生 物 相 容 性 生 物 可 分 解 性 修 復 功 能 成 膜 性 保 水 性 無 毒 性, 生 物 耐 受 性 可 被 溶 菌 酶 分 解 具 有 治 療 特 性 具 抗 細 菌 病 毒 真 菌 效 果 (Rinaudo, 2006) 16

30 ( 三 ) 藥 物 控 制 釋 放 之 應 用 許 多 研 究 指 出, 幾 丁 聚 醣 具 有 高 度 正 電 荷 及 可 形 成 膠 體 和 薄 膜 的 特 性, 故 可 應 用 於 藥 物 控 制 釋 放 方 面 ( 陳,2000) 文 獻 指 出 幾 丁 聚 醣 具 有 提 高 藥 物 運 輸 (enhance the transport)(illum et al., 1994), 增 加 藥 物 在 腸 道 吸 收 ( absorption enhancer ) ( Tengamnuay and Mitra,1997) 提 高 藥 物 生 體 利 用 率 (improve the bioavailibility) (Luessen et al.,1996), 並 可 有 效 的 黏 附 在 黏 膜 上, 打 開 控 制 物 質 進 入 細 胞 內 之 緊 密 連 接 (tight junctions) 通 道 等 特 性 (Artursson et al.,1994), 這 些 特 性 一 方 面 能 控 制 藥 物 釋 放 和 延 長 有 效 治 療 時 間 ; 另 一 方 面 更 可 以 把 藥 物 送 到 特 定 位 置, 故 可 用 於 藥 物 釋 放 技 術 已 有 許 多 文 獻 利 用 幾 丁 聚 醣 與 藥 物 結 合, 製 備 成 微 米 粒 子 微 脂 粒 口 錠 溶 液 膠 囊 薄 膜 或 乾 燥 粒 子 等, 並 將 其 運 用 在 口 服 非 腸 胃 鼻 部 眼 部 及 基 因 等 治 療 方 面 ( 見 表 四 ) 以 幾 丁 聚 醣 作 為 藥 物 基 材 時, 其 應 用 性 及 特 性 會 受 到 幾 丁 聚 醣 之 顆 粒 大 小 密 度 黏 度 去 乙 醯 程 度 及 分 子 量 等 影 響 而 文 獻 指 出 幾 丁 聚 醣 在 藥 物 運 送 上 有 下 列 優 點 : 1. 穩 定 藥 物 中 的 成 分 因 為 幾 丁 聚 醣 具 有 正 電 荷 可 與 藥 物 中 帶 負 電 荷 游 離 脂 肪 酸 交 互 作 用 形 成 乳 劑 狀, 依 此 形 式 幾 丁 聚 醣 與 脂 肪 酸 能 形 成 聚 合 物 (co-polymer) 達 到 保 護 脂 肪 功 能 性, 避 免 藥 物 中 脂 肪 酸 成 分 在 高 溫 滅 菌 過 程 遭 受 破 壞 (Junaa and Muller, 1999) 2. 促 進 藥 物 吸 收 文 獻 指 出 一 些 不 易 被 消 化 吸 收 的 藥 物 如 atenolol 與 幾 丁 聚 醣 混 合 後, 經 實 驗 證 實 幾 丁 聚 醣 可 提 升 atenolol 被 腸 道 細 胞 Caco-2 的 吸 收 度 17

31 表 四 幾 丁 聚 醣 在 藥 物 學 上 的 應 用 及 其 藥 物 傳 遞 形 式 Table 4. Pharmaceutical applications and delivery system of chitosan. Route of administration Oral Delivery system Microparticulate Liposomes Buccal disk Solution Vesicle Film coating Tablets Spray dried particles capsules Parenteral Microspheres Solution Nasal Ocular Solution Suspension Gene therapy Other Gel systems (Dodane and Vilivalam, 1998) 18

32 率 達 10~15 倍 (Schipper,et al., 1999) 3. 延 緩 或 控 制 藥 物 溶 解 速 度 有 些 藥 物 屬 於 水 溶 性 或 是 遇 到 酸 即 溶 解, 使 得 這 些 藥 物 無 法 順 利 到 達 腸 道 被 吸 收 而 喪 失 其 功 效, 而 幾 丁 聚 醣 可 作 為 口 服 藥 無 傳 遞 載 體, 具 有 延 緩 或 控 制 藥 物 溶 解 速 度 (Brine, 1989;Felt et al., 1999; Ganza-Gonzalez et al.,1999) 4. 幫 助 藥 物 送 達 目 的 器 官 幾 丁 聚 醣 同 時 具 有 疏 水 基 和 親 水 基, 可 與 紫 杉 醇 (toxol) 形 成 小 於 100nm 小 顆 粒 膠 粒 (micell), 研 究 證 實 依 此 形 式 紫 杉 醇 能 更 有 效 地 被 送 達 至 腫 瘤 部 位, 且 紫 杉 醇 與 幾 丁 聚 醣 之 混 合 物 對 腫 瘤 細 胞 的 抑 制 能 力 比 游 離 的 紫 杉 醇 佳 (Miwa et al., 1999) ( 四 ) 幾 丁 聚 醣 有 助 於 物 質 在 腸 道 吸 收 之 因 素 1. 幾 丁 聚 醣 具 生 物 黏 著 性 許 多 文 獻 指 出 幾 丁 聚 醣 擁 有 良 好 黏 膜 黏 著 性 (mucoadhesive)(lehr et al., 1992; Needleman and Smales,1995; Rillosi and Buckton, 1995; He et al., 1998;Shimoda et al., 2001; Kockisch et al., 2003) 這 是 因 為 幾 丁 聚 醣 有 高 度 正 電 荷, 可 透 過 分 子 間 靜 電 吸 引 作 用 力, 黏 附 在 帶 負 電 之 黏 膜 表 面, 有 此 特 性 歸 因 於 幾 丁 聚 醣 有 : (1) 強 的 氫 鍵 鍵 結 基 團 如 OH, COOH(Schipper et al., 1997); (2) 高 度 電 荷 (Dodane et al., 1999); (3) 高 度 分 子 量 (Schipper et al., 1996; Kotze et al., 1998); 19

33 (4) 鏈 具 有 良 好 的 伸 展 性 (He et al., 1998); (5) 表 面 能 量 特 性 可 支 持 幾 丁 聚 醣 滲 透 至 黏 膜 (Lueβen et al., 1994) 2. 幾 丁 聚 醣 具 可 逆 性 地 調 控 腸 道 上 皮 細 胞 之 緊 密 連 接 (tight junction) 開 合 之 能 力 緊 密 連 接 是 一 種 封 閉 連 接, 主 要 存 在 上 皮 細 胞 和 內 皮 細 胞 間, 如 消 化 道 上 皮 膀 胱 上 皮 腦 毛 細 管 內 皮 以 及 睪 丸 支 持 細 胞 之 間 等 緊 密 連 接 是 由 occuldin claudin 及 cytoplasmic plague 蛋 白 質 所 組 成 的 錯 合 物, 而 cytoplasmic plague proteins 又 是 由 Zonula Occludens-1 (ZO-1) Zonula Occludens-2(ZO-2) Zonula Occludens-3(ZO-3) 及 cingulin 等 蛋 白 質 所 構 成, 如 圖 三 ZO-1 位 於 occuldin 與 cytoskeleton 間, 在 調 控 細 胞 間 隙 上 的 緊 密 連 接 之 緊 密 度 扮 演 重 要 的 角 色 (Furuse et al., 1994;Yamamoto et al., 1997) 秦 (2005) 指 出 腸 道 上 皮 細 胞 緊 密 連 接 主 要 功 能 為 (a) 選 擇 性 屏 障 : 腸 道 上 皮 細 胞 緊 密 連 接 區 為 一 動 態 通 透 性 屏 障, 其 具 有 雙 重 功 能, 能 阻 止 潛 在 有 害 物 質 或 病 原 菌 進 入 體 內, 同 時 能 允 許 營 養 物 質 進 入 體 內 ;(b) 維 持 柵 欄 功 能 : 已 知 緊 密 連 接 是 由 圍 繞 在 上 皮 細 胞 頂 端 的 跨 膜 蛋 白 (Occludin Claudins 等 ) 所 構 成, 因 此 限 制 了 以 緊 密 連 接 區 為 界 的 上 皮 細 胞 頂 側 膜 和 底 側 膜 兩 部 份 細 胞 膜 上 的 脂 質 流 動 ( 即 柵 欄 功 能 ) 文 獻 指 出 幾 丁 聚 醣 的 衍 生 物 具 有 促 進 胜 肽 類 藥 物 在 腸 道 內 釋 放 及 吸 收 的 效 果 (Kotze et al.,1998) 原 因 是 其 具 有 可 逆 性 調 控 腸 道 上 皮 細 胞 間 的 緊 密 連 接 開 合 的 功 能, 讓 藥 物 或 營 養 物 質 順 利 通 過 腸 到 進 入 血 液 中 被 吸 收 Dodane 等 人 (1999) 指 出 幾 丁 聚 醣 調 控 腸 道 上 皮 細 胞 緊 密 連 接 開 合 是 因 為 幾 丁 聚 醣 帶 有 正 電 荷, 能 夠 黏 附 在 腸 道 上 皮 細 胞 上, 與 調 控 20

34 圖 三 緊 密 連 接 蛋 白 錯 合 物 之 概 略 結 構 Figure 3. Schematic representation of interactions among tight junction proteins. (Ward et al., 2000) 21

35 緊 密 連 接 開 合 的 蛋 白 產 生 作 用, 如 減 少 ZO-1 蛋 白 質 量, 使 細 胞 支 架 (cytoskeleton) 中 的 F-Actin 由 絲 狀 轉 變 成 球 狀 以 穿 透 式 電 顯 微 鏡 觀 察 腸 道 上 皮 細 胞 之 結 構 ( 圖 四 ), 指 出 細 胞 具 有 連 續 的 頂 端 膜 正 常 微 絨 毛 ( ) 及 緊 密 的 緊 密 連 接 的 結 構 (a); 將 細 胞 以 0.1 % chitosan 處 理 30 分 鐘 後, 發 現 細 胞 出 現 許 多 大 的 細 胞 內 空 泡 (V) 及 腫 脹 的 網 狀 結 構 ( ), 在 ( ) 位 置 也 可 觀 察 到 微 絨 毛 經 由 幾 丁 聚 醣 處 理 後 呈 不 規 則 的 排 列 (b) 之 後, 做 回 復 處 理, 將 培 養 液 中 的 幾 丁 聚 醣 移 除, 繼 續 培 養 24 小 時, 觀 察 發 現 細 胞 結 構 可 恢 復 到 未 處 理 前 相 似 (c) 因 此 證 實 幾 丁 聚 醣 能 夠 可 逆 性 調 控 上 皮 細 胞 之 細 胞 間 和 細 胞 內 路 徑, 來 增 加 物 質 的 滲 透 性 另 外 藉 由 測 量 上 皮 細 胞 之 穿 透 電 阻 (transepithelial electrical resistance,teer) 可 觀 察 到 幾 丁 聚 醣 對 緊 密 連 接 的 調 控 Lin 等 人 (2007) 以 幾 丁 聚 醣 與 聚 麩 胺 酸 (poly(γ-glutamic acid), γ-pga) 合 成 100~200nm 直 徑 的 奈 米 微 粒 載 體 並 包 覆 胰 島 素, 而 後 將 其 通 過 胃 到 達 小 腸, 其 研 究 結 果 指 出 幾 丁 聚 醣 可 藉 由 與 小 腸 黏 膜 之 黏 附 作 用 打 開 上 皮 細 胞 間 之 緊 密 連 接, 再 將 胰 島 素 釋 出, 使 胰 島 素 能 順 利 通 過 小 腸 壁 進 入 血 液 循 環, 提 升 胰 島 素 生 體 利 用 率 (bioavailability) 進 而 達 到 降 血 糖 之 效 果 22

36 圖 四 以 穿 透 電 子 顯 微 鏡 觀 察 幾 丁 聚 醣 對 腸 道 上 皮 細 胞 之 影 響,(a) 為 Caco-2 細 胞 正 常 型 態,(b) 為 經 由 0.1% 幾 丁 聚 醣 處 理 30 分 鐘 後 之 細 胞 (c) 為 將 幾 丁 聚 醣 移 除 後, 繼 續 培 養 24 小 時 後 之 細 胞 Figure 4. Transmission electron micrographs of Caco-2 cells before(a), or after 30 min of 0.1% chitosan treatment(b)and 24 h recovery following 0.1% chitosan treatment(c). 30,000. (Dodane et al., 1999) 23

37 五 奈 米 科 技 發 展 ( 一 ) 奈 米 科 技 奈 米 是 一 種 長 度 單 位,1 奈 米 為 百 萬 分 之 一 公 釐 ; 也 就 是 十 億 分 之 一 公 尺 (10-9 公 尺 ), 是 10 個 氫 原 子 並 排 起 來 的 長 度 奈 米 技 術 是 在 奈 米 尺 度 (<100nm) 理 解 控 制 與 操 縱 物 質 的 科 學 技 術, 包 含 基 礎 與 應 用 研 究 基 本 上, 奈 米 材 料 具 有 特 殊 的 表 面 體 積 與 量 子 效 應, 可 能 會 表 現 新 的 特 性 與 功 效, 因 此 奈 米 技 術 的 目 標 是 利 用 奈 米 結 構 所 具 有 的 特 性 開 發 具 有 特 定 功 能 的 產 品 ( 二 ) 奈 米 在 食 品 之 應 用 1. 食 品 加 工 方 面 食 品 原 料 經 過 奈 米 化 過 程 改 變 物 質 的 粒 徑 大 小 時, 能 夠 創 造 出 異 於 常 態 之 新 特 性 產 品 在 食 品 加 工 應 用 方 面 當 食 品 經 過 微 膜 微 膠 囊 微 乳 化 微 脂 粒 微 球 等 各 種 技 術 處 理 之 後 可 改 變 其 原 先 之 物 理 性 質, 如 : (1) 提 高 溶 解 度 : 將 食 品 奈 米 化 後, 可 使 食 品 粒 徑 變 小 比 表 面 積 增 加, 溶 解 度 隨 之 增 加, 如 植 物 固 醇 難 溶 於 水 或 脂 肪, 經 由 奈 米 化 後 容 易 溶 解 於 水 或 油 相 ; 珍 珠 粉 經 由 奈 米 化 後 可 提 高 胺 基 酸 溶 出 量 及 溶 解 速 度 (Guan et al.,2006); 或 者 在 奈 米 包 覆 傳 遞 系 統, 將 奈 米 顆 粒 內 部 空 間 填 裝 一 些 非 極 性 分 子, 如 油 脂 類 香 料 抗 菌 劑 抗 氧 化 劑 及 維 生 素 等, 以 提 高 溶 解 度 (Chen et al., 2006a) (2) 改 善 感 官 品 質 : 如 將 澱 粉 奈 米 化 後 可 將 澱 粉 產 生 類 似 脂 肪 的 爽 24

38 滑 細 膩 口 感, 因 此 可 利 用 奈 米 化 後 的 澱 粉 取 代 部 分 脂 肪 類 成 分, 製 成 低 脂 食 品 (Zhu et al., 2006) (3) 延 長 保 存 期 限 : 利 用 奈 米 包 覆 技 術, 將 營 養 物 質 裝 載 於 核 心 部 位, 與 外 界 環 境 做 隔 離, 達 到 保 護 作 用 (Chen et al., 2006b) 2. 保 健 食 品 方 面 食 品 經 由 奈 米 化 製 程 後 會 使 營 養 性 成 分 在 體 內 產 生 不 同 於 常 態 食 品 的 分 布 與 運 轉 方 式, 因 此 具 有 以 下 特 性 : (1) 提 高 吸 收 率 : 降 低 粒 徑 形 成 非 離 子 分 子, 皆 有 助 於 提 高 營 養 物 質 在 腸 道 之 吸 收 率, 對 增 加 物 質 再 生 體 組 織 上 的 滲 透 傳 輸 及 吸 收 (Chen et al., 2006b and Medina et al., 2007) (2) 提 高 生 體 利 用 率 : 利 用 奈 米 包 覆 技 術, 裝 載 脂 溶 性 維 生 素, 使 其 容 易 溶 於 水 且 提 高 生 體 利 用 率 ; 或 者 包 覆 極 性 與 非 極 性 分 子, 如 蛋 白 質, 可 以 提 高 其 穿 透 細 胞 膜 之 能 力, 協 助 傳 遞 至 標 的 細 胞 (Chen et al., 2006a) (3) 增 進 保 健 功 效 : 利 用 奈 米 包 覆 技 術, 可 將 營 養 物 質 做 包 覆, 可 保 護 營 養 物 質 不 受 腸 道 溫 度 ph 值 變 化 酵 素 作 用 等 影 響, 增 加 營 養 物 質 可 利 用 率, 同 時 在 奈 米 載 體 的 保 護 下, 營 養 物 質 能 迅 速 靠 近 腸 道 而 被 吸 收, 延 長 營 養 物 質 在 腸 道 保 留 濃 度 及 滯 留 時 間, 有 效 發 揮 其 生 理 功 效 (Chen et al., 2006b) 25

39 ( 三 ) 奈 米 在 藥 物 之 應 用 大 約 有 95% 的 藥 物 皆 有 動 力 學 差 或 吸 收 不 好 的 問 題 (Brayden, 2003), 要 將 藥 物 有 效 傳 送 到 病 灶 位 置 並 不 影 響 正 常 組 織 器 官, 首 先 需 調 控 的 是 藥 物 在 體 大 小 因 此 奈 米 技 術 隨 之 被 廣 泛 地 應 用 於 藥 物 傳 遞 方 面 Allen 和 Cullis(2004) 指 出 利 用 奈 米 藥 物 傳 輸 可 改 善 藥 物 本 生 欠 缺 的 性 質, 如 下 : 1. 提 高 藥 物 溶 解 度 疏 水 性 藥 物 在 生 理 環 境 下 容 易 析 出 沉 澱, 須 與 賦 型 劑 (excipients) 合 併 使 用 來 增 加 其 溶 解 性, 但 賦 型 劑 通 常 具 有 毒 性 如 Cremphor 若 使 用 微 脂 粒 (lipid micelles) 或 微 胞 (liposomes) 奈 米 藥 物 傳 遞 系 統, 可 同 時 提 供 親 水 基 和 疏 水 基, 增 加 藥 物 的 吸 收 2. 避 免 藥 物 外 滲 造 成 組 織 傷 害 給 藥 時, 具 有 細 胞 毒 性 之 藥 物 若 不 慎 由 血 管 內 流 至 周 邊 組 織, 會 導 致 組 織 損 傷 或 壞 死, 如 doxorubicin( 為 抗 癌 藥 物, 但 容 易 對 心 臟 產 生 累 積 性 的 傷 害 ) 奈 米 藥 物 傳 遞 系 統 可 調 控 藥 物 釋 放, 減 少 藥 物 釋 放 量, 降 低 因 藥 物 外 滲 造 成 的 組 織 傷 害 3. 避 免 藥 物 在 生 物 體 內 快 速 降 解 在 生 理 環 境 ph 下, 藥 物 容 易 失 去 其 活 性, 如 蛋 白 質 或 基 因 等 藥 物 易 受 到 消 化 道 酵 素 破 壞 以 奈 米 藥 物 傳 遞 系 統 則 可 保 護 藥 物 不 被 降 解, 維 持 藥 物 釋 放 量 及 減 少 藥 物 使 用 量 26

40 4. 改 善 藥 物 動 力 學 差 腎 臟 會 將 藥 物 速 地 清 除, 則 需 以 高 劑 量 或 連 續 的 注 射 方 式 給 藥 奈 米 藥 物 傳 遞 系 統 則 可 改 變 藥 物 的 分 佈 濃 度 及 產 生 緩 慢 釋 放 的 效 果, 可 解 決 小 分 子 物 質 容 易 被 腎 臟 迅 速 清 除 的 問 題 5. 選 擇 性 標 的 到 發 病 組 織 藥 物 在 體 內 分 佈, 恐 影 響 正 常 組 織 或 器 官, 形 成 副 作 用, 因 此 限 制 了 給 藥 濃 度, 但 如 此 一 來 藥 物 濃 度 降 低 反 而 影 響 其 對 發 病 位 置 之 治 療 效 果 奈 米 藥 物 傳 遞 系 統 具 有 標 的 功 能, 能 針 對 病 灶 位 置 增 加 給 藥 濃 度, 如 對 腫 瘤 組 織 產 生 強 通 透 性 及 停 滯 效 果 (EPR effect) 而 梁 (2007) 指 出, 目 前 奈 米 藥 物 傳 遞 系 統 大 致 可 分 為 微 脂 粒 高 分 子 前 驅 藥 物 奈 米 微 胞 奈 米 微 乳 化 樹 狀 高 分 子 及 奈 米 顆 粒 六 類 型, 如 圖 五 所 示 ( 四 ) 奈 米 顆 粒 (Nanoparticles) 一 般 認 定 粒 子 大 小 小 於 1000 nm 為 微 米 ( 次 微 米 ) 顆 粒, 而 奈 米 粒 子 大 小 小 於 100 nm 則 稱 為 奈 米 顆 粒 (Lan et al., 2005; Vo-Dinh, 2005) 然 而 在 藥 學 領 域, 則 認 為 粒 子 大 小 小 於 1µm( 即 1000 nm) 即 可 定 義 為 奈 米 顆 粒 (Kipp, 2004), 因 此 本 文 認 定 奈 米 顆 粒 泛 指 尺 寸 大 小 介 於 數 奈 米 至 數 百 奈 米 之 顆 粒 文 獻 指 出 奈 米 顆 粒 比 微 米 顆 粒 (>1µm) 更 容 易 通 過 腸 道 上 皮 細 胞 (Desai et al.,1996), 當 顆 粒 粒 徑 大 於 1µm 是 無 法 通 過 生 物 屏 障, 而 當 顆 粒 大 小 介 於 nm 時, 則 可 改 善 營 養 物 質 之 生 體 利 用 率 27

