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1 52 ACTAUNIVERSITATISTRADITIONISMEDICALISSINENSISPHARMACOLOGIAEQUESHANGHAIVol.30No.4Jul.,2016 DOI: /j x 实验中医 参芪扶正注射液对人肺腺癌耐药细胞株 A549/DDP 的增敏作用 熊英, 刘春英, 王淳辽宁中医药大学基础医学院 ( 辽宁沈阳 ) 摘要 目的 : 观察参芪扶正注射液 ( 参芪液 ) 对人肺腺癌顺铂耐药细胞株 (A549/DDP) 耐药性的逆转作用及其可能机制 方法 :1~120g/L 参芪液干预 A549/DDP 细胞 48h, 倒置显微镜观察细胞的形态变化 ; MTT 法检测参芪液对 A549/DDP 细胞株增殖的作用以及对顺铂 (DDP) 敏感性的影响 ; 低浓度参芪液 (8g/L) 中浓度参芪液 (16g/L) 高浓度参芪液 (32g/L) 联合 DDP(40μg/ml) 分别作用于 A549/DDP 细胞 24h, 流式 PI 单染法检测细胞凋亡率,Westernblot 检测 Cleaved caspase 3 蛋白表达 结果 : 与对照组比较, 2~120g/L 参芪液对 A549/DDP 细胞有增殖抑制作用, 且呈浓度依赖性 (P<0.05);2g/L 参芪扶正注射液作用 A549/DDP 细胞后, 顺铂敏感性提高, 逆转倍数 (RF) 为 2.66 倍 ; 与 DDP 组比较, 低 中 高浓度参芪液联合 DDP 组, 均能显著诱导 A549/DDP 细胞凋亡 (P<0.05),Cleaved caspase 3 蛋白表达上调 结论 : 参芪扶正注射液能够逆转 A549/DDP 细胞对顺铂的耐药性, 其机制可能是通过启动凋亡调控基因介导的 Caspase 级联反应, 活化 Caspase 3, 从而导致细胞凋亡 关键词 参芪扶正注射液 ; 非小细胞肺癌 ; 肿瘤耐药 ;Caspase 3 肺癌是严重威胁人类健康与生命的恶性肿瘤, 已成为我国恶性肿瘤致死的首要因素 肺癌中以非小细胞肺癌 (nonsmalcellungcancer,nsclc) 多见, 占 80% ~85%, 由于诊断时 70% 的患者已发生淋巴结和 ( 或 ) 远处脏器转移, 因此,NSCLC 的治疗多以化疗为主 [1] 临床上 NSCLC 一线治疗首选以铂类为基础的联合化疗方案, 但越来越多的患者表现出对铂类药物产生耐药, 且这种耐药还造成了患者对放疗或其他不同药理机制的药物的敏感性降低 [2], 严重影响了 NSCLC 的临床疗效 参芪扶正注射液 ( 简称参芪液 ) 为临床常用中药注射剂, 具有抑制血栓 提高回心血流量 降压 调节机体免疫等作用 [3] 此外, 临床常与化疗药物联合应用, 在肺癌 食管癌 结直肠癌等的辅助治疗中取得了较好效果, 但具体机制尚不明确 [4 6] 本 [ 基金项目 ] 国家自然科学基金资助项目 ( , ); 辽宁省自然科学基金项目 ( ) [ 作者简介 ] 熊英, 女, 在读硕士生, 主要从事中医药抗肿瘤临床与基础研究 [ 通讯作者 ] 王淳, 教授, 硕士生导师 ; E 研究采用顺铂 (cis Dichlorodiamineplatinum,DDP) 耐药的人肺腺癌细胞株 (A549/DDP), 通过体外细胞学实验, 以探讨参芪扶正注射液改善肺癌顺铂耐药 敏化疗药物的机制 1 材料与方法 1.1 实验材料 药物和试剂参芪扶正注射液主要成分为党参 黄芪 ( 丽珠集团利民制药厂生产, 批号 : ,250ml/ 支 ), 生药浓度为 160g/L [7],4 避光保存 DDP 冻干粉 ( 齐鲁制药有限公司生产, 批号 : DB,10mg/ 支 ); 取 10mg 顺铂溶解于 5mlPBS 中, 储存液浓度为 2g/L,-20 长期避光保存, 工作液浓度为 1g/L,4 避光保存 胎牛血清 (FBS,Bovogen, 澳大利亚 ; 生产批号 :10915); 青霉素和链霉素 (Gibco, 美国 ; 生产批号 :GA3502); RPMI 1640 培养基 (Hyclone, 美国 ; 生产批号 : NYJ0981); 磷酸盐缓冲液 PBS(Hyclone, 美国 ; 生产批号 :NZA1072);0.25% 胰蛋白酶 Trypsin EDTA (Genview, 美国 ; 生产批号 :GP3180); 四甲基偶氮唑盐 MTT(Amresco, 美国 ; 生产批号 :0793); 二甲亚砜

