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1 中国组织工程研究与临床康复第 14 卷第 7 期 出版 Journl of Clinicl Rehbilittive Tissue Engineering Reserch Februry 12, 2010 Vol.14, No.7 胰岛素与硒联合作用糖尿病大鼠骨骼肌胰岛素信号转导通路中 PI3K 和 GLUT4 蛋白的表达 徐天娇, 袁秉祥 Effect of insulin combined with selenium on PI3K nd GLUT4 expression in cellulr signl trnsduction of skeletl muscle in dibetic rts Xu Tin-jio, Yun Bing-xing Abstrct BACKGROUND: PI3K is fmily of enzymes involved in insulin signl trnsduction pthwy, the bnorml expression of which would ffect synthesis, secretion, nd migrtion of GLUT4, therefore, results in incresed blood sugr, eventully, leds to dibetes. OBJECTIVE: To discuss the effects of insulin combined with selenium on PI3K nd GLUT4 expression in cellulr signl trnsduction of skeletl muscle in dibetic rts. METHODS: Sprgue Dwley (SD) rts were rndomly divided into the control, dibetic, insulin-treted dibetic, selenium-treted dibetic nd combintion dministrtion groups. All rts were prepred for dibetic models by injecting 50 mg/kg Streptozocin exception of the control group. Rts in the control nd dibetic groups were free to food nd wter; in the insulin tretment group, rts were subcutneous injected 1 U/(kg d) insulin. Rts in the selenium tretment group were treted with dose of 180 µg/kg per dy of sodium selenite dissolved in redistilled wter by gvge; nd in the combintion dministrtion were given both tretments for 4 successive weeks. The levels PI3K nd GLUT4 in skeletl muscle were estimted using Western blotting nd immunohistochemistry techniques. RESULTS AND CONCLUSION: Immunohistochemistrl results were ccordnce to Western blotting results, which showed the combintion of insulin nd selenium cn remrkble increse the levels of PI3K in skeletl muscle nd GLUT4 in skeletl muscle membrne frction, therefore, enhnce the insulin signl trnsduction pthwy. Xu TJ, Yun BX. Effect of insulin combined with selenium on PI3K nd GLUT4 expression in cellulr signl trnsduction of skeletl muscle in dibetic rts.zhongguo Zuzhi Gongcheng Ynjiu yu Linchung Kngfu. 