41 圖 五 奈 米 藥 物 傳 遞 系 統 Figure 5. Nano-drug delivery system. ( 梁,2007) 28

42 (Acosta,2009), 且 顆 粒 愈 小, 其 生 體 利 用 率 愈 高 食 品 經 過 奈 米 化 後, 會 延 長 其 在 腸 胃 道 中 排 空 時 間, 可 提 高 其 與 腸 道 上 皮 細 胞 的 接 觸 機 會 或 直 接 被 細 胞 吸 收 ( 圖 六 ), 因 此 可 增 加 營 養 物 質 之 吸 收 與 利 用 (Chen et al., 2006b;Chau et al.,2007) 奈 米 顆 粒 可 利 用 化 學 或 機 械 方 法 所 製 造,Acosta(2009) 指 出 利 用 機 械 方 式 所 製 備 出 之 奈 米 顆 粒 大 小 通 常 介 於 nm 之 間 ; 然 而 以 化 學 法 則 可 製 備 出 nm 之 顆 粒 奈 米 顆 粒 的 中 心 是 由 固 體 所 構 成, 其 可 由 不 同 種 類 的 物 質 所 形 成, 如 高 分 子 脂 質 蛋 白 質 醣 類 聚 電 錯 合 物 (polyelectrolyte) 或 藥 物 本 身 的 奈 米 顆 粒 表 五 為 奈 米 顆 粒 藥 物 傳 遞 系 統 現 況 與 產 品 特 性 ( 梁,2007) 29

43 圖 六 奈 米 顆 粒 於 腸 道 吸 收 之 優 勢 Figure 6. Schematic representation of different absorption mechanisms of bioactive molecules. (Chen et al., 2006b) 30

44 表 五 奈 米 顆 粒 藥 物 傳 遞 系 統 現 況 與 產 品 特 性 Table 5. Recent developt of nonoparticle as drug delivery system and its applications. 藥 物 傳 遞 系 統 發 展 現 況 產 品 特 性 目 前 應 用 之 藥 物 奈 米 顆 粒 以 物 理 或 電 荷 吸 引 方 (nanoparticle) 式 將 藥 物 包 覆 在 生 物 高 分 子 動 物 實 驗 可 分 解 的 高 分 子 中, 並 Insulin, 奈 米 顆 粒 形 成 奈 米 顆 粒, 可 用 來 Antisense 包 覆 蛋 白 質 或 基 因 藥 oligonucleotide 白 蛋 白 上 市 物 Paclitaxel 奈 米 顆 粒 (Abraxane ) 藥 物 奈 米 顆 粒 上 市 以 各 種 物 理 方 式 如 研 Sirolimus (NanoCrystal ) 磨 噴 霧 分 散 超 臨 界 (Rapamune ), 等 方 式 將 藥 物 結 晶 切 Fonofibrate 割 成 奈 米 化, 再 以 界 面 (Tricor ), 活 性 劑 加 以 分 散 (< Megestrol 1000 奈 米 ) (Megace ) ( 梁,2007) 31

45 六 幾 丁 聚 醣 奈 米 顆 粒 ( 一 ) 常 見 幾 丁 聚 醣 微 / 奈 米 級 顆 粒 的 製 備 方 法 以 幾 丁 聚 醣 作 為 基 材 製 備 微 米 及 奈 米 顆 粒 已 被 廣 泛 應 用 在 藥 物 傳 遞 上, 幾 丁 聚 醣 可 透 過 物 理 法 及 化 學 法 將 藥 物 吸 附 於 表 面 或 包 覆 在 微 粒 中, 物 理 法 有 研 磨 法 噴 霧 乾 燥 法 過 篩 法 等, 但 以 物 理 法 製 備 出 之 顆 粒 粒 徑 不 易 達 奈 米 級, 且 粒 徑 分 佈 廣, 再 加 上 只 能 透 過 顆 粒 表 面 吸 附 方 式 攜 帶 藥 物, 故 較 不 適 用 於 藥 物 傳 遞 方 面,Gan 和 Wang 等 人 (2007) 統 整 出 幾 項 近 年 常 被 用 來 幾 丁 聚 醣 奈 米 顆 粒 之 化 學 方 法 及 其 應 用 在 藥 物 蛋 白 質 或 基 因 上 ( 見 表 六 ), 方 法 如 下 : 1. 共 凝 結 及 沉 澱 法 (Coacervation or precipitation) 共 凝 結 及 沉 澱 法 製 作 原 理 是 透 過 幾 丁 聚 醣 在 鹼 性 條 件 下 無 法 溶 解 的 特 性 來 製 備 顆 粒, 造 成 幾 丁 聚 醣 形 成 顆 粒 的 作 用 力 主 要 為 分 子 內 氫 鍵 其 製 備 方 法 是 利 用 附 有 噴 嘴 之 空 氣 壓 縮 機 將 幾 丁 聚 醣 噴 入 鹼 性 溶 液 ( 如 NaOH NaOH-mathanol 或 ethanediamine) 中, 此 時 因 幾 丁 聚 醣 不 溶 於 鹼 性 溶 液 的 特 性, 當 幾 丁 聚 醣 溶 液 接 觸 到 鹼 性 溶 液 後, 會 產 生 有 凝 結 及 沈 澱 的 反 應 將 沉 澱 物, 再 經 過 濾 及 多 次 離 心 水 洗 作 用, 去 除 殘 留 的 鹼 性 溶 液, 即 可 得 幾 丁 聚 醣 微 米 / 奈 米 顆 粒 (Nishimura et al., 1986) Mao 等 人 (2001) 利 用 共 凝 結 法 製 備 幾 丁 聚 醣 -DNA 奈 米 顆 粒, 發 現 備 出 顆 粒 並 不 成 規 則 球 型 顆, 但 顆 粒 粒 徑 可 達 nm, 在 ph<6 時 顆 粒 表 面 電 位 帶 正 電 荷, 約 為 +12 ~+18 mv; 另 外 以 此 方 法 製 備 出 顆 粒 具 有 保 護 DNA 不 受 核 酸 分 解 酵 素 影 響 之 優 點 32

46 表 六 常 見 幾 丁 聚 醣 奈 米 顆 粒 之 製 備 方 法 及 其 在 藥 物 蛋 白 質 或 基 因 上 的 應 用 Table 6. Summary of preparation method for chitosan nanoparticles. Method of preparation Drugs/proteins/genes Chitosan nanoparticle systems Ionic gelation Coacervation or precipitation Emulsion-droplet coalescence Reverse micellar Self-assembly chemical modification Insulin, BSA, cyclosporin A DNA gadopentetic acid Doxorubicin Deoxycholic acid (Gan and Wang,2007) 33

47 2. 乳 化 液 滴 接 合 法 (Emulsion-droplet coalescence) 此 方 法 由 Tokumitsu 等 人 (1999) 所 提 出, 其 將 微 乳 化 交 聯 法 及 沉 澱 法 兩 種 方 法 做 結 合, 不 僅 可 以 利 用 交 聯 劑 來 穩 定 顆 粒 結 構 外, 還 藉 由 結 合 幾 丁 聚 醣 液 與 氫 氧 化 鈉 液 滴 所 造 成 之 沉 澱 反 應 來 加 強 顆 粒 結 構 其 製 備 流 程 為 先 個 別 配 置 幾 丁 聚 醣 - 藥 物 乳 化 液 (w/o) 及 幾 丁 聚 醣 NaOH 乳 化 液 (w/o), 而 後 以 高 速 攪 拌 將 兩 者 均 勻, 即 可 產 生 幾 丁 聚 醣 奈 米 顆 粒 此 方 法 已 被 成 功 應 用 在 製 備 幾 丁 聚 醣 - gadopentetic acid 奈 米 顆 粒 上, 可 獲 得 藥 物 裝 載 率 45 %, 平 均 粒 徑 在 452 nm 之 奈 米 顆 粒 3. 離 子 交 聯 法 (Ionic gelation) 離 子 交 聯 成 膠 法 是 常 見 用 來 製 備 幾 丁 聚 醣 奈 米 顆 粒 的 方 法 其 製 備 原 理 是 利 用 幾 丁 聚 醣 的 胺 基 在 酸 性 條 件 下 會 帶 正 電, 這 個 特 性 使 其 易 與 帶 負 電 之 分 子 進 行 離 子 交 聯 而 產 生 奈 米 顆 粒, 最 常 使 用 之 帶 負 電 之 分 子 為 tripolyphosphate(tpp),tpp 為 帶 五 個 負 電 之 分 子, 可 與 幾 丁 聚 醣 產 生 足 夠 強 度 之 作 用 力 而 形 成 奈 米 顆 粒, 這 些 作 用 力 包 括 離 子 鍵 氫 鍵 及 親 疏 水 之 作 用 力 等 (Kawashima et al.,1985a/1985b) Fernández-Urrusuno 等 人 (1999) 利 用 此 方 法 包 覆 胰 島 素, 發 現 以 CS/TPP 重 量 比 6/1 製 備 之 奈 米 顆 粒, 可 製 得 粒 徑 在 300~ 400 nm, 表 面 電 位 為 +54~+25 mv 之 奈 米 顆 粒 而 Xu 及 Du(2003) 利 用 此 方 法 包 覆 BSA, 以 TEM 觀 察 顆 粒, 可 觀 察 到 顆 粒 粒 徑 約 在 20~200 nm 之 間, 形 狀 呈 球 型 之 奈 米 顆 粒 4. 逆 微 胞 法 (Reverse micellar) 此 方 法 是 利 用 水 與 油 及 界 面 活 性 劑 所 組 成 之 熱 力 學 穩 定 混 合 34

48 物, 以 巨 觀 觀 察 此 混 合 物 是 均 勻 的, 而 以 微 觀 來 看 水 相 及 油 相 則 是 被 界 面 活 性 劑 形 成 的 薄 膜 隔 開 (Leong and Candau, 1982) 此 方 法 製 作 流 程 是 先 將 介 面 活 性 劑 與 有 機 溶 劑 混 合, 再 加 入 幾 丁 聚 醣 及 交 聯 劑 後, 之 後 去 除 有 機 溶 劑 和 介 面 活 性 劑, 即 可 得 幾 丁 聚 醣 微 米 / 奈 米 顆 粒 Mitra 等 人 (2001) 利 用 此 方 法 來 包 覆 抗 癌 藥 物 Doxorubicin, 經 由 quasi-elastic light scattering 測 量 顆 粒 粒 徑, 得 知 粒 徑 大 小 約 100±10 nm, 已 知 此 大 小 之 藥 物 顆 粒 對 於 腫 瘤 細 胞 具 有 良 好 滲 透 性 和 較 長 之 滯 留 效 果 5. 化 學 修 飾 自 我 組 裝 法 (Self-assembly chemical modification) 幾 丁 聚 醣 自 我 組 裝 顆 粒 原 理 是 利 用 同 時 具 有 親 水 性 及 疏 水 性 機 團 的 兩 性 分 子 鏈, 在 溶 液 中 藉 由 親 疏 水 性 的 作 用 力 而 形 自 我 組 裝 顆 粒 方 法 為 將 幾 丁 聚 醣 經 化 學 交 聯 接 上 疏 水 鏈, 而 得 具 兩 性 分 子 性 質 之 幾 丁 聚 醣 衍 生 物 ; 高 分 子 鏈 上 之 親 水 基 與 疏 水 基 具 有 自 我 組 裝 的 特 性 故 可 形 成 奈 米 顆 粒 Lee 等 人 (1998) 利 用 疏 水 基 團 Deoxycholic acid 修 飾 水 溶 性 幾 丁 聚 醣, 接 著 將 幾 丁 聚 醣 -Deoxycholic acid 置 於 ph 7.2 之 磷 酸 緩 衝 溶 液 中, 則 可 自 我 組 裝 成 平 均 粒 徑 大 小 在 160 nm 之 奈 米 微 囊 所 形 成 之 奈 米 微 囊 又 可 以 離 子 鍵 結 方 式 與 DNA 結 合, 形 成 幾 丁 聚 醣 自 我 組 裝 DNA 複 合 體 ( 平 均 粒 徑 大 小 在 300nm), 複 合 體 能 有 效 的 將 DNA 轉 送 至 COS-1 細 胞 上 進 行 表 現 35

49 ( 二 ) 幾 丁 聚 醣 - 三 聚 磷 酸 鈉 (CS-TPP) 包 覆 蛋 白 質 之 機 制 1. 幾 丁 聚 醣 結 構 幾 丁 聚 醣 在 酸 性 溶 液 中 或 小 於 其 pka(ph~6.3) 時 其 結 構 C 2 上 所 帶 的 胺 基 (NH 2 ) 會 轉 變 成 帶 有 正 電 荷 (NH 3 + ) 的 胺 基 ( 圖 七 a) 2. 三 聚 磷 酸 鈉 結 構 三 聚 磷 酸 鈉 (sodium tripolyphosphate,tpp) 是 由 三 個 磷 酸 組 合 而 5- 成 的 多 元 體, 帶 有 多 種 負 電 離 子 ( 如 P 3 O 10 離 子 OH - 及 HP 3 O 4-10 ), 當 三 聚 磷 酸 鈉 溶 於 水 中 磷 酸 鹽 會 分 解 出 鈉 離 子, 而 使 五 個 磷 酸 根 分 別 帶 負 電 荷 ( 圖 七 b) 3. 幾 丁 聚 醣 - 三 聚 磷 酸 鈉 反 應 機 制 三 聚 磷 酸 鈉 之 負 電 荷 -P 3 O HP 3 O10 4- 及 -OH - group 會 與 幾 丁 聚 醣 之 -NH 3 + 互 相 競 爭 產 生 離 子 交 聯 作 用 (ionic-crosslinking) 而 形 成 網 狀 結 構 之 膠 體 顆 粒 ( 圖 七 c) 在 不 同 ph 下, 幾 丁 聚 醣 與 三 聚 磷 酸 鈉 的 鍵 結 會 有 所 差 異 幾 丁 聚 + 醣 在 酸 性 下 (ph <4.5) 帶 有 -NH 3 較 多, 分 子 之 間 會 有 靜 電 排 斥 作 用, 所 形 成 的 chitosan-tpp 顆 粒 結 構 較 延 長, 骨 架 呈 現 梯 形 狀 態 (ladder) + ( 圖 八 a); 而 在 ph>4.5 環 境 中, 幾 丁 聚 醣 帶 有 -NH 3 較 少, 分 子 之 間 靜 電 排 斥 作 用 較 少, 所 形 成 CS-TPP 顆 粒 為 環 狀 結 構 (loop)( 圖 八 b), 幾 丁 聚 醣 與 TPP 之 鍵 結 是 以 環 狀 結 構 較 為 安 定 另 外, 幾 丁 聚 醣 溶 液 + 之 ph 接 近 其 pka~6.3 時, 其 結 構 上 的 -NH 3 會 再 度 被 質 子 化 轉 變 為 -NH 2, 故 需 將 幾 丁 聚 醣 溶 液 ph 調 控 在 4.5~6.3 之 間 最 為 理 想 TPP 在 36

50 (a) 幾 丁 聚 醣 溶 於 酸 性 溶 液 中 (b) 三 聚 磷 酸 鈉 (TPP) (c) Chitosan-TPP 交 聯 反 應 圖 七 幾 丁 聚 醣 與 TPP 之 離 子 交 聯 反 應 Figure 7. Molecular structure of chitosan in acid solution ( a ) and tripolyphosphate(tpp)(b). Ionic crosslinking between chitosan and TPP(C). (Hsieh et al., 2008) 37

51 圖 八 幾 丁 聚 醣 與 三 聚 磷 酸 鈉 在 不 同 ph 值 下 之 鍵 結 情 形 Figure 8. Ladder-loop transition of chitosan-tpp complex structures:(a) ladder type;(b)loop type. (Mi et al., 1999) 38

52 ph 9.0 時, 其 溶 液 呈 現 負 電 荷 為 -OH - -P 3 O 及 -HP 3 O ; 當 TPP 溶 液 在 ph 5.0 時, 則 呈 現 -P 3 O 及 -HP 3 O ; 而 TPP 溶 液 在 ph 3.0 時, 完 全 解 離 為 -P 3 O 10 5-, 因 此 TPP 溶 液 ph 因 選 擇 在 9.0 最 為 理 想 而 楊 (2008) 比 較 三 種 不 同 ph 之 幾 丁 聚 醣 溶 液 (ph ) 與 三 種 不 同 ph 之 TPP 溶 液 (ph ) 反 應 製 備 奈 米 顆 粒, 發 現, 以 幾 丁 聚 醣 溶 液 ph 4.7 與 TPP 溶 液 ph 9.0 下 製 備 出 之 奈 米 顆 粒 懸 浮 液 較 佳 且 其 顆 粒 為 奈 米 級 因 此 本 文 選 定 幾 丁 聚 醣 與 TPP 溶 液 分 別 為 ph 4.7 與 ph 幾 丁 聚 醣 - 蛋 白 質 - 三 聚 磷 酸 鈉 反 應 機 制 Luangtana-ana 等 人 (2005) 利 用 幾 丁 聚 醣 包 覆 BSA, 實 驗 結 果 發 現 幾 丁 聚 醣 與 BSA 之 間 的 作 用 力 除 了 離 子 交 聯 鍵 結 之 外 幾 丁 聚 醣 與 TPP 鍵 結 過 程 中, 亦 會 將 BSA 包 覆 進 去 其 作 用 機 制 可 分 為 以 下 兩 種 ( 見 圖 九 ): (1) 離 子 交 互 作 用 : 以 牛 血 清 白 蛋 白 (bovine serum albumin,bsa) 為 例,BSA pi 值 為 4.8, 當 溶 液 ph >4.8 ( 一 般 製 備 幾 丁 聚 醣 奈 米 顆 粒 溶 液 ph 值 為 ), 蛋 白 質 結 構 帶 負 電 荷 (-COO - ) 會 與 幾 丁 聚 醣 的 正 電 荷 (-NH + 3 ) 產 生 離 子 交 互 作 用, 因 此 蛋 白 質 可 藉 由 此 方 式 鍵 結 在 幾 丁 聚 醣 - 三 聚 磷 酸 膠 體 顆 粒 表 面 或 內 部 (2) 物 理 包 覆 : 幾 丁 聚 醣 與 三 聚 磷 酸 鈉 以 離 子 交 聯 (ionic-crosslinking) 方 式 形 成 凝 膠 時 可 將 帶 電 或 不 帶 電 之 物 質 包 埋 在 其 網 狀 結 構 內 部 ( 如 圖 九 ) 39

53 Janes 等 人 (2001) 指 出, 使 用 幾 丁 聚 醣 與 三 聚 磷 酸 鈉 反 應 機 制 來 製 備 奈 米 顆 粒 之 優 缺 點 為 : 1) 反 應 條 件 溫 和 且 簡 單, 且 不 使 用 毒 性 較 高 的 化 學 交 聯 劑, 但 由 於 此 粒 子 成 型 的 機 制 是 透 過 離 子 鍵 結, 所 以 容 易 因 溶 液 環 境 之 變 化 而 使 粒 子 無 法 形 成 ;2) 可 藉 由 操 控 條 件 調 整, 產 生 所 希 望 得 到 的 粒 徑, 粒 徑 大 小 介 於 100 到 1000 之 間 ;3) 在 某 些 製 備 條 件 下 所 得 顆 粒 之 表 面 仍 帶 高 度 正 電 荷 ;4) 對 蛋 白 質 疫 苗 質 體 DNA 等 物 質, 具 極 佳 的 包 覆 效 果 顆 粒 的 組 成 會 影 響 釋 放 速 率 ;5) 經 冷 凍 乾 燥 程 序 後, 仍 維 持 包 覆 物 之 活 性 及 顆 粒 之 完 整 性 40

54 離 子 交 互 作 用 物 理 包 覆 圖 九 幾 丁 聚 醣 包 覆 BSA 之 機 制 圖 Figure 9. Schematic of chitosan encapsulation mechanism of BSA. (Luangtana-anan et al., 2005) 41

55 ( 三 ) 幾 丁 聚 醣 - 三 聚 磷 酸 鈉 (CS-TPP) 奈 米 顆 粒 之 應 用 Ko 等 人 (2002) 透 過 幾 丁 聚 醣 與 TPP 之 離 子 交 聯 作 用 來 製 備 微 奈 米 顆 粒, 結 果 可 得 利 徑 大 小 介 於 500 ~ 710 mm 之 顆 粒, 且 對 felodipine 之 包 覆 率 高 達 90% 其 指 出 當 降 低 TPP 溶 液 之 ph 值 及 增 加 幾 丁 聚 醣 分 子 量 時, 可 獲 得 表 面 平 滑 且 呈 球 狀 之 微 / 奈 米 顆 粒 ; 而 以 低 ph 或 高 濃 度 之 TPP 溶 液 製 備 幾 丁 聚 醣 微 / 奈 米 顆 粒 時, 可 降 低 felodipine 之 釋 放 ; 當 增 加 幾 丁 聚 醣 分 子 量 及 濃 度 時, 會 使 felodipine 釋 放 顯 著 地 減 少 Xu 和 Du(2003) 以 幾 丁 聚 醣 -TPP 包 覆 BSA 製 備 奈 米 顆 粒, 並 探 討 幾 丁 聚 醣 結 構 對 奈 米 顆 粒 特 性 之 影 響 透 過 其 方 法 可 製 備 出 粒 徑 介 於 20~200 nm 之 奈 米 顆 粒 ( 以 TEM 觀 察 ), 其 以 FTIR 進 一 步 證 實 幾 丁 聚 醣 是 透 過 其 結 構 上 之 胺 基 與 TPP 產 生 交 聯 反 應 其 並 指 出 幾 丁 聚 醣 奈 米 顆 粒 之 特 性 會 受 到 幾 丁 聚 醣 之 去 乙 醯 度 分 子 量 濃 度 以 及 BSA 之 添 加 量 等 因 素 影 響, 隨 幾 丁 聚 醣 分 子 量 的 增 加 (10~210 kda), 幾 丁 聚 醣 對 BSA 包 覆 率 隨 之 增 加, 而 釋 放 率 隨 之 下 降 (73.9~17.6%); 幾 丁 聚 醣 去 乙 醯 度 增 加 (75.5~92%), 包 覆 率 會 隨 之 增 加 而 釋 放 率 隨 之 減 少 ; 隨 著 幾 丁 聚 醣 與 BSA 濃 度 的 增 加, 其 包 覆 率 有 降 低 之 趨 勢, 而 幾 丁 聚 醣 對 BSA 裝 載 率 愈 高, 釋 放 速 率 愈 快 Gan 等 人 (2005) 將 幾 丁 聚 醣 -TPP 奈 米 顆 粒 應 用 基 因 傳 遞 上, 結 果 可 獲 得 粒 徑 大 小 介 於 nm 且 表 面 具 有 正 高 度 電 荷 之 奈 米 顆 粒 其 指 出 CS/TPP 重 量 比 對 奈 米 顆 粒 之 粒 徑 大 小 及 表 面 電 位 有 重 大 之 影 響, 當 CS/TPP 重 量 比 增 加, 奈 米 顆 粒 之 粒 徑 大 小 及 表 面 電 位 皆 會 隨 之 增 加 ; 而 當 CS/TPP 重 量 比 固 定, 奈 米 顆 粒 之 表 面 電 位 皆 會 隨 幾 丁 聚 醣 濃 度 增 加 而 減 少 42

