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1 临床与病理杂志 J Clin Pathol Res 2019, 39(1) doi: /j.issn View this article at: 肿瘤相关血小板 RNA 用于恶性肿瘤液体活检的研究进展范怡畅综述俞静审校 ( 首都医科大学附属北京友谊医院肿瘤中心, 北京 ) [ 摘要 ] 随着精准医疗概念的提出, 恶性肿瘤的早期筛检及基于肿瘤基因检测的靶向治疗成为一个重要的研究方向对肿瘤组织进行病理诊断并进行相关基因检测是目前进行肿瘤诊断和制定治疗策略的重要基石组织活检因其有创性高风险性难以重复性及异质性, 在临床应用中受到一定的限制而液体活检则是组织活检有效的补充, 它是一种新型的微创检测方法, 可通过分析个体化的基因表达谱, 提高检测的准确性, 降低检测成本目前液体活检方法如循环肿瘤 DNA(circulating tumor DNA,ctDNA) 循环肿瘤细胞(circulating tumor cell,ctc) 血小板 RNA 等用于肿瘤检测的研究已取得一定的进展 [ 关键词 ] 肿瘤相关血小板 RNA; 非小细胞肺癌 ; 液体活检 Research progress of tumor-educated platelets RNA in liquid biopsy of non-small cell lung cancer FAN Yichang, YU Jing (Center of Oncology, Beijing Friendship Hospital, Capital Medical University, Beijing , China) Abstract Keywords With proposing the concept of precision medicine, early diagnosis of malignant tumor and targeted therapy based on tumor gene detection have become an important development trend. Pathological analysis and related genetic analysis of the tumor tissue are important criteria for tumor diagnosis and treatment. Tissue biopsy is restricted in clinical application because of invasive, high risk, difficult repeat-ability and heterogeneity. And liquid biopsy is a kind of new minimally invasive detect method to analyze individualized gene expression profiles, supplying for tissue biopsy. Moreover, it could improve the accuracy of detection and reduce the testing cost. Currently, circulating tumor DNA (ctdna), circulating tumor cells (CTC), platelet RNA has been used for liquid biopsy and made some progress. tumor-educated platelets RNA; non-small cell lung cancer; liquid biopsy 收稿日期 (Date of reception): 通信作者 (Corresponding author): 俞静, yujing026@163.com 基金项目 (Foundation item): 国家自然科学基金 ( ); 首都卫生发展科研专项项目 ( ); 首都医科大学基础 - 临床科研合作基金 (17JL14); 首都医科大学附属北京友谊医院科研启动基金 (yyqdkt2016-4) This work was supported by the National Natural Science Foundation ( ), Capital Health Research and Development of Special Project ( ), Basic-Clinical Cooperation Program from Capital Medical University (17JL14), and Research Foundation of Beijing Friendship Hospital, Capital Medical University (yyqdkt2016-4), China.