2010;14(7): [ 摘要 背景 :PI3K 是骨骼肌中胰岛素信号转导途径级联反应中关键的蛋白分子之一, 其表达异常可影响 GLUT4 的合成 分泌 移位等变化, 从而使血糖升高 目的 : 通过检测胰岛素和硒联合应用对糖尿病大鼠骨骼肌胰岛素信号转导通路有关蛋白激酶 (PI3K GLUT4) 表达的影响 方法 :SD 雄性大鼠随机分为正常组 糖尿病组 糖尿病 + 胰岛素组 糖尿病 + 亚硒酸钠组 糖尿病 + 胰岛素 + 亚硒酸钠组 除正常组外, 其余 4 组大鼠腹腔注射链尿佐菌素 50 mg/kg 复制大鼠糖尿病模型 正常组和糖尿病自由进水和进食 ; 糖尿病 + 胰岛素组按 1U/(kg d) 皮下注射胰岛素, 糖尿病 + 亚硒酸钠组按 180 µg/(kg d) 管饲亚硒酸钠, 糖尿病 + 胰岛素 + 亚硒酸钠组两药联合用药持续 4 周 ; 应用免疫印迹和免疫组织化学法检测各实验组骨骼肌胞浆中 PI3K 和胞膜上 GLUT4 蛋白表达 结果与结论 : 免疫组织化学方法所得结果与免疫印迹一致 胰岛素和硒联合应用能明显增加骨骼肌细胞胞浆中 PI3K 和胞膜上 GLUT4 蛋白的表达量, 说明胰岛素和硒联合应用是通过 PI3K 途径和增加骨骼肌组织 GLUT4 蛋白的表达来增强胰岛素信号转导 关键词 : 胰岛素 ; 硒 ; 骨骼肌 ; 磷脂酰肌醇 3 激酶 (PI3K); 葡萄糖转运体 4(GLUT4); 肌肉肌腱组织工程 doi: /j.issn 徐天娇, 袁秉祥. 胰岛素与硒联合作用糖尿病大鼠骨骼肌胰岛素信号转导通路中 PI3K 和 GLUT4 蛋白的表达 [J]. 中国组织工程研究与临床康复,2010,14(7): [ Xu Tin-jio, Studying for doctorte, xtj1118@163.com Correspondence to: Yun Bing-xing, Professor, ybx@mil.xjtu.edu.cn Received: Accepted: 西安交通大学医学院药理系, 陕西省西安市 徐天娇, 女, 1975 年生, 陕西省乾县人, 汉族, 西安交通大学在读博士, 主要从事心血管药理研究 xtj1118@163. com 0 引言近几年研究表明骨骼肌是体内廓清血糖最重要的组织,PI3K 是骨骼肌中胰岛素信号转导途径级联反应中关键的蛋白分子之一, 其表达异常可影响 GLUT4 的合成 分泌 移位等变化, [1-4] 从使血糖升高 作者前期的研究显示胰岛素和硒联合应用 能够显著改善链尿佐菌素诱导的糖尿病大鼠的 [5] 高血糖和高血脂症状 目前尚未见到有关两药联合应用对骨骼肌中胰岛素信号转导通路有关蛋白激酶的影响 故实验应用 Western blotting 和免疫组织化学技术检测胰岛素和硒联合应用对链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠骨骼肌中 PI3K 和 GLUT4 蛋白表达, 旨在进一步明确两药联合应用增加葡萄糖摄取利用是否与胰岛素受体下游的信号分子有关 通讯作者 : 袁秉祥, 教授, 西安交通大学医学院药理系, 陕西省西安市 ybx@mil.xjtu. edu.cn 中图分类号 :R318 文献标识码 :B 文章编号 : (2010) 收稿日期 : 修回日期 : ( /W Z) ISSN CN /R CODEN: ZLKHAH 1213

2 1 材料和方法设计 : 随机对照动物实验 时间及地点 : /12 动物饲养实验在西安交通大学药理系动物实验室完成 ; 免疫组织化学和免疫印记在西安交通大学医学实验中心完成 材料 : 清洁级 SD 雄性大鼠 35 只, 体质量 180~230 g, 西安交通大学医学院实验动物中心提供 ( 动物合格证陕医动字 :08-005) 分笼饲养, 房间温度保持在 25 左右, 湿度在 50% 左右 适应性喂养 1 周后进行分组喂养 明暗周期 12 h(6:00~18:00), 自由进水和进食 腹腔注射链尿佐菌素 (streptozotocin,stz) 50 mg/kg 复制大鼠糖尿病模型 1 周后于大鼠尾尖取血, 测定血糖和尿糖, 血糖 >16. 