56 Wu(2005) 利 用 幾 丁 聚 醣 -TPP 奈 米 顆 粒 包 覆 甘 草 酸 銨 (ammonium glycyrrhizinate), 結 果 可 得 表 面 具 有 正 電 荷 之 奈 米 顆 粒, 且 對 甘 草 酸 銨 有 良 好 之 包 覆 效 果, 濃 度 高 達 0.5 mg/ml 其 利 用 TEM 可 觀 察 到 大 小 介 於 nm 奈 米 顆 粒 ; 而 利 用 DLS 方 法 觀 察, 得 知 顆 粒 置 於 水 中 其 粒 徑 會 大 於 120 nm Grenha 等 人 (2005) 將 幾 丁 聚 醣 奈 米 顆 粒 應 用 於 肺 蛋 白 傳 遞 上, 其 指 出 幾 丁 聚 醣 奈 米 顆 粒 對 蛋 白 質 有 良 好 之 裝 載 率 (65 80%), 有 75 80% 的 胰 島 素 會 可 在 15 分 鐘 內 被 釋 出 體 外, 而 在 水 溶 液 中 奈 米 顆 粒 之 粒 徑 及 表 面 電 位 不 會 受 到 改 變 Gan 及 Wang (2007) 以 幾 丁 聚 醣 -TPP 奈 米 顆 粒 包 覆 牛 血 清 白 蛋 白 (bovine serum albumin,bsa) 時, 結 果 可 得 粒 徑 大 小 介 於 nm 及 表 面 帶 有 高 度 正 電 荷 之 chitosan-bsa-tpp 奈 米 顆 粒 其 指 出 當 幾 丁 聚 醣 分 子 量 愈 高 濃 度 愈 低,CS/TPP 重 量 比 愈 低,BSA 濃 度 愈 高, 對 BSA 有 較 高 之 包 覆 率 Jang 等 人 (2008) 探 討 包 覆 L-Ascorbic Acid(AA) 之 幾 丁 聚 醣 奈 米 顆 粒 在 水 溶 液 中 加 熱 處 理 之 安 定 性 其 指 出 當 幾 丁 聚 醣 及 TPP 濃 度 分 別 在 1.5 及 0.6 mg/ml 時, 可 獲 得 粒 徑 大 小 在 170 nm 之 奈 米 顆 粒 ; 當 AA 濃 度 由 0.1 mg/ml 增 加 至 0.3 mg/ml 時, 顆 粒 粒 徑 會 隨 之 增 加, 表 面 電 位 則 隨 之 下 降, 另 外 依 其 方 法 可 獲 得 穩 定 之 包 覆 率 (10 12%) Liu 等 人 (2009) 研 究 指 出 離 子 交 聯 法 來 製 備 幾 丁 聚 醣 奈 米 顆 粒 時, 可 藉 由 調 控 各 種 因 子 如 chitosan/tpp 比 例 濃 度 ph 值 和 鹽 類 之 添 加 等 來 調 整 奈 米 顆 粒 之 粒 徑 大 小 及 表 面 電 位 其 指 出 幾 丁 聚 醣 奈 米 顆 粒 來 包 覆 ciprofloxacin(ch) 時, 在 ph 4.8 下, 幾 丁 聚 醣 與 TPP 濃 度 分 別 在 2 和 1 mg/ml 時 可 獲 得 粒 徑 大 小 約 300nm 之 奈 米 顆 粒, 且 當 43

57 固 定 幾 丁 聚 醣 濃 度 時, 提 高 TPP 可 降 低 顆 粒 之 粒 徑 Yang 等 人 (2009) 探 討 幾 丁 聚 醣 分 子 量 對 於 幾 丁 聚 醣 奈 米 顆 粒 在 藥 物 傳 遞 上 及 應 用 性 之 影 響 其 指 出 之 會 當 幾 丁 聚 醣 分 子 量 愈 低 其 對 藥 物 包 覆 率 愈 佳, 以 55 kda 之 幾 丁 聚 醣 包 覆 fluorouracil(5fu) 時, 可 獲 得 粒 徑 大 小 為 70.6 nm 之 奈 米 顆 粒, 且 裝 載 率 達 66% Dudhani 及 Kosaraju(2010) 利 用 幾 丁 聚 醣 -TPP 包 覆 catechin 以 製 備 具 生 物 黏 著 性 之 奈 米 顆 粒, 並 探 討 其 特 性, 指 出 在 ph 5.5 下, chitosan/tpp 比 例 為 2/1 時, 幾 丁 聚 醣 奈 米 顆 粒 對 catechin 時 包 覆 率 可 達 90%; 在 模 擬 體 外 腸 道 環 境 累 積 釋 放 試 驗, 結 果 顯 示 在 24 小 時 後 catechin 在 腸 液 累 積 釋 放 量 為 32%; 而 利 用 螢 光 標 記 來 觀 察 奈 米 顆 粒 之 生 物 黏 著 性, 結 果 得 知 包 覆 及 未 包 覆 有 catechin 之 奈 米 顆 粒 具 分 別 具 有 40% 及 32% 黏 膜 黏 著 力, 因 此 證 實 幾 丁 聚 醣 具 有 良 好 之 生 物 黏 著 性 及 控 制 catechin 在 腸 胃 道 中 之 釋 放 能 力 由 以 上 文 獻 可 得 知 幾 丁 聚 醣 奈 米 顆 粒 已 被 廣 泛 地 應 用 在 藥 物 蛋 白 質 或 基 因 上, 而 其 特 性 會 受 到 許 多 因 素 所 影 響, 因 此 本 研 究 將 進 一 步 詳 細 探 討 對 分 離 大 豆 蛋 白 質 水 解 物 濃 度 幾 丁 聚 醣 分 子 量 及 幾 丁 聚 醣 /TPP 重 量 比 等 影 響 因 子 對 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 之 包 覆 率 裝 載 率 產 率 粒 徑 大 小 表 面 電 位 及 在 不 同 ph 下 之 安 定 性 之 影 響 ( 四 ) 幾 丁 聚 醣 顆 粒 之 特 性 分 析 幾 丁 聚 醣 奈 米 顆 粒 之 特 性 分 析 主 要 包 括 了 顆 粒 型 態 觀 察 粒 徑 分 析 及 表 面 電 位 分 析 等 三 個 部 份 依 不 同 置 備 方 法 所 得 的 奈 米 顆 粒 的 歷 經 大 小 及 分 佈 決 定 了 奈 米 顆 粒 品 質 的 優 劣 44

58 1. 顆 粒 型 態 觀 察 利 用 電 子 顯 微 鏡 ( 如 SEM TEM) 可 直 接 觀 察 粒 子 的 型 態 及 大 小, 但 由 此 方 法 所 測 量 出 粒 子 之 實 際 粒 徑 可 能 侷 限 於 局 部, 只 能 判 定 一 次 粒 子, 但 對 聚 集 態 的 大 小 則 判 定 不 易, 無 法 代 表 整 個 溶 液 中 所 有 粒 子 的 狀 態, 再 加 上 其 操 作 過 程 複 雜 及 成 本 高 等 缺 點, 所 以 比 較 少 使 用 此 方 來 測 量 粒 子 粒 徑 大 小 2. 粒 徑 分 析 奈 米 粒 徑 測 量 大 多 採 用 雷 射 光 散 射 法 (DLS), 此 方 法 是 透 過 測 量 粒 子 在 溶 液 中 會 因 受 到 周 圍 溶 劑 分 子 的 碰 撞 使 顆 粒 產 生 隨 機 運 動, 又 稱 布 朗 運 動, 大 粒 子 布 朗 運 動 慢, 小 粒 子 布 朗 運 動 快, 所 以 當 雷 色 光 源 打 向 奈 米 顆 粒 會 產 生 散 射, 光 散 色 角 度 會 因 遇 到 粒 子 粒 徑 大 小 不 同 而 有 所 差 異, 再 經 由 數 學 方 程 式 Stokes-Einstein equation 公 式 轉 換 而 求 得 粒 徑 大 小 及 分 佈 平 均 粒 徑 ( 稱 為 z- 均 值 ) 是 基 於 光 散 射 強 度 權 重 的 平 均 值, 為 一 種 動 態 光 散 射 所 有 的 平 均 值 多 Stokes-Einstein equation: d(h) = kt 3πηD d(h) = 粒 子 的 水 力 直 徑 D = 待 測 粒 子 的 擴 散 係 數 k = 波 茲 曼 常 數 T = 測 量 時 溶 液 的 絕 對 溫 度 η= 溶 劑 的 黏 度 45

59 3. 表 面 電 位 表 面 電 位 是 與 一 個 顆 粒 在 某 一 特 定 介 質 中 所 帶 的 總 電 荷 有 關, 確 切 地 來 說, 是 顆 粒 在 剪 切 面 處 的 電 位, 可 用 來 預 測 膠 體 系 統 的 穩 定 性, 如 果 顆 粒 帶 有 很 多 負 的 或 正 的 電 荷, 也 就 是 說 很 高 的 Zeta 電 位, 它 們 會 相 互 排 斥, 從 而 達 到 整 個 體 系 的 穩 定 性 ; 如 果 顆 粒 帶 有 很 少 負 的 或 正 的 電 荷, 也 就 是 說 它 的 Zeta 電 位 很 低, 它 們 會 相 互 吸 引, 從 而 達 到 整 個 體 系 的 不 穩 定 性 奈 米 顆 粒 之 表 面 電 位 會 影 響 顆 粒 的 穩 定 性 外, 當 顆 粒 應 用 於 藥 物 傳 遞 時, 表 面 電 位 更 會 影 響 藥 物 的 輸 送 及 釋 放 一 般 表 面 電 位 是 使 用 雷 射 都 普 勒 電 泳 法, 在 電 場 中, 表 面 帶 有 電 荷 的 奈 米 顆 粒 會 產 生 電 泳 動 現 象, 利 用 儀 器 偵 測 此 泳 動 距 離, 即 可 進 一 步 計 算 出 顆 粒 表 面 電 位 所 帶 有 之 電 量 表 面 電 位 愈 高, 顆 粒 的 分 散 體 系 愈 穩 定, 水 相 中 顆 粒 分 散 穩 定 性 的 分 界 線 一 般 認 為 在 +30 mv 或 -30 mv 46

60 七 分 離 大 豆 蛋 白 質 水 解 物 ( isolate soy protein hydrolysates,isph) ( 一 ) 大 豆 蛋 白 質 之 生 理 功 能 食 品 蛋 白 質 在 人 體 新 陳 代 謝 過 程 中 為 一 重 要 營 養 來 源 具 有 提 供 人 體 所 需 胺 基 酸 及 能 量 供 給 等 功 能, 而 許 多 蛋 白 質 隱 含 著 活 性 片 段 通 過 腸 胃 道 後 具 有 特 殊 之 生 理 調 節 作 用 (Choi et al., 2001) 大 豆 是 一 種 含 蛋 白 質 及 多 種 營 養 素 之 食 品, 食 品 加 工 中 常 見 的 大 豆 原 料 包 有 三 種 : 脫 脂 大 豆 蛋 白 粉 (defatted soy bean flour) 濃 縮 大 豆 蛋 白 質 (soybean protein concentrate, SPC) 分 離 大 豆 蛋 白 質 (isolate soy protein, ISP) 脫 脂 大 豆 其 蛋 白 質 含 量 約 50%, 是 將 大 豆 碾 碎 進 行 脫 脂 後 再 經 適 當 地 處 理 成 細 粉 之 產 品 ;SPC 是 將 脫 脂 大 豆 蛋 白 質 粉 去 除 水 溶 性 多 醣 灰 分 等 成 分 後 的 製 品, 其 蛋 白 質 含 量 約 65~70%; 而 ISP 為 濃 縮 大 豆 粉 用 水 或 稀 鹼 液 抽 出 蛋 白 質, 過 濾 加 酸 至 大 豆 蛋 白 質 等 電 點 (ph 4.5), 除 去 大 多 非 蛋 白 質 成 分 的 產 品, 其 蛋 白 質 含 量 85~95% (Anson, 1957) 由 於 一 般 大 豆 製 品 中 都 含 有 豐 富 之 纖 維 質, 會 妨 礙 大 豆 蛋 白 之 消 化 吸 收 與 利 用, 而 經 萃 取 後 的 ISP 除 了 蛋 白 質 含 量 高 達, 也 去 除 不 好 的 膽 固 醇 油 脂 及 植 物 固 醇 等, 屬 無 色 無 香 無 味 及 安 定 性 高 之 產 品, 且 不 含 蛋 白 酶 抑 制 因 子 (trypsin inhibitor), 其 蛋 白 質 的 含 量 與 酪 蛋 白 分 離 物 相 近, 不 僅 可 以 促 進 人 體 的 利 用 還 可 減 輕 代 謝 的 負 擔, 因 此 具 有 高 度 之 營 養 及 經 濟 價 值 47

61 ( 二 ) 大 豆 蛋 白 水 質 解 物 之 生 理 功 能 蛋 白 質 的 水 解 是 由 於 肽 鍵 的 斷 裂, 而 產 生 不 同 分 子 量 大 小 的 胜 肽 和 游 離 胺 基 酸, 其 可 透 過 酸 鹼 或 酵 素 的 作 用 來 進 行 然 而, 酸 鹼 的 化 學 水 解 作 用 較 不 易 控 制, 且 容 易 破 壞 L 型 胺 基 酸 反 而 成 為 D 型, 或 形 成 lysinoalanine 等 有 毒 物 質 而 影 響 產 品 之 營 養 價 值 因 此 一 般 加 工 操 作 上 會 選 擇 溫 和 條 件 下 即 可 進 行 的 酵 素 水 解 法 研 究 指 出 蛋 白 質 經 由 酵 素 水 解 後, 所 分 解 出 具 有 生 物 活 性 的 胜 肽 可 更 加 提 升 原 有 蛋 白 質 的 機 能 性, 即 使 經 由 消 化 系 統 作 用 後 仍 具 有 不 同 生 理 功 能 (Pihlanto-Leppälä, 2001) 而 已 有 許 多 文 獻 採 用 酵 素 來 水 解 大 豆 蛋 白, 並 指 出 大 豆 蛋 白 質 經 由 不 同 酵 素 水 解 產 生 之 水 解 物 具 有 不 同 生 理 功 能, 這 些 生 理 活 性 包 括 : 降 血 脂 及 降 膽 固 醇 特 性 (Yasuyuki and Yoshikawa, 2000) 抗 氧 化 活 性 (Chen et al., 1995a, Chen et al., 1995b and Moure et al., 2006) 降 血 壓 (Wu and Ding, 2001and Chiang et al., 2006) 改 善 動 脈 順 應 性 及 血 管 內 皮 功 能 (Ringseis et al., 2005) 減 輕 胰 島 素 阻 抗 和 減 重 效 果 (Hermansen et al., 2001 and Gibbs et al., 2004) 等 ( 三 ) 分 離 大 豆 蛋 白 質 水 解 物 之 生 理 功 能 膜 反 應 系 統 是 利 用 不 同 孔 徑 大 小 濾 膜 管 柱 進 行 區 分, 可 產 出 不 同 分 子 量 之 產 物 並 可 提 升 產 物 之 功 能 性 蛋 白 質 食 品 中 均 含 有 一 些 功 能 性 胜 肽 片 段, 但 在 體 內 消 化 時 間 不 夠 或 攝 取 量 不 足, 不 一 定 能 水 解 出 足 夠 的 需 求 濃 度, 在 預 防 保 健 的 觀 點 下, 膳 食 的 機 能 性 成 分 胜 肽 濃 度 在 到 達 某 程 度 時 才 能 有 效 預 防 疾 病 因 此, 利 用 濾 膜 區 分 可 控 制 水 解 產 物 的 分 子 量 分 布 濃 度 及 品 質, 大 量 並 持 續 生 產 出 具 有 機 能 性 之 小 48

62 分 子 量 之 蛋 白 質 或 胜 肽 產 品 (Pihlanto-Leppälä, 2001) 以 下 為 近 年 來 利 用 酵 素 及 連 續 膜 反 應 系 統 來 生 產 具 有 特 殊 生 理 功 能 性 之 大 豆 蛋 白 質 水 解 物 之 相 關 文 獻 : Chiang 等 人 (1999) 指 出 將 分 離 大 豆 蛋 白 質 經 由 alcalas 及 flavourzyme 反 應 後, 再 利 用 膜 過 濾 系 統 進 行 區 分 與 濃 縮 後, 結 果 可 得 到 具 高 度 抗 氧 化 活 性 之 分 離 大 豆 蛋 白 質 水 解 物 ( 水 解 物 分 子 量 介 於 3~30kDa) Chiang 等 人 (2006) 指 出 利 用 alcalase 水 解 分 離 大 豆 蛋 白 質, 而 後 利 用 膜 過 濾 系 統 進 行 區 分 與 濃 縮 後, 成 功 生 產 出 具 高 度 降 血 壓 效 果 之 分 離 大 豆 蛋 白 質 水 解 物 ( 水 解 物 分 子 量 介 於 1~10kDa) 趙 (2009) 指 出 分 離 大 豆 蛋 白 質 經 由 neutrase 反 應 的 水 解 物, 利 用 膜 過 濾 系 統 進 行 區 分 與 濃 縮 後, 分 子 量 10~30 kda 水 解 物 具 有 有 顯 著 促 進 脂 肪 分 解 活 性 ; 而 經 由 flavourzyme 反 應 的 水 解 物, 利 用 膜 過 濾 系 統 進 行 區 分 與 濃 縮 後, 則 是 分 子 量 在 1~10 kda 水 解 物 具 有 有 顯 著 促 進 脂 脂 肪 分 解 活 性 Tsou 等 人 (2010) 指 出 分 離 大 豆 蛋 白 質 經 由 neutrase 反 應 的 水 解 物, 利 用 膜 過 濾 系 統 進 行 區 分 與 濃 縮 後, 可 得 到 具 有 抑 制 脂 質 生 成 的 分 離 大 豆 蛋 白 質 水 解 物 ( 分 子 量 介 於 1.3~2.2 kda) 本 研 究 選 用 的 分 離 大 豆 蛋 白 質 水 解 物 是 經 由 neutrase 反 應 過 的 水 解 物, 再 透 連 續 過 膜 反 應 系 統, 從 水 解 物 篩 選 出 10~30kDa 之 分 離 大 豆 蛋 白 水 質 解 物, 因 此 片 段 水 解 物 已 通 透 過 細 胞 (3T3-L1 脂 肪 細 胞 ) 測 試, 證 實 其 具 有 良 好 促 進 脂 肪 分 解 活 性, 為 具 有 顯 著 減 脂 功 能 的 蛋 白 質 水 解 物, 但 由 於 此 片 段 之 蛋 白 質 水 解 物 分 子 量 大, 不 易 被 完 整 吸 收, 49

63 且 在 消 化 過 程 中 容 易 受 到 腸 胃 道 酵 素 破 壞 及 水 解, 使 其 功 能 性 片 段 喪 失 因 此 本 文 嘗 試 以 幾 丁 聚 醣 作 為 壁 材, 三 聚 磷 酸 鈉 作 交 聯 劑, 將 此 大 分 子 分 離 大 豆 蛋 白 質 水 解 物 包 覆 或 吸 附 在 其 結 構 中, 並 將 其 製 備 成 奈 米 級 顆 粒, 希 望 透 過 此 方 式 來 包 覆 分 離 大 豆 蛋 白 質 水 解 物 及 穩 定 其 活 性 成 分 50

64 參 材 料 與 方 法 一 實 驗 材 料 ( 一 ) 原 料 粗 幾 丁 質 ( 蟹 殼,Chitin)( 高 雄 應 化 公 司, 高 雄 台 灣 ) 分 離 大 豆 蛋 白 質 水 解 物 (ISPH)( 由 東 海 大 學 江 文 德 老 師 實 驗 室 提 供 ) ( 二 ) 藥 品 1. 去 乙 醯 度 分 析 : Potassium polyvinyl sulfate solution( 和 光 純 藥, 日 本 ) Toluidine blue(sigma, 美 國 ) 2. 幾 丁 聚 醣 水 解 酵 素 : 纖 維 酵 素 (Cellulase from Trichoderma reesei ATCC,6.9 units/mg solid)(sigma, 美 國 ) 3. 幾 丁 聚 醣 分 子 量 分 析 : Sodium acetate(ferak, 德 國 ) 標 準 品 :Pullulan(Shodex, 日 本 ) 4. 蛋 白 質 分 子 量 分 析 : 標 準 品 :cytochrome C Aprotinin Gastrin I (Gly) 3 及 Glycine (Sigma, 美 國 ) 5. 蛋 白 質 定 量 分 析 : Coomassie Plus TM - The Better Bradford Assay Kit ( Pierce Biotechnology, 美 國 ) 6. 安 定 性 試 驗 : Hydrochioric acid( 聯 工 化 學 廠 股 份 有 限 公 司, 台 灣 ) 51