2 上海中医药大学学报第 30 卷第 4 期 2016 年 7 月 DMSO(Amresco, 美国 ; 生产批号 :0231);RIPA 裂解液 碘化丙啶 (PI)( 鼎国昌盛生物技术有限责任公司, 北京 ; 生产批号 :43B00150,4A200120);β actin 单克隆抗体 Cleaved caspase 3 多克隆抗体 (SAB, 美国 ; 生产批号 :AF 1603,AF 1404) 细胞株及细胞培养人肺腺癌细胞株 (A549) 和人肺腺癌耐药顺铂细胞株 (A549/DDP), 购自中国科学院肿瘤研究中心 ( 北京 ) A549 A549/DDP 细胞株培养在含 10%FBS 及青霉素和链霉素各 100U/ml 的 RPMI1640 培养基中,37 95% 湿度 5%CO 2 条件下培养,0.25% 胰蛋白酶消化传代 实验均采用对数生长期细胞 另外, A549/DDP 细胞置于 2μg/mlDDP 浓度中维持其耐药性 1.2 观察指标和方法 A549/DDP 细胞形态观察培养 A549/DDP 细胞至细胞 80% 融合后, 制成单细胞悬液 10 5 /ml, 分别加入不同浓度参芪液 ( g/L), 于 48h 后倒置显微镜下观察细胞形态 MTT 法检测 A549/DDP 细胞增殖情况取对数生长期的 A549/DDP 制成单细胞悬液 10 5 /ml, 接种于 96 孔板中, 每孔 200μl,37 95% 湿度 5% CO 2 条件下培养过夜 待细胞贴壁后分组 : 空白组 ( 仅有培养基 ) 对照组 ( 培养的细胞中不加任何干预药物 ) 及不同浓度参芪液组 ( 参芪液终浓度分别为 g/L), 每组均设 4 个平行复孔 继续培养 24h 后利用 MTT 法检测细胞增殖情况, 加入 5g/LMTT20μl, 再培养 4h, 后弃上清, 加入 DMSO150μl, 置摇床混匀 10min, 酶标仪于波长 490nm 处测定吸光度值 (A 值 ), 取平均值 根据公式计算细胞抑制率 (IR)(%)=[1- ( 不同浓度参芪组 A 均值 - 空白组 A 均值 )/( 对照组 A 均值 - 空白组 A 均值 )] 100% MTT 法检测 A549/DDP 对 DDP 的耐药倍数取对数生长期的 A549 及 A549/DDP 细胞, 分别接种于 96 孔板中, 方法同上 细胞分组 : 空白组 对照组及不同浓度 DDP 组, 其中 DDP 终浓度分别为 μg/ml, 每组均设 4 个平行复孔 继续培养 48h, 加入 5g/LMTT20μl, 再培养 4h, 后弃上清, 加入 DMSO150μl, 震荡混匀, 490nm 处测定 A 值 按改良寇式法计算半数抑制浓 53 度 (IC 50 ):lgic 50 =Xm-I[P-(3-Pm-Pn) 4] 其中,Xm:lg 最高剂量 ;I:lg( 最高剂量 / 相临剂量 ); P: 阳性反应率之和 ;Pm: 最高阳性反应率 ;Pn: 最低阳性反应率 [8] 耐药倍数 (RI)=IC 50(A549/DDP) /IC 50(A549) 对 A549/DDP 细胞顺铂耐药的逆转作用检测取对数生长期的 A549/DDP 细胞, 接种于 96 孔板中, 方法同上 待细胞贴壁后分组 : 对照组 参芪液组 (2g/L) 及参芪液联合不同浓度 DDP 组, 其中 DDP 终浓度分别为 μg/ml, 每组均设 4 个平行复孔 继续培养 48h, 加入 5g/LMTT 20μl, 再培养 4h, 后弃上清, 加入 DMSO150μl, 震荡混匀,490nm 处测定 A 值, 取平均值并计算 IC [9] 50 逆转倍数(RF)= 不加参芪液药物干预组 IC 50 / 参芪液药物干预组 IC 50 以上实验重复 3 次 流式细胞术检测 A549/DDP 细胞凋亡情况取对数生长期的 A549/DDP 细胞接种于平皿中, 待细胞达到 80% 