118 圆锥角膜患者行 CCL 后观察 6 个月, 有 2 例发生基质混浊, 虽然对视力影响不大, 但不能排除长期发展 [7] 成角膜瘢痕的风险 Kymionis 等对 23 例 28 眼进行期圆锥角膜患者实行准分子激光屈光性角膜切削术 (photorefractivekeratectomy,prk

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己熊
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1 转化医学杂志 2013 年 4 月第 2 卷第 2 期 TranslationalMedicineJournal,Vol.2No.2,Apr 紫外光 / 核黄素角膜交联术后角膜上皮下雾状混浊的研究进展庞旭, 彭秀军 [ 摘要 ] 紫外光 / 核黄素角膜交联疗法是最近几年发展起来的一种治疗圆锥角膜的新方法, 通过诱导角膜基质内纤维相互交联而提高角膜强度, 从而阻止圆锥角膜的进展然而, 角膜交联术后出现角膜上皮下雾状混浊的机制尚不明确本文就近年来紫外光 / 核黄素角膜交联术基本原理, 术后出现角膜上皮下雾状混浊 (haze) 的发病情况发病机制以及可能的预防和治疗手段的研究进展作一简要综述, 以期针对机制给予相应干预预防和治疗 haze 形成, 从而提高紫外光 / 核黄素角膜交联术的稳定性和预测性, 为预防 haze 提供新的方向 [ 关键词 ] 紫外光 / 核黄素 ; 角膜交联 ; 角膜上皮下雾状混浊 [ 中图分类号 ]R454 2;R772 2 [ 文献标志码 ]A [ 文章编号 ] (2013) doi: /j isn 圆锥角膜是主要角膜致盲疾病之一, 目前应用的治疗措施均有其局限性, 其中 21% 的圆锥角膜患者需行角膜移植 [1] 相对于西方国家而言, 我国一直存在角膜供体短缺的难题, 许多需要角膜移植的患者由于难以得到供体角膜而致盲, 因此探求取代角膜移植手术治疗圆锥角膜等角膜扩张疾病的非手术疗法一直是眼科领域关注的重点课题紫外光 / 核黄素角膜交联术 (cornealcolagencros linking, CCL) 是近年来应用于临床的角膜成形技术, 基础研究和临床应用证明角膜交联手术稳定性好, 预测性强, 是一种安全有效的屈光性手术方法, 有望成为替代角膜移植的非手术疗法然而, 随着角膜交联应用的日益广泛, 学者发现该手术术后仍然存在一些难以克服的问题, 其中最主要的是术后存在不同程度的角膜上皮下雾状混浊 (haze), 影响手术效果, 部分病例发展为严重的角膜白斑, 甚至导致患者视力障碍因此, 探究紫外光 / 核黄素交联术后 haze 形成机制及治疗方法成为亟待解决的问题本文结合临床实践和相关文献, 对其作一综述 1 CCL 的基本原理 CCL 的基本原理是利用 370nm 波长紫外光照射渗透到角膜基质内的核黄素, 核黄素作为一种光敏剂, 在紫外线的作用下被激发到三线态并产生活性氧族 (oxygenfreeradicals,ofr), 以单线态氧为主 OFR 能诱导角膜胶原纤维的氨基 ( 团 ) 之间发生化学交联反应 (Ⅱ 型光化学反应 ), 这种光化学反应在瞬间改变胶原的物理学特性和组织超微结构, 从而增加了胶原纤维的机械强度和抵抗角膜扩张的能力 [2], 因此在临床上用于阻止圆锥角膜角膜扩 [ 作者单位 ] 北京, 解放军总医院军医进修学院学员队 ( 庞旭 ); 北京, 海军总医院眼科 ( 庞旭, 彭秀军 ) 张等角膜疾病的发展标准 CCL 手术的操作方法 : 1 机械法去除角膜表面直径 9mm 范围内的上皮 2 在角膜表面滴加 0 1% 核黄素 ( 溶解于 20% 右旋糖苷 ), 每 3min1 次, 持续 30min 后在裂隙灯蓝光照射下, 确认核黄素已经进入前房 3 用波长为 (370±5)nm, 光束直径为 9mm 的紫外光光束照射处理的角膜, 时间为 30min, 辐射度为 3mW/cm 2, 相当于 3 4J 的总照射能量在照射过程中, 每 5 min 用 0 1% 的核黄素溶液和表面麻醉剂冲洗 1 次角膜表面 4 照射结束后, 使用抗生素眼膏涂眼, 角膜表面覆盖浸有 0 3% 氧氟沙星的绷带型接触镜, 直至角膜上皮愈合 [2] 2 CCL 后 haze 的发病情况临床试验发现 CCL 术后存在不同程度的角膜混浊, 严重者影响角膜屈光力和术后视力 Koler [3] 等观察 99 例 117 眼不同程度圆锥角膜患者行 CCL 手术后效果和并发症情况, 发现术后 1 个月所有病例均出现临床可见的角膜前部基质混浊, 分级为 0 78±0 42 术后 6 个月为 0 18±0 28 术后 1 年为 0 06±0 18 术后 1 年时 haze 发生率为 7 6%, 角膜中央基质瘢痕发生率为 2 8%, 而且术后 haze 的出现与圆锥角膜的严重程度角膜厚度及屈光度有明显联系 Raiskup [4] 报道 127 例 163 眼 1~3 期圆锥角膜患者行 CCL 治疗后, 术后 1 年 14 眼出现明显可见的角膜混浊, 约占总数的 9%, 并且这种术后长期的 haze 应用类固醇眼液治疗无明显效果, 可 [5] 能是对类固醇眼液产生了抵抗国内樊郑军观察了 10 例接受紫外光 / 核黄素角膜交联治疗的进行性圆锥角膜患者, 发现术后早期大多数治疗眼出现角膜水肿和角膜轻度混浊现象提示该治疗除了去除角膜上皮继发的组织反应外, 可能还有光化学治疗本身对角膜的作用 Mazota [6] 报道 39 例 40 眼

2 118 圆锥角膜患者行 CCL 后观察 6 个月, 有 2 例发生基质混浊, 虽然对视力影响不大, 但不能排除长期发展 [7] 成角膜瘢痕的风险 Kymionis 等对 23 例 28 眼进行期圆锥角膜患者实行准分子激光屈光性角膜切削术 (photorefractivekeratectomy,prk) 联合 CCL 手术, 术后观察个月 ; 术后 1 个月发现 13 眼出现后部基质线形混浊, 约占总数的 46 42%, 同时共焦显微镜检查发现这 13 眼的角膜基质深度 400 μm 左右存在高反射区域, 这种高反射区可能与角膜基质细胞的移行活化并合成过多的细胞外基质胶原的分解与沉积有关 ; 尽管这些高反射区从角膜后部逐渐向前移动, 反射系数逐渐减少, 但在术后 12 个月检查裂隙灯和共焦显微镜发现 haze 并未完全消退 3 CCL 后 haze 的发病机制 3 1 角膜创伤愈合机制角膜交联术后 haze 形成与角膜组织创伤后愈合修复反应有关正常情况下, 角膜上皮细胞为 5~6 层, 基质纤维排列规则, 角膜处于平衡的水合状态, 保持其透明性当角膜损伤后, 会引起创伤后愈合修复反应, 这个过程非常复杂, 包括细胞移行细胞激活增生和细胞外基质的合成和重构, 是由细胞因子生长因子趋化因子介导的非常复杂的级联反应角膜分为 5 层结构, 其中角膜上皮细胞和角膜基质中的成纤维细胞均可合成分泌基质金属蛋白酶 (matrixmetaloproteinases, MMPs), 是主要的基质降解酶, 能降解角膜内的主要胶原 [8] 在炎症或损伤发生时, 活化的 MMPs 参与伤口收缩细胞迁移坏死组织的清除等伤口愈合过程, 对机体起到了保护和修复的作用 [9] 组织基质金属蛋白酶抑制剂 (tisueinhibitorofmetalo pro teinases,timp) 是 MMPs 特异抑制物, 正常也存在于角膜组织微环境中, 与 MMPs 共同参加角膜胶原的溶解和组织重构正常的生理状态下,MMPs TIMP 与胶原在角膜基质内保持动态平衡 ; 当角膜基质细胞出现异常凋亡时, 破坏了 MMPs 和 TIMP 