7 mmol/l, 尿糖 +++~++++ 者确定为糖尿病模型 实验过程中对动物处置符合 2006 年科学技术部发布的 关于善待实验动物的指导性意见 [6] 主要试剂及仪器 : 主要试剂及仪器来源 扫描后应用图像分析软件进行分析 免疫组织化学染色 (SP 法 ) 测量骨骼肌中 PI3K 和 GLUT4 蛋白表达 : 处死动物后, 取骨骼肌,40 g/l 多聚甲醛固定, 常规石蜡包埋, 切片 (4 μm); 体积分数 3%H2O2 室温孵育 10 min;5%~10% 正常山羊血清封闭 10 min; 加入一抗,37 孵育 1.0~2.0 h; 滴加生物素标记的二抗, min; 滴加辣根过氧化物酶标记的链卵白素, min;dab 显色, 室温 3min; 苏木精复染 1min; 乙醇脱水 ; 中性树胶封固 主要观察指标 : 骨骼肌中 PI3K 蛋白和 GLUT4 蛋白水平的变化 设计 实施 评估者 : 设计 实施为第一作者, 评估为第二作者 统计学分析 : 采用 Scion Imge softwre 分别对 PI3K 和 GLUT4 免疫组织化学染色强度进行了图像分析, 在显微镜放大 400 倍视野下拍照 应用 SPSS 11.0 统计 软件对实验数据进行方差分析, 结果用 x±s 表示, 以 P< 0.05 为差异有显著性意义 2 结果 _ RIPA 裂解液 PI3K 单克隆抗体 链脲佐菌素 (STZ) 亚硒酸钠 GLUT4 多克隆抗体 β-ctin 多克隆抗体二抗 : 抗山羊 IgG-HRP 化学增强发光试剂盒 PVDF Gel Doc200 型全自动凝胶成像分析系统 美国 Bioteke 公司美国 sigm 公司美国 Upstte Biotechology 公司美国 SANTA CRUZ 公司美国 VIGMA 公司美国 Pierce Chemicl 公司美国 Dupont 公司美国 BIO-RAD 公司美国 BIO-RAD 公司 2.1 实验动物数量分析实验选用大鼠 35 只, 分为 5 组, 无脱失, 全部进入结果分析 2.2 骨骼肌中 PI3K 蛋白水平的变化免疫印迹方法检测结果 : 各组胞浆中 PI3K 水平见图 1 PI3K β-ctin 实验方法 : 采用免疫印记和免疫组织化学的方法检测骨骼肌中 PI3K 和 GLUT4 蛋白含量的变化 分组 : 将大鼠随机分为 5 组, 每组 7 只 1 正常组 : 自由进水和进食 2 糖尿病组 : 自由进水和进食 3 糖尿病 + 胰岛素组 : 按 1U/(kg d) 皮下注射胰岛素, 持续 4 周 4 糖尿病 + 亚硒酸钠组 : 按 180µg/(kg d) 管饲亚硒酸钠, 持续 4 周 5 糖尿病 + 胰岛素 + 亚硒酸钠组 : 按 1U/(kg d) 皮下注射胰岛素, 同时管饲 180µg/(kg d) 亚硒酸钠, 持续 4 周 免疫印迹法测量骨骼肌中 PI3K 和 GLUT4 蛋白水平 : 取适量的骨骼肌加入不同的 PIRA 裂解液团分别提取总蛋白 [7-8] 和膜蛋白 取等量的总蛋白或膜蛋十二烷基硫酸钠- 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE) 分离后, 电转移至 PVDF 膜上, 室温下以封闭液封闭 PVDF 膜 1h, 与兔抗大鼠 PI3K 和 GLUT4 抗体 4 孵育过夜, 再与辣根过氧化物酶标记的抗兔 IgG 室温下孵育 1h, 将 PVDF 膜与 X 射线片一同放入暗合盒内爆光, 待显色后即可照相, 照片经 1214 PI3K/bet-ctin (100%) P < 0.01, vs. dibetic group; b P < 0.01, vs. insulin-treted dibetic group; c P < 0.01, vs. selenium-treted dibetic group; 1: control group; 2: dibetic group; 3: insulin-treted dibetic group; 4: selenium-treted dibetic group; 5: combintion dministrtion group Figure 1 图 Western blotting of PI3K expression in skeletl muscle of ech group 免疫印记法测得各组大鼠骨骼肌 PI3K 表达水平 与正常对照组比较, 糖尿病模型组胞浆中 PI3K 含量明显下降, 约 36%(P <0.01) 与糖尿病组比较, 单用胰岛素治疗组 胰岛素 + 硒联合治疗组胞浆中 PI3K 含量 bc Tretment P.O. Box 1200, Shenyng cn.zglckf.com

