第二章 實驗技術

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1 2-1 數 Time-Correlated Single Photon Counting TCSPC Fluo Time 200 PicoQuant 利 PicoQuant 數 來 行 - time-resolved fluorescence spectra 量 理 2-1 [ 1] 利 行 精 錄 雷 synchronization trigger SYNC trigger 行累 pile up [2] TCSPC 數 1 (temporal profile) TCSPC 2-2 [3] 雷 pulsed diode laser full width half maximum FWHM 80 ps 雷 driver PDL 800-B PicoQuant 數 constant fractional discriminator CFD variable delay line 425A ORTEC TCSPC SPC630 PicoQuant sample chamber 兩 雷 iris 雷 量 focusing lens 利 兩 行 量 perpendicular horizontal 度 magic angle polarizer [1] Becker, H. GmbH, Time-Correlated Single Photon Counting Modules Multi SPC Software. [2] Valeur, B., Molecular Fluorescence: Principles and Applications; Weinheim; Wiely-VCH, New York, 2002; pp175. [3] web site: diau08.ac.nctu.edu.tw/tcspc_pop.htm 16

2 2-1. TCSPC 理 [1] 2-2. Fluo Time 200 [3] 17

3 subtractive double monochromator 9030DS Sciencetech micro-channel plate photon-multiplier tube MCP-PMT R3809U-57 Hamamatsu 流 Pre-Amplifier TCSPC TCSPC 行 TCSPC 行 2-3 [4] 利 兩 數 constant fractional discriminator CFD NIM - time-to-amplitude converter TAC TAC 便 兩 TAC 類 - 數 analog-to-digital converter ADC channel multi-channel analyzer MCA 行 累 行 累 L F S T M L T CFD MCP-PMT S F 濾 D CFD M MCP-PMT Stop TAC Start D CFD 數 ADC TAC - ADC 類 - 數 MCA MCA 2-3. TCSPC [4] [4] 立 論 年 18

4 2-2 electronics 數 constant fractional discriminator CFD threshold 度 來 度 便 路 略 2-4 [4] Noise Single photon events Multi- photon events 1 Disc / LLD ULD 2-4 度 數 數 讀 兩 例 invert T d 理 零 time-to-amplitude converter TAC TAC 類 精 利 TAC 精 雷 19

5 類 兩 2-5 [4] Photon detected next SYNC ready for next photon TAC setting time TAC starts TAC stops ADC starts reset TAC ready start-stop time TAC dead time 2-5 TAC 若 TAC 兩 TAC 行 來 blind 略 狀 更 了 率 TAC 兩 TCSPC 數 率 1/100 雷 度 iris 來 TAC 兩 - normal start-stop mode - reverse start-stop mode 20

6 了 降 率 TAC 若 - 不 TAC TAC dead time 行 讀 率 類 - 數 analog-to-digital converter ADC TAC 類 - 數 類 - 數 multi-channel analyzer, MCA MCA 錄 數 數 variable delay line TAC 類 - 數 累 了不 數 利 TAC 來 度 數 路 行 不 行 不 異 利 兩 行 行 nm 度 21

7 millimeter mm 行 spectral bandwidth nm 2-3 雷 Laser source PicoQuant 雷 LDH-P-C 400 LDH-P-C nm 80 ps 2-6 (A) (B) 率 2.5 MHz ~ 40 MHz 雷 量 (A) (B) Intensity /a.u Intensity /a.u Time/ ns Time ns 2-6 (A) LDH-P-C 400 B LDH-P-C 435 數 率 40 MHz 80 ps 2-4 (Time-resolved fluorescence anisotropy) TCSPC 了 量 來 理 22

8 雷 力 (transition moment) (fluorophores) (anisotropy) 力 (depolarization) 力 力 不 (torsional vibrations) 朗 (Brownian motion) 量 (resonant energy transfer) [5] 量 例 (molecular mobility) 狀 (flexibility) 雷 不 (anisotropy) () r t = ( ) ( ) () + 2 () I t I t I t I t ( 2-1) r(t) I 度 行 度 ( ) = ( ) + 2 ( ) I t I t I t ( 2-2) ( ) I t I () t = [1+ 2 r() t ] 3 I() t I () t = [1 r() t ] 3 ( 2-3) ( 2-4) [5] Valeur, B., Molecular Fluorescence: Principles and Applications; Weinheim; Wiely-VCH, New York, 2002; pp