的平衡当角膜的损伤修复起主要作用时,MMPs 表达不足, 激活的角膜细胞合成过多胶原纤维和细胞外基质, 不能被 TIMP 完全清除, 结果导致角膜上皮下雾状混浊屈光回退和角膜透明度下降 [10] 为了 [11] 观察 CCL 术后角膜损伤愈合过程,Wolensak 等对 8 只金吉拉大白兔的右眼给予标准 CCL 治疗, 左眼为对照组, 术后 3d 7d 4 周和 6 周分别选取 2 只动物取角膜作常规病理和 α 肌动蛋白免疫组化染色, 结果发现去除的角膜上皮在术后 2d 基本愈合, 术后早期兔眼角膜即出现基质水肿和明显 haze, 角膜厚度增加到 (850±66)μm, 与术前角膜厚度 (332± 43)μm 相比差异具有统计学意义术后 3d 在照射区即可观察到角膜内皮细胞和基质细胞的凋亡, 并且在照射区周围的浅层基质内出现明显的炎症反应, 并可见大量巨噬细胞淋巴细胞和中性粒细胞浸润术后 7d, 基质的水肿开始逐渐消退, 角膜内皮层恢复完整, 在后 1/2 基质内可见基质细胞的有丝分裂, 在照射区临近的基质内可见许多巨大的纺垂形成纤维细胞聚集术后 4 周基质细胞迁移至照射区并增生, 出现 α 肌动蛋白阳性的细胞, 但细胞密度仍小于术前, 前部基质还存在零散的基质细胞缺乏区域术后 6 周, 角膜基质重建, 基本恢复正常, 未见明显 haze 3 2 凋亡机制既往研究表明, 继角膜上皮损伤后较早发生的改变就是在角膜基质中出现基质细胞的凋亡 [12], 在准分子激光原位角膜磨镶术 (laserinsi tukeratomileusis,lasik) 和 PRK 手术后, 可以看到术后早期角膜基质凋亡细胞的数量与角膜愈合反应的程度呈正相关 [13], 这种细胞凋亡的反应在一定程度上导致 haze 形成角膜细胞的凋亡是角膜创伤修复愈合的启动因素, 被激活的角膜基质细胞分泌多种细胞因子, 通过角膜上皮基质细胞间的相互作用, 参与角膜基质细胞凋亡的调控 ; 基质中被激活的成纤维细胞合成细胞骨架成分, 分泌黏附分子, 导致多种胶原纤维混乱排列, 可能是 haze 形成的机制 [14] Wolensak 等研究了 CCL 对角膜基质细胞和内皮细胞的损伤作用, 发现经过 CCL 治疗的兔眼, 在术后 24h 出现细胞凋亡, 凋亡的部位主要在深达 300 μm 的角膜基质中, 而且细胞凋亡的深度与辐射的强度呈正相关与 PRK 后引起的 haze 仅存在于上皮下不同, 角膜交联引起的 haze 深度可达到 60% 角膜基质, 即 300μm 左右, 与细胞凋亡出现的位置一致, 说明 haze 形成可能与基质细胞凋亡有关 [6] 3 3 氧化还原机制抗氧化酶和具有还原能力的化合物组成正常角膜组织内的抗氧化系统, 前者主要包括超氧化物岐化酶 (superoxidedismutase, SOD) 谷胱甘肽过氧化物酶 (glutathioneperoxidase, GPx) 和硫氧还原酶, 集中在上皮细胞层和内皮细胞层, 是角膜组织中主要的抗氧化酶 ; 后者主要包括抗坏血酸谷胱甘肽等在这些主动和被动的抗氧化体系作用下, 角膜细胞可以维持氧化还原状态的平衡, 使线粒体稳定地供能, 并且维持活力随着各种原因导致细胞内氧自由基升高, 将会启动细胞内抗氧化系统来对抗这种持续升高, 如果自由基大量生成超过 SOD 及 GPx 的清除能力时, 细胞内的不饱和脂肪酸就发生脂质过氧化, 导致细胞组织的损伤, 细

