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差习
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1 1 TEV 蛋白酶热稳定性突变体的理性设计 Rational design of TEV protease mutants with enhanced thermostability G05D 刘逸珩

2 小组成员组长 : 康锦瑞 @stu.pku.edu.cn 李展 @stu.pku.edu.cn 张萃雯 @stu.pku.edu.cn 刘逸珩 @stu.pku.edu.cn 2

3 3 小组成员编号姓名导师研究方向 G05A 康锦瑞李毅水稻的抗病毒机制 G05B 张萃雯范六民逆境小体形成的分子机制 G05C 李展李磊 mirna 和铜稳态 G05D 刘逸珩王忆平生物固氮合成生物学

其酶活性会急剧下降 F. Cesaratto, O. R. Burrone, G.

4 背景 TEV 蛋白酶 (TEVp) TEVp 来源于烟草蚀纹病毒 TEV, 其基因组全长为 9500bp, 编码一个 3054 氨基酸的多肽, 在感染细胞后经过三种病毒蛋白酶加工成 10 个成熟产物 TEVp 的最适温度为 30, 当温度达到或高于 37 时, 其酶活性会急剧下降 F. Cesaratto, O. R. Burrone, G. Petris, Tobacco Etch Virus protease: A shortcut across biotechnologies. J. Biotechnol. 231, (2016). 4

5 5 背景应用 : 蛋白质纯化蛋白质纯化过程常需要一些亲和标签, 如 GST-Tag His-Tag 等

6 背景应用 : 定化学计量比多组分表达系统 J. Yang et al., Polyprotein strategy for stoichiometric assembly of nitrogen fixation components for synthetic biology. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 115, E8509-E8517 (2018). 6

7 7 背景应用 : 定化学计量比多组分表达系统将 Klebsiella oxytoca 原本的 18 个基因融合为 5 个巨型基因, 且能够维持原本表达量的化学计量比值 J. Yang et al., Polyprotein strategy for stoichiometric assembly of nitrogen fixation components for synthetic biology. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 115, E8509-E8517 (2018).

8 背景脯氨酸效应 : 现象脯氨酸在寡聚 -1,6 葡萄糖苷酶中的占比与来源菌株的偏好温度呈现显著的正相关关系来源菌株生境特征 Proline % Bacillus cereus ATCC 7064 嗜温菌 2.37 Bacillus coagulans ATCC 7050 兼性嗜温菌 4.63 Bacillus sp. KP 1071 嗜热菌 5.67 Bacillus thermoglucosidasius KP 1006 专性嗜热菌 6.79 Bacillus flavocaldarius KP 1288 极端嗜热菌 8.52 Y. Suzuki, K. Oishi, H. Nakano, T. Nagayama, A strong correlation between the increase in number of proline residues and the rise in thermostability of five Bacillus oligo-1,6-glucosidases. Appl. Microbiol. Biotechnol. 26, (1987). 8

9 背景脯氨酸效应 : 原理脯氨酸具有较强的刚性, 在合适位点引入脯氨酸突变能够稳定蛋白结构, 是一种常用的蛋白质工程策略脯氨酸可限制蛋白质未折叠形式的柔性, 将未折叠形式的熵优势降低 ~1.2 kcal/mol 脯氨酸突变在 β- 转角无规卷曲以及 α- 螺旋和 β- 折叠的 N 端等位点容忍性通常较好 J. Huang, B. J. Jones, R. J. Kazlauskas, Stabilization of an alpha/beta-hydrolase by Introducing Proline Residues: Salicylic Acid Binding Protein 2 from Tobacco. Biochemistry 54, (2015). R. S. Prajapati et al., Thermodynamic effects of proline introduction on protein stability. Proteins 66, (2007). 9

10 背景脯氨酸效应 : 应用通过序列比对以及分子动力学模拟, 确定潜在的突变位点后, 通过定点引入脯氨酸突变的方式将烟草的 SABP 蛋白的 T 1/2 15min 提升了 25.7 J. Huang, B. J. Jones, R. J. Kazlauskas, Stabilization of an alpha/beta-hydrolase by Introducing Proline Residues: Salicylic Acid Binding Protein 2 from Tobacco. Biochemistry 54, (2015). 10

11 背景脯氨酸效应 : 应用通过引入 2 个脯氨酸, 将抗原 S 蛋白稳定在活性构象, 从而激发更高效更持久的免疫反应 ( 在辉瑞及 Moderna 的疫苗生产中已应用 ) 两名共一 :Daniel Wrapp 王年爽 D. Wrapp et al., Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation. Science 367, (2020). 11

12 12 使用完整序列预测结构发现 RCSB PDB 中 TEVp 的结构存在部分片段的缺失 (1Q31) 使用 I-TASSER Sever 预测完整的序列结构, 补全缺失部分用 Swiss-PdbViewer 将预测结果与 1Q31 做拟合