2 194 临床与病理杂志, 2019, 39(1) 近几年, 恶性肿瘤的早期筛检及基于肿瘤基因检测的靶向治疗成为重要的研究热点对肿瘤组织进行病理分析及相关基因学分析是目前进行肿瘤诊断和指导治疗的重要前提, 但仅仅从组织活检中获得的肿瘤信息还不尽完善, 有时并不能准确全面地反映组织的异质性 [1-2] 另外, 肿瘤组织活检属于侵入性检查, 这不仅限制了二次活检的可行性, 并且临床上有一部分患者确诊时已为晚期, 患者身体虚弱, 不能耐受有创操作以获取足够的肿瘤组织进行分子检测液体活检是一种新型的微创检测方法, 可根据个体化的表达谱来提高检测的准确性, 降低检测成本, 另外也可以进行基因学分析, 作为组织活检的补充血液富含信息来源, 通过它可以检测识别和分类实体肿瘤及其亚型, 辅助指导治疗每毫升血液中约含有 2~5 亿个血小板, 在保证高质量 RNA 和主要肿瘤 RNA 特征的同时, 整个血液还可以在室温下储存 48 h [3] 这些特点使得血小板具有很高的诊断 [4] 价值研究证实这种微创检验方法可以用来辅助诊断监测肿瘤的发生发展分析基因状态并指导治疗等目前循环肿瘤 DNA(circulating tumor DNA,ctDNA) 循环肿瘤细胞 (circulating tumor cell, CTC) 血小板 RNA 等液体活检方法用于肿瘤诊断方面的研究已取得很大进展其中血小板 RNA 用于肿瘤的检测已经在非小细胞肺癌 (nonsmall cell lung cancer,nsclc) 乳腺癌结直肠癌胰腺癌神经胶质瘤胆管癌等恶性肿瘤中开展了相关临床研究 [4] 本文就血小板 RNA 用于液体活检的研究进展作一综述, 现报告如下 1 血小板的功能血小板是人体重要的无核血细胞, 含有丰富的 RNA, 包括信使 RNA(messenger RNA, mrna) 转运 RNA(transfer ribonucleic acid RNA, trna) 核糖体 RNA(ribosomal RNA,rRNA) 核仁小分子 RNA(small nucleolar RNA,snoRNA) 微小核糖核酸 (micro RNA,miRNA) 等在生理情况 [5-6] 下, 研究证实血小板参与机体促凝血抗炎等多种生理功能此外, 血小板还可以分泌促进细胞生长和血管生成的生长因子其还能吸引其他血细胞, 如单核细胞和粒细胞, 这可能有助于营造转移前微环境 [7] 而在肿瘤微环境相关研究领域 [3] 中, 研究揭示血小板能促进肿瘤的增殖侵袭血管生成等恶性生物学行为 2 血小板与肿瘤的相互关系及肿瘤相关血小板的形成在肿瘤发生发展过程中, 肿瘤细胞可以通过直接或间接的方式通过不同的信号分子或受体影响血小板, 整合改变血小板 RNA 信息及蛋白质含量, 形成肿瘤相关血小板 (tumor-educated platelets,teps), 通过多种途径参与肿瘤细胞的增殖和转移一方面, 肿瘤细胞主要通过释放血小板活化受体选择素 P, 刺激血小板, 使其释放多种生长因子和促血管生成因子, 如促血管生成素 (ANGPT1), 血小板源性生长因子 (platelet derived growth factor,pdgf) 成纤维细胞生长因子 (basic fibroblast growth factor, BFGF) 表皮生长因子 (epidermal growth factor,egf) 肝细胞生长因子 (hepatocyte growth factor,hgf) 胰岛素样生长因子 (insulin like growth factor-1,igf1) 转化生长因子 (transforming growth factor β,tgfβ), 血管内皮生长因子 -A(vascular endothelial growth factor-a, VEGF-A) 和血管内皮生长因子 -C(VEGF-C) TEPs 可释放这些因子到肿瘤微环境中, 参与肿瘤的生长及转移 [6] 此外, 血小板还可以向肿瘤细胞转移 MHC I 类蛋白, 从而参与肿瘤细胞的免疫逃逸, 使之免受自然杀伤 (NK) 细胞的识别及破坏血小板也可以在 CTC 周围形成肿瘤细胞 - 纤维 - 血小板的聚集体, 同样具有保护肿瘤细胞免受 NK 细胞识别破坏的作用 [3] 另一方面, 血小板可以通过囊泡的方式摄取肿瘤细胞特有的 mrna, 如点突变的驱动基因新的融合基因, 还有一些非编码 RNA, 这些 RNA 能够进一步调控血小板 mrna 的表达剪接如肿瘤来源的血小板因子 4(PF4,CXCL4) 能够促进 NSCLC 患者骨髓巨核细胞介导的血小板生成 [8] 另外, 通过 RT-PCR 技术和深度扩增测序法, 研究人员在 NSCLC 患者的 TEPs RNA 中, 可以检测到具有肿瘤特异性的棘皮动物微管相关蛋白 4 和间变淋巴瘤激酶的融合基因 (echinoderm microtubule associated protein like 4-Anaplastic lymphoma kinase,eml4-alk) Kirsten 鼠肉瘤基因 (Kirsten rat sarcoma,kras) 和表皮生长因子受体 (epidermal growth factor receptor,egfr) 的点突变 [1], 这一技