3 显著性增加 (P <0.05,P <0.01); 而单用硒治疗组胞浆中 PI3K 含量无显著性增加 (P >0.05) 与胰岛素和硒治疗组比较表明, 联合用药组胞浆中 PI3K 含量的均显著性增加 (P <0.01) 说明胰岛素和硒联合应用时对糖尿病大鼠骨骼肌胞浆中 PI3K 蛋白表达的影响明显优于单用胰岛素或单用硒治疗 免疫组织化学方法检测结果 : 见图 2 含量也显著性增加 (P <0.01) 说明胰岛素和联合应用时对糖尿病大鼠骨骼肌胞膜 GLUT4 蛋白表达的影响明显优于单用胰岛素或单用硒治疗, 见图 3 GLUT4 β-ctin : Control group c: Insulin-treted dibetic group b: Dibetic group d: Selenium-treted dibetic group GLUT/bet-ctin(100%) P < 0.01, vs. dibetic group; b P < 0.01, vs. insulin-treted dibetic group; c P < 0.01, vs. selenium-treted dibetic group; 1: Control group; 2: Dibetic group; 3: Insulin-treted dibetic group; 4: Selenium-treted dibetic 5: Combintion dministrtion group Figure 3 图 Western blotting of GLUT4 expression in skeletl muscle of ech group 免疫印迹法测得各组大鼠骨骼肌 GLUT4 表达水平 免疫组织化学方法检测结果 : 见图 4 bc Tretment e: Combintion dministrtion group Figure 2 Immunochemistry of PI3K expression in ech group ( 400) 图 2 各实验组大鼠骨骼肌 PI3K 免疫组织化学 ( 400) : Control group b: Dibetic group 免疫组织化学方法所得结果与免疫印迹一致 免疫组织化学染色大鼠骨骼肌细胞内出现棕黄色物质为阳性 正常对照组骨骼肌细胞内 PI3K 染色均分布于肌细胞胞浆中, 着色强, 与正常对照组比较, 糖尿病组肌细胞内 PI3K 染色明显减少 ; 两药联合应用能明显改变胞浆中 PI3K 的表达量, 接近于正常值 而单给胰岛素或单给亚硒酸钠治疗仅能部分改善胞浆中的低 PI3K 状态 因此, 联合用药组在纠正糖尿病大鼠骨骼肌胞浆中 PI3K 水平方面是最有效的 2.3 骨骼肌中 GLUT4 蛋白水平的变化免疫印迹方法检测结果 : 与正常对照组比较, 糖尿病模型组胞膜 GLUT4 含量明显下降, 约 47% (P <0.01) 与糖尿病组比较, 胰岛素治疗组 硒治疗组 胰岛素 + 硒联合治疗组胞膜 GLUT4 含量显著性增加 (P <0.01) 与胰岛素和硒治疗组比较表明, 联合用药对胞膜 GLUT4 ISSN CN /R CODEN: ZLKHAH c: Insulin-treted dibetic group e: Combintion dministrtion group d: Selenium-treted dibetic group Figure 4 Immunochemistry of GLUT4 expression in ech group ( 400) 图 4 各实验组大鼠骨骼肌 GLUT4 免疫组织化学 ( 400) 1215

