霍乱弧菌Tat基因共转录和不同弧菌Tat基因簇同源性分析

Size: px

Start display at page:

Download "霍乱弧菌Tat基因共转录和不同弧菌Tat基因簇同源性分析"

市费
4 years ago
Views:

1 霍乱图 8 表 3 参 16 占 6 面发排稿霍乱弧菌双精氨酸转运系统基因共转录和同源性分析朱召芹陈海丽周海健景怀琦闫梅英宰淑蓓蔡金凤胡芸文阚飙 DOI: /cma.j.issn 基金项目 : 国家十二五科技重大专项 (2012ZX ZX ); 国家自然科学基金青年基金 ( ); 上海市卫生局青年基金 ( );2013 年上海市公共卫生临床中心启动基金作者单位 : 上海市公共卫生临床中心病原体应急检测与生物安全部 ( 朱召芹陈海丽胡芸文 ), 医学检验科 ( 宰淑蓓蔡金凤 ); 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 ( 周海健景怀琦闫梅英阚飙 ) 通信作者 : 阚飙, kanbiao@icdc.cn 摘要目的研究霍乱弧菌双精氨酸转运系统 (twin-arginine translocation system, Tat) 基因簇各个基因的共转录情况, 并确定参与 Tat 转录基因簇构成方法选择霍乱弧菌 El Tor 型菌株 N16961 和 tatabc 基因缺失株 N169-dtat 进行 Tat 基因簇及上下游基因, 即上游蛋白质生物合成 ubi aarf 基因和下游细胞色素 C551 过氧化物酶 cyt551 基因进行转录分析选择霍乱弧菌及其他弧菌属菌株, 通过 PCR 产物测序和序列比对, 对 Tat 转运系统的同源性进行比较, 进行 Tat 基因簇各基因聚类分析结果 Tat 基因簇 4 个基因 (tata tatb tatc 和 tate) 均可以共转录 Ubi aarf 基因可以与 tata 及 tatb 共转录 Cyt551 基因与上游的 4 个基因均不共转录 ; 通过 N16961 Tat 基因缺失株总 RNA 逆转录分析发现, 虽然 ubi aarf 与 tata tatb 的共转录由于基因缺失被阻断, 但该基因仍可以被分别转录不同型别的霍乱弧菌和其他弧菌属的菌株 tata tatb tatc tate 和 tatabc 基因聚类分析结果表明,Tat 基因簇的种属变异性很小, 是一段很保守的序列结论霍乱弧菌 ubi aarf 基因与 Tat 基因簇可能共同受调控因子的作用 ;Tat 基因在弧菌属中属于保守结构关键词弧菌, 霍乱 ; 基因 ; 序列同源性 Analysis of twin-arginine translocation system gene homology and transcription in Vibrio species Zhu Zhaoqin *, Chen Haili, Zhou Haijian, Jing