65 Sodium Chloride(Panreac Quimca Sa, 西 班 牙 ) Potassium Dihydrogen Phosphate( 石 津 製 藥 株 式 會 社, 日 本 ) 7. 蛋 白 質 電 泳 分 析 : N,N,N,N, -Tetramethylethylenediamine Coomasssie Brilliant Blue R-250 Bronophenol blue(sigma, 美 國 ) Sodium dodecyl sulfate(sds)(bio-rad, 美 國 ) Glycine(Panreac Quimca Sa, 西 班 牙 ) Acryamide-bisFertiglosung 40%(Merck, 德 國 ) Ammoniumperoxodisulfate(APS)(GERBU, 德 國 ) Tris(hydroxymethyl)aminomethane(Tris)(Mallinckrodt Baker, 美 國 ) BlueRAY Prestained Protein Ladder(GeneDireX, 比 利 時 ) 8. 其 他 : Sodium tripolyphosphate( 和 光 純 藥, 日 本 ) Acetic acid Sodium hydroxide( 聯 工 化 學 廠 股 份 有 限 公 司, 台 灣 ) 二 實 驗 儀 器 1. 磨 粉 機 :1hp 型 ( 群 策 電 機 工 業 股 份 有 限 公 司, 台 灣 ) 2. 分 析 篩 網 :Tyler 標 準 規 格 篩 網 (Endecotts, 英 國 ) 3. 電 磁 式 過 篩 機 :OCTAGONDIGITAL 2000 型 (Endecotts, 英 國 ) 4. ph meter:sp701 型 (Suntex, 台 灣 ) 5. 真 空 冷 凍 乾 燥 機 :EYELAFD-5N 型 (Tokyo, 日 本 ) 6. 高 速 低 溫 離 心 機 :CR22GII 型 (Hitachi, 日 本 ) 7. 微 量 超 高 速 離 心 機 :CS 120GX 型 (Hitachi, 日 本 ) 8. 高 效 率 液 相 層 析 儀 (1): A. L-6000 pump(hitachi, 日 本 ) 52

66 B. RI-Deterctor 8110(Bischoff, 德 國 ) C. D-2500 chromatointegrator 積 分 儀 (Hitachi, 日 本 ) 9. 高 效 率 液 相 層 析 儀 (2): A. 765 HPLC compact pump(alcott, 美 國 ) B. UV-VIS Deterctor /S-3702(Soma, 日 本 ) C. Chromatocorder 21 積 分 儀 (System Instruments, 日 本 ) 10. 膜 反 應 系 統 A. 捲 式 膜 (Polyethersulfone spiral-wound membrane): 分 子 量 限 值 (Molecular weight cutoff) 分 別 為 30 和 10 kda (kilo Daltons) (Osmonics Inc., 美 國 ) B. 膜 分 離 系 統 (Membrane reactor system)( 邁 先 生 物 技 術 股 份 有 限 公 司, 台 灣 ) 11. Microplate reader:mrⅡ 型 (DYNEX, 美 國 ) 12. 雷 射 奈 米 粒 徑 及 界 面 電 位 分 析 儀 : Zetasizer Nano 3000HS 型 (Malvern Instrument, 英 國 ) 13. 細 胞 粉 碎 機 :XL-2020 型 (Misonix, 美 國 ) 14. 往 復 式 恆 溫 震 盪 器 :BT-350 型 (Yih Der, 台 灣 ) 15. 蛋 白 質 電 泳 分 析 : A. 鑄 膠 套 件 電 泳 套 件 : Versatile Mini-PROTEAN 3 Electerophresis Cell(Bio-Rad, 美 國 ) B. 電 源 供 應 器 :MP-250(MAJOR SCIENCE, 台 灣 ) 16. 掃 描 式 電 子 顯 微 鏡 :JSM 7000F 型 (Jeol, 日 本 ) 17. 傅 立 葉 轉 換 紅 外 線 光 譜 儀 :IR Prestige-21 型 (Shimadzu, 日 本 ) 53

67 三 材 料 準 備 ( 一 ) 幾 丁 聚 醣 參 考 沈 (2004) 方 法, 將 片 狀 粗 幾 丁 質 以 粉 碎 機 磨 碎 後, 用 40 和 60 mesh 篩 網 ( 大 小 介 於 0.25~0.42mm) 過 篩, 取 介 於 mesh 之 間 顆 粒 之 幾 丁 質 加 入 57%(w/v)NaOH 溶 液 中 (20 ml NaOH / g chitin), 以 100±2 進 行 加 熱 攪 拌 處 理 後, 取 出 幾 丁 聚 醣 並 以 大 量 蒸 餾 水 沖 洗, 直 到 NaOH 完 全 被 沖 洗,pH 達 中 性, 置 入 烘 箱 乾 燥 (80 8 小 時 ) 而 後 使 用 滴 定 方 法 (Toei and Kohara, 1976) 及 配 合 標 準 品 來 測 定 幾 丁 聚 醣 之 去 乙 醯 度, 並 取 得 大 於 85% 去 乙 醯 度 之 幾 丁 聚 醣 作 為 實 驗 之 用 ( 二 ) 不 同 分 子 量 幾 丁 聚 醣 之 製 備 參 考 Qin 等 人 (2004) 及 Lin 等 人 (2005) 以 纖 維 酵 素 水 解 幾 丁 聚 醣 之 實 驗 方 法 取 1g 之 幾 丁 聚 醣 (Mw kda) 溶 解 於 100 ml 之 0.2M 醋 酸 溶 液 中, 配 置 1 % (w/v) 幾 丁 聚 醣 溶 液, 攪 拌 24 小 時 後, 以 過 濾 器 (PET 材 質 ) 將 幾 丁 聚 醣 溶 液 做 粗 過 濾, 去 除 溶 液 中 較 大 的 雜 質 及 鹽 類, 而 後 以 10N 或 1N NaOH 溶 液 調 ph 至 5.0, 接 著 加 入 不 同 濃 度 之 纖 維 酵 素 (cellulase,6.9 units/mg solid)( 及 10 mg/g chitosan), 於 37 恆 溫 水 浴 震 盪 反 應 12 小 時, 立 刻 加 熱 (100,15 min) 使 酵 素 失 活, 待 溶 液 冷 卻 至 室 溫, 以 1 號 及 4 號 濾 紙 過 濾 溶 液, 再 用 10N 或 1N NaOH 溶 液 調 ph 至 7.0, 使 幾 丁 聚 醣 析 出, 析 出 物 再 經 過 三 次 高 速 離 心 (21000 g,30 min) 水 洗 去 除 鹽 類 後, 以 冷 凍 乾 燥 收 集 其 粉 末 而 後 利 用 膠 體 層 析 管 柱 ( Gel Permeation Chromatography,GPC) 來 測 定 其 分 子 量, 並 取 未 水 解 幾 丁 聚 醣 (Mw kda) 及 2 種 幾 丁 聚 醣 水 解 物 (chitosan hydrolysates,cs), 其 分 子 量 分 別 為 及 kda 54

68 ( 三 )10~30kDa 分 離 大 豆 蛋 白 質 水 解 物 之 製 備 本 實 驗 所 選 用 之 分 離 大 豆 蛋 白 質 10~30kDa 水 解 物 是 經 由 30 和 10 kda 兩 種 不 同 分 子 量 限 值 (molecular weight cutoff,mwco) 濾 膜 對 水 解 物 進 行 區 分 濾 膜 對 區 分 其 原 理 為 使 用 不 同 分 子 量 限 值 之 濾 膜 進 行 水 解 物 的 分 離 及 純 化, 膜 反 應 系 統 如 圖 十 所 示 參 考 Chiang 等 人 (2006) 方 法 稍 作 修 改, 首 先 使 30kDa MWCO 濾 膜 對 水 解 物 進 行 處 理, 方 法 為 將 水 解 物 之 置 於 反 應 槽, 由 幫 浦 將 水 解 物 經 管 A 輸 送 至 捲 式 膜 內, 此 時 調 整 管 C 上 的 流 速 控 制 閥, 對 捲 式 膜 進 行 加 壓, 於 是 分 子 量 小 於 濾 膜 MWCO 的 分 子, 則 會 通 過 濾 膜 經 由 管 B 收 集 為 濾 液 (permeate), 即 分 子 量 小 於 30kDa 之 水 解 物 ; 接 著 將 小 於 30kDa 之 水 解 物 再 經 10kDa MWCO 濾 膜 處 理, 則 得 到 分 子 量 介 於 10~30kDa 之 水 解 物 55

69 圖 十 膜 反 應 系 統 Figure 10. Membrane reactor system. 56

70 四 實 驗 方 法 ( 一 ) 幾 丁 聚 醣 - 分 離 大 豆 蛋 白 質 水 解 物 - 三 聚 磷 酸 鈉 (CS-ISPH-TPP) 奈 米 顆 粒 之 製 備 參 考 楊 (2008) 之 研 究 結 果, 其 指 出 幾 丁 聚 醣 溶 液 在 ph 4.7 下, CS-TPP 之 懸 浮 液 中 幾 丁 聚 醣 顆 粒 為 奈 米 級, 而 TPP 溶 液 於 ph 9.0 時 有 三 種 負 電 荷 (-OH P 3 O 10 及 -HP 3 O 4-10 ), 能 有 效 地 與 幾 丁 聚 醣 之 + -NH 3 發 生 作 用 產 生 更 多 CS-TPP 奈 米 顆 粒 ( 霧 狀 較 濃 ), 且 以 CS/TPP 重 量 比 6/1 條 件 下 包 覆 表 沒 食 子 兒 茶 素 沒 食 子 酸 酯 (epigallocatechin gallate,egcg), 所 製 備 出 之 CS-TPP-EGCG 奈 米 顆 粒 對 EGCG 具 有 較 高 的 包 覆 效 力 粒 徑 較 小 顆 粒 表 面 帶 有 高 度 之 正 電 荷 及 在 胃 液 或 腸 液 中 具 有 高 度 之 安 定 性 等 優 點, 故 本 文 參 照 其 結 果 稍 作 修 改 來 製 備 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 而 CS ISPH 及 TPP 三 者 之 添 加 次 序 則 參 考 吳 (2008) 之 研 究 結 果, 其 指 出 先 將 牛 血 清 白 蛋 白 (bovine serum albumin,bsa) 加 入 幾 丁 聚 醣 溶 液 中 而 後 再 加 入 TPP 溶 液 可 得 高 度 之 包 覆 率, 且 可 將 BSA 包 覆 於 CS-TPP 網 狀 結 構 中 ( 二 )CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 特 性 之 影 響 因 子 參 考 吳 (2008) 及 楊 (2008) 之 方 法, 將 不 同 分 子 量 幾 丁 聚 醣 (CS) 溶 於 1 %(v/v) 之 醋 酸 溶 液 中 至 2 mg/ml 之 濃 度, 調 ph 至 4.7; 將 不 同 濃 度 之 三 聚 磷 酸 鈉 (TPP) 溶 於 去 離 子 水 中, 調 ph 至 9.0; 將 不 同 濃 度 之 分 離 大 豆 蛋 白 質 水 解 物 (ISPH) 溶 於 去 離 子 水 中 樣 品 添 加 次 序 為 先 將 ISPH 加 入 CS 溶 液 中 攪 拌, 再 加 入 TPP 溶 液 中 攪 拌 ( 註 : 在 攪 拌 過 程 皆 置 於 冰 上 以 維 持 樣 品 低 溫, 目 的 是 為 保 鮮 ) 1. ISPH 濃 度 之 影 響 57

71 將 1 ml 不 同 濃 度 ( mg/ml) 之 ISPH 溶 液 加 至 5 ml 幾 丁 聚 醣 溶 液 中 (Mw kda,2mg/ml,ph 4.7) 攪 拌 10min, 再 將 前 者 緩 慢 滴 入 2 ml TPP 溶 液 (0.84mg/mL,pH 9.0) 攪 拌 15min, 使 得 混 合 液 中 CS/TPP 重 量 比 為 6/1, 而 後 添 加 20μL glycerol 攪 拌 5min ( 目 的 : 避 免 奈 米 顆 粒 互 相 黏 附 ), 最 後 離 心 30 min(48,000 g,15 ), 可 得 沈 澱 物 即 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 之 後 分 析 其 包 覆 率 裝 載 率 及 產 率, 測 定 奈 米 顆 粒 之 粒 徑 大 小 及 表 面 電 位 2. 幾 丁 聚 醣 分 子 量 之 影 響 將 1 ml ISPH 溶 液 (5 mg/ml) 加 至 5 ml 不 同 分 子 量 (Mw 及 kda,2mg/ml,ph 4.7) 幾 丁 聚 醣 溶 液 中 攪 拌 10min, 再 將 前 者 緩 慢 滴 入 2 ml TPP 溶 液 (0.84mg/mL,pH 9.0) 攪 拌 15min, 使 得 混 合 液 中 CS/TPP 重 量 比 為 6/1, 而 後 添 加 20μL glycerol 攪 拌 5min ( 目 的 : 避 免 奈 米 顆 粒 互 相 黏 附 ), 最 後 離 心 30 min(48,000 g,15 ), 可 得 沈 澱 物 即 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒, 之 後 分 析 其 包 覆 率 裝 載 率 及 產 率, 測 定 奈 米 顆 粒 之 粒 徑 大 小 及 表 面 電 位 3. CS/TPP 重 量 比 之 影 響 將 1 ml ISPH 溶 液 (5mg/mL) 加 至 5 ml CS 溶 液 中 (Mw kda,2mg/ml,ph 4.7), 再 將 前 者 緩 慢 滴 入 2 ml 不 同 濃 度 ( mg/ml,ph 9.0) 之 TPP 溶 液 攪 拌, 使 得 混 合 液 中 CS/TPP 重 量 比 分 別 為 6/1 5/1 4/1 3/1 及 2/1, 而 後 添 加 20μ L glycerol 攪 拌 5min( 目 的 : 避 免 奈 米 顆 粒 互 相 黏 附 ), 最 後 離 心 30 min (48,000 g,15 ), 可 得 沈 澱 物 即 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 之 後 分 析 其 包 覆 率 裝 載 率 及 產 率, 並 測 定 奈 米 顆 粒 之 粒 徑 大 小 及 表 面 電 位 58

72 ( 三 )CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 在 胃 腸 液 中 之 安 定 性 之 影 響 因 子 1. CS/TPP 重 量 比 影 響 將 1 ml ISPH 溶 液 (5mg/mL) 加 至 5 ml CS 溶 液 中 (Mw kda,2 mg/ml,ph 4.7), 再 將 前 者 緩 慢 滴 入 2 ml 不 同 濃 度 ( mg/ml) 之 TPP 溶 液 (ph 9.0), 使 得 混 合 液 中 CS/TPP 重 量 比 分 別 為 6/1 5/1 4/1 3/1 及 2/1, 而 後 添 加 20μL glycerol 攪 拌 5min, 最 後 離 心 30 min(48,000 g,15 ), 可 得 沈 澱 物 即 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒, 並 取 上 清 液 測 定 ISPH 含 量, 計 算 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 中 ISPH 含 量 而 後 參 考 Zhang 及 Kosaraju (2007) 方 法, 將 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 分 別 置 於 6mL 之 ph 1.2 之 鹽 酸 緩 衝 溶 液 (1g NaCl,3.5mL HCl(36%), 去 離 子 水 定 量 至 500 ml,hcl 調 整 ph 至 1.2) 2 小 時 及 ph 7.4 之 磷 酸 緩 衝 溶 液 (25mL O.2M KH 2 PO 4,7.7mL O.2M NaOH, 去 離 子 水 定 量 至 100 ml,o.2m NaOH 調 整 ph 至 7.4) 6 小 時, 以 模 擬 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 在 胃 腸 液 中 之 安 定 性 2. 幾 丁 聚 醣 分 子 量 對 安 定 性 之 影 響 將 1 ml ISPH 溶 液 (5mg/mL) 加 至 5 ml 不 同 分 子 量 ( 及 kda) 之 CS 溶 液 中 (2 mg/ml,ph 4.7), 再 將 前 者 緩 慢 滴 入 2 ml TPP 溶 液 (1.67mg/mL,pH 9.0), 使 得 混 合 液 中 CS/TPP 重 量 比 為 3/1, 而 後 添 加 20µL glycerol 攪 拌 5min, 最 後 離 心 30 min(48,000 g, 15 ), 可 得 沈 澱 物 即 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒, 並 取 上 清 液 測 ISPH 含 量, 計 算 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 中 ISPH 含 量 而 後 參 考 Zhang 及 Kosaraju (2007) 方 法, 將 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 分 別 置 於 6mL 之 ph 1.2 之 鹽 酸 緩 衝 溶 液 (1g NaCl,3.5mL HCl(36%), 去 離 子 水 定 量 至

73 ml,hcl 調 整 ph 至 1.2)2 小 時 及 ph 7.4 之 磷 酸 緩 衝 溶 液 (25mL O.2M KH 2 PO 4,7.7mL O.2M NaOH, 去 離 子 水 定 量 至 100 ml,o.2m NaOH 調 整 ph 至 7.4)6 小 時, 以 模 擬 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 在 胃 腸 液 中 之 安 定 性 3. 以 SDS-PAGE 評 估 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 經 過 模 擬 胃 腸 道 消 化 試 驗 後 ISPH 分 子 量 之 變 化 將 1 ml ISPH 溶 液 (5mg/mL) 加 至 5 ml CS 溶 液 中 (Mw kda, 2 mg/ml, ph 4.7), 再 將 前 者 緩 慢 滴 入 2 ml TPP 溶 液 (1.67mg/mL,pH 9.0), 使 得 混 合 液 中 CS/TPP 重 量 比 為 3/1, 而 後 離 心 (48,000 g,15,30 min), 得 沈 澱 物 即 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 而 後 參 考 Wu 與 Ding(2002) 的 試 驗 方 法, 將 200mg 分 離 大 豆 蛋 白 質 水 解 物 及 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 溶 於 20mL 之 0.1M KCl-HCl 緩 衝 溶 液 (ph 2.0), 於 37 下 震 盪 培 養 4 小 時, 以 模 擬 胃 部 的 環 境, 之 後 以 2N NaOH 調 整 其 ph 至 7.0, 取 部 分 樣 品 備 用 剩 餘 樣 品 繼 續 於 37 震 盪 培 養 4 小 時, 以 模 擬 腸 道 的 環 境, 實 驗 終 了 取 部 分 樣 品 備 用 最 後 利 用 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) 來 評 估 蛋 白 質 之 分 子 量 60

74 五 分 析 方 法 ( 一 ) 幾 丁 聚 醣 去 乙 醯 度 之 測 定 參 考 Toei 與 Kohara (1976) 方 法, 精 稱 0.02g 幾 丁 聚 醣 樣 品 及 標 準 品 並 記 錄 其 重 量 將 樣 品 及 標 準 品 溶 於 10mL 之 0.1M 醋 酸 溶 液 中, 置 於 室 溫 下 攪 拌 一 小 時 待 其 溶 解, 再 以 蒸 餾 水 定 量 至 50mL 接 著, 取 5mL 樣 品 及 標 準 品 溶 液 於 三 角 錐 形 瓶 中, 加 入 0.05mL toluidine blue 指 示 劑 後, 以 N / 400 potassium polyvinyl sulfate solution(p.v.s.k) 進 行 滴 定, 滴 定 至 溶 液 由 藍 色 變 成 紅 紫 色, 此 為 其 滴 定 終 點, 利 用 標 準 品 滴 定 量 與 重 量 和 樣 品 之 重 量 及 滴 定 量 做 計 算 即 可 得 知 去 乙 醯 度 ( 二 ) 幾 丁 聚 醣 水 解 物 之 分 子 量 分 析 參 考 吳 (2008) 之 方 法, 精 稱 10mg 幾 丁 聚 醣 水 解 物 及 pullulan 標 準 品, 分 別 溶 於 10mL 1% 醋 酸 溶 液 及 去 離 子 水 中, 靜 置 冰 箱 隔 夜 後, 以 0.45µm filter 進 行 過 濾 利 用 Gel Permeation Chromatography(GPC) 方 法 分 析 幾 丁 聚 醣 水 解 物 之 分 子 量 以 pullulan 標 準 品 建 立 檢 量 線 ( 附 錄 一 ) Pullulan 標 準 品 分 子 量 分 別 為 及 Dalton 測 定 樣 品 遲 滯 時 間 (retention time) 並 與 檢 量 線 相 互 對 照, 即 可 推 算 幾 丁 聚 醣 水 解 物 之 重 量 平 均 分 子 量 系 統 :L-6000 pump D-2500 chromatointegrator 積 分 儀 (Hitach 公 司, 日 本 ) 偵 測 器 :RI-Deterctor 8110(Bischoff, 德 國 ) 管 柱 :HSp gel AQ5.0(Waters ; 6.0mm * 150 mm) 移 動 相 :0.2M 醋 酸 /0.1M 醋 酸 鈉 流 速 : 為 0.6 ml/min 61

