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欠阎
3 years ago
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1 三分钟绘制一张优美的 GSEA 图云平台官网 : 绘制韦恩图 : 撰稿人吕枫烨 ( 联系方式 : ) GSEA 作为一种富集方法可以有效弥补根据差异倍数阈值筛选这种方法的疏漏, 能反映一批基因的微量变化的累积所造成的显著功能差异, 在表达差异不那么显著的情况下, 帮我们找到最值得关注的基因本文主要为您迅速绘制一张优美的 GSEA 提供步骤指导 (3-8 要点 ); 另附背景知识了解 (1-2) 和细节优化方法 (9 及之后的要点 ), 可后期慢慢研究调整 ; 同时提供相关分析方法说明 ( 见工具中的分析方法页 ), 为您深入了解提供支持

2 1. 引子 : 了解 GSEA( 知识补充, 已经熟悉的可跳过 ) 举个简单的例子, 我们有一个肿瘤药物敏感组 vs 不敏感对照组我们可以拿到它的表达谱, 我们可以根据差异表达的基因得到一个基因列表 L(gene list) 拿到这个基因列表 L, 你会怎么处理呢? 按照一般的分析套路来说, 我们肯定会关注 top 基因, 看看表达倍数差异大的基因 ( 上调或者是下调的 top 基因 ), 然后拿到这些基因进行分析 ( 通路富集分析, 画热图等等 ) 做 GO,KEGG 通路富集分析最后得到的结果就是值得关注的 top 基因以及通路, 但是如果表达差异不显著但是可能对生物通路很重要的基因则会漏掉取 top 基因分析有什么缺陷吗? 1 经过多重假设检验校正后, 单个基因可能达不到统计学意义的阈值, 因为可能存在背景噪声, 相关的生物学差异不大 2 有些显著性差异表达的基因( 具有统计学意义 ) 但是没有什么生物学意义 3 一系列协同作用的基因会影响细胞的生命活动 ( 与第一条联系起来 ) 单基因分析可能会遗漏对通路的重要影响例如编码代谢途径重要成员的基因上调 20%, 可能会显著改变该途径的通量, 而且可能比单个基因增加 20 倍更为重要 4 当研究相同的生物作用通路时, 这两项研究中具有统计学意义的基因列表可能会很少有重叠 ( 如肿瘤药物敏感组 VS 不敏感组 )

3 2. 了解三种数据分析方法 :( 知识补充, 已经熟悉的可跳过 ) 参考文献 :Khatri P, Sirota M, Butte A J, et al. Ten Years of Pathway Analysis: Current Approaches and Outstanding Challenges[J]. PLoS Computational Biology, 2012, 8(2):e ORA:Over-representation analysis 曾经一段时间, micro array 技术的风靡产生了对下游分析的极大需求, over-representation analysis (ORA) 应运而生, 从一系列基因里根据阈值提取出部分基因进行显著性分析, 也就是统计学常见的 2X2 交叉表格法, 对每个 pathway 进行统计分析, 常见 tests 都建立在 hypergeometric distribution chi-square binomial distribution 等方法上缺陷 : 1) 只考虑了差异基因列表, 并不考虑差异基因的表达情况 ; 2) 只检验了通过设定阈值筛选标准的基因, 对差异微弱的基因并未考虑, 但实际上会造成 bias; 3) 每个基因会作为独立存在事件考虑, 未加入相互影响干扰因素 ; 4) Pathway 也是作为独立存在事件考虑我们日常分析中最常见的 GO/KEGG 分析就是基于这种原理, 虽然老旧但实用