2 Huaiqi, Yan Meiying, Zai Shubei, Cai Jinfeng, Hu Yunwen, Kan Biao. * Pathogen Diagnosis and Biosafety department, Shanghai Public Health Clinical Center, Fudan University, Shanghai , China Corresponding author: Kan Biao, kanbiao@icdc.cn Abstract Objective To determine the function of twin-arginine translocation system(tat)and gene cluster in Vibrio strains and to analyze the homology of tat gene cluster among different Vibrio spp. strains based on N16961 and tatabc mutant strains N169-dtat. Methods Different serotypes of biotype strains of Vibrio spp. were selected to detect the transcription of 4 genes of Tat transport system and upstream ubi aarf gene and downstream cyt551 gene by the total RNA reverse transcription and homologicity of the gene cluster by sequencing analysis. Results Our results showed that the 4 genes of tat cluster (tata, tatb, tatc, and tate) were intragenic and co-transcribed. We found that ubi aarf gene could be co-transcribed with tata, tatb, but not with tatc. The electron transport chain and energy metabolism-related genes, cytochrome C551 peroxidase gene, and 4 genes located at upstream of tatabc operon were not transcribed with tatabc. Although the co-transcription between ubi aarf and tatab was blocked in N169-dtat strain, they were still transcribed separately. Homologous analysis of genes of tat cluster in different types of V. cholerae showed that tat gene cluster was a very conservative. Conclusion The ubi and aarf gene might be co-transcribed with genes of tat cluster in V. cholerae, which and the close relationship showed that they might play a key function in V. cholerae. Key words Vibrio cholerae; Genes; Sequence homology 双精氨酸转运系统 (twin-arginine translocation system,tat) 是 1997 年 Settles 等 [1] 发现的存在于植物类囊体膜中的蛋白质运输系统, 运输底物为完全折叠蛋白质并结合一定的氧化还原因子 [2], 与经典的分泌途径转运系统 (Sec 转运系统 ) 不同目前, 已经发现 Tat 系统主要基因在许多细菌中存在, 包括大肠埃希菌幽门螺杆菌鼠疫耶尔森菌沙门菌铜绿假单胞菌结核分枝杆菌霍乱弧菌流感嗜血杆菌葡萄球菌等 [3-5] 我们前期通过对基因同源比较分析, 推定霍乱弧菌存在 Tat 转运系统的主要基因但是, 霍乱弧菌 Tat 转运系统的操纵子和转录起始位点还未知, 其结构基因与上下游基因的共转录

3 关系需要明确, 同时, 弧菌属中是否具有 Tat 系统其序列保守性及与弧菌不同种分化背景下的遗传进化关系也值得分析材料与方法 1. 菌株 : 为了确定 Tat 基因簇的转录, 选择不同血清型和生物型的霍乱弧菌代表株进行 Tat 基因簇 4 个基因的共转录分析 [15] 首先确定 Tat 基因簇各基因之间是否发生共转录, 进一步确定霍乱弧菌的 Tat 基因簇的功能单元组成, 除此之外, 还要根据 Tat 基因簇的位置, 确定上下游基因, 即与细菌蛋白生物合成与能量代谢有关的蛋白质的生物合成 ubi aarf 基因 (VC0085) 和细胞色素 C551 过氧化物酶 cyt551 基因 (VC0089) 是否参与共转录, 寻找 Tat 基因簇和上下游基因之间可能存在的关联转录同时选择不同霍乱弧菌代表株 ( 包括 O1 古典型 O139 O1 El Tor O22 非凝集弧菌等 ) 和拟态弧菌 (V. mimicus) 弗尼斯弧菌 (V. furnissii) 河弧菌 (V. fluviolis) 副溶血弧菌(V. parahaemolyticus) 创伤弧菌(V. vulnificus) 等其他弧菌, 进行 Tat 基因簇 4 个基因比较, 初步分析弧菌属携带 Tat 基因状况及 Tat 基因簇的序列遗传差异所用的菌株见表 1 表 1 实验用菌株的菌属特征血清型毒素产生情况及来源描述编码菌属特征霍乱毒素来源 A VP20( 河弧菌 ) / - 本实验室保存 B Vm7( 拟态弧菌 ) / - 本实验室保存 C Vv1( 创伤弧菌 ) / - 本实验室保存 D Vms3( 麦氏弧菌 ) / - 本实验室保存 E Vfns1( 弗尼斯弧菌 ) / - 本实验室保存 F1 ICDC-VP133( 副溶血弧菌 ) / - 秦皇岛 F2 ICDC-VP24( 副溶血弧菌 ) / - 印度 G 569B( 霍乱弧菌 ) O1 古典生物型 + 本实验室保存 H MO45( 霍乱弧菌 ) O139 + 本实验室保存 I Wujiang-2( 霍乱弧菌 ) O1 埃尔托生物 + 本实验室保存型 J JS32( 霍乱弧菌 ) O1 埃尔托生物 - 本实验室保存型 K 4-7( 霍乱弧菌 ) O1 埃尔托生物 - 本实验室保存