75 溫 度 :45 樣 品 濃 度 :1 mg/ml 注 射 量 :20 µl 偵 測 時 間 :15 min ( 三 )10~30kDa 分 離 大 豆 蛋 白 質 水 解 物 分 子 量 分 析 參 考 Chiang 等 人 (1999) 方 法, 樣 品 以 去 離 子 水 配 製 成 5mg/mL, 以 0.22µm filter 進 行 過 濾 利 用 HPLC 方 法 分 析 10~30kDa 分 離 大 豆 蛋 白 質 水 解 物 分 子 量 分 布 情 形 由 標 準 品 定 義 分 子 量 標 準 品 與 分 子 量 如 下 : cytochrome C(12588 Da) Aprotinin( Da) Gastrin I ( Da) Gly- Gly- Gly(189.2 Da) 及 Glycine(75.07 Da) 測 定 樣 品 遲 滯 時 間 (retention time) 並 與 標 準 品 遲 滯 時 間 相 互 對 照, 即 可 推 算 出 離 大 豆 蛋 白 質 水 解 物 分 子 量 分 布 情 形 系 統 :765 HPLC compact pump(alcott, 美 國 ) Chromatocorder 21 積 分 儀 (System Instruments, 日 本 ) 偵 測 器 :UV-VIS Deterctor /S-3702(Soma, 日 本 ) 管 柱 :Superdex TM peptide 10/300GL(GH Healthcare, Sweden) 管 柱 體 積 :24 ml 流 速 :0.4 ml/min 移 動 相 :0.25M NaCl/0.02M phosphate buffer,ph 7.2 偵 測 波 長 :214 nm 注 射 量 :20 µl 樣 品 濃 度 :5 mg/ml 偵 測 時 間 :60 min 62

76 ( 四 ) 蛋 白 質 定 量 利 用 蛋 白 質 套 組 (Coomassie Plus TM -The Better Bradford Assay Kit, Pierce Biotechnology, USA) 進 行 定 量 步 驟 如 下, 將 蛋 白 質 經 適 當 稀 釋 後, 取 出 10 µl 稀 釋 樣 品 與 300µl 的 試 劑 混 合 均 勻 於 室 溫 下 反 應 十 分 鐘, 隨 後 測 量 595nm 下 的 吸 光 值 (DYNEX MRⅡmicroplate reader, USA) (Bradford, 1976;Zor and Selinger, 1996) ( 五 ) 包 覆 率 裝 載 率 及 產 率 之 分 析 於 製 備 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 時, 將 CS-ISPH-TPP 反 應 液 離 心, 取 上 清 液, 利 用 Bradford Method 測 定 其 ISPH 含 量, 計 算 其 包 覆 率 (encapsulation efficiency %) 標 準 曲 線 (ISPH 濃 度 vs 吸 光 值 ) 為 ISPH 之 稀 釋 溶 液 ( 附 錄 二 ) 接 著 將 離 心 後 所 得 之 沈 澱 物 即 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒, 利 用 烘 箱 烘 乾 秤 重, 至 衡 重, 即 可 得 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 之 乾 重, 並 計 算 其 裝 載 率 (loading capacity %) 產 率 (process yield %) 分 析 則 以 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 之 乾 重 除 以 添 加 入 固 形 物 重 量, 即 CS ISPH 及 TPP 起 始 配 置 之 重 量 (w/w) 所 得 63

77 ( 六 ) 奈 米 顆 粒 粒 徑 和 表 面 電 荷 之 測 定 使 用 雷 射 光 散 射 法 粒 徑 及 界 面 電 位 分 析 儀 (Zetasizer 3000HS, Malvern,UK) 測 定 奈 米 顆 粒 大 小 及 表 面 電 荷 為 了 避 免 偵 測 到 灰 塵 等 顆 粒 較 大 的 雜 質, 實 驗 前 所 有 樣 品 等 溶 液 先 以 0.45 µm 過 濾 膜 過 濾 再 製 備 奈 米 顆 粒 將 CS-TPP 及 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 懸 浮 於 去 離 子 水 中, 使 用 超 音 波 細 胞 粉 碎 機 將 聚 集 顆 粒 震 碎 (40% duty cycle,20 secs), 靜 置 min 後, 取 上 層 溶 液, 以 動 態 光 散 射 法 (dynamic light scattering method) 測 定 粒 子 粒 徑 大 小 另 外, 將 CS-TPP 及 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 以 去 離 子 水 稀 釋 至 適 當 濃 度, 測 定 其 表 面 電 荷 所 有 樣 品 皆 測 定 三 次, 求 其 平 均 值 (mean ±SD) ( 七 ) 安 定 性 之 分 析 1. 模 擬 胃 液 中 (ph 1.2) 之 安 定 性 參 考 Zhang 與 Kosaraju(2007) 方 法, 將 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 置 於 6 ml 鹽 酸 緩 衝 溶 液 (ph 1.2) 之 50 ml 三 角 錐 形 瓶, 於 恆 溫 水 浴 槽 中 震 盪 (37,75 rpm), 按 及 2 小 時 取 出 0.5 ml 溶 液 樣 品, 利 用 Bradford Method 測 定 ISPH 含 量 ( 標 準 曲 線 參 照 附 錄 三 (a)) 並 以 下 列 公 式 計 算 其 時 間 累 積 ISPH 之 釋 放 率, 同 時 再 加 回 0.5 ml 鹽 酸 緩 衝 溶 液, 使 瓶 內 維 持 一 定 體 積 計 算 方 式 如 下 : Wn = Cn V + Vs Σ[C (a-1) ] Wn / W 100 = 時 間 累 積 ISPH 釋 放 率 (%) Wn: 時 間 累 積 ISPH 總 含 量 W:CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 中 ISPH 總 含 量 64

78 n,a: 取 樣 次 數 C: 測 定 ISPH 之 濃 度 V: 總 溶 液 體 積 Vs: 採 取 樣 品 體 積 2. 模 擬 腸 液 中 (ph 7.4) 之 安 定 性 參 考 Zhang 與 Kosaraju(2007) 方 法, 將 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 置 於 6 ml 磷 酸 緩 衝 溶 液 (ph 7.4) 之 50 ml 三 角 錐 形 瓶 於 恆 溫 水 浴 槽 中 震 盪 (37,75 rpm ), 按 及 6 小 時 取 出 0.5 ml 溶 液 樣 品, 利 用 Bradford Method 測 定 ISPH 含 量 ( 標 準 曲 線 參 照 附 錄 三 (b)) 並 以 上 述 公 式 計 算 其 時 間 累 積 ISPH 之 釋 放 率, 同 時 再 加 回 0.5 ml 磷 酸 緩 衝 溶 液, 使 瓶 內 維 持 一 定 體 積, 計 算 方 式 同 上 ( 八 ) 蛋 白 質 電 泳 分 析 蛋 白 質 電 泳 分 析 是 利 用 SDS-PAGE ( sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) 來 評 估 蛋 白 質 之 分 子 量 於 迷 你 電 泳 裝 置 鑄 膠 器 中 注 入 10% SDS-PAGE 分 離 膠 體 溶 液 (separating gel, 含 4.13 ml d.d.h 2 O,2.5 ml 1.5M Tris-HCl(pH8.8),100 µl 10% SDS, 80µL APS,3 ml Acryamide,8 µl TEMED), 待 其 凝 固 後, 於 其 上 覆 蓋 5% 聚 集 膠 體 溶 液 (stacking gel, 含 1.98 ml d.d.h 2 O,312.5 µl 0.5M Tris-HCl(pH6.8),50 µl 10% SDS,30 µl APS,250 µl Acryamide, 4 µl TEMED), 待 其 凝 固 後 將 其 置 於 迷 你 電 泳 裝 置 內 於 迷 你 電 泳 裝 置 內 加 入 1X 電 泳 緩 衝 液 (electrode buffer,ph8.3, 含 25mM Tris,0.2M glycine,0.1% SDS) 備 用 取 25µL 樣 品 與 5µL 追 蹤 染 劑 (bromophenol blue) 混 合 後 以 95 加 熱 5min, 冷 卻 後 即 可 注 入 樣 品 槽, 並 加 入 蛋 白 質 標 準 溶 液 做 對 照 先 以 電 壓 70 伏 特 跑 上 膠, 再 改 變 電 壓 為 100 伏 特 65

79 跑 下 膠, 待 樣 品 溶 液 之 追 蹤 染 劑 跑 至 膠 底 時 即 停 止, 取 出 膠 片, 以 Coomasssie Brilliant Blue R-250 進 行 染 色 染 色 完 畢 後 使 用 脫 色 液 或 水 沖 洗 膠 片 數 次, 至 其 背 景 透 明 後 即 可 利 用 玻 璃 紙 進 行 封 膠 ( 九 ) 傅 立 葉 轉 換 紅 外 線 光 譜 儀 (FTIR) 分 析 CS CS-TPP 奈 米 顆 粒 及 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 經 冷 凍 乾 燥, 取 得 其 粉 末 顆 粒, 儲 存 備 用 將 CS 粉 末 CS-TPP 奈 米 顆 粒 粉 末 及 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 粉 末 分 別 與 KBr 以 1:99 比 例 研 磨 混 和 後 壓 成 薄 片, 利 用 傅 利 葉 轉 換 紅 外 線 光 譜 儀 (FTIR) 測 量 波 數 cm -1 之 間 的 吸 收 光 譜 ( 十 ) 掃 描 式 電 子 顯 微 鏡 (SEM) 觀 察 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 以 去 離 子 水 多 次 反 覆 離 心 水 洗 作 用, 以 去 除 樣 品 中 的 鹽 類, 將 顆 粒 覆 懸 於 1 ml 去 離 子 水 中, 利 用 超 音 波 細 胞 粉 碎 機 分 散 樣 品 後, 將 樣 品 滴 在 鋁 箔 片 上 置 於 70 烘 箱 烘 乾 24 小 時, 再 以 離 子 附 膜 機 將 樣 品 鍍 上 一 層 適 當 厚 度 的 白 金 後, 以 熱 場 發 射 掃 描 式 電 子 顯 微 鏡 觀 察 幾 丁 聚 醣 顆 粒 表 面 型 態 ( 十 一 ) 統 計 分 析 本 實 驗 數 據 皆 以 平 均 ± 標 準 誤 差 (means±sem) 表 示 所 有 組 別 之 試 驗 數 據 皆 利 用 SAS 9.1 套 裝 軟 體 進 行 全 隨 機 設 計 (completely randomized desigin) 變 異 分 析 (ANOVA) 及 Duncan s new multiple Range test 分 析, 當 機 率 值 小 於 0.05(p < 0.05) 表 示 各 組 於 統 計 上 有 顯 著 差 異 並 使 用 SigmaPlot 10.0(Systat software, USA) 軟 體 進 行 作 圖 66

80 肆 結 果 與 討 論 一 樣 品 製 備 ( 一 ) 幾 丁 聚 醣 之 製 備 幾 丁 質 經 過 高 溫 及 強 鹼 處 理 後, 會 使 得 其 結 構 上 的 乙 醯 基 (-NHCOCH 3,acetyl group) 被 脫 去, 轉 變 成 胺 基 (-NH 2,amino group), 當 去 乙 醯 度 到 達 一 定 的 程 度 之 後 ( 各 文 獻 定 義 不 同 ) 即 可 稱 為 幾 丁 聚 醣 本 實 驗 參 考 沈 (2004) 實 驗 方 法, 欲 製 備 大 於 85 % 去 乙 醯 度 之 幾 丁 聚 醣, 其 條 件 為 : 將 mesh 之 幾 丁 質 置 於 100±2 的 57%(w/v) NaOH 溶 液 中 (20 ml NaOH / g chitin) 攪 拌 130 min, 結 果 可 得 去 乙 醯 度 大 於 85 % 之 幾 丁 聚 醣 幾 丁 聚 醣 去 乙 醯 度 是 決 定 幾 丁 聚 醣 應 用 功 能 性 之 ㄧ 大 因 素, 在 藥 物 傳 遞 方 面, 由 於 高 去 乙 醯 度 幾 丁 聚 醣 溶 解 在 酸 性 溶 液 中 時, 具 有 高 度 陽 離 子 之 特 性, 可 以 提 高 對 腸 黏 膜 的 吸 附 力 以 及 可 暫 時 性 的 打 開 腸 黏 膜 上 的 緊 密 連 接 (tight junctions), 有 利 於 藥 物 營 養 物 質 等 滲 透 吸 收 (Huang et al., 2004;Lin et al., 2005) 且 在 Wu 及 Du(2003) 研 究 亦 指 出 增 加 幾 丁 聚 醣 去 乙 醯 度 愈 高 ( %), 對 牛 血 清 白 蛋 白 (bovine serum albumin,bsa) 之 包 覆 率 愈 佳 及 可 降 低 BSA 的 釋 放 速 率 因 此 本 文 選 定 去 乙 醯 度 大 於 85 % 之 幾 丁 聚 醣 來 做 研 究 ( 二 ) 不 同 分 子 量 幾 丁 聚 醣 之 製 備 以 纖 維 酵 素 水 解 幾 丁 聚 醣 可 得 不 同 分 子 量 之 幾 丁 聚 醣, 其 優 點 為 專 一 性 高, 產 率 高, 且 反 應 效 果 佳 本 實 驗 使 用 去 乙 醯 度 大 於 85% 之 幾 丁 聚 醣 (Mw kda) 經 不 同 濃 度 之 纖 維 酵 素 (6.9 units/mg solid) 67

81 ( 及 10 mg/g chitosan) 於 37 水 解 12 小 時 後, 可 得 出 不 同 分 子 量 之 幾 丁 聚 醣, 分 子 量 分 別 為 及 81.6 kda( 圖 十 一 ) 其 反 應 之 專 一 性 及 再 現 性 高, 可 製 出 低 分 子 量 之 幾 丁 聚 醣 水 解 物 (chitosan hydrolysates,cs) 至 81.6 kda 而 已 有 文 獻 指 出 利 用 纖 維 酵 酶 所 製 備 出 之 低 分 子 量 幾 丁 聚 醣 水 解 物 具 有 良 好 抗 菌 活 性 (Tsai et al.,2004) 抗 腫 瘤 活 性 (Qin et al., 2004) 及 免 疫 活 性 (Wu and Tsai, 2004) 等 功 效 在 藥 物 傳 遞 方 面, 幾 丁 聚 醣 分 子 量 對 於 奈 米 顆 粒 特 性 及 形 成 有 重 要 的 影 響, 包 括 調 控 顆 粒 之 粒 徑 大 小 包 覆 率 裝 載 率 釋 放 率 安 定 性 表 面 電 荷 等 Gan 及 Wang(2007) 指 出 使 用 不 同 分 子 量 幾 丁 聚 醣 在 製 備 奈 米 顆 後, 發 現 幾 丁 聚 醣 分 子 量 對 BSA 的 包 覆 率 及 其 體 外 釋 放 量 是 有 影 響 的, 分 子 量 愈 高, 包 覆 率 愈 高 另 外, 幾 丁 聚 醣 分 子 量 也 會 影 響 奈 米 顆 粒 粒 徑 及 表 面 電 位, 分 子 量 愈 高, 粒 徑 愈 大, 表 面 電 荷 愈 高 ; 分 子 量 愈 低, 溶 解 性 愈 佳, 有 助 於 奈 米 顆 粒 膠 體 在 溶 液 中 之 的 穩 定 性 (Fernández-Urrusuno et al., 1999), 且 製 備 出 之 奈 米 顆 粒 粒 徑 愈 小, 其 在 腸 胃 道 中 排 空 時 間 延 長, 可 提 高 其 與 腸 道 上 皮 細 胞 的 接 觸 機 會 或 直 接 被 細 胞 吸 收, 可 增 加 營 養 物 質 之 吸 收 與 利 用 (Chen et al., 2006b;Chau et al.,2007) 因 此 本 文 將 選 定 三 種 不 同 分 子 量 幾 丁 聚 醣 : 低 分 子 量 (LMW,131.1 kda) 中 分 子 量 (MMW,231.4 kda) 及 高 分 子 量 (HMW,475.5 kda, 即 未 水 解 ) 來 包 覆 分 離 大 豆 蛋 白 質 水 解 物 並 對 其 物 理 化 學 特 性 做 一 探 討 68

82 500 Chitosan molecular weight ( kda ) Cellulase concentration (mg/g chitosan) 圖 十 一 纖 維 酵 素 濃 度 對 幾 丁 聚 醣 水 解 度 之 影 響 Figure 11. Effect of cellulase concentration on the degree of chitosan hydrolysis. 69

83 ( 三 )10~30kDa 分 離 大 豆 蛋 白 質 水 解 物 之 區 分 大 豆 蛋 白 質 經 由 不 同 酵 素 水 解 產 生 之 水 解 物 具 有 不 同 生 理 功 能 趙 (2009) 指 出 分 離 大 豆 蛋 白 質 經 由 Neutrase 反 應 的 水 解 物, 利 用 膜 過 濾 系 統 進 行 區 分 與 濃 縮 後, 分 子 量 10~30 kda 水 解 物 具 有 顯 著 促 進 脂 肪 分 解 活 性, 為 具 有 顯 著 減 脂 功 能 的 蛋 白 質 水 解 物 本 實 驗 所 獲 得 之 分 離 大 豆 蛋 白 質 水 解 物 是 以 Neutrase 酵 素 進 行 特 定 時 間 水 解 後 所 得 之 水 解 物, 其 中 含 有 不 同 大 小 分 子 片 段 的 蛋 白 質 及 胜 肽, 而 本 實 驗 只 欲 收 集 10~30 kda 之 分 離 大 豆 蛋 白 質 水 解 物 作 蛋 白 質 水 解 物 模 型, 故 使 用 膜 反 應 系 統 將 特 定 片 段 加 以 區 隔 分 離 本 實 驗 使 用 了 兩 種 不 同 限 值 之 濾 膜 (30 kda 和 10kDa MWCO) 對 水 解 物 進 行 分 離 及 純 化, 而 後 再 以 HPLC 方 法 分 析 水 解 物 分 子 量 結 果 由 圖 十 二 所 示, 其 水 解 物 分 子 量 大 多 集 中 在 12,588 Da 附 近, 本 文 將 此 水 解 物 定 義 為 10~30 kda 分 離 大 豆 蛋 白 質 水 解 物 ( 即 大 於 10 kda 且 小 於 30 kda ) 70

84 圖 十 二 分 離 大 豆 蛋 白 質 水 解 物 (ISPH) 經 30 和 10kDa 濾 膜 區 分 所 得 的 濃 縮 物 分 子 量 分 布 圖 Figure 12. Molecular weight distribution of isolate soy protein hydrolysates produced from 30 and 10 kda MWCO membrane. 71

85 二 分 離 大 豆 蛋 白 質 水 解 物 (ISPH) 濃 度 幾 丁 聚 醣 (CS) 分 子 量 及 幾 丁 聚 醣 - 三 聚 磷 酸 鈉 (TPP) 重 量 比 對 幾 丁 聚 醣 - 分 離 大 豆 蛋 白 質 水 解 物 - 三 聚 磷 酸 鈉 (CS-ISPH -TPP) 奈 米 顆 粒 特 性 之 影 響 ( 一 )ISPH 濃 度 之 影 響 文 獻 指 出 幾 丁 聚 醣 分 子 量 愈 低, 溶 解 性 愈 佳, 不 僅 有 助 於 奈 米 顆 粒 膠 體 在 溶 液 中 之 的 穩 定 性 (Fernández-Urrusuno et al., 1999) 所 製 備 出 之 奈 米 顆 粒 粒 徑 較 小, 可 增 加 其 與 腸 道 上 皮 細 胞 的 接 觸 機 會 或 直 接 被 細 胞 吸 收, 有 利 於 營 養 物 質 之 吸 收 與 利 用 (Chen et al., 2006b;Chau et al.,2007) 因 此 本 試 驗 先 使 用 分 子 量 kda 之 幾 丁 聚 醣, 固 定 CS/TPP 重 量 比 為 6/1, 探 討 不 同 濃 度 ( mg/ml) 之 ISPH 對 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 特 性 之 影 響 1. 包 覆 率 裝 載 率 及 產 率 之 影 響 圖 十 三 所 示, 以 低 分 子 量 幾 丁 聚 醣 (131.1 kda) 包 覆 ISPH 時, 低 濃 度 (1mg/mL) 之 ISPH 可 獲 得 較 高 之 包 覆 率 (82%), 隨 著 ISPH 濃 度 增 加 至 大 於 3mg/mL, 其 包 覆 率 均 維 持 在 50%, 推 測 此 為 低 分 子 量 幾 丁 聚 醣 在 溶 液 中 立 體 結 構 障 礙 小, 溶 液 黏 度 較 低, 且 幾 丁 聚 醣 鏈 上 游 離 之 胺 基 多, 於 ISPH 濃 度 較 低 時 可 與 ISPH 充 分 進 行 離 子 鍵 結, 並 且 有 效 地 捕 捉 ISPH 而 在 ISPH 濃 度 高 時, 其 包 覆 率 下 降 之 原 因 為 : Luangtana-ana 等 人 (2005) 指 出, 幾 丁 聚 醣 包 覆 ISPH 的 機 制 有 兩 種 : 一 是 透 過 離 子 鍵 結 方 式, 利 用 幾 丁 聚 醣 鏈 上 帶 正 電 之 胺 基 與 蛋 白 質 上 之 羧 基 (-COO - ) 進 行 鍵 結 ; 其 二 是 透 過 幾 丁 聚 醣 與 與 TPP 能 形 成 網 狀 結 構 之 特 性, 將 ISPH 以 物 理 包 覆 方 式 包 覆 在 其 結 構 中, 因 此 幾 丁 聚 醣 鏈 上 之 胺 基 扮 演 著 重 要 之 角 色, 在 探 討 包 覆 率 時 須 考 慮 到 幾 丁 聚 醣 胺 72