13 分子动力学模拟利用力场能量迭代求解蛋白质分子和溶剂分子中原子的牛顿运动方程, 记录构象在模拟中发生的改变根据热力学定律, 系统往往会趋向于其自由能较低的状态, 也就是稳定的状态可用来解决的问题 : 1. 蛋白质的折叠问题, 获得稳定构象 2. 配体与蛋白质的对接 3. 蛋白质的稳定性问题软件 :Gromacs MODIFIED 13

14 流程图 14

15 M. R. Smaoui, J. Waldispuhl, Computational re-engineering of Amylin sequence with reduced amyloidogenic potential. BMC Struct Biol 15, 7 (2015). 15 根据 PDB 坐标生成拓扑文件命令 :gmx pdb2gmx -f TEVp-I_TASSER.pdb -o conf.gro -p topol.top -ignh 力场 :GROMOS96 53a6 溶剂模型 :SPC

16 16 加立方体模拟盒子命令 :gmx editconf -f conf.gro -bt cubic -d 2.5 -c -o cubic_tevp.gro

17 17 加溶剂命令 :gmx solvate -cp cubic_tevp.gro -o cubic_tevp.pdb -p topol.top

18 18 能量最小化命令 :gmx grompp -f em.mdp -c cubic_tevp.pdb -p topol.top -o em_tevp

19 19 加 7 个 Cl 用于平衡电荷命令 :gmx genion -s em_tevp.tpr -o ION.gro -p topol.top -nn 7 -nname CL

20 20 再次能量最小化, 并记录轨迹命令 :gmx grompp -f em.mdp -c ION.gro -p topol.top -o em_tevp.tpr gmx mdrun -s em_tevp.tpr -deffnm cold v

21 21 查看能量降低情况命令 :gmx energy -f cold.edr -o cold.xvg 选择 Potential( 势能 ) 势能步数

22 体系升温, 查看升温情况命令 :gmx grompp -f upgrade.mdp -c cold.gro -p topol.top -o em_tevp_hot.tpr gmx mdrun -s em_tevp_hot.tpr -v -deffnm hot gmx energy -f hot.edr -o hot.xvg 温度 (K) 时间 (ps) 22

23 23 体系升温过程采样命令 :gmx grompp -f sample.mdp -c hot.gro -p topol.top -o em_tevp_hot_sample.tpr gmx mdrun -s em_tevp_hot_sample.tpr -v -deffnm hot_sample

24 24 计算 RMSD 命令 :gmx rms -s em_tevp_hot_sample.tpr -f hot_sample.trr -o rmsd.xvg 发现 150 ps 时暂未达到热力学稳态, 应继续模拟至 RMSD 值较稳定 RMSD (nm) 时间 (ps)

25 25 计算 RMSF 命令 :gmx rmsf -s em_tevp_hot_sample.tpr -f hot_sample.trr -o rmsf.xvg -res 可见, 各氨基酸残基 RMSF 值相对大小与 I-TASSER Server 预测的 B-factor 基本一致 RMSF (nm) 残基

26 26 确定候选突变位点选择 RMSF 值较高的区域, 要求尽量不在底物结合位点或者活性中心位置选定 T119P K120P M122P 位于 β- 转角位置

27 27 M122P MISSENSE3D 预测该突变会造成结构的改变, 因此排除

28 28 K120P MISSENSE3D 预测该突变不造成结构的改变, 但会导致突变后该分子在突变位点减少一个氢键, 不利于提高热稳定性, 因此排除

29 29 T119P 无结构的改变, 无氢键数目的改变, 因此初步定为较理想的突变位点

30 30 分子动力学模拟 T119P 对结构的稳定效果使用 I-TASSER Server 对突变后的蛋白结构做预测, 用于分子动力学模拟在同样的参数设置下, 模拟结果显示,T119P 的分子在 120 附近的柔性较 WT 减弱, 整体刚性增强, 稳定性增强 RMSF(nm) WT T119 P 残基

31 31 WT 与 T119P 的结构比对预测 T119P 的结构, 发现仍然能够与 WT 有较高的拟合度 WT T119P

32 后续工作延长模拟时间, 获得更为准确的模拟结果 ; 对其他潜在的柔性较高的位点进行同样的突变模拟 ; 计算突变位点对整体结构热力学稳定性的贡献 ; 实验验证热稳定性 ( 包括最适温度变性温度等 ) 是否有提升 ; 实验验证突变后蛋白质的活性溶解性等其他生化参数是否发生改变 32

33 33 谢谢! G05 TEV 蛋白酶热稳定性突变体的理性设计 Rational design of TEV protease mutants with enhanced thermostability

材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析

材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析生物技术通报黄艳燕黄靖华卢福芝孙靓彭立新周兴黄日波利用的方法从鼠李糖乳杆菌基因组中扩增到乳酸脱氢酶基因并连接到载体上构建表达质粒将重组质粒转化大肠杆菌重组菌株经诱导表达电泳分析表明在大肠杆菌中实现了表达表达产物的分子量约为同时采用紫外分光光度法测定乳酸脱氢酶的酶活测得重组菌株的乳酸脱氢酶活力为最适反应温度为最适乳酸脱氢酶克隆表达鼠李糖乳杆菌