融合时分组, 分为对照组 DDP 组 (40μg/ml) 及 DDP(40μg/ml)+ 参芪液组 ( 低浓度 8g/L 中浓度 16g/L 高浓度 32g/L) 继续培养 24h, 收集细胞, 用预冷的 PBS 洗 2 次, 后加入预冷的 70% 乙醇固定, 离心后重悬细胞,PI 避光染色 30min, 用 FACScan 流式细胞仪进行检测,ModFit 3.0 软件进行分析 Western blot 法检测 A549/DDP 细胞 Cleaved caspase 3 蛋白表达 A549/DDP 细胞达到细胞融合 80% 时, 按上述分组加药, 继续培养 24h 收集细胞,RIPA 缓冲液 (1 PBS,1%NP40,0.1% SDS,0.1mmol/LPMSF) 于冰上裂解 30min,BCA 法测定细胞的蛋白含量, 常规方法制备蛋白质电泳样品,12%SDS PAGE 湿转转印到 PVDF 膜,5% 脱脂奶粉封闭, 分别检测 Cleaved caspase 3 和 β actin 蛋白的表达 1.3 统计学方法应用 SPSS17.0 统计软件对数据进行 OneWayANOVA 方差分析 计量资料用 x±s 表示,P<0.05 为差异有统计学意义 2 结果 2.1 对 A549/DDP 细胞形态的影响对照组细胞多呈梭形或多边形, 形态规则 细胞折光性好 ; 不同浓度参芪液干预 48h 后, 随着药物浓度的增加, 细胞逐渐收缩呈圆形漂浮状, 折光性差, 细胞数量减少, 死亡细胞增多 见图 1

3 ACTAUNI VERSI TATI STRADI TI ONI SMEDI CALI SSI NENSI SPHARMACOLOGI AEQUESHANGHAIV 3N J u 2 5 A 对照组 B 参芪液 2g L C 参芪液 8g L D 参芪液 g L E 参芪液 8 g L F 参芪液 2 g L 图 各组 A5 DDP细胞形态比较 倒置显微镜 2 对 A5 DDP细胞增殖作用的影响 结果显 5 对 DDP诱导 A5 DDP细胞凋亡的影响 流 示 随着参芪液药物干预浓度增加 细胞抑制率逐 式细胞仪检测结果显示 与 DDP组比较 低 中 高 渐升高 呈浓度依赖性 见图 2 参芪液联合 DDP组 均能显著诱导 A5 DDP细胞 DDP细胞的凋亡率 P 5 发生凋亡 升高 A5 见图 3 对 A5 DDP细胞蛋白表达的影响 W b 结 果 显 示 随 着 参 芪 液 药 物 干 预 浓 度 增 加 C p 3的表达逐渐增加 呈浓度依赖性 见图 3 讨论 肺癌是本虚表实的一种慢性消耗性疾病 本虚 注 与对照组比较 P 5 P 以气虚 阴虚 气阴两虚为多见 邪实主要为气滞 图 2 各组 A 5 DDP细胞增殖抑制情况比较 3 A5 DDP细胞对顺铂的耐药情况 DDP对 A5 9和 A5 DDP细胞的增殖均有抑制作用 I C5 血瘀 痰凝 毒聚为主 化疗后药物更易耗气伤血 损伤脾胃 所谓 医宗必读 积聚 积之成也 正 气不足 而后邪气踞之 化疗后正气虚弱 难以 A5 DDP 为 79 88±5 2 μg m I C5 A5 9 抗邪 反 而 会 加 重 病 情 此 时 运 用 扶 正 为 主 的 中 为 9 8± 5 2 μg m 耐药倍数 RI 为 9 9 药 益肾健脾 理气和胃 补气养血 养阴温阳 可以 对 A5 DDP细胞耐药的逆转作用 扶助患者正气 减轻化疗后不良反应 结果显 示 2g L参芪液组 I C5 A5 DDP 明显降 低 与 参芪扶正注射液为扶正类中药注射剂 主要成 A5 DDP组比较差异有统计学意义 P 5 参 分为党参 黄芪的提取物 具有补中益气 活血化瘀 DDP细胞对顺铂的耐药性 见 芪液能够逆转 A5 的功效 2 其中党参味甘 平 归脾肺经 能够补脾 表 养胃 润肺生津 健运中气 黄芪味甘 温 擅长补益 表 各组 A5 DDP细胞顺铂敏感性比较 肺脾肾气虚不足 兼能升阳举陷 利水消肿 黄芪 组 别 A5 DDP组 A5 DDP 参芪液组 A5 DDPI C5 x± μg m RF 被李时珍誉为 补药之长 尤善于补脾益肺 益气 79 88±5 2 固表 配合党参补益中气 补血生津 治疗肺癌化疗 后正气不足及血虚津伤引起的体虚倦怠 食少便溏 8 3 3± 2 注 与 A5 DDP组比较 P 5 或便秘 腹胀 浮肿尿少 面色萎黄 乏力 头晕等症