86 基 與 ISPH 鍵 結 位 多 寡 外, 還 需 考 慮 幾 丁 聚 醣 與 TPP 形 成 之 網 狀 結 構 多 寡, 因 此 可 得 知 幾 丁 聚 醣 對 ISPH 包 覆 能 力 是 有 限 的 當 幾 丁 聚 醣 與 ISPH 鍵 結 達 飽 和 或 幾 丁 聚 醣 與 TPP 形 成 之 網 狀 結 構 少, 多 餘 的 ISPH 就 會 無 法 被 鍵 結 或 包 覆 在 奈 米 顆 粒 上, 因 此 溶 液 中 被 測 得 之 ISPH 量 就 多, 包 覆 率 就 低 在 裝 載 率 方 面, 如 圖 十 三 所 示, 隨 著 ISPH 濃 度 增 加, 低 分 子 量 之 幾 丁 聚 醣 對 ISPH 裝 載 率 有 顯 著 的 增 加 趨 勢 (3~12%) 推 測 因 ISPH 濃 度 較 低 時,ISPH 被 包 覆 進 奈 米 微 粒 的 量 少, 未 達 飽 和 的 裝 載 率, 因 此 雖 有 較 高 包 覆 率, 但 實 際 被 包 入 奈 米 顆 粒 內 的 ISPH 量 是 低 的 Xu 和 Du(2003) 以 幾 丁 聚 醣 (210 kda) 與 TPP 進 行 離 子 交 聯 來 包 覆 BSA, 製 備 奈 米 顆 粒, 指 出 隨 著 BSA 濃 度 的 增 加, 幾 丁 聚 醣 對 BSA 包 覆 率 會 隨 之 下 降, 但 裝 載 率 則 是 隨 BSA 濃 度 增 加 而 增 加 Wu(2005) 以 幾 丁 聚 醣 (200 及 24 kda) 與 TPP 進 行 離 子 交 聯 來 包 覆 甘 草 酸 銨 (ammonium glycyrrhizinate), 製 備 奈 米 顆 粒, 也 指 出 隨 著 甘 草 酸 銨 濃 度 的 增 加, 幾 丁 聚 醣 對 甘 草 酸 銨 之 包 覆 率 會 隨 之 下 降, 裝 載 率 則 是 隨 著 甘 草 酸 銨 濃 度 增 加 而 增 加 在 產 率 方 面, 結 果 如 圖 十 三 所 示 隨 著 ISPH 濃 度 增 加, 低 分 子 量 之 幾 丁 聚 醣 對 產 率 並 無 明 顯 的 差 異 性 及 趨 勢 ( 平 均 為 27%), 推 測 應 是 CS TPP ISPH 三 者 鍵 結 有 一 定 比 率,CS 與 TPP 鍵 結 多, 則 對 ISPH 之 鍵 結 就 少, 反 之 CS 與 ISPH 鍵 結 多, 則 對 TPP 之 鍵 結 就 少, 故 於 產 率 上 差 異 不 大 另 外, 由 於 實 驗 所 製 備 出 之 奈 米 顆 粒 量 很 少, 且 容 易 在 實 驗 操 作 過 程 或 烘 乾 過 程 上 造 成 部 分 樣 品 損 失, 因 此 最 後 再 定 量 上 非 常 困 難, 而 後 改 善 方 法 因 採 大 量 製 備 方 式, 再 來 計 算 其 產 率, 這 樣 才 比 較 能 看 出 其 產 率 上 之 差 異 性 73

87 Process yield (%) ISPH encapsulation (%) Loading capacity (%) ISPH concentration(mg/ml) 圖 十 三 ISPH 濃 度 對 包 覆 率 裝 載 率 及 產 率 之 影 響 Figure 13. Effect of ISPH concentration on the encapsulation efficiency ( ), loading capacity( )and process yield( ).(CS molecular weight:131.1kda;cs/tpp mass ratio: 6/1). 74

88 2. 粒 徑 大 小 之 影 響 圖 十 四 所 示,ISPH 濃 度 對 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 粒 徑 之 影 響 隨 著 ISPH 濃 度 之 增 加,CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 之 粒 徑 有 變 大 的 趨 勢, 推 測 應 是 CS-TPP 包 覆 了 更 多 ISPH 之 緣 故 Wu(2005) 指 出 使 用 分 子 量 為 200 kda 之 幾 丁 聚 醣 包 覆 甘 草 酸 銨 (ammonium glycyrrhizinate) 時, 顆 粒 粒 徑 會 隨 著 甘 草 酸 銨 濃 度 增 加 而 增 加, 但 以 24 kda 之 幾 丁 聚 醣 包 覆 甘 草 酸 銨 時, 其 顆 粒 粒 徑 增 加 不 明 顯, 其 認 為 是 由 於 低 分 子 量 之 幾 丁 聚 醣 其 有 較 高 的 溶 解 性, 因 此 有 助 於 奈 米 顆 粒 膠 體 在 溶 液 中 之 的 穩 定 性 之 故 (Fernández-Urrusuno et al., 1999) Gan 及 Wang(2007) 也 有 相 同 的 指 出, 包 覆 有 BSA 者 之 顆 粒 粒 徑 皆 大 於 未 包 覆 者 3. 表 面 電 位 之 影 響 文 獻 指 出, 幾 丁 聚 醣 上 之 正 電 荷 (NH + 3 ) 可 提 高 其 對 腸 黏 膜 的 吸 附 力 以 及 可 暫 時 性 的 打 開 腸 黏 膜 上 的 緊 密 連 接 (tight junctions) 之 能 力, 有 利 於 藥 物 營 養 物 質 等 滲 透 吸 收,(Huang et al., 2004;Lin et al., 2005) 因 此 本 文 探 討 了 ISPH 濃 度 對 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 表 面 電 位 之 影 響, 如 表 七 所 示, 隨 著 ISPH 濃 度 之 增 加,CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 之 表 面 電 位 並 無 明 顯 改 變, 顆 粒 表 面 均 帶 正 電 荷, 介 於 +42.1~ mv 之 間 推 測 應 是 幾 丁 聚 醣 於 酸 溶 液 中, 其 結 構 上 的 NH 2 被 質 子 化 形 成 帶 正 電 的 NH 3 +, 此 時 將 幾 丁 聚 醣 溶 液 滴 入 帶 負 電 荷 的 TPP 溶 液 中, 形 成 中 和 反 應 產 生 幾 丁 聚 醣 奈 米 顆 粒, 而 在 顆 粒 表 面 上 仍 存 在 正 電 荷 及 + 未 與 TPP 離 子 形 成 交 互 作 用 之 NH 3 離 子 Gan 及 Wang(2007) 指 出 當 奈 米 顆 粒 包 覆 BSA 後, 其 表 面 電 位 只 有 輕 微 的 減 少, 其 認 為 有 此 現 象 是 因 為 幾 丁 聚 醣 鏈 上 尚 有 許 多 游 離 之 胺 基 並 未 被 BSA 佔 據, 因 此 蛋 白 質 吸 附 於 幾 丁 聚 醣 表 面 並 不 會 改 變 幾 丁 聚 醣 分 子 之 表 面 電 位 75

89 340 Particle size (nm) B B B AB AB A ISPH concentration(mg/ml) 圖 十 四 ISPH 濃 度 對 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 粒 徑 之 影 響 Figure 14. Effect of ISPH concentration on the particle size of CS-ISPH-TPP nanoparticles. ( CS molecular weight : 131.1kDa;CS/TPP mass ratio: 6/1). * A-B mean in the same bar ( ISPH concentration ) with different superscripts are significantly different(p < 0.05). 76

90 表 七 ISPH 濃 度 對 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 表 面 電 荷 之 影 響 Table 7. Effect of ISPH concentration on the zeta potential of CS-TPP-ISPH nanoparticles. ISPH concentration(mg/ml) ζpotential(mv) ±4.5 A ±1.8 A ±1.8 A ±2.0 A ±2.1 A ±1.8 A (CS molecular weight:131.1kda;cs/tpp mass ratio: 6/1). *A mean in the same column(isph concentration)with different superscripts are significantly different(p <0.05). 77

91 ( 二 ) 幾 丁 聚 醣 分 子 量 之 影 響 由 前 實 驗 結 果 得 知 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 之 裝 載 率 及 粒 徑 會 隨 著 ISPH 濃 度 的 增 加 而 增 加, 而 包 覆 率 會 隨 著 ISPH 濃 度 的 增 加 而 下 降, 本 文 欲 獲 得 具 高 度 包 覆 率 裝 載 率 及 產 率 之 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒, 同 時 亦 欲 獲 得 小 粒 徑 之 奈 米 顆 粒, 故 本 文 認 為 當 ISPH 溶 液 濃 度 固 定 為 5mg/mL 時 可 獲 得 穩 定 之 包 覆 率 裝 載 率 及 產 率 之 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 ( 以 低 分 子 量 之 幾 丁 聚 醣 為 例, 其 包 覆 5mg/mL ISPH 時, 包 覆 率 為 52%, 裝 載 率 為 10%, 產 率 為 28%), 且 其 粒 徑 亦 可 控 制 在 奈 米 尺 寸 ( 以 低 分 子 量 之 幾 丁 聚 醣 為 例, 其 包 覆 5mg/mL ISPH 時, 可 得 顆 粒 粒 徑 大 小 為 nm) 故 本 試 驗 固 定 ISPH 溶 液 濃 度 為 5mg/mL,CS/TPP 重 量 比 為 6/1, 探 討 不 同 分 子 量 ( 及 kda) 之 幾 丁 聚 醣 對 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 特 性 之 影 響 1. 包 覆 率 裝 載 率 及 產 率 之 影 響 表 八 所 示, 以 不 同 分 子 量 之 幾 丁 聚 醣 來 包 覆 相 同 濃 度 之 ISPH(5 mg/ml) 對 其 包 覆 率 裝 載 率 及 產 率 之 影 響 結 果 顯 示 其 包 覆 率 裝 載 率 及 產 率 皆 無 顯 著 差 異 由 先 前 究 結 果 顯 示, 以 低 分 子 量 之 幾 丁 聚 醣 包 覆 不 同 濃 度 之 ISPH 時, 則 會 隨 ISPH 濃 度 增 加 包 覆 率 有 隨 之 降 低 之 趨 勢, 而 裝 載 率 隨 之 增 加 的 趨 勢 ( 見 圖 十 三 ), 這 顯 示 出 ISPH 之 包 覆 率 裝 載 率 主 要 是 會 受 到 ISPH 濃 度 影 響, 而 不 受 幾 丁 聚 醣 之 分 子 量 影 響 78

92 表 八 幾 丁 聚 醣 分 子 量 對 包 覆 率 裝 載 率 及 產 率 之 影 響 Table 8. Effect of chitosan molecular weight on the encapsulation efficiency, loading capacity and process yield. CS MW Encapsulation efficiency% Loading capacity% Process yield% ±4.53 A 10.97±0.90 A 30.88±1.73 A ±4.26 A 9.57±0.65 A 28.18±2.08 A ±3.96 A 9.60±0.40 A 27.58±0.00 A (CS/TPP mass ratio: 6/1;ISPH concentration:5mg/ml). *A mean in the same column(chitosan MW)with different superscripts are significantly different(p < 0.05). 79

93 Wu(2005) 以 幾 丁 聚 醣 (200 及 24 kda) 與 TPP 進 行 離 子 交 聯 來 包 覆 甘 草 酸 銨, 製 備 奈 米 顆 粒, 指 出 高 分 子 量 之 幾 丁 聚 醣 (200 kda) 對 甘 草 酸 銨 之 包 覆 率 及 裝 載 率 皆 優 於 低 分 子 量 之 幾 丁 聚 醣 (24 kda), 其 認 為 是 由 於 幾 丁 聚 醣 分 子 量 愈 高 其 鏈 上 胺 基 愈 多, 能 與 TPP 形 成 交 聯 位 置 愈 多, 對 甘 草 酸 銨 之 捕 捉 能 力 愈 佳 之 故 而 Yang 等 人 (2009) 卻 有 不 同 之 見 解, 其 比 較 不 同 分 子 量 幾 丁 聚 醣 ( 及 55 kda) 對 fluorouracil(5-fu) 的 包 覆 率, 指 出 幾 丁 聚 醣 分 子 量 愈 低 對 5-FU 包 覆 效 率 愈 佳, 其 認 為 是 由 於 低 分 量 之 幾 丁 聚 醣 其 鏈 短, 具 有 更 多 的 游 離 胺 基, 因 此 能 產 生 更 多 離 子 交 聯 作 用 來 吸 附 5-FU, 因 此 包 覆 率 增 加 2. 粒 徑 之 影 響 圖 十 五 所 示, 以 不 同 分 子 量 之 幾 丁 聚 醣 製 備 CS-TPP 及 CS-ISPH -TPP 奈 米 顆 粒, 結 果 隨 著 幾 丁 聚 醣 分 子 量 增 加,CS-TPP 及 CS-ISPH- TPP 奈 米 顆 粒 之 粒 徑 隨 之 增 加, 且 包 覆 有 ISPH 者 粒 徑 皆 大 於 未 包 覆 者, 推 測 是 由 於 幾 丁 聚 醣 分 子 量 愈 大, 其 鏈 愈 長, 因 此 鏈 與 鏈 之 立 體 空 間 障 礙 大, 所 以 奈 米 顆 粒 粒 徑 就 較 大 Wu(2005) 指 出 隨 著 幾 丁 聚 醣 分 子 量 的 增 加, 其 粒 徑 有 跟 著 增 加 之 趨 勢 ; 而 比 較 200 及 24 kda 之 幾 丁 聚 醣 包 覆 不 同 濃 度 之 甘 草 酸 銨 時, 其 指 出 當 以 分 子 量 200 kda 之 幾 丁 聚 醣 包 覆 甘 草 酸 銨 時, 顆 粒 粒 徑 會 隨 著 甘 草 酸 銨 濃 度 增 加 而 增 加, 但 以 24 kda 之 幾 丁 聚 醣 包 覆 甘 草 酸 銨 時, 其 顆 粒 粒 徑 增 加 並 不 明 顯, 其 認 為 是 由 於 低 分 子 量 之 幾 丁 聚 醣 其 有 較 高 的 溶 解 性, 因 此 有 助 於 奈 米 顆 粒 膠 體 在 溶 液 中 之 的 穩 定 性 之 故 (Fernandez-Urrusuno et al., 1999) Gan 及 Wang(2007) 也 有 相 同 的 指 出, 隨 幾 丁 聚 醣 分 子 量 增 加 奈 米 顆 粒 粒 徑 有 增 加 之 趨 勢, 而 包 覆 有 BSA 者 之 顆 粒 粒 徑 皆 大 於 未 包 覆 者 80

94 Ab Aa Unoladed ISPH-loaded Particle size (nm) Bb Ba Cab Ca Chitosan molecular weight (kda) 圖 十 五 幾 丁 聚 醣 分 子 量 對 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 粒 徑 之 影 響 Figure 15. Effect of chitosan molecular weight on the particle size of CS-ISPH-TPP nanoparticles.(cs/tpp mass ratio: 6/1;ISPH concentration:5mg/ml). *A-C mean in the same bar(chitosan molecular weight)with different superscripts are significantly different(p < 0.05). * a-b mean in the same bar( Type of nanoparticle) with different superscripts are significantly different(p < 0.05). 81

95 3. 表 面 電 位 之 影 響 表 九 所 示, 觀 察 三 種 不 同 分 子 量 之 幾 丁 聚 醣 ( 及 kda) 奈 米 顆 粒 有 未 包 覆 及 包 覆 ISPH 對 顆 粒 之 表 面 電 荷 影 響, 得 知 CS-TPP 及 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 表 面 電 荷 均 為 帶 正 電, 且 包 覆 ISPH 後, 其 表 面 電 位 並 無 明 顯 改 變, 表 面 電 位 介 於 +41.9~+44.2 mv 之 間, 是 為 幾 丁 聚 醣 鏈 上 尚 有 許 多 游 離 之 胺 基 並 未 被 ISPH 鍵 結 之 故 Wu (2005) 指 出 隨 著 幾 丁 聚 醣 分 子 量 的 增 加, 顆 粒 表 面 電 位 差 異 不 大, 且 其 表 面 電 位 亦 介 於 +45 mv 左 右 ( 三 )CS/TPP 重 量 比 之 影 響 Liu 與 Gao(2009) 研 究 指 出 以 不 同 濃 度 (1~4 mg/ml) 之 幾 丁 聚 醣 (Mw 650 kda) 對 不 同 濃 度 (0.25~2.5 mg/ml) 之 TPP 製 備 CS-TPP 奈 米 顆 粒 時, 當 幾 丁 聚 醣 濃 度 為 2mg/mL,TPP 濃 度 為 2.5 mg/ml 時 ( 即 本 實 驗 條 件 CS/TPP 重 量 為 2/1), 所 製 備 出 之 CS-TPP 奈 米 顆 粒 會 產 生 絮 集 現 象, 為 了 避 免 此 現 象 發 生, 故 本 試 驗 僅 使 用 低 分 子 量 幾 丁 聚 醣 (Mw kda) 來 做 試 驗 本 試 驗 使 用 5mL 相 同 濃 度 (2 mg/ml) 之 低 分 子 量 CS 溶 液 (Mw kda) 對 2mL 不 同 濃 度 (0.84~2.5 mg/ml) 之 TPP 溶 液 製 備 CS-TPP 奈 米 顆 粒, 並 包 覆 1mL 相 同 濃 度 (5mg/mL) 之 ISPH 溶 液, 探 討 不 同 CS/TPP 重 量 比 (6/1 5/1 4/1 3/1 及 2/1) 對 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 特 性 之 影 響 1. 包 覆 率 裝 載 率 及 產 率 之 影 響 82

96 表 九 幾 丁 聚 醣 分 子 量 對 CS-TPP 及 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 表 面 電 位 之 影 響 Table 9. Effect of chitosan molecular weight on the zeta potential of CS-TPP and CS-ISPH-TPP nanoparticles. Type of nanoparticle CS MW(kDa) Unloaded ISPH-loaded ζpotential(mv) ±2.4 Aa +44.2±3.3 Aa ±0.9 Aa +42.4±3.2 Aa ±4.5 Aa +43.7±2.0 Aa (CS/TPP mass ratio: 6/1;ISPH concentration:5mg/ml). *A mean in the same column (CS MW) with different superscripts are significantly different(p < 0.05). *a mean in the same column (type of nanoparticle) with different superscripts are significantly different(p < 0.05). 83

97 如 表 十 所 示, 利 用 低 分 子 量 之 幾 丁 聚 醣 (131.1 kda) 來 製 備 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒, 發 現 以 CS/TPP 重 量 比 為 3/1 及 4/1 可 獲 得 較 高 之 包 覆 率, 分 別 為 64.61% 及 64.93%, 此 為 較 低 之 CS/TPP 重 量 比 ( 即 TPP 含 量 較 多 ), 幾 丁 聚 醣 其 結 構 上 的 胺 基 與 TPP 產 生 離 子 交 聯 程 度 及 機 會 增 加, 因 此 能 形 成 較 多 的 網 狀 結 構 來 包 覆 ISPH, 使 包 覆 率 提 升 ; 而 CS/TPP 重 量 比 為 5/1 及 6/1 時 幾 丁 聚 醣 與 TPP 之 離 子 反 應 結 合 不 如 CS/TPP 重 量 比 3/1 及 4/1 緊 密, 對 ISPH 捕 捉 能 力 有 限, 故 包 覆 率 明 顯 低 於 CS/TPP 重 量 比 為 3/1 及 4/1 組 別 ; 而 CS/TPP 重 量 比 為 2/1 時, 其 包 覆 率 亦 明 顯 低 於 CS/TPP 重 量 比 為 3/1 及 4/1 之 組 別, 此 為 過 多 之 + TPP 會 使 得 幾 丁 聚 醣 的 胺 基 傾 向 TPP 鍵 結, 一 方 面 NH 3 量 減 少, 一 方 面 形 成 更 緊 密 之 CS-TPP 鍵 結, 使 得 奈 米 顆 粒 對 ISPH 容 納 量 減 少, 因 此 造 成 ISPH 包 覆 率 下 降 在 裝 載 率 方 面, 如 表 十 所 示, 發 現 CS/TPP 重 量 比 愈 低 (6/1~2/1) 其 裝 載 率 愈 低 (9.60%~3.22%), 當 CS/TPP 重 量 比 為 2/1 時, 其 裝 載 率 只 有 3.22%, 此 由 於 CS/TPP 重 量 比 的 減 少 ( 即 TPP 含 量 增 加 ), 會 使 + 得 幾 丁 聚 醣 的 胺 基 傾 向 TPP 鍵 結, 一 方 面 NH 3 量 減 少, 一 方 面 形 成 更 緊 密 之 CS-TPP 鍵 結, 使 得 奈 米 顆 粒 對 ISPH 容 納 量 減 少,ISPH 被 包 覆 進 奈 米 顆 粒 的 量 少, 裝 載 率 就 低 在 產 率 方 面, 如 表 十 所 示, 發 現 CS/TPP 重 量 比 愈 低 ( 即 TPP 含 量 較 多 ) 其 產 率 愈 高,CS/TPP 重 量 比 為 2/1 時, 其 產 率 可 達 46%, 這 是 因 為 TPP 含 量 愈 多, 其 與 幾 丁 聚 醣 產 生 交 聯 之 機 會 愈 多, 所 形 成 的 CS-TPP 及 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 量 就 愈 多 Grenha 等 人 (2005) 比 較 CS/TPP 重 量 比 6/1~3.6/1 對 產 率 之 影 響,CS/TPP 重 量 比 愈 低, 幾 丁 聚 醣 與 TPP 鍵 結 愈 多, 其 產 率 愈 高 (12~60%), 此 結 果 與 本 研 究 相 似 84

98 表 十 CS/TPP 重 量 比 對 包 覆 率 裝 載 率 及 產 率 之 影 響 Table 10. Effect of CS/TPP mass ratio on the encapsulation efficiency, loading capacity and process yield. CS/TPP mass ratio Encapsulation efficiency% Loading capacity% Process yield% 2/ ±2.14 B 3.22±0.06 C 46.00±2.00 A 3/ ±3.26 A 5.60±0.45 B 37.26±3.19 B 4/ ±2.01 A 6.00±0.18 B 36.76±1.75 B 5/ ±2.14 B 5.57±0.13 B 31.85±0.47 C 6/ ±3.96 B 9.60±0.40 A 27.58±0.00 D (CS molecular weight:131.1kda ;ISPH concentration:5mg/ml). *A-D mean in the same column(cs/tpp mass ratio)with different superscripts are significantly different(p < 0.05). 85