9 雷 (vertical) 兩 (vertical) (horizontal) 雷 不 不 率 數 來 數 G factor 2-5 G = I I HV HH ( 2-5) 2-6 () r t = VV VV ( ) VH ( ) () + 2 () I t GI t I t GI t VH ( 2-6) r(t) 數 數 數 laser polarizer V V Lens and Filter H 2-7 量 24

10 2-5 - 見 UV-Vis spectrometer 量 兩 量 量 論 量 Varian Cary50 - 見 190 ~ 1100 nm 率 1200 nm 度 0.25 nm 量 不 2-8 / / (deuterium/ tungsten/ halogen Lamp, DH2000, Ocean Optics) 利 (Y R600-UV, Ocean Optics) CCD (HR4000-UV-NIR, Ocean Optics) nm entrance aperture 5 µm 度 0.5 nm CCD 列 3648-element linear CCD array 量 度 錄 度 I 0 (λ) 量 量 量 錄 I r (λ) 量 量 錄 I s (λ) 率 R s (λ) = I s (λ) / I 0 (λ) R 率 率 來 R(λ) = R-R s (λ) 六 R 不 R(λ) 率 R R(λ) / R 量 度 Lamp Fiber CCD adaptor sample

11 2-5-1 (Charge-Coupled Device, CCD) CCD Ocean Optics 2-9 ( 1-10 ) [6] (1) SMA 905 連 (connector) 連 CCD 精 CCD (2) (slit) 量 (3) 濾 (absorbance filter) (second order) (4) (collimating mirror) (5) (grating) (6) (focus mirror) (detector) (7) L2 (L2 detector collection lens) 率 (8) OFLV 濾 (9) UV2 ( UV2 detector upgrade) (10) CCD 列 (array) CCD 1 10 路 [6] Product Catalog (Ocean Optics). 26

12 CCD 2-6 Fluorescence spectrometer 量利 雷 90 CCD USB2000-FLG Ocean Optics 行 nm 200 µm 度 10 nm CCD 列 2-7 料 (Data analysis) 利 TCSPC 了 理 利 FloFit 數 行 S(t) 數 (Instrument Response Function, IRF) K(t`) 數 X(t-t`) (convolution)

13 t () = (') ( ') S t K t X t t dt' ( 2-7) 數 行 parallel model 連 consecutive model FluoFit 利 行 行 數 數 來 行 行 A N 輻 輻 Bi τ i i = 1, 2, N 不 i τ N 行 A i i Bi τ A1 1 B1 τ A 2 2 B2 τ N A 3 3 B3 τ N AN B 數 2-8 N N () X () t tot = X exp( / i A t = X A t τ ) i N i= 1 i= 1 i ( 2-8) X () t i 數 A i X A i i 數 amplitude 零 度 τ i i 數 數 decay time coefficient 2-8 理 (Sample handling) Protoporphyrin(IX) Zinc(II) ( ZnPP 1-1) Strem Chemicals 度 95% ZnPP (terahydrofuran THF ) (Sigma-Alderich ) 奈 ZnPP/ THF 來 THF 28

14 數 ZnPP 理 奈 奈 料 林金 奈 奈 料 兩 奈 料 理 (Anodized Aluminum Oxide) AAO 列 洞 洞 來 度 奈 AAO 流 2-10 度 99.9% 度 50 理 5 更 精 利 離 行 亮 金 來 理 利 易 率 理 AAO 洞 不 理 理 AAO AAO 留 理 洞 AAO 2-11 AAO 理 錄 來 SEM (a) (b) (c) AAO 奈 15 nm 理 硫 (sulfuric acid) (phosphoric acid) (d) (e) (f) AAO 奈 70 nm 理 (oxalic acid) (chromic acid) 2-12 AAO 奈 SEM 29

15 理 SEM 精 理, AAO 理, AAO AAO 2-10 AAO 流 30

16 200 nm 200 nm 200 nm (a) (b) (c) 200 nm 200 nm 200 nm (d) (e) (f) 2-11 AAO SEM (1) 理 (a) 硫 (d) (2) 利 AAO (b) (e) (3) 理 AAO AAO 奈 (c) 15 nm (f) 70 nm (a) 200 nm (b) 200 nm 2-12 兩 理 AAO SEM AAO 奈 度 AAO 奈 (a) 15 nm (b) 70 nm AAO 奈 度 (a) 74.5 µm (b) 51.1 µm 31