3 肿瘤相关血小板 RNA 用于恶性肿瘤液体活检的研究进展范怡畅, 等 195 术使得血小板 RNA 在基因检测方面的应用具有可行性 3 液体活检的优势目前的肿瘤诊断依赖于将肿瘤进行切除并进行病理学检查以及相关基因学分析, 最常用的是新鲜肿瘤组织或 4% 中性甲醛固定的石蜡组织 [9] 但仅从组织活检中获得信息还不完善, 有时候限制了对肿瘤进行快速定性, 甚至有时候并不能准确反映组织的异质性 [2] 另外, 肿瘤组织活检属于侵入性检查, 这限制了重复性应用 ( 肿瘤治疗需要追踪疗效以及动态监测对治疗的耐药性 ) 而液体活检是一种新型的无创检测方法, 可根据个体化的表达谱来提高检测的准确性, 降低检测成本, 作为组织活检的补充, 可以提供精确的综合性的分子诊断信息, 也可以在多个维度上反映肿瘤微环境的相关信息, 并且还可以达到 :1) 早期筛检肿瘤 ;2) 预测患者的肿瘤分期和转移 ;3) 为个体化治疗寻找新靶点 ;4) 肿瘤治疗前分类 / 预测疗效 ;5) 早期治疗监测, 实时性分析疗效 ;6) 动态观察疾病的复发和转移 [3,9] 4 TEPs RNA 在液体活检中的应用 4.1 TEPs RNA 基因测序用于肿瘤诊断血小板可以通过简单的离心步骤从血液中分离出来, 其 RNA 易于纯化, 利于检测基因融合和剪接体等 [10] 通过对 TEPs 中 RNA 测序, 可以识别多种与趋化因子细胞黏附聚集和细胞相互作用相关的蛋白编码基因, 从而诊断出不同种类的肿瘤 [11] [1] Best 等对 283 个血小板样本进行了 RNA 测序, 包括健康人 (n=55) 和肿瘤患者 ( n=228), 癌症类型 : 胶质母细胞瘤 NSCLC 结直肠癌胰腺癌乳腺癌肝癌和胆管癌利用癌症患者和健康人的不同 TEPs RNA 谱, 开发一种新型的预测算法, 可以用于确诊恶性肿瘤 ( 准确率约 96%) 判断肿瘤类型 ( 准确率约 71%) 以及肿瘤的分子突变亚型 ( 准确率 85%~95%) [1] [12] 此后,2017 年 Best 等将临床样本从 2015 年的 283 例扩展到了 779 例, 其中包括 402 例诊断为早期或晚期 NSCLC 的病例组, 以及 277 例包括了多发性硬化症慢性胰腺炎等疾病的对照组研究人员采集全血样本之后, 首先分离出富含血小板的血浆, 再利用 OptiPrep 密度梯度离心方法分离出血小板, 将分离出的血小板利用 Clontech 和 Illumina 的文库制备试剂盒进行建库, 并在 HiSeq 2500 平台上测序通过 ThromboSeq 技术对 TEPs RNA 分析, 早期肺癌诊断准确率可达 81% 曲线下面积 (AUC) 为 0.89, 晚期转移性肺癌诊断准确率为 88%,AUC 为 0.94; 在年龄吸烟状况和血液储存时间短的实验组中, 该算法的准确度高达 91% [12] 2018 年 [9] Wurdinger 团队通过 ThromboSeq 技术, 发现分析 TEPs RNA 还可识别前列腺癌 PCA3, KLK3, FOLH1,NPY, 乳腺癌 PIK3CAΔ,HER2+, 胶质瘤 EGFRvIII, NSCLCKRAS, EGFR, PIK3CA, HER2 突变等生物标志物 4.2 TEPs RNA 用于基因测序及指导靶向治疗用药 EGFR 基因及相关通路蛋白 EGFR 基因是 NSCLC 的驱动基因之一, 可以刺激肿瘤细胞异常增殖分化, 是肿瘤发生发展的重要因素之一目前 30%~40% 的 NSCLC 患者在确诊时携带 EGFR 基因突变 [13] 表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂 (epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor,egfr-tki) 已广泛应用于 EGFR 基因敏感突变的晚期 NSCLC 患 [14] 者的治疗, 更有 ARCHER 1050 研究发现第二代 EGFR-TKI 达可替尼可使中位无进展生存期达到 14.7 个月, 总生存期更是可达 34.1 个月这些 EGFR 基因敏感突变的突变率约为 37.3%, 主要包括 L858R,19-Del,18 和 20 外显子突变等, 其中前 2 种突变约 90% [15] 然而, 在应用 EGFR-TKI 的过程中, 一些初始治疗有效的患者在 