4 型 L 19-22( 霍乱弧菌 ) O1 埃尔托生物 - 本实验室保存型 M N53( 霍乱弧菌 ) 非凝集弧菌 - 本实验室保存 N ( 霍乱弧菌 ) O22 - 本实验室保存 O B4( 霍乱弧菌 ) O139 - 本实验室保存 P 94001( 霍乱弧菌 ) 本实验室保存 N16961 N16961( 霍乱弧菌 ) O1 埃尔托生物 + 本实验室保存型 N169-dtat tatabc 变异 / + 本实验室构建注 : + 表示产生霍乱毒素, 表示不产生霍乱毒素 ; / 表示未进行血清分型 2. 试剂 : 胰蛋白胨酵母提取物购自上海普迈生物科技有限公司 ;rtaq 聚合酶购自宝生物工程 ( 大连 ) 有限公司 ; 染色体提取试剂盒细菌总 RNA 提取试剂盒 RNeasy Mini Kit 购自凯杰生物技术 ( 上海 ) 有限公司 ;Super Scrip TM Ⅲ 购自上海普迈生物科技有限公司表 2 霍乱弧菌双精氨酸转运系统基因共转录实验用引物引物名称序列 (5'~3') 靶基因基因预测名称 82-P1 GAATCTGGGCTGCGCGAAGGG VC P1 CATTCTCGATTTGGGCGGCGG VC0083 长度 (bp) 与前一基因间隔 (bp) 84-P1 CTATCTGGCATTAAACCTCTC VC P1 GTTTCGCGACAGTTTCTTCCA VC0085 ubi aarf P2 CCAAGCCTTCGACATACAGCA VC P1 CTTATCATTGCAGTGATCGTG VC0086 tata P2 GACGCATTGGTTTTGGCCTGC VC P1 TCGCTATTGTGGCGCTGGTGG VC0087 tatb P2 TGCGACGCGCTATCGAGGCGA VC P3 AGCGATTACCCCATGCGATTC VC P4 TCACTGCTCGGCGTTGCGGCG VC P1 CAACCTTTGATCAGCCATTTG VC0088 tatc P2 ATAAAAACGAGCGAAGAACAA VC P1 GAGTTTGAAAAGACCTTAGTG VC0089 cyt P2 GCCACTATCTTACCGTTTTCA VC P1 GCTACCGTCAGTCACTTCTTT VC0532 DNA bin 692