4 上海中医药大学学报 第3 卷 55 第 期 2 年 7月 A A5 DDP细胞流式细胞检测图 B A5 DDP细胞凋亡率 与 DDP组比较 P 5 图 3 各组 A5 DDP细胞凋亡率比较 目前 中药逆转肿瘤细胞耐药的分子机制有多 种 可 以 通 过 腺 苷 三 磷 酸 结 合 转 运 蛋 白 ATP b d g p ABC转运蛋白 超家族介 导的药物外排泵机制 谷胱甘肽 GSH 和谷胱甘肽 S 转移酶 GST 介导的肿瘤细胞解毒 修复系统 凋 亡调控基因 信号转导因子介导的抗凋亡机制等作 图 各组 A5 DDP细胞 C p 3蛋白表达 用 72 如扶 正 固 本 类 中 药 补 中 益 气 汤 能 够 激 活 b 电泳图 W PI 3K Ak 信号通路 通过膜转运蛋白介导的药物外 黄芪除了能补虚益气 扶助正气外 还具有抗癌的 排泵机制 下调 P 糖蛋白 P g p 多药耐药相关蛋 功效 日华子本草 中所言黄芪能 助气壮筋骨 白 MRP 肺 耐 药 相 关 蛋 白 LRP 的 表 达 逆 转 长肉 补血 破 癖 3 参芪扶正注射液通过联合 A5 DDP细胞顺铂耐药 2225 本研究发现参芪扶 化疗药物 扶助正气 兼能消 散结 改善化疗后患 p 3活化 促进 正注射液通过诱导细胞发生 C 者的恶病质状态 提高化疗药物对机体的敏感性 无活性的 P p 3酶原激活 分解成 C 使 正气存内 邪不可干 壮者气行则愈 怯者而成 p 3 导致细胞凋亡 从而逆转 A5 DDP细胞 病 顺铂耐药性 鉴此 我们推测 扶正固本类中药可 临床研究发现 参芪液联合放疗治疗非小细胞 肺癌可显著提高化疗药物的有效率 5 但机制不 通过多条途径逆转肿瘤细胞耐药性 从而达到化疗 增敏作用 明 本研究发现 参芪液具有直接抑制人肺腺癌顺 综上所述 参芪扶正注射液具有抑制人肺癌细 铂耐药细胞增殖的作用 这可能是其临床提高化疗 胞增殖 降低细胞顺铂耐药倍数 逆转顺铂耐药性 药物有效性的原因之一 另外 参芪液还具有降低 的作用 其机制可能通过启动凋亡调控基因介导的 肺癌细胞顺铂耐药倍数 逆转顺铂耐药性的作用 C p 级联反应 诱导 C p 3依赖的细胞凋亡 这与参芪液增敏其他恶性肿瘤细胞相一致 如参芪 液与赫塞汀联合应用 可促进赫塞汀对 HER 2阳性 乳腺癌细胞增殖的抑制作用 参考文献 HuL L gg Yu gw A g h d y p m p x mb w h p

5 56 ACTAUNIVERSITATISTRADITIONISMEDICALISSINENSISPHARMACOLOGIAEQUESHANGHAIVol.30No.4Jul.,2016 linechemotherapyforpatientswithadvancednsclcwithregional lymph nodemetastasis:studyprotocolforarandomizedcontroled trial(plc GCtrial)[J].Trials,2013,14(1): [2]Chang A.Chemotherapy, chemoresistance and the changing treatmentlandscapefornsclc[j].lungcancer,2011,71(1):3 10. [3]QiF,ZhaoL,ZhouA,etal.Theadvantagesofusingtraditional Chinesemedicineasanadjunctivetherapyinthewholecourseof cancertreatmentinsteadofonlyterminalstageofcancer[j].biosci Trends,2015,9(1): [4] 唐杰, 何海浪, 许荣龙, 等. 参芪扶正注射液联合放疗治疗非小细胞肺癌的 Meta 分析 [J]. 中国实验方剂学杂志,2015,21(1): [5] 敖曼, 连相尧, 刘承一, 等. 参芪扶正注射液对肺癌化疗患者造血功能和免疫功能的影响 [J]. 山东医药,2012,52(3): [6] 吴少兵, 朱红梅, 韦敏, 等. 