1~2 年内会出现获得性耐药 [16] 既往研究表明 :EGFR-TKI 获得性耐药机制中约 50% 归因于 T790M 突变 ( 突变率约 7%), 另外还包括 KRAS 基因突变 ( 突变率约 32.2%) 磷酸肌醇 3 激酶 (phosphotylinosital 3 kinase,pik3ca) 突变 ( 突变率约 2%) c-met 原癌基因突变 ( 突变率约 4.2%) HER-2 突变 ( 突变率约 2%) [17] 为明确耐药原因, 临床常规推荐组织二次活检但组织活检因其具有创伤性风险大及异质性等特点, 使其应用受限而液体活检则可以作为组织活检的一 [18] 种替代或补充方法有研究者取局限性或转移的 NSCLC 患者血小板标本进行检测, 利用 SVM/ LOOCV 算法分析, 并与组织基因检测结果相比, 发现 TEPs RNA 谱与组织 mrna 谱有较高的一致性 (kappa 值 =0.795~0.895, P<0.05), EGFR 突变准确度达 87%,KRAS 突变准确度达 90%,MET 检测

4 196 临床与病理杂志, 2019, 39(1) 准确度达 91% 因此, 通过对 TEPs RNA 谱进行分析, 可用于基因测速并指导靶向治疗用药 EML4-ALK 融合基因肺癌患者中 EML4-ALK 基因融合, 促使肺癌发生和进展克唑替尼 (Crizotinib) 是治疗 ALK 阳 [19] 性 NSCLC 有效的靶向药物有研究利用患者血小板, 采用 RT-PCR 方法, 检测到晚期肺癌患者 EML4-ALK 融合基因的表达率约 5%, 其中血小板 RNA 检测的灵敏度为 65%, 特异性为 100%, 而血浆 RNA 检测的灵敏度为 21%, 特异性为 100% [20] 此外,ALK 阳性 NSCLC 患者接受克唑替尼治疗后, 不可避免地在 1~2 年内相继发生耐药在使用克唑替尼治疗的患者血小板中的 EML4-ALK 重组的持久性与肿瘤的进展和预后不良有关, 可以用来预测和监测克唑替尼的治疗效果 [21] 5 结语目前 ctdna 和 CTC 用于肿瘤诊断的检测方法已取得了很大进展, 但存在含量少以及不稳定等不足而基于血小板的液体活检在检测个体化治疗的相关分子靶点方面有很大的潜力, 通过对 TEPs 中 RNA 测序, 不仅可以辅助诊断肿瘤类型及亚型, 也可以检测基因突变, 用于指导靶向治疗用药但目前 TEPs RNA 用于液体活检的大多临床研究还处于探索阶段, 还需要进一步大规模研究和临床验证参考文献 1. Best MG, Sol N, Kooi I, et al. RNA-seq of tumor-educated platelets enables blood-based pan-cancer, multiclass, and molecular pathway cancer diagnostics[ J]. Cancer Cell, 2015, 28(5): Clancy L, Freedman JE. The role of circulating platelet transcripts[ J]. J Thromb Haemost, 2015, 13(Suppl 1): S33-S Sol N, Wurdinger T. Platelet RNA signatures for the detection of cancer[ J]. Cancer Metastasis Rev, 2017, 36(2): Kanikarla-Marie P, Lam M, Menter DG, et al. Platelets, circulating tumor cells, and the circulome[ J]. Cancer Metastasis Rev, 2017, 36(2): Bardelli A, Pantel K. Liquid biopsies, what we do not know (yet)[ J]. Cancer Cell, 2017, 31(2): Franco AT, Corken A, Ware J. Platelets at the interface of thrombosis, inflammation and cancer[ J]. Blood, 2015, 126(5): Stegner D, Dütting S, Nieswandt B. Mechanistic explanation for platelet contribution to cancer metastasis[ J]. Thromb Res, 2014, 133 Suppl 2: S149-S Feller SM, Lewitzky M. Hunting for the ultimate liquid cancer biopsy let the TEP dance begin[ J]. Cell Commun Signal, 2016, 4(1): Best MG, Wesseling P, Wurdinger T. Tumor-educated platelets as a noninvasive biomarker source for cancer detection and progression monitoring[ J]. Cancer Res, 2018, 78(13): 范军振, 石怀银. 