5 32-P2 GTAGCACTCGGTCACCACTCC VC P1 CTCTTAATCTTGGGGTGTATT VC0533 tate/tata P2 CTCTTGCTCAATAGCGAAGCT VC P1 GTACCACGCGATCTAACCACT VC0534 deda P2 ATCCAGAATTAGCCAGCAAGT VC 总 RNA 提取 : 按照试剂盒的操作步骤提取电泳和 PCR 验证是否有 RNA 的降解和 ( 或 ) DNA 的污染, 确定 RNA 的浓度和纯度提取样品的总 RNA 后, 根据 RNA 的凝胶电泳图来判断 RNA 的质量 RNA 的质量判断标准是有清晰的 23 S 和 16 S 条带, 无降解, 且肉眼观察 23 S 条带亮度约是 16 S 的 1~2 倍细菌 23 S 和 16 S 大小分别约为 2.9 kb 和 1.5 kb; 同时选用 1~2 对引物进行 PCR 扩增, 以排除 DNA 污染 4.PCR 检测 :10 µmol/l 上下游引物各 1 µl, 总 RNA 10 µl,dntp 4 µl, 加水补至 20 µl 65 放置 5 min 后冰上放置 1 min 以上, 向以上体系中继续加入 :5 缓冲液 4 µl 0.1 mol/l 二硫苏糖醇 (DTT) 和 Super Scrip TM Ⅲ 各 1 µl 50 1 h 后 min 向以上体系中加入 RNase H,37 作用 30 min, 以去除多余的 RNA 10 缓冲液 dntp 10 µmol/l 上下游引物 Taq 酶模板各 2 µl, 补三蒸水 (TDW) 至 20 µl PCR 扩增参数 :94 5 min, s,50 35 s,72 2 min,35 个循环 5. 数据分析 : 使用分子进化遗传分析软件 Mega 5.0 采取 Clustalw 方法进行基因进化树和蛋白序列比对分析, 构建进化树共转录分析用 Photoshop 软件进行展示结果 1.N16961 全序列上 Tat 转运系统基因簇的位置关系 : 通过已测序的霍乱弧菌标准株 N16961 基因组与大肠埃希菌 tatabcd 操纵子同源比较分析, 推定霍乱弧菌 N16961 存在 Tat 转运系统的主要基因与其他革兰阴性菌相比,El Tor 霍乱弧菌 N16961 的 Tat 系统的基因结构是独特的 tata(vc0086) tatb(vc0087) 和 tatc(vc0088) 位于 Ⅰ 号染色体上, 与大肠埃希菌不同的是, 在霍乱弧菌 N16961Ⅰ 号染色体上没有发现与大肠埃希菌 tate 同源性高的基因片段, 与大肠埃希菌 tate 基因同源性高的 tata2 基因 (VCA0533) 位于霍乱弧菌的小染色体上 (Ⅱ 号染色体 );tatabc 基因簇附近没有 tatd 基因与细菌蛋白生物合成与能量代谢有关的蛋白质的生物合成 ubi aarf 基因 (VC0085) 和细胞色素 C551 过氧化物酶 cyt551 基因 (VC0089) 位于 tatabc 基因簇的上下游, 见表 2 2. 霍乱弧菌 El Tor 菌株 N16961 Tat 基因簇共转录分析 : 以 TDW 和用于逆转录同管 RNA

6 作为阴性对照以野生株 N16961 为模板, 各基因内部均正常转录 ( 图 1); 以野生株 N16961 为模板进行共转录分析,Ubia arf 与下游的 tata 和 tatb 共转录,Cyt551 与 tatb 和 tatc 均不共转录 ( 图 2); 以 N169-dtat 为模板进行共转录分析, 因 tatabc 基因簇缺失, 所以 tatabc 基因不共转录, 同时也与下游的 Cyt551 不共转录 ( 图 3) 但 Ubi aarf 和 Cyt551 基因没有受 tatabc 基因缺失影响, 还可以正常转录从图 1~3 和表 3 可以看出 :(1)cyt551 基因与上游的 4 个基因均不共转录 ;(2)tatA tatb tatc 基因共转录 ;(3)Ubi aarf 基因可以与 tata tatb 共转录图 3 是以 N169-dtat 提取的总 RNA 进行逆转录的结果, 可以看出 VC0085 虽然与 tata tatb 的共转录被阻断, 但仍可以自身转录因 VC0085 参与了共转录, 因此, 需再设计引物察看上游 2~3 个基因是否也参与共转录, 以期找到真正的转录起始 VC0084 和 VC0090 与他们之间的序列都不共转录, 图中未做标示表 3 埃尔托生物型霍乱弧菌 N16961 双精氨酸转运系统基因簇共转录分析上游引物所在的基因下游引物所在的基因引物组合模板 cdna N16961 染色体 ( 阳性对照 ) ubi aarf cyt P1,89-P2 N ubi aarf tata 85-P1,86-P2 N tata tatc 86-P1,88-P2 N tata tatb 86-P1,87-P2 N tatb tatc 87-P1,88-P2 N tatc cyt P1,89-P2 N tata cyt P1,89-P2 N tatb cyt P1,89-P2 N ubi aarf tatb 85-P1,87-P2 N ubi aarf tatc 85-P1,88-P2 N DNA-bin tate 32-P1,33-P2 N DNA-bin deda 32-P1,34-P2 N tate deda 33-P1,34-P2 N VC0082 ubiaarf 82-P1,85-P2 N VC0082 tata 82-P1,86-P2 N VC0082 tatb 82-P1,87-P2 N