99 2. 粒 徑 之 影 響 如 圖 十 六 所 示, 奈 米 顆 粒 之 粒 徑 會 受 到 CS/TPP 重 量 比 影 響 而 改 變, 當 幾 丁 聚 醣 分 子 量 固 定 為 131.1kDa,CS/TPP 重 量 比 由 6/1 減 少 至 4/1 時, 顆 粒 粒 徑 會 隨 之 增 加, 推 測 此 為 TPP 含 量 增 加, 幾 丁 聚 醣 的 胺 基 與 TPP 產 生 鍵 結 機 會 變 多, 能 形 成 更 多 的 網 狀 結 構, 因 此 粒 徑 隨 之 增 加 ; 而 當 CS/TPP 之 重 量 比 由 4/1 減 少 至 2/1 時, 其 粒 徑 則 呈 現 變 小 的 趨 勢, 是 由 於 TPP 含 量 增 加 幾 丁 聚 醣 鏈 上 的 胺 基 幾 乎 都 鍵 結 上 TPP, 因 此 幾 丁 聚 醣 鏈 與 鏈 之 間 的 斥 力 減 低, 立 體 空 間 障 礙 便 少, 因 此 粒 徑 變 小 另 外, 有 包 覆 ISPH 組 別 之 粒 徑 皆 大 於 未 包 覆 組 別, 此 為 ISPH 被 鍵 結 或 包 覆 進 幾 丁 聚 醣 -TPP 奈 米 顆 粒 中 之 故 Grenha 等 人 (2005) 指 出 當 CS/TPP 重 量 比 由 3.6/1 增 加 至 6/1 製 備 奈 米 顆 粒 時, 其 粒 徑 隨 之 增 加 (300~390 nm), 其 認 為 是 由 於 幾 丁 聚 醣 與 TPP 之 間 鍵 結 增 加 之 故 ; 而 其 以 CS/TPP 重 量 比 6/1 及 5/1 來 包 覆 有 胰 島 素 時, 包 覆 有 胰 島 素 組 別 之 粒 徑 皆 大 於 未 包 覆 組 別, 是 由 於 胰 島 素 被 包 覆 到 其 結 構 中 所 致 Gan(2005) 使 用 三 種 不 同 分 子 量 之 幾 丁 聚 醣 對 不 同 比 例 之 TPP 製 備 奈 米 顆 粒 (CS/TPP 重 量 比 為 3/1~7/1), 其 指 出 奈 米 顆 粒 粒 徑 會 隨 著 幾 丁 聚 醣 分 子 量 增 加 及 CS/TPP 重 量 提 高 而 跟 著 增 加 (100~250 nm) Liu 與 Gao(2008) 指 出 提 高 濃 度 之 TPP 製 備 奈 米 顆 粒 時 可 得 到 較 小 之 粒 徑 ( 約 210 nm), 包 覆 有 ciprofloxacin (CH) 組 別 之 粒 徑 皆 大 於 未 包 覆 組 別 本 文 結 果 與 文 獻 之 結 果 略 有 差 異, 本 文 認 為 當 TPP 含 量 增 加 會 使 幾 丁 聚 醣 之 網 狀 結 構 變 多, 同 時 導 致 顆 粒 粒 徑 增 加, 故 在 增 加 CS/TPP 重 量 比 (5/1 及 6/1) 亦 有 可 能 使 顆 粒 粒 徑 變 小 86

100 Particle size(nm) Db Ea Bb Ba Ab Aa Ba Ca Unloaded ISPH-loaded Cb Da :1 3:1 4:1 5:1 6:1 CS/TPP mass ratio 圖 十 六 CS/TPP 重 量 比 對 CS-TPP 及 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 粒 徑 之 影 響 Figure 16. Effect of CS/TPP mass ratio on the particle size of CS-TPP and CS-ISPH-TPP nanoparticles. ( CS molecular weight : 131.1kDa;ISPH concentration:5mg/ml). * A-E mean in the same bar ( CS/TPP mass ratio ) with different superscripts are significantly different(p < 0.05). * a-b mean in the same bar ( type of nanoparticle ) with different superscripts are significantly different(p < 0.05). 87

101 3. 表 面 電 位 之 影 響 如 表 十 一 所 示, 不 同 CS/TPP 重 量 比 對 未 包 覆 及 有 包 覆 ISPH 奈 米 顆 粒 之 表 面 電 位 的 影 響, 當 CS/TPP 重 量 比 由 6/1 減 少 至 3/1 時, 其 表 面 電 位 雖 有 些 許 差 異, 但 顆 粒 表 面 皆 帶 有 高 度 之 正 電 荷 ( 未 包 覆 42.6~46.7 mv; 有 包 覆 43.7~47.6 mv) 研 究 發 現, 當 CS/TPP 重 量 比 減 少 至 2/1 時, 未 包 覆 及 有 包 覆 ISPH 組 別 其 顆 粒 表 面 電 位 均 出 現 驟 降 之 情 形 ( 未 包 覆 組 : 由 46.7 mv 減 至 26.6 mv; 包 覆 ISPH 組 別 : 由 mv 減 至 mv), 此 由 於 CS/TPP 重 量 比 減 少 至 2/1 時,TPP 含 量 大 幅 增 加, 因 此 TPP 易 與 幾 丁 聚 醣 鏈 上 的 胺 基 產 生 鍵 結, 使 得 幾 丁 聚 + 醣 之 NH 3 部 位 變 少, 表 面 電 位 降 低 許 多 文 獻 皆 指 出 CS-TPP 奈 米 顆 粒 之 表 面 電 位 會 受 到 TPP 的 濃 度 及 包 覆 物 質 濃 度 等 因 素 影 響 而 降 低 Grenha 等 人 (2005) 指 出 當 CS/TPP 重 量 比 由 6/1 減 低 至 3.6/1 製 備 奈 米 顆 粒 時, 其 表 面 電 位 會 由 +45 mv 減 至 +34 mv; 當 CS-TPP 奈 米 顆 粒 包 覆 胰 島 素 後 其 表 面 電 位 跟 著 會 降 低, 其 表 面 電 位 亦 會 降 低 Gan(2005) 指 出 當 CS/TPP 重 量 比 由 7/1 減 至 3/1 時, 其 表 面 電 位 跟 著 遞 減 ( 約 +45 mv 減 至 +30 mv) Liu 與 Gao(2009) 亦 指 出 隨 著 TPP 濃 度 的 增 加 (0.75~1.75 mg/ml), 其 奈 米 顆 粒 表 面 電 位 皆 有 有 隨 之 下 降 之 趨 勢 ( 約 +45 mv 減 至 +32 mv) 許 多 文 獻 指 出 因 幾 丁 聚 醣 具 有 高 度 正 電 荷, 故 其 擁 有 良 好 黏 膜 黏 著 性 (mucoadhesive)(lehr et al., 1992; Needleman and Smales,1995; Rillosi and Buckton, 1995; He et al., 1998;Shimoda et al., 2001; Kockisch et al., 2003);Dodane 等 人 (1999) 也 指 出 幾 丁 聚 醣 具 有 調 控 腸 道 上 皮 細 胞 之 緊 密 連 接 (tight junction) 開 合 是 因 為 幾 丁 聚 醣 帶 有 正 電 荷, 但 本 實 驗 發 現 當 CS/TPP 重 量 比 減 少 至 2/1 時, 未 包 覆 及 有 包 覆 組 別 之 顆 88

102 粒 表 面 電 位 均 會 出 現 驟 降 之 情 形, 恐 影 響 幾 丁 聚 醣 之 生 物 特 性 ( 如 生 物 黏 著 性 ) 及 其 對 腸 道 上 皮 細 胞 之 緊 密 連 接 調 控 之 能 力, 故 本 文 認 為 在 製 備 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 時 CS/TPP 重 量 不 宜 低 於 3/1 89

103 表 十 一 CS/TPP 重 量 比 對 CS-TPP 及 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 表 面 電 位 之 影 響 Table 11. Zeta potential of CS-TPP and CS-ISPH-TPP nanoparticles prepared with different CS/TPP mass ratio. Type of nanoparticle CS/TPP mass ratio Unloaded ζpotential(mv) ISPH-loaded 2/ ±2.3 Cb +24.0±1.4 Da 3/ ±1.3 ABa +44.8±1.6 BCa 4/ ±1.4 Aa +47.6±1.4 Aa 5/ ±1.4 ABb +46.4±2.0 ABa 6/ ±4.5 Ba +43.7±2.0 Ca (CS molecular weight:131.1kda ;ISPH concentration:5mg/ml). *A-D mean in the same column(cs/tpp mass ratio)with different superscripts are significantly different(p < 0.05). *a-b mean in the same column(type of nanoparticle)with different superscripts are significantly different(p < 0.05). 90

104 三 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 於 胃 腸 液 中 之 安 定 性 之 影 響 因 子 Berger (2004) 所 指 出, 當 幾 丁 聚 醣 在 中 性 環 境 ( 其 ph~=6.0) + 時, 其 利 用 帶 正 電 荷 NH 3 與 帶 負 電 之 加 入 物 質 ( 如 TPP 之 P0 4 -) 產 生 良 好 的 離 子 交 聯 鍵 結 (crosslinking), 使 其 聯 結 構 造 緊 密 且 完 整 當 降 低 環 境 之 ph 值 ( 酸 性 下 ), 幾 丁 聚 醣 上 更 多 的 NH 2 被 質 子 化 變 為 NH 3 +, 形 成 高 度 帶 正 電 之 分 子 鏈, 使 幾 丁 聚 醣 鏈 與 鏈 之 間 產 生 排 斥 作 用, 而 不 利 於 帶 負 電 之 物 質 將 幾 丁 聚 醣 鏈 進 行 聯 結 作 用, 如 此, 其 聯 結 構 造 會 鬆 散 當 環 境 ph 值 偏 鹼 性 (ph>7) 時, 幾 丁 聚 醣 之 NH 3 + 變 為 NH 2 (pka~6.3), 而 降 低 與 帶 負 電 荷 物 質 作 用, 亦 其 聯 結 構 造 鬆 散 如 此, 於 酸 性 或 鹼 性 下 均 造 成 幾 丁 聚 醣 間 之 聯 結 作 用 不 穩 固 而 影 響 其 包 覆 作 用 ( 見 圖 十 七 ) 另 外,Zhang 與 Kosaraju(2007) 指 出 當 環 境 中 ph 太 高 或 太 低, 都 會 造 成 幾 丁 聚 醣 與 TPP 之 間 離 子 交 聯 鍵 結 特 性 改 變, 導 致 奈 米 顆 粒 奈 米 顆 粒 不 安 定 或 瓦 解, 因 此 本 文 分 別 探 討 了 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 在 模 擬 胃 液 (ph 1.2) 及 腸 液 (ph7.4) 下 之 安 定 性 ( 一 )CS/TPP 重 量 比 之 影 響 本 試 驗 使 用 低 分 子 量 幾 丁 聚 醣 (Mw kda), 固 定 ISPH 濃 度 為 5mg/mL, 探 討 不 同 CS/TPP 重 量 比 (6/1 5/1 4/1 3/1 及 2/1) 對 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 安 定 性 之 影 響 於 試 驗 中,ISPH 若 能 被 穩 定 的 包 覆 在 奈 米 顆 粒 中, 其 於 胃 腸 液 中 之 時 間 累 積 釋 放 量 (Cumulative release,cr) 愈 低, 則 表 示 其 安 定 性 愈 佳 1. 模 擬 胃 液 中 (ph 1.2) 之 安 定 性 91

105 圖 十 七 不 同 ph 值 下 幾 丁 聚 醣 與 帶 負 電 聚 合 物 之 鍵 結 及 澎 潤 情 形 Figure 17. Structure and ph-sensitive swelling of a polyelectrolyte complex containing chitosan;, negative charge of the additional polymer; +, positive charge of chitosan;. (Berger et al., 2004) 92

106 如 圖 十 八 a,cs-isph-tpp 奈 米 顆 粒 置 於 ph 1.2 緩 衝 溶 液 下 2 小 時, 測 定 時 間 累 積 ISPH 之 釋 放 率 發 現 當 幾 丁 聚 醣 分 子 量 固 定,CS/TPP 重 量 比 由 6/1 減 少 至 2/1 時, 時 間 累 積 ISPH 之 釋 放 率 隨 之 降 低, 表 示 從 顆 粒 中 釋 放 出 ISPH 減 少, 奈 米 顆 粒 之 安 定 性 增 加 此 由 於 CS/TPP 重 量 比 減 少 (TPP 含 量 增 加 ) 時, 幾 丁 聚 醣 之 胺 基 (NH 3+ ) 與 TPP 之 - P0 4 結 合 良 好, 所 形 成 的 網 狀 鍵 結 更 緊 密, 使 得 ISPH 不 易 被 釋 放 2. 模 擬 腸 液 中 (ph 7.4) 之 安 定 性 如 圖 十 八 b,cs-isph-tpp 奈 米 顆 粒 置 於 ph 7.4 緩 衝 溶 液 下 6 小 時 內, 測 試 其 時 間 累 積 釋 放 率 發 現 時 間 累 積 ISPH 之 釋 放 率 與 在 酸 性 環 境 下 有 相 似 情 形 當 幾 丁 聚 醣 分 子 量 固 定,CS/TPP 重 量 比 由 6/1 減 少 至 2/1 時, 其 奈 米 顆 粒 之 ISPH 釋 放 率 隨 之 減 少, 表 示 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 之 安 定 性 增 加, 此 原 因 與 上 述 相 同 Carmen(1997) 以 幾 丁 聚 醣 -TPP 製 備 薄 膜, 包 覆 cholrpheniramine maleate 和 guaifenesin 時, 指 出 增 加 TPP 濃 度 可 有 效 降 低 藥 物 釋 放 量 Ko 等 人 (2002) 亦 指 出 當 提 升 TPP 濃 度 可 有 較 降 低 felodipine 釋 放 量 由 本 實 驗 結 果 得 知,CS/TPP 重 量 比 為 2/1 時,CS -ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 具 極 佳 的 安 定 性, 於 ph 1.2 下 2 小 時 及 ph 7.4 下 6 小 時,ISPH 之 時 間 累 積 釋 放 率 分 別 為 35% 及 17% 但 此 CS/TPP 重 量 比 會 造 成 顆 粒 之 表 面 電 位 呈 現 驟 降 之 情 況 ( 表 十 ), 而 影 響 其 奈 米 顆 粒 在 腸 內 之 吸 收 許 多 文 獻 (Lehr et al., 1992; Needleman and Smales,1995; Rillosi and Buckton, 1995; He et al., 1998; Dodane et al., 1999;Shimoda et al., 2001; Kockisch et al., 2003) 指 出 幾 丁 聚 醣 奈 米 顆 粒 表 面 之 正 電 荷 較 多 時, 有 利 於 顆 粒 與 帶 負 電 之 腸 道 上 皮 細 胞 膜 做 結 合, 可 增 加 顆 粒 在 腸 道 之 滯 留 時 間, 增 加 物 質 之 吸 收, 亦 有 利 於 打 開 腸 膜 上 皮 細 胞 之 緊 密 連 接, 93

107 (a)in the ph 1.2 buffer Cumulative release ( CR,%) :1 3:1 4:1 5:1 6: Time (hr) (b)in the ph 7.4 buffer 80 2:1 3:1 4:1 5:1 6:1 Cumulative release ( CR,%) Time (hours) 圖 十 八 CS/TPP 重 量 比 對 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 在 模 擬 胃 液 中 (ph 1.2 buffer)(a) 及 模 擬 腸 液 中 (ph 7.4 buffer)(b) 之 安 定 性 影 響 Figure 18. Effect of CS/TPP mass ratio on the stability of CS-ISPH-TPP nanoparticles in the ph 1.2 buffer(a)and ph 7.4 buffer(b). ( CS molecular weight 131.1kDa ; ISPH concentration : 5mg/mL). 94

108 讓 物 質 易 進 入 血 液 內 ( 二 ) 幾 丁 聚 醣 分 子 量 之 影 響 依 前 述 結 果, 後 續 實 驗 將 選 擇 CS/TPP 重 量 比 3/1 作 為 最 佳 比 例, 因 此 本 實 驗 固 定 ISPH 濃 度 為 5mg/mL,CS/TPP 重 量 比 為 3/1, 探 討 不 同 分 子 量 ( 及 kda) 之 幾 丁 聚 醣 對 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 於 模 擬 胃 液 (ph 1.2) 及 腸 液 (ph7.4) 中 安 定 性 之 影 響 1. 模 擬 胃 液 中 (ph 1.2) 之 安 定 性 如 圖 十 九 a 所 示, 不 同 分 子 量 之 幾 丁 聚 醣 對 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 於 模 擬 胃 液 (ph 1.2) 在 2 小 時 內 安 定 性 之 影 響 幾 丁 聚 醣 之 分 子 量 為 及 kda, 其 時 間 累 積 之 ISPH 釋 放 率 分 別 為 及 40% 此 表 示 隨 著 CS 分 子 量 之 增 加, 奈 米 顆 粒 更 為 安 定 此 應 由 於 低 分 子 量 之 幾 丁 聚 醣 在 溶 液 中 溶 解 性 較 高, 其 溶 液 黏 度 較 低, 且 鏈 子 短, 鏈 子 間 之 排 斥 力 較 大 使 其 聯 結 構 造 (CS-TPP) 較 不 穩 固, 釋 放 ISPH 較 多 ; 而 高 分 子 量 者 之 鏈 子 較 長, 其 溶 液 黏 度 亦 較 高, 因 而 鏈 子 間 排 斥 力 有 某 程 度 受 阻, 使 其 聯 結 構 造 較 安 定 2. 模 擬 腸 液 中 (ph 7.4) 之 安 定 性 如 圖 十 九 b 所 示, 不 同 分 子 量 之 幾 丁 聚 醣 對 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 於 模 擬 腸 液 (ph 7.4) 在 6 小 時 內 安 定 性 之 情 形 結 果 與 上 述 有 類 似 之 情 形, 及 CS 分 子 量 較 高, 其 奈 米 顆 粒 安 定 性 較 佳 幾 丁 聚 醣 之 分 子 量 為 及 kda, 在 6 小 時, 時 間 累 積 之 ISPH 釋 放 率 分 別 為 及 45% 此 由 於 高 分 子 量 幾 丁 聚 醣 之 鏈 子 較 長, 其 溶 液 較 黏, 有 助 於 包 覆 ISPH 作 用 之 關 係 Xu 和 Du(2003) 指 出 幾 丁 聚 醣 分 子 量 增 加 95

109 (80~210 kda),bsa 在 ph 7.4 之 phosphate buffer saline(pbs) 釋 放 率 由 73.9 減 至 17.6%, 分 子 量 高 釋 放 速 率 愈 低 Gan 及 Wang(2007) 比 較 三 種 不 同 分 子 量 幾 丁 聚 醣 (HMW MMW 及 LMW) 包 覆 BSA 後, 置 於 ph 7.4 之 PBS 中 6 小 時, 其 指 出 BSA 之 釋 放 會 隨 著 CS 分 子 量 的 增 加 而 降 低 ;Yang 等 人 (2009) 以 不 同 分 子 量 幾 丁 聚 醣 ( 及 55 kda) 來 包 覆 fluorouracil(5-fu), 其 也 有 相 同 的 指 出,5-FU 之 釋 放 會 隨 著 CS 分 子 量 的 增 加 而 降 低 96

110 (a)in the ph 1.2 buffer 45 Cumulative release ( CR,%) HMW(475.5 kda) MMW(231.5 kda) LMW(131.1 kda) Time (hours) (b)in the ph 7.4 buffer Cumulative release ( CR,%) HMW(475.5 kda) MMW(231.5 kda) LMW(131.1 kda) Time (hours) 圖 十 九 幾 丁 聚 醣 分 子 量 對 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 在 模 擬 胃 液 中 (ph 1.2 buffer)(a) 及 模 擬 腸 液 中 (ph 7.4 buffer)(b) 之 安 定 性 影 響 Figure 19. Effect of chitosan molecular weight on the stability of CS-ISPH-TPP nanoparticles in the ph 1.2 buffer(a)and ph 7.4 buffer(b).(cs/tpp mass ratio: 3/1;ISPH concentration: 5mg/mL). 97

111 四 於 胃 腸 液 最 為 安 定 之 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 之 製 備 及 其 特 性 依 前 述 研 究 結 果 顯 示, 以 高 分 子 量 之 幾 丁 聚 醣 製 備 之 CS-ISPH -TPP 奈 米 顆 粒 安 定 性 最 佳, 因 此 本 試 驗 以 分 子 量 為 kda 之 幾 丁 聚 醣,ISPH 濃 度 5mg/,mL 及 CS/TPP 重 量 比 為 3/1 來 製 備 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 後, 分 析 其 對 ISPH 之 包 覆 率 裝 載 率 及 產 率 粒 徑 大 小 及 表 面 電 位 ( 一 ) 包 覆 率 裝 載 率 及 產 率 之 分 析 當 固 定 幾 丁 聚 醣 三 聚 磷 酸 鈉 重 量 比 為 3/1 時, 高 分 子 量 之 幾 丁 聚 醣 對 ISPH 包 覆 率 約 為 69%, 裝 載 率 約 為 5%,CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 產 率 約 為 43%( 表 十 二 ) 幾 丁 聚 醣 分 子 量 愈 高 其 鏈 上 胺 基 愈 多, 能 與 TPP 形 成 交 聯 位 置 愈 多, 對 ISPH 有 良 好 之 捕 捉 能 力 ( 二 ) 粒 徑 分 析 固 定 CS/TPP 重 量 比 為 3/1 時, 以 高 分 子 量 之 幾 丁 聚 醣 製 備 CS-TPP 及 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒, 利 用 粒 徑 分 析 儀 (Zetasizer 3000HS) 測 定 奈 米 顆 粒 在 水 相 中 之 粒 徑 大 小, 其 粒 徑 分 別 為 402 及 446 nm, 包 覆 有 ISPH 組 別 之 粒 徑 顯 著 大 於 未 包 覆 組 別 ( 表 十 三 ), 此 結 果 皆 與 前 述 相 同, 幾 丁 聚 醣 分 子 量 愈 大, 其 鏈 愈 長, 因 此 鏈 與 鏈 之 立 體 空 間 障 礙 大, 所 以 奈 米 顆 粒 粒 徑 就 較 大 ; 而 ISPH 被 鍵 結 或 包 覆 進 CS-TPP 奈 米 顆 粒 時 會 導 致 顆 粒 粒 徑 增 加 98