参芪扶正注射液配合食管癌放疗的疗效观察 [J]. 肿瘤基础与临床,2011,24(4): [7] 张锦文. 参芪扶正注射液研究 [C]. 武汉 : 华中科技大学,2008. [8] 赵斌, 葛金芳, 朱娟娟. 小议在 MTT 法测细胞增殖率中 IC 50 的计算方法 [J]. 安徽医药,2007,11(9):834. [9] 齐春胜, 高森, 李会强, 等. 异长春花碱逆转肺癌顺铂耐药 A549/ DDP 细胞耐药性的作用和机制 [J]. 中国肺癌杂志,2014,17 (2): [10] 明 李中梓. 医宗必读 [M]. 呼和浩特 : 内蒙古人民出版社, 2006: [11] 赖景春, 彭卫卫, 邓江华. 参芪扶正注射液联合化疗对恶性肿瘤的增效减毒作用 [J]. 中国老年学杂志,2013,33(24): [12] 刘效栓, 李喜香. 中药注射剂临床合理使用手册 [M]. 北京 : 化学工业出版社,2015: [13] 五代 日华子. 日华子本草 [M]. 合肥 : 安徽科学技术出版社, 2005:30, [14] 谢华. 黄帝内经白话释译 [M]. 北京 : 中国古籍出版社,2000: 93 94,362. [15] 黄爱霞, 姚国相, 陈燕, 等. 参芪扶正联合 PG 方案治疗晚期非小细胞肺癌的疗效观察 [J]. 中国生化药物杂志,2014,34(1): [16] 赵勇, 傅羽, 吴耀华. 参芪扶正注射液与赫塞汀联合应用对乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响 [J]. 哈尔滨医科大学学报,2013,47 (3): [17] 吴慧.ABCBl 和 ABCG2 基因多态性与肿瘤发病及预后的相关性研究 [D]. 沈阳 : 中国医科大学,2013:5 6. [18] 于丹, 于宁, 王雨, 等. 补中益气汤对肺腺癌 A549/DDP 荷瘤小鼠 LRP 蛋白影响的研究 [J]. 中华中医药杂志,2014,29(5): [19]JanesMR,Limon J,SoL,etal.Efectiveandselectivetargetingof leukemiacelsusingatorc1/2kinaseinhibitor[j].natmed, 2010,16(1): [20] 刘亚莉, 易佳丽, 王莹, 等. 补中益气汤含药血清对 A549/DDP 细胞 PI3K/AKT 信号转导通路影响的实验研究 [J]. 中国医科大学学报,2014,3(1): [21] 井欢, 于丹, 唐莹, 等. 补中益气汤对 A549/DDP 动物模型实体瘤中耐药相关酶 GST 和 TopoⅡ 表达的影响 [J]. 时珍国医国药,2014,20(3): [22] 李璐璐, 迟寿军, 王莹, 等. 补中益气汤含药血清联合 sirna 对肺腺癌 A549/DDP 细胞的 LRP 表达影响 [J]. 重庆医科大学学报,2014,39(9): [23] 蔡霄月, 张铭, 杨晓华, 等.β 榄香烯对紫杉醇耐药肺癌细胞的抑制作用及 Wnt/β catenin 信号通路的影响 [J]. 上海中医药大学学报,2016,30(1): [24] 井欢, 唐莹, 于丹, 等. 补中益气汤含药血清同 sirna 对 A549/ DDP 细胞 MRP 表达影响的比较 [J]. 中国实验方剂学杂志, 2014,20(8): [25] 易佳丽, 井欢, 王莹, 等. 补中益气汤含药血清对 A549/DDP 中 p Akt 和 P gp 表达的影响 [J]. 中国实验方剂学杂志,2013,19 (17): 编辑 : 沈蕾收稿日期 : TheSensitizationEfectofShenQiFuZhengInjectiononHuman LungAdenocarcinomaCancerCelLineA549/DDP XIONGYing,LIUChun ying,wangchun BasicMedicalColege,LiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shenyang, ABSTRACT