7 VC0082 tatc 82-P1,88-P2 N VC0083 ubiaarf 83-P1,85-P2 N VC0083 tata 83-P1,86-P2 N VC0083 tatb 83-P1,87-P2 N VC0083 tatc 83-P1,88-P2 N VC0084 ubiaarf 84-P1,85-P2 N VC0084 tata 84-P1,86-P2 N VC0084 tatb 84-P1,87-P2 N VC0084 TatC 84-P1,88-P2 N VC0084 VC P1,84-P2 N ubiaarf ubiaarf 85-P1,85-P2 N dtata dtata 86-P1,86-P2 N dtatb dtatb 87-P1,87-P2 N dtatc dtatc 88-P1,88-P2 N cyt551 cyt P1,89-P2 N dtate dtate 33-P1,33-P2 N VC0084 VC P1,84-P2 N169-dtat + + ubiaarf ubiaarf 85-P1,85-P2 N169-dtat + + dtata dtata 86-P1,86-P2 N169-dtat - - dtatb dtatb 87-P1,87-P2 N169-dtat - - dtatc dtatc 88-P1,88-P2 N169-dtat - - cyt551 cyt P1,89-P2 N169-dtat - - dtate dtate 33-P1,33-P2 N169-dtat + + DNA-bin DNA-bin 32-P1,32-P2 N169-dtat + + deda deda 34-P1,34-P2 N169-dtat + + 注 : + 表示 cdna 检测有目的条带 ; - 表示 cdna 检测没有发现目的条带

8 tata tatb tatc 和 tata2(tate)4 个基因均可以基因内转录 ;tatabc 基因簇上游基因 ubi aarf 和下游基因 cyt551 可以基因内转录 ;tata2 的上游基因 VC0032 和 VC0034 也可以基因内转录图 1 双精氨酸转运系统基因簇以野生株 N16961 为模板的基因内转录分析 ubi aarf 基因可以与 tata 和 tatb 两个基因共转录, 但不能与 tatc 基因共转录 ;tata 和 tatb 基因可以共转录,tatA tatb 和 tatc 基因也可以供转录 ;tatb 和 tatc 基因均不能与 cyt551 基因共转录图 2 双精氨酸转运系统基因簇以野生株 N16961 为模板的基因间共转录分析 ubi aarf 和 cyt55 基因可以基因内转录, 但与 tata tatb 和 tatc 之间的基因没有共转录图 3 双精氨酸转运系统基因簇以 tatabc 基因缺失株 N169-dtat 为模板的共转录分析 3. 不同弧菌 Tat 系统基因序列比对结果 : 总体上霍乱弧菌各血清型和生物型的同源性较高,Tat 基因簇的种属变异性很小, 是一段很保守的序列相同血清型和生物型的霍乱弧菌的 tat 基因簇聚类分析并没有完全聚集在一起, 提示霍乱弧菌 tat 系统的功能与霍乱弧菌的

9 血清型和生物型应该没有明显关联 tatb 和 tatc 是霍乱弧菌 Tat 系统的主要功能单位 [16], 序列比对发现 N16961 Wujiang-2 MO45 和 569B 的 tatabc,tatb 和 tatc 同源性较高, 而 4~ 7 和 19~22 的同源性较高 ( 图 4~8) 图 4 不同霍乱弧菌代表株双精氨酸转运系统 tata 基因聚类分析结果图 5. 不同霍乱弧菌代表株双精氨酸转运系统 tatb 基因聚类分析结果