112 表 十 二 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 之 包 覆 率 裝 載 率 及 產 率 分 析 Table 12. The encapsulation efficiency, loading capacity and process yield of CS-ISPH-TPP nanoparticles. CS MW(kDa) Encapsulation efficiency % Loading capacity % Process yield% ± ± ±2.58 (CS molecular weight: 475.5kDa;CS/TPP mass ratio: 3/1;ISPH concentration:5mg/ml). 99

113 ( 三 ) 表 面 電 位 固 定 幾 丁 聚 醣 三 聚 磷 酸 鈉 重 量 比 為 3/1 時, 以 高 分 子 量 之 幾 丁 聚 醣 製 備 之 CS-TPP 及 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 表 面 均 為 帶 正 電, 而 包 覆 ISPH 組 別 其 表 面 電 荷 比 未 包 覆 者 低 ( 表 十 三 ), 推 測 可 能 是 幾 丁 聚 醣 分 子 量 愈 高 能 與 TPP 形 成 之 鍵 結 愈 多 也 可 容 納 較 多 之 ISPH, 因 此 表 面 電 位 較 低 ( 四 ) 以 SDS-PAGE 評 估 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 經 過 模 擬 胃 腸 道 消 化 試 驗 後 ISPH 分 子 量 之 變 化 將 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 分 別 經 由 三 種 處 理 :1) 放 入 蒸 餾 水 ; 2) 放 入 ph 2.0 緩 衝 溶 液, 於 37 下 震 盪 4 小 時 ;3) 將 顆 粒 經 ph 2.0 緩 衝 溶 液 處 理 4 小 時 後, 再 調 整 溶 液 之 ph 至 7.0, 於 37 下 再 震 盪 4 小 時 處 理 後 離 心 (10,000 g,10min), 取 其 上 層 液 與 沉 澱 奈 米 顆 粒 以 SDS-PAGE ( sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) 鑑 定 ISPH 之 存 在, 以 確 定 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 之 安 定 性 圖 二 十 顯 示, 以 SDS-PAGE 分 析 ISPH 之 分 子 量 ( 溶 於 蒸 餾 水 ), 得 知 ISPH 平 均 分 子 量 分 布 在 10~ 32kDa 左 右 (A 及 a) CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 於 蒸 餾 水, 其 上 層 液 未 出 現 ISPH bend(b), 但 奈 米 顆 粒 中 ( 沉 澱 物 ) 有 出 現 ISPH bend(b), 這 表 示 ISPH 被 穩 固 地 包 覆 在 奈 米 顆 粒 中, 無 法 釋 放 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 於 ph 2.0 緩 衝 溶 液 處 理 4 小 時 後, 其 上 層 液 出 現 較 小 片 段 之 ISPH bend(c), 這 表 示 由 奈 米 顆 粒 游 離 出 之 少 量 ISPH 因 受 到 酸 性 ph 影 響 而 降 解 ; 但 奈 米 顆 粒 中 仍 有 ISPH bend(c), 此 表 示 存 在 奈 米 顆 粒 中 之 ISPH 可 被 幾 丁 聚 醣 保 護 不 被 降 解 另 外,CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 於 ph 2.0 處 理 4 小 100

114 表 十 三 CS-TPP 及 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 之 粒 徑 及 表 面 電 位 分 析 Table 13. The particle size and zeta potential of CS-TPP and CS-ISPH-TPP nanoparticles. Type of nanoparticle Particle size(nm) Zeta potential(mv) Unloaded ±6.33 B +43.2±2.2 A ISPH-loaded ±9.81 A +39.8±0.7 B (CS molecular weight: 475.5kDa;CS/TPP mass ratio: 3/1;ISPH concentration:5mg/ml). *A-B mean in the same column (Type of nanoparticle) with different superscripts are significantly different(p < 0.05). 101

115 M:Protein markers A,a:ISPH in water B,b:CS-ISPH-TPP in water C,c:CS-ISPH-TPP in ph2.0 buffer for 4hr D,d:CS-ISPH-TPP in ph2.0 for 4hr and followed in ph7.0 buffer for 4hr 圖 二 十 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 於 模 擬 過 胃 腸 液 中 之 SDS-PAGE 電 泳 圖 Figure 20. SDS-PAGE profile of the stability of CS-ISPH-TPP nanoparticles in the ph 2.0 buffer and follow ph 7.0 buffer. (CS molecular weight:475.5kda ;ISPH concentration: 5mg/mL;CS/TPP mass ratio: 3/1). 102

116 時 後 繼 續 於 ph 7.0 處 理 4 小 時 後, 其 上 層 液 一 樣 出 現 較 小 片 段 之 ISPH bend(d), 而 奈 米 顆 粒 中 仍 有 ISPH bend(d), 這 表 示 由 奈 米 顆 粒 中 游 離 出 之 ISPH 會 受 到 酸 性 及 鹼 性 ph 影 響 而 降 解, 而 存 在 奈 米 顆 粒 中 之 ISPH 可 被 幾 丁 聚 醣 保 護 不 被 降 解 以 上 結 果 顯 示 以 CS Mw 475.5kDa,CS/TPP 重 量 比 3/1 及 ISPH 濃 度 5mg/mL 下 製 備 之 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 確 實 可 保 護 ISPH 不 受 環 境 ph 影 響, 維 持 其 安 定 性, 與 前 述 相 符 103

117 五 掃 描 式 電 子 顯 微 鏡 (SEM) 觀 察 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 外 觀 型 態 如 圖 二 十 一 為 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 之 SEM 圖 在 SEM 圖 中 可 見 奈 米 顆 粒 之 粒 徑 均 小 於 100 nm, 並 且 顆 粒 呈 現 球 型 此 結 果 與 以 粒 徑 分 析 儀 (Zetasizer 3000 HS) 所 測 定 出 之 奈 米 顆 粒 粒 徑 還 要 小, 原 因 是 該 樣 品 有 經 乾 燥 再 以 SEM 照 相 所 致 文 獻 指 出 外 型 成 球 型 之 物 質 通 透 細 胞 膜 較 容 易 且 速 度 較 快 ( 陳,2004), 而 幾 丁 聚 醣 分 子 量 愈 低, 製 備 出 之 奈 米 顆 粒 粒 徑 愈 小, 其 在 腸 胃 道 中 排 空 時 間 延 長, 可 提 高 其 與 腸 道 上 皮 細 胞 的 接 觸 機 會 或 直 接 被 細 胞 吸 收, 因 此 可 增 加 營 養 物 質 之 吸 收 與 利 用, 提 升 營 養 物 質 生 體 利 用 率 (Chen et al., 2006b; Chau et al.,2007) Acosta(2009) 也 指 出 利 用 奈 米 顆 粒 來 傳 遞 營 養 及 保 健 食 品 時, 顆 粒 粒 徑 小 於 500 nm 可 提 高 物 質 之 吸 收 率 及 攝 入 量 ; 當 顆 粒 小 於 100 nm 則 可 顯 著 地 增 加 物 質 之 生 體 利 用 率 因 此 本 試 驗 所 製 備 之 奈 米 顆 粒 具 有 提 高 ISPH 在 腸 道 之 吸 收 及 生 體 利 用 率 104

118 A B 圖二十一 CS-ISPH-TPP 奈米顆粒之掃瞄式電子顯微鏡 SEM 觀察 Figure 21. SEM of CS-ISPH-TPP nanoparticles. A 60,000 and B 90,000 CS Mw: kda; CS/TPP mass ratio: 3/1 ISPH concentration 5mg/mL. 105

119 六 傅 立 葉 轉 換 紅 外 線 光 譜 儀 (FTIR) 分 析 CS ISPH 及 TPP 之 鍵 結 情 形 本 實 驗 之 構 想 為 CS-TPP 奈 米 顆 粒 構 造 內 由 幾 丁 聚 醣 結 構 上 的 胺 基 (-NH ) 與 TPP 離 子 (-P 3 O 10 及 -HP 3 O 4-10 ) 形 成 離 子 交 聯 反 應, 可 形 成 的 ; 而 CS -ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 方 面, 由 幾 丁 聚 醣 包 覆 ISPH 的 機 制 有 兩 種 : 一 是 透 過 離 子 鍵 結 方 式, 利 用 幾 丁 聚 醣 鏈 上 帶 正 電 之 胺 基 與 蛋 白 質 上 之 羧 基 (-COO - ) 進 行 鍵 結 ; 其 二 是 透 過 幾 丁 聚 醣 與 TPP 能 形 成 網 狀 結 構 之 特 性, 將 ISPH 以 物 理 包 覆 方 式 包 覆 在 其 結 構 中, 我 們 希 望 藉 由 FTIR 光 譜 圖 進 一 步 來 了 解 CS-TPP 及 CS -ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 之 化 學 結 構 特 性 圖 二 十 二 表 示 幾 丁 聚 醣 ISPH CS-TPP 奈 米 顆 粒 及 CS -ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 之 FTIR 光 譜 圖,(a) 為 幾 丁 聚 醣 特 徵 吸 收 波 峰 圖, 在 3425 cm -1 出 現 為 幾 丁 聚 醣 -NH 2 與 -OH 基 之 伸 縮 振 動 (Yu et al.,1999; Wang et al., 2004),1683 cm -1 為 carbonyl ( ) 之 伸 縮 振 動 (amide I band),1558 cm -1 為 胺 基 (-NH 2 ) 之 彎 曲 振 動 (amide II band)(arof et al., 2003; Salokhe et al., 2005;Boonsongrit et al., 2008), 而 1074 cm -1 出 現 之 吸 收 坡 峰 為 saccharine(c-o-c) 的 結 構 (Qi et al., 2004; Wu et al., 2005) ISPH(b) 在 1652 cm -1 出 現 carbonyl 之 伸 縮 振 動, 1530 cm -1 出 現 -NH 2 之 彎 曲 振 動, 在 3377 cm -1 出 現 -NH 2 與 -OH 基 伸 縮 張 振 動 幾 丁 聚 醣 -TPP 奈 米 顆 粒 (c), 原 先 在 3425 cm -1 波 峰 往 前 移 至 3406 cm -1, 且 波 峰 變 寬, 此 可 能 為 幾 丁 聚 醣 與 TPP 之 氫 鍵 結 合 提 升 之 故 (Yu et al., 1999), 而 原 先 幾 丁 聚 醣 在 1683 cm -1 及 1558 cm -1 吸 收 波 峰 消 失, 移 至 1639 及 1554 cm -1, 表 示 幾 丁 聚 醣 的 -NH 2 和 carbonyl 與 TPP 產 生 離 子 產 生 交 聯 反 應, 進 而 提 升 了 分 子 間 與 分 子 內 的 作 用 力 所 致 (Knaul et al., 1999;Xu and Du, 2003) 而 CS -ISPH-TPP 106

120 (a) (b) (C) (d) Wavenumber (cm -1 ) 圖 二 十 二 幾 丁 聚 醣 (a) 分 離 大 豆 蛋 白 質 水 解 物 (b) CS-TPP 奈 米 顆 粒 (c) 及 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 (d) 之 FTIR 光 譜 圖 Fig 22. FTIR spectra of CS(a), ISPH(b), CS-TPP nanoparticles(c) and CS-ISPH-TPP nanoparticles(d).(cs Mw: kda; CS/TPP mass ratio: 3/1;ISPH concentration:5mg/ml). 107

121 奈 米 顆 粒 (d), 原 先 幾 丁 聚 醣 在 3425 cm -1 波 峰 也 往 前 移 至 3408 cm -1, 波 峰 也 變 得 更 寬, 其 在 1683 cm -1 及 1558 cm -1 吸 收 波 峰 也 消 失, 位 移 至 1643 及 1548 cm -1, 推 測 幾 丁 聚 醣 的 -NH 2 和 carbonyl 會 與 TPP 及 ISPH 產 生 更 多 鍵 結 之 故 而 比 較 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 與 CS TPP 奈 米 顆 粒 之 波 峰 圖, 發 現 兩 者 十 分 相 似, 推 測 幾 丁 聚 醣 與 ISPH 之 間 交 互 作 用 很 小, 無 化 學 鍵 結 的 反 應 發 生 所 致 Boonsongrit 等 人 (2008) 以 CS TPP 奈 米 顆 粒 來 包 覆 不 同 胰 島 素 時, 也 指 出 相 同 現 象, 幾 丁 聚 醣 與 胰 島 素 交 互 作 用 很 弱 5- 以 上 結 果 與 本 文 推 定 符 合,TPP 離 子 (-P 3 O 10 及 -HP 3 O 4-10 ) 會 與 CS 結 構 上 的 胺 基 (-NH + 3 ) 形 成 離 子 鍵 結 反 應 ; 而 CS 的 胺 基 (-NH + 3 ) 也 會 與 ISPH 之 羧 基 (-COO - ) 進 行 鍵 結 ; 另 外,CS-TPP 會 透 過 其 網 狀 結 構, 以 物 理 性 包 覆 方 式 將 ISPH 包 覆 在 其 結 構 中 ( 無 化 學 鍵 結 之 產 生 ) 108

122 伍 結 論 一 不 同 分 子 量 幾 丁 聚 醣 之 製 備 利 用 纖 維 酵 素 水 解 幾 丁 聚 醣, 可 有 效 製 備 出 低 分 子 量 之 幾 丁 聚 醣 水 解 物 (chitosan hydrolysates,cs) 至 81.6 kda 利 用 此 方 水 解 幾 丁 聚 醣 不 僅 操 作 簡 單 無 化 學 殘 留 及 廢 液 處 理 問 題, 且 對 幾 丁 聚 醣 之 水 解 專 一 性 及 再 現 性 高 二 幾 丁 聚 醣 - 分 離 大 豆 蛋 白 質 水 解 物 - 三 聚 磷 酸 鈉 (CS-ISPH-TPP) 奈 米 顆 粒 之 製 備 及 特 性 之 影 響 因 子 本 試 驗 利 用 ph 4.7 之 幾 丁 聚 醣 (CS) 溶 液 與 ph 9.0 之 三 聚 磷 酸 鈉 (TPP) 溶 液 反 應, 包 覆 分 離 大 豆 蛋 白 質 水 解 物 (ISPH), 並 各 別 比 較 CS 分 子 量 ISPH 添 加 濃 度 及 CS/TPP 重 量 比 對 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 特 性 之 影 響 ( 一 )ISPH 濃 度 之 影 響 使 用 低 分 子 量 幾 丁 聚 醣 (131.1 kda),cs/tpp 重 量 比 6/1 來 包 覆 不 同 濃 度 (1~9 mg/ml) 之 ISPH 時, 當 ISPH 濃 度 增 加 至 大 於 3mg/mL 其 包 覆 率 均 維 持 在 50%, 而 隨 著 ISPH 濃 度 增 加, 裝 載 率 會 隨 之 增 加 (3~12%), 產 率 則 無 明 顯 的 差 異 性 及 趨 勢 ( 平 均 為 27%), CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 之 粒 徑 亦 有 增 加 的 趨 勢, 表 面 電 位 則 無 明 顯 的 改 變 ( 介 於 +42.1~ mv 之 間 ) ( 二 ) 幾 丁 聚 醣 分 子 量 之 影 響 109

123 使 用 不 同 分 子 量 ( 及 kda), 固 定 ISPH 濃 度 為 5mg/mL,CS/TPP 重 量 比 6/1 來 製 備 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 時, 隨 CS 分 子 量 的 增 加, 其 包 覆 率 裝 載 率 及 產 率 皆 無 顯 著 差 異, 而 CS-TPP 及 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 之 粒 徑 則 會 隨 之 增 加, 且 包 覆 有 ISPH 者 粒 徑 皆 大 於 未 包 覆 者, 於 表 面 電 位 方 面 則 無 明 顯 改 變 ( 介 於 +41.9~ +44.2mV) ( 三 )CS/TPP 重 量 比 之 影 響 使 用 低 分 子 量 幾 丁 聚 醣 (131.1 kda), 固 定 ISPH 溶 液 濃 度 為 5mg/mL, 探 討 不 同 CS/TPP 重 量 比 (6/1 5/1 4/1 3/1 及 2/1) 對 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 特 性 之 影 響, 結 果 得 知, 以 CS/TPP 重 量 比 為 3/1 及 4/1 可 獲 得 較 高 之 包 覆 率 (64.61% 及 64.93%),CS/TPP 重 量 比 愈 低 (6/1~2/1) 其 裝 載 率 愈 低 (9.60~3.22%), 產 率 愈 高 (28~46%) 粒 徑 方 面,CS/TPP 重 量 比 由 6/1 減 少 至 4/1 時, 顆 粒 粒 徑 會 隨 之 增 加, 而 CS/TPP 重 量 比 由 4/1 減 少 至 2/1 時, 粒 徑 則 呈 現 變 小 的 趨 勢 CS/TPP 重 量 比 由 6/1 減 少 至 3/1 時, 顆 粒 表 面 皆 帶 有 高 度 之 正 電 荷, 而 CS/TPP 重 量 比 減 少 至 2/1 時, 顆 粒 表 面 電 位 會 出 現 驟 降 之 情 形 ( 未 包 覆 組 : 由 mv 減 至 mv; 包 覆 ISPH 組 別 : 由 mv 減 至 mv) 三 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 於 胃 腸 液 中 之 安 定 性 之 影 響 因 子 ( 一 )CS/TPP 重 量 比 之 影 響 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 於 胃 液 (ph 1.2) 及 腸 液 (ph7.4) 環 境 下, 其 安 定 性 會 隨 CS/TPP 重 量 比 減 少 (6/1~2/1) 而 增 加 110

124 ( 二 ) 幾 丁 聚 醣 分 子 量 之 影 響 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 在 胃 液 (ph 1.2) 及 腸 液 (ph7.4) 環 境 下, 其 安 定 性 會 隨 著 幾 丁 聚 醣 之 分 子 量 的 增 加 (131.1~475.5kDa) 而 增 加 四 於 模 擬 胃 腸 液 最 為 安 定 之 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 之 製 備 及 其 特 性 以 高 分 子 量 之 幾 丁 聚 醣,CS/TPP 重 量 比 3/1,ISPH 濃 度 5mg/mL 所 製 備 之 備 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 安 定 性 最 佳, 而 其 包 覆 率 約 為 69%, 裝 載 率 約 為 5%, 產 率 約 為 43%, 粒 徑 為 446 nm, 顆 粒 表 面 帶 正 電 (+40 mv) 而 以 SDS-PAGE 評 估 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 經 過 模 擬 胃 腸 道 消 化 試 驗 後 ISPH 分 子 量 之 變 化, 可 得 知 以 CS -TPP 包 覆 ISPH 製 備 成 奈 米 顆 粒 確 實 可 保 護 ISPH 不 受 環 境 ph 影 響, 維 持 其 安 定 性 五 掃 描 式 電 子 顯 微 鏡 (SEM) 觀 察 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 外 觀 型 態 以 低 分 子 量 之 CS(Mw kda),cs/tpp 重 量 比 3/1,ISPH 濃 度 5mg/mL 所 製 備 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 以 SEM 觀 察, 可 見 奈 米 顆 粒 之 粒 徑 均 小 於 100 nm, 並 呈 球 型 六 傅 立 葉 轉 換 紅 外 線 光 譜 儀 (FTIR) 分 析 CS ISPH 及 TPP 之 鍵 結 情 形 由 FTIR 分 析 可 得 知 CS 之 胺 基 (-NH 3 + ) 會 與 TPP 之 離 子 (-P 3 O

125 及 -HP 3 O ) 及 ISPH 之 羧 基 (-COO - ) 產 生 鍵 結 反 應 ; 且 CS-TPP 對 ISPH 之 包 覆 屬 於 物 理 性 ( 無 化 學 鍵 結 產 生 ) 七 總 結 以 ph 4.7 之 幾 丁 聚 醣 溶 液 與 ph 9.0 之 TPP 溶 液 混 可 製 備 出 CS -TPP 奈 米 顆 粒, 對 ISPH 具 極 佳 的 包 覆 效 果, 並 可 藉 由 操 控 條 件 調 整 (CS 分 子 量 ISPH 添 加 濃 度 及 CS/TPP 重 量 比 ), 產 生 具 有 高 包 覆 率 裝 載 率 及 產 率 之 CS-ISPH-TPP 奈 米 顆 粒 另 外, 本 試 驗 所 製 備 之 顆 粒 均 屬 奈 米 級, 呈 球 型, 且 顆 粒 表 面 帶 有 高 度 正 電 而 顆 粒 的 組 成 會 影 響 釋 安 定 性, 幾 丁 聚 醣 分 子 量 愈 高,CS/TPP 重 量 比 愈 低, 安 定 性 愈 佳 未 來 可 望 進 一 步 以 動 物 實 驗 或 細 胞 實 驗 來 探 討 CS-ISPH -TPP 奈 米 顆 粒 對 促 進 營 養 物 質 的 吸 收 及 提 高 生 體 利 用 率 的 能 力 112

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139 柒 附 錄 y = x R2 = Log MW Retention Time (min) Shodex STANDARD P-82 Grade MW 10-4 Mw/Mm P P P P P P P 附 錄 一 Pullulan 之 標 準 曲 線 圖 Appendix 1. Standard curve of Pullulan. 126

140 O.D. 595nm y = x R 2 = ISPH concentration (mg/ml) 附 錄 二 ISPH 之 標 準 曲 線 圖 Appendix 2. Standard curve of ISPH. 127

141 (a)in the ph1.2buffer O.D. 595nm y = x R2 = ISPH concentration (mg/ml) (b)in the ph7.4 buffer O.D. 595nm y = x R2 = ISPH concentration (mg/ml) 附 錄 三 ISPH 溶 於 ph1.2 及 ph7.4 緩 衝 溶 液 中 之 標 準 曲 線 圖 Appendix 3. Standard curve of ISPH in the ph1.2 and ph7.4 buffer. 128