4 2. FCS:Functional Class Scoring Approaches FCA 的推测设想认为虽然强烈的单个基因的改变可以影响到 pathways, 但是微弱的相互协同的功能相关基因的变化也可以拥有这种影响, 所以这种方法的输入数据是一个基因水平的统计数据 ( 标准化后食用更佳 ), 随后把 gene-level 的数据输入到 pathway-level 进行统计, 现有方法包括 Kolmogorov-Smirnov statistic, sum, mean, or median of gene-level statistic, the Wilcoxon rank sum, and the maxmean statistic 等, 最后再做一个显著性检验相对于 ORA,FCS 完善了三个缺陷 : 1) 不需要人为的阈值确定差异基因 list; 2) FCS 使用所有可用的表达水平进行分析 ; 3) FCS 考虑了基因相互间的变化, 解释了基因变化与 pathway 之间的依赖性缺陷 : 1) 类似于 ORA,pathway 之间的分析依旧是彼此独立的 ( 此种原因可以解释为单个基因同时存有多种功能, 在多个 pathway 中发挥作用,overlap 过多的 pathway 就会相互干扰 ); 2) 使用 rank 的方式纵然有着很多优点, 但是忽略了单个基因的变化幅度, 也就是权重本篇所讲述的 GSEA 使用的就是这种原理

5 3. PT:Pathway Topology -Based Approaches 因为 ORA 和 FCS 只考虑了基因而未利用额外的数据信息所以天然的存有着分析短板 PT 就是尝试利用额外的信息进行统筹分析, 但是它其实和 FCS 的分析过程是没有差别的, 唯一的区别在于在进行 gene-level statistics 的时候使用 pathway topology 方法 Rahnenfuhrer et al. 推出的 ScorePAGE, 通过计算相关和协方差的方式来得到类似于 FCS 的 pathway-level 的结果, 但是又综合考虑了两组 gene list 之间需要 connect 的难度从而进行给分, 而不是像 FCS 分配统一权重缺陷 : 1) PT-based 的方法千差万别, 结论也千差万别, 很难界定结果的准确性 ; 2) 精确的分析结果依赖于数据库的信息准确性, 但是细胞特异性的基因表达数据目前还非常不完善, 这也是卡住方法开发的门槛 ; 3) 相关分析无法考虑动态变化, 毕竟生物系统是一个不断协调变化的过程综上所述,GSEA 是目前相对较合适的一种寻找值得关注的基因和通路的方法参考资料 :

6 3. 了解输入数据格式点击示例文件下载查看 (Fig. 1): Fig. 1 Fig. 2 Fig. 3 输入文件必须为 xlsx 格式 (txt xls csv 等均不行 ) 第一列为 ID, 第二列为表达量 (Fig. 2: 如前文所述,GSEA 使用的数据是表达量, 而非 FC 值 ) 输入数据的 ID 必须与基因集中的 ID 是同一种类型, 否则出现 Fig. 3 的报错目前只支持两种 ID 类型 :entrez 和 symbols 上述示例数据用的是 entrez ID, 它是一串只包含数字的基因编号, 在 NCBI 和 KEGG 数据库中均通用上传输入文件前, 必须先选择对应的输入数据的 ID 类型, 否则分析报错 (Fig. 3)

不同数据集可能是包含关系, 如带 all 字样的数据集可能包含该分类下所有其他数据集的内容为避免重复分析, 使用前请先了解相关数据集的内容 1. 当选择最后一项使用自定义的基因集时, 会出现上传文件的功能组件 2.

7 4. 了解基因集当前分析使用的基因集当选择另一个基因集时, 会立即重新分析 1. 提供的基因集全部来自 GSEA 官方提供的数据库 :MSigDB 2. 点击该链接直接跳转至官方下载路径 ( 前提是已注册登录该网站, 反之, 会进入官网的注册登录界面 ) 3. 下图即为该链接点开后的界面, 点击红框内的条目即可下载对应的数据集 4. 不同数据集可能是包含关系, 如带 all 字样的数据集可能包含该分类下所有其他数据集的内容为避免重复分析, 使用前请先了解相关数据集的内容 1. 当选择最后一项使用自定义的基因集时, 会出现上传文件的功能组件 2. 若需要使用自己的基因集, 请按照官方的 gmt 格式整理, 格式说明见 : ats#gmt:_gene_matrix_transposed_file_format_.28.2a.gmt.29

5. 关于 Gene Symbols 和 Gene Entrez ID MSigDB 基因集输入数据如上图, 红框区的数据类型需要对应 (MSigDB 的 3~ 最后列 <=> 输入数据的第一列 ) 只要两个红框内数据对应, 您可以将内容替换成 mirna, 蛋白代谢等, 分析任何组学的数据区别在于基因集是事先根据了解数据库或者文献而整理好的数据,