10 图 6 不同霍乱弧菌代表株双精氨酸转运系统 tatc 基因聚类分析结果图 7 不同霍乱弧菌代表株双精氨酸转运系统 tatabc 基因聚类分析结果

11 图 8 不同霍乱弧菌代表株双精氨酸转运系统 tate 基因聚类分析结果讨论 Tat 系统是存在于许多病原菌中有重要毒力机制的特殊蛋白转运系统 Tat 系统不仅在细菌生理功能方面, 而且在某些病原微生物的致病性中也发挥作用 [2-7], 还参与了很多重要的机制, 例如细胞膜的形成生物膜的形成电子运输链的排列在很多环境压力下的生存以及运动性等 [5] Tat 运输系统的底物在功能上通常是构成氧化呼吸链, 尤其是厌养条件下呼吸链的重要组成成分, 为细菌能量代谢所必需 [2] Tat 系统的缺陷可能会导致包括生长运动性和一些毒性因子分泌在内的多种表型缺陷, 因此,Tat 系统是细菌毒性决定因子 [3,8-14] 前期通过分析霍乱弧菌是否转运 Tat 运输底物三甲胺 -N- 氧化酶 TMAO, 发现霍乱弧菌中存在功能性的 Tat 系统 tatabc 基因簇缺失株和野生株在运动性和鞭毛合成及在需氧和厌氧培养条件下的生长状况都没有发现差别然而,Tat 基因缺失株的生物膜形成能力下降, 而且在乳鼠肠道内的黏附定居能力及与 HT-29 细胞体外黏附能力都下降这些结果表明,Tat 机制在对霍乱弧菌的致病性中也发挥重要的作用该系统与霍乱弧菌的生物膜形成黏附定居和毒力有关 [3] 但由于霍乱弧菌 Tat 基因簇与大肠埃希菌有差异, 比如 Tat 基因簇分布在不同的染色体, 没发现 tatd 基因, 转录起始位点未知等, 同时, 霍乱弧菌与其他弧菌的 Tat 系统的亲缘关系如何及作用机制是否相似等问题都值得进一步探讨是否其他非致病性弧菌的 Tat 系统也存在类似的机制需要进一步探索本研究发现,Tat 基因簇各基因 (tata tatb 和 tatc) 均可以内转录, 而且可以相互共转录由于 ubi aarf (VC0085) 可以与 Tat 基因簇共转录, 因此, 进一步检测上游 2~3 个基因, 寻求转录起始位点研究发现,ubi aarf 基因可以与 tata 和 tatb 共转录, 通过 N16961 Tat 基因缺失株总 RNA 逆转录分析发现, 虽然 ubi aarf 与 tata tatb 的共转录被