4 免疫组织化学方法所得结果与免疫印迹一致 GLUT4 分布于正常对照组大鼠骨骼肌的细胞膜上, 在糖尿病状态下, 骨骼肌细胞膜上 GLUT4 的含量明显减少 两药联合应用能明显改变膜上 GLUT4 的表达量, 接近于正常值 而单给胰岛素或单给亚硒酸钠治疗仅能部分改善细胞膜上的低 GLUT4 状态 因此, 联合用药组在逆转糖尿病大鼠骨骼肌细胞膜上 GLUT4 含量方面是最有效的 3 讨论在骨骼肌中, 胰岛素经血液循环到达相应靶组织后, 与其上的胰岛素受体 α 亚单位相结合, 激活其 ß 亚单位的内在激酶活性, 导致 IR 自身磷酸化 磷酸化的 IR 一方面为其他信号分子提供结合位点 ; 另一方面其磷酸激酶可致 IRS-1 磷酸化 IRS-1 被磷酸化后即暴露出特异性结合位点, 能募集并激活含有 SH2 区域的蛋白质激酶磷脂酰 [9-11] 肌醇 3(PI3K), 使信号以激酶链式反应下传, 从而导致葡萄糖转运蛋白 4(GLUT4) 的合成 分泌 移位等变 [12] 化,GLUT4 是直接影响葡萄糖入胞的细胞因子, 对血糖的调节极其重要 已有研究显示, 血糖的调节主要受 PI3K 介导的胰岛素信号转导通路的影响, 因此 PI3K 蛋白表达异常可影响 GLUT4 的表达, 最终导致血糖升高 已有研究显示 :PI3K 受损可能是糖尿病状态引起 [13-15] 的代谢紊乱如高脂血症等所致 作者前期的研究显 [5] 示 : 糖尿病大鼠存在明显的高血糖和高血脂症状, 这可能导致骨骼肌组织胰岛素介导的 PI3K 明显受损 试验结果也显示 : 经胰岛素和硒联合治疗后能明显降低糖尿病大鼠的血糖和血脂, 故推测是否胰岛素和硒联合应用也能逆转骨骼肌组织 PI3K 的受损 故此本试验运用免疫组织化学和 Westernblotting 的方法检测了正常对照组 糖尿病模型组 胰岛素治疗组 硒治疗组 胰岛素 + 硒治疗组的骨骼肌胞浆中 PI3K 蛋白的表达量 实验结果表明 : 糖尿病模型组与正常对照组比较骨骼肌 PI3K 蛋白表达显著减少, 这说明糖尿病大鼠骨骼肌组织中 PI3K 明显受损, 与作者的推测一致 经胰岛素和硒联合治疗后 PI3K 表达明显增高接近于正常对照组, 提示胰岛素和硒联合应用能逆转骨骼肌组织 PI3K 的受损, 这也与作者的推测一致 两药联合应用时这种显著增加糖尿病大鼠骨骼肌 PI3K 蛋白表达的作用, 可能会直接影响 GLUT4 蛋白激酶的表达, 最终影响葡萄糖的摄取和利用 骨骼肌细胞膜上 GLUT4 能提高骨骼肌中的糖利用同时也能缓解高血糖状态 已知有许多生理, 病理和药 [16-17] 物因素可以影响 GLUT4 的表达 已有研究显示: [18] GLUT4 的高表达可改善 DBPDB 鼠糖尿病血糖 胰岛素输注可使正常人 有胰岛素抵抗的肥胖患者和 1 型糖 [19] 尿病患者 GLUT4 表达增加 在肥胖患者中, 通过饮食控制, 可以降低骨骼肌中的三酰甘油, 并可以降低骨骼 1216 [20] 肌细胞 TNFAmRNA, 同时上调 GLUT4 的基因表达 对肌肉的长期低频刺激也可以诱导 GLUT4 表达超过基础水平, 即使是胰岛素抵抗的肥胖 Zucker 大鼠肌肉细胞, 在长期慢性运动刺激下 GLUT4 的含量也增加了 [21] McLen 等在几种转基因鼠上发现运动增加 GLUT4 [22-28] 基因的表达 目前已知对 GLUT4 表达调节不仅在转录水平, 而且在转录后水平也存在 实验结果显示 : 糖尿病大鼠细胞胞膜上 GLUT4 含量明显下降, 说明骨骼肌细胞存在葡萄糖转运障碍, 这将导致血糖的升高 ; 胰岛素和硒联合应用后能明显改善胞膜上 GLUT4 水平, 接近于正常值, 说明两药联合应用能明显改善骨骼肌细胞的葡萄糖转运障碍, 从而纠正糖尿病大鼠的糖脂代谢紊乱 ; 免疫组织化学的结果与 Western blotting 的结果相似 说明, 两药联合应用纠正糖尿病大鼠骨骼肌细胞膜上 GLUT4 的含量改变方面是非常有效的 4 参考文献 [1] Wu FL,Zhng YF,Zhng MZ.Yingyng Xuebo. 1999;21(2): 吴凤兰, 张亚非, 张明珠. 硒和维生素 E 对糖尿病大鼠氧化和非酶糖化的影响 [J]. 营养学报,1999,21(2): [2] Bynes JW. Role of oxidtive stress in development of complictions in dibetes. J Dibetes 1991;40:405. [3] Yng Z.Renmin Junyi. 2006;49(4): 杨真. 微量元素锌 铬与糖尿病的关系 [J]. 