8 5. 关于 Gene Symbols 和 Gene Entrez ID MSigDB 基因集输入数据如上图, 红框区的数据类型需要对应 (MSigDB 的 3~ 最后列 <=> 输入数据的第一列 ) 只要两个红框内数据对应, 您可以将内容替换成 mirna, 蛋白代谢等, 分析任何组学的数据区别在于基因集是事先根据了解数据库或者文献而整理好的数据, 输入数据是您的实验结果数据 gene symbols: 基因名称是科研工作者按照基因功能起的名字, 通常是对功能描述的缩写 gene entrez id: 基因 ID 是一串数字是 Entrez 对基因的命名方式 *** 了解 entrez ID :

9 6. 上传数据 ( 以示例数据为例 ) 按照顺序分别选择 ID 类型基因集上传输入文件, 上传完成后, 自动开始分析, 等待十几秒即可出图 : 在上传数据前务必确认 ID 类型, 否则上传完成后立即报错退出默认显示 p 值最小的一张图查看具体基因集处的基因集默认按 p 值从小到大排列右边自动显示所选基因集的 p 值

10 7. 输入数据处理默认情况不对您输入的数据进行任何处理, 十分建议您在上传数据前先自行整理 ( 每种组学或者数据情况的整理方式可能不尽相同 ), 如归一化或者去除极值等 ; 若您不便进行处理, 以下数据处理方案供您参考, 但可能未必完全适合您的数据, 请知悉若输入数据没有经过处理,GSEA 的分析结果可能不太理想, 如下图所示 : 1.p 值较大 ( 图例为该次分析所得到的的最小 p 值结果 ); 2. Ranked list metric 图几乎没有内容, 因为极值太大, 导致小的数字在图上几乎不可见

11 同样的数据, 经过数据处理后, 可得到如下结果 : 1.p 值变得显著 ;2. Ranked list metric 图能相对清楚的展示您的数据分布数据处理 : 取 log 值缩小数据间的差距, 有助于分析分布跨数量级的数据, 如 :0.01~1000, 跨了 6 个数量级去除极值 1. 极值可能是噪音, 可以去掉这些数据进行分析, 尝试能否使您的结果更显著 2. 选择去除极值后会显示一个区间范围, 如 2~998, 意为保留数值在总体中排序为 0.2%~99.8% 的数据, 即删除最小和最大的 0.2% 的数据 3. 举个简单例子 : 如图为将数据从小到大四等分, 若您选择 25~75, 即意味着保留值在 0~ 之间的数据 ( 分别为 25% 和 75% 对应的数值 ) 在实际应用中, 考虑到极值的个数只占总数的极小一部分, 我们将数据千等份, 即您可选的数字范围为 1~ 在上个例子中您可能已经观察到,0% 和 25% 所对应的数字均为零, 此时, 填 0~75 和 25~75 的效果是一样的因为在 0%~25% 之间的数字均为零, 在这个区间内, 删除掉任何比例的 0 值数据都将会是一种随机删除的过程, 所以我们不进行删除 z-score 处理一种常见的归一化方法, 公式为 : 不论您以何种顺序选择, 数据处理的顺序始终是先取 log 后去极值最后做 z-score( 同它们在工具中的排列顺序 )

12 8. 分析结果下载如右图所示提供了三种下载方式数据下载 1. 输出数据名决定了该文件名该名称根据输入数据名自动填充如无必要不必修改 2. 该内容为 GSEA 分析的表格结果根据 p 值从小到大排列您可以根据该表决定查看哪个基因集的图片结果 3. 如下图所示做完一次分析后您可以先查看表格结果挑选一些图片进行查看然后决定是否需要调整参数重新分析杭州联川生物技术股份有限公司杭州经济技术开发区下沙 6 号大街 260 号中自科技园 16 幢 4 层邮编电话传真

图片下载 1. 输出图片名决定了该文件名, 该名称根据所选基因集 p 值类型和该基因集的对应类型 p 值自动填充, 如无必要不必修改 2. 输出图片类型决定了图片后缀和类型, 其中,pdf 和 svg 是矢量图,png 和 tiff 是高清非矢量图, 其分辨率已经标注 ( 足够用来发文章 ) 3. 图片高度和宽度用于决定图片大小, 同时还有以下作用 : A. 调整图片比例 ; B.