12 阻断, 但该基因仍可以自身转录 VC0085 与 Tat 基因簇可以共转录, 而上游的 VC0084 与 Tat 基因簇之间的序列都不共转录, 已在结果描述上增加这句, 推测 ubi aarf (VC0085) 基因可能是霍乱弧菌 Tat 转录起始位点 cyt551 基因与上游的 4 个基因均不共转录提示 ubi aarf 与 tatabc 基因簇的功能或对环境的反应是相关联的, 这与 E. coli 的 Tat 转运系统 tatabcd 基因簇形成一个单独操纵子进行转录有不同不同血清型的霍乱弧菌 tata tatb tatc tate 基因聚类分析结果表明,Tat 基因簇的种属内变异性很小, 是一段很保守的序列霍乱弧菌中不同菌株间的 Tat 系统各基因比较, 显示了不同群型 ( 古典生物型和埃尔托生物型 ) 产毒非产毒菌株之间的差异, 同时, 未发现 Tat 基因簇位于可水平转移的成分中, 提示 Tat 基因簇与不同群型菌株的基因组分化是同步的 Tat 基因簇可能是弧菌本身固有的, 是发挥关键功能的区域参考文献 [1] Settles AM, Yonetani A, Baron A, et al. Sec-independent protein translocation by the maize Hcf106 protein[j]. Science, 1997, 278(5342): [2] Palmer T, Berks BC. The twin-arginine translocation(tat)protein export pathway[j]. Nat Rev, Microbiol, 2012, 10(7): [3] Zhang L, Zhu Z, Jing H, et al.. Pleiotropic effects of the twin-arginine translocation system on biofilm formation, colonization, and virulence in Vibrio cholera[j]. BMC Microbiol, 2009, 9:114. [4] Wu LF, Ize B, Chanal A, et al. Bacterial twin-arginine signal peptide-dependent protein translocation pathway: evolution and mechanism[j]. J Mol Microbiol Biotechnol, 2000, 2(2): [5] Ochsner UA, Snyder A, Vasil AI, et al. Effects of the twin-arginine translocase on secretion of virulence factors, stress response, and pathogenesis[j]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2002, 99(12): [6] Ding Z, Christie PJ. Agrobacterium tumefaciens twin-arginine-dependent translocation is important for virulence,flagellation,and chemotaxis but not type Ⅳ secretion[j]. J Bacteriol, 2003, 185(3): [7] Voulhoux R, Ball G, lze B, et al. Involvement of the twin-arginine translocation system in protein secretion via the type Ⅱ pathway[j]. EMBO J, 2001, 20(23): [8] Sargent F, Bogsch EG, Stanley NR, et al. Overlapping functions of components of a baterial Sec-independent protein export pathway[j]. EMBO J, 1998, 17(13): [9] Berks BC. A common export pathway for proteins binding complex redox cofactors?[j]. Mol Microbiol, 1996, 22(3): [10] Simon R, Priefer U, Piihler A. A broad host range mobilization system for in vivo genetic engineering: transposon mutagenesis in gram-negative bacteria[j]. Bio Technology, 1983, 1: [11] Müller M. Twin-arginine-specific protein export in Escherichia coli[j]. Res Microbiol, 2005, 156(2):

13 [12] Palmer T, Berks BC. Moving folded proteins across the bacterial cell membrane[j]. Microbiology, 2003,149(Pt 3): [13] Lavander M, Ericsson SK, Bröms JE, et al. The twin arginine translocation system is essential for virulence of Yersinia pseudotuberculosi[j]. Infect Immuni, 2006, 74(3): [14] 张丽娟, 高守一, 景怀琦, 等. 霍乱弧菌 Tat 蛋白运输系统基因簇的确定与功能阻断分析 [J]. 遗传学报,2002, 29(10): [15] 王鸣, 李孝权, 莫自耀, 等年广州地区霍乱弧菌主要致病相关基因特征分析 [J]. 中华预防医学杂志, 2006, 40(4): [16] 朱召芹, 景怀琦, 陈海丽, 等. El Tor 霍乱弧菌双精氨酸转运系统功能单位的分析研究 [J]. 微生物与感染, 2012, 7(2): ( 收稿日期 : ) ( 本文编辑 : 吕相征 )

< 1+1 <! " #$% &!"#$ %&' ( )( %&* ) + ), %&- )+. )../'0 ) 1 ) "' )!"#$%&' (1% ( )* " + + %,-.2(13/01 )' 扩增 &' 基因煮沸获得铜绿假单胞菌 ) 基因组作为模板 ) )( 作为引物

< 1+1 <! #$% &!#$ %&' ( )( %&* ) + ), %&- )+. )../'0 ) 1 ) ' )!#$%&' (1% ( )* + + %,-.2(13/01 )' 扩增 &' 基因煮沸获得铜绿假单胞菌 ) 基因组作为模板 ) )( 作为引物 213456!"# $ % # %557;&/55/?5,/ @@@!88>>!"#!$% &'()*+ 武汉市疾病预防控制中心武汉 /&55, % 华中科技大学同济医学院病原生物学系微生物教研室武汉 /&55&5 & 武汉市第十一医院武汉 /&5555,- O ' 0 ' =! 6!, 2 M*34!. 5 '2 ' 0 0* 6) 7 88^9:;0, 6! 89-4 O?@ 7%58