Objective:ToinvestigatethereverseefectandmechanismsofShenQiFuZhenginjection(SQFZI)onthe cisplatinresistanceofhumanlungadenocarcinomacancercelline(a549/ddp).methods:48haftertreatmenta549/ddp celwith1 120g/LSQFZI,invertedmicroscopewasusedtoobservethemorphologicalchangesofA549/DDPcelline;MTT asaywasusedtodeterminetheefectofsqfzionproliferationandsensitivenestocisplatinofa549/ddpcel.24hafter treatmenta549/ddpwithlow (8g/L),middle (16g/L),high (32g/L)concentrationofSQFZIcombinedwithDDP(40 μg/ml),piflowcytometrytestandwesternblotwereusedtodeterminecelapoptosisandcleaved caspase 3expresion respectively.results:comparedwithcontrolgroup,2~120g/lsqfzicaninhibittheproliferationofa549/ddpcelina concentration dependentmanner(p<0.05).treatedwith2mg/mlsqfzi,thesensitivityofa549/ddpcellinetocisplatin increasedandthereversalfoldupto2.66.comparedwithddpgroup,sqfziatdiferentconcentrationcombinedwithddp significantlyinducedapoptosisina549/ddpcels(p<0.05)andtheexpresionofcleaved caspase 3wasup regulated. Conclusion:SQFZIcouldmoderatelyreversethedrugresistanceofA549/DDPcelstocisplatin.Themechanism maybe relatedtostart upcaspasecascadereactionmediatedbyapoptosisregulationgeneandactivatecaspase 3,whichleadsto apoptosis. KEYWORDS ShenQiFuZhenginjection;Non smalcellungcancer;drugresistanceoftumor;caspase 3

12 (autophagy),imagej,,, 3 [1-4] (self-eating) Transwelinvasion, 20μmol L -1 LY A549 [5] PI3K/AKT 24h,PBS, [6-8],, ml -1 ( ) 600μL

12 (autophagy),imagej,,, 3 [1-4] (self-eating) Transwelinvasion, 20μmol L -1 LY A549 [5] PI3K/AKT 24h,PBS, [6-8],, ml -1 ( ) 600μL ( )2017 57 5JournalofNanchangUniversity(MedicalSciences)2017,Vol.57No.5 11 LY294002, (, 330006) : LY294002 PI3K/AKT 0 10 15 20 25 30μmol L -1 LY294002(LY294002 ) A549,PBS CCK8 LY294002 A549 ; Westernblot

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