人民军医,2006,49(4): [4] Pglissotti MJ, Kng J, Thresher JS, et l. Elevted bsl PI3-kinse ctivity nd reduced in sulin signling insucrose-induced hepticin sulin resistnce. Am J Physio l(endocrinolmetb). 2002; 282:E170 [5] Krlsson H, Krlsson M,Thorn H,et l. Insulin induces trnsloction of glucose trnsporter GLUT4 to plsm membrne cveole in dipocytes. The FASEB Journl. 2002;16(2):249. [6] Tinjio Xu, Bingxing Yun,Ymin Zou. Effect of insulin in combintion with selenium on blood glucose nd GLUT4 expression in skeletl muscle of streptozotocin-induced dibetic rts. Xi n Jiotong Dxue Xuebo(Yingwenbn). 2009;21(2): [7] The Ministry of Science nd Technology of the People s Republic of. Guidnce Suggestions for thecrenduseof Lbortory Animls 中华人民共和国科学技术部. 关于善待实验动物的指导性意见 [8] Zhng P, Ling ZW, Wng HH,et l. Disn Junyi Dxue Xuebo. 2004; 26(6): 张平, 梁自文, 王海慧, 等. 钒酸钠治疗增加实验性糖尿病大鼠骨骼肌 GLUT4 表达的研究 [J]. 第三军医大学学报,2004;26(6): [9] Luo Y,Co RX.Guoji Neifenmi Dixie Zzhi. 2006;26 (1) 罗怡, 曹仁贤. 胰岛 β 细胞胰岛素信号转导通路 [J]. 国际内分泌代谢杂志,2006,26 (1) [10] Cui JX.Zhiye yu Jinkng. 2006;22(22) 崔俊雪. 糖尿病及其常见问题 [J]. 职业与健康,2006,22(22) [11] Anish Gupte, Silvi Mor. Activtion of the Cbl insulin signling pthwy in crdic muscle;dysregultion in obesity nd dibetes. Biochemicl nd Biophysicl Reserch Communictions. 2006; 342: [12] Zhng L,Chen LM,Ni HX,et l.zhongguo Zuzhi Gongcheng Ynjiu yu Linchung Kngfu. 2006; 10(39): 张雷, 陈立梅, 倪红霞, 等. 葛根素影响链脲佐菌素诱导糖尿病大鼠脂肪细胞葡萄糖转运蛋白 4 的表达 [J]. 中国组织工程研究与临床康复, 2006; 10(39): [13] Kim YB,Shulmn GI,Khn BB.Ftty cid infusion selectively impirs insulin ction on Akt1 nd protein kinse C lmbd/zet but not on glycogen synthse kinse-3.j Biol Chem.2002;277(36): [14] Federici M,Menghini R,Muriello A,et l.insulin-dependent ctivtion of endothelil nitric oxide synthse is impired by O-linked glycosyltion modifiction of signling proteins in humn coronry endothelil cells.circultion.2002;106(4): P.O. Box 1200, Shenyng cn.zglckf.com

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