13 图片下载 1. 输出图片名决定了该文件名, 该名称根据所选基因集 p 值类型和该基因集的对应类型 p 值自动填充, 如无必要不必修改 2. 输出图片类型决定了图片后缀和类型, 其中,pdf 和 svg 是矢量图,png 和 tiff 是高清非矢量图, 其分辨率已经标注 ( 足够用来发文章 ) 3. 图片高度和宽度用于决定图片大小, 同时还有以下作用 : A. 调整图片比例 ; B. 调整字号, 若原图为 7x7, 改为 14x14 后, 图片视觉比例不变, 但是图中的字号看上去小一半 4. 该按键只能下载当前展示的图片, 用于下载您感兴趣但是 p 值不够显著的基因集图片打包下载 1. 打包下载的内容包括 : A. GSEA 分析的表格结果 ; B. 根据您选择的 p 值类型和阈值筛选出 top10 的基因集, 并根据您选择的图片类型做出相应图片 ; C. 本次分析所使用的参数, 方便您后续回溯见右图 2. 因为要绘制十张图片, 打包下载可能耗时较久, 建议您测试考虑成熟后再最终打包下载 3. 那些您关注的但是并不在 p 值最显著的 10 张图中的基因集建议您使用图片下载功能来下载

14 9. 分析参数调整一般情况下, 推荐您使用默认的参数值, 此部分的参数调整不是必须的若您有明确的需求, 可以在这个界面进行调整 p 值类型和阈值 : 决定进行阈值筛选的 p 值类型如下图所示, 分析结果中给出三种 p 值类型 1. 默认输出 pvalue(p 值类型 )<0.05( 阈值 ) 的数据表格 ; 2. 默认展示 pvalue<0.05 的基因集的图片 ( 即决定了查看具体基因集中可选择的基因集 )

15 step 权重和置换次数 : 与计算 ES 值的算法有关, 在此不再赘述, 感兴趣的可以去 GSEA 官网查看相关资料 ( 修改这两个值会改变分析结果, 包括 ES NES 和 p 值等 p 值矫正算法 : 计算 p.adjust 值的算法基因集大小 : 包含的基因个数在这个范围内的基因集才会进行分析若基因集内基因个数太小, 分析结果不具有统计学意义, 基因集内基因个数太多, 容易得到 p 值显著的结果, 但是范围太广不利于您筛选目标基因 10. 绘图参数调整图片标题 : 可以为空, 但是不能出现中文选择绘制的图片 :GSEA 的分析结果图片从上到下由三张图片组成 ES 图热图和 Rank 图, 您可以根据您的情况调整图片 1. 调整图片顺序 ;2. 删除某张图 ( 如 Rank 图绘制效果不理想 ) 字号 : 可以调整字体大小 ( 除了下图红框内的文本 ) ES 颜色 : 决定了 ES 图的线 / 点和图内的基因集名称的颜色可以修改, 既可以是 # 开头的颜色命名方式, 也可以是 R 语言内置的颜色名, 参考使用说明中的参考的颜色值 ES 图形类型 : 线或点在图中绘制 p 值 : 决定了如图内容是否显示

一登录 crm Mobile 系统 : 输入 ShijiCare 用户名和密码, 登录系统, 如图所示 : 第 2 页共 32 页

一登录 crm Mobile 系统 : 输入 ShijiCare 用户名和密码, 登录系统, 如图所示 : 第 2 页共 32 页第 1 页共 32 页 crm Mobile V1.0 for IOS 用户手册一登录 crm Mobile 系统 : 输入 ShijiCare 用户名和密码, 登录系统, 如图所示 : 第 2 页共 32 页二 crm Mobile 界面介绍 : 第 3 页共 32 页三新建 (New) 功能使用说明 1 选择产品第 4 页共 32 页 2 填写问题的简要描述和详细描述第 5 页共