晚期非小细胞肺癌 EGFR-TKIs 耐药机制及外周血 ctdna 基因检测的研究进展 [ J]. 诊断病理学杂志, 2018, 25(2): FAN Junzhen, SHI Huaiyin. Research progress on the mechanism of EGFR-TKIs resistance non-small lung cancer and gene detection of ctdna in peripheral blood[ J]. Chinese Journal of Diagnostic Pathology, 2018, 25(2): Molina-Vila MA, Mayo-de-Las-Casas C, Giménez-Capitán A, et al. Liquid biopsy in non-small cell lung cancer[ J]. Front Med (Lausanne), 2016, 3: Best MG, Sol N, In t Veld SGJG, et al. Swarm intelligence-enhanced detection of non-small-cell lung cancer using tumor-educated platelets[ J]. Cancer Cell, 2017, 32(2): e Bello M. Binding mechanism of kinase inhibitors to EGFR and T790M, L858R and L858R/T790M mutants through structural and energetic analysis[ J]. Int J Biol Macromol, 2018, 118(Pt B): Mok TS, Cheng Y, Zhou X, et al. Improvement in overall survival in a randomized study that compared dacomitinib with gefitinib in patients with advanced non-small-cell lung cancer and EGFR-activating mutations[ J]. J Clin Oncol, 2018, 36(22): 杨耀湘. 非小细胞肺癌患者 ALK EGFR KRAS 基因的检测及临床病理特征 [ J]. 中国现代药物应用, 2018, 12(8): YANG Yaoxiang. Gene detection of ALK, EGFR, KRAS and clinicopathologic features in patients with non-small cell lung cancer[ J]. Chinese Journal of Modern Drug Application, 2018, 12(8): Otsuka K, Hata A, Takeshita J, et al. EGFR-TKI rechallenge with bevacizumab in EGFR-mutant non-small cell lung cancer[ J]. Cancer Chemother Pharmacol, 2015, 76(4): Sorber L, Zwaenepoel K, Deschoolmeester V, et al. Circulating cellfree nucleic acids and platelets as a liquid biopsy in the provision of personalized therapy for lung cancer patients[ J]. Lung Cancer, 2017, 107: Joosse SA, Pantel K. Tumor-educated platelets as liquid biopsy in cancer patients[ J]. Cancer Cell, 2015, 28(5):

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