3 转化医学杂志 2013 年 4 月第 2 卷第 2 期 TranslationalMedicineJournal,Vol.2No.2,Apr 胞凋亡机制将被机体启动, 目的是清除过度受伤的细胞, 从而保证组织和器官发挥正常的生理功能因此, 细胞凋亡与细胞内氧化还原状态密切关联, 氧化还原状态的改变促进了氧自由基的产生, 激活凋亡诱导因子, 致使细胞凋亡 ; 凋亡细胞数量的变化同时又加剧细胞内氧化还原状态的改变, 这种改变伴随细胞凋亡的不同阶段 [15] 标准的 CCL 治疗需要去除角膜上皮, 在角膜局部滴加光敏剂核黄素并应用 370nm 长波紫外线照射 30min 既往研究表明, 单纯的机械性角膜上皮清创术引起的细胞凋亡主要出现在 50μm 以内的前部基质, 并且在术后 4h 即可表现 [16] ; 而 CCL 引起的细胞凋亡主要出现在术后 24h [14], 这是由于 CCL 造成的细胞凋亡主要是由于紫外光照射产生的自由基对细胞的毒性作用紫外光照射核黄素不仅释放单线态氧诱导胶原纤维的氨基 ( 团 ) 之间发生化学交联反应, 从而增加了胶原纤维的机械强度和抵抗角膜扩张的能力 ; 另一方面, 紫外线照射以及术后炎症反应浸润聚集的多形白细胞也会释放大量超氧阴离子自由基, 损伤角膜组织, 加重组织水肿, 降解角膜胶原, 可能促进了影响手术效果的角膜 haze 形成当炎症反应减轻, 角膜基质内释放的自由基逐渐减少, 能够被组织自身的抗氧化系统清除, 脂质过氧化产物逐渐代谢, 角膜基质组织达到新的氧化还原平衡, 角膜恢复透明这种自由基损伤是慢性过程, 与临床上 Greenstein [17] 等观察 44 例 50 眼圆锥角膜或 LASIK 术后角膜扩张患者行 CCL 术后 haze 的变化规律是 haze 在术后 1 个月最明显, 术后 3 个月趋于稳定, 而在 3~12 个月逐渐消退相吻合 4 CCL 后 haze 的治疗进展及前景 4 1 类固醇滴眼液应用由于目前临床上主要应用糖皮质激素预防或减少准分子激光术后 haze 形成, 其作用机制主要是减少角膜细胞 DNA 合成, 降低角膜细胞活性及透明质酸含量, 抑制成纤维细胞增生, 减少胶原合成等特点 [18] 此外, 还有人认为皮质类固醇激素强大的抗炎作用使得屈光手术损伤的角膜组织中多种炎性介质如白介素肿瘤坏死因子白三烯前列腺素血小板活化因子 NO 以及黏附因子的致炎作用减弱, 从而减少角膜上皮的增生和角膜中透明质酸的含量, 减少成纤维细胞的支架构成起到减轻 haze 的作用 [19] 因此, 借鉴准分子激光术后预防 haze 形成的经验, 学者也应用类固醇滴眼液预防和治疗 CCL 术后 haze 形成, 一般是在角膜上皮愈合后局部应用 1~3 周 [4,20] ; 大部分 CCL 术后出现 haze 的病例在术后 6~12 个月可以痊愈 ; 但也有一部分病例形成顽固的角膜瘢痕, 严重影响视力 ; 有少数病例对类固醇滴眼液治疗产生抵抗长期应用糖皮质激素有引起激素性高眼压的危险, 糖皮质激素应用于 CCL 术后 haze 的确切机制尚不清楚, 对其应用仍存在争议, 需要开发更安全有效的治疗手段 4 2 改进手术方式标准的 CCL 手术方法需要去除角膜上皮, 破坏上皮细胞间的紧密连接, 有利于核黄素在角膜基质内的渗透但这种对角膜上皮的损伤可能会诱发角膜的创伤 - 愈合反应, 破坏角膜滋生合成分解平衡, 使角膜基质重建, 新生胶原粗大且排列紊乱, 空泡内容物不均匀, 造成光线的散射, 形成 haze 因此, 研究人员采取各种措施改进传统的 CCL 手术方法, 不去除角膜上皮, 借以减轻 haze [21] 的程度, 已取得较大的进展 Filippelo 等将 20 例双眼进展期圆锥角膜患者分为试验组和对照组, 每例患者 1 眼给予经上皮紫外光 / 核黄素角膜交联方法, 即不去除角膜上皮, 核黄素浓度不变, 但溶液里添加乙二胺乙酸 (ethylenediaminetetraaceticacid, EDTA) 作为助渗剂 ; 该例患者另 1 眼为自身对照术后发现试验组内 40% 出现短暂充血和异物感, 但术后 24h 即恢复与对照组相比, 试验组在术后 18 个月的视力最佳矫正视力角膜地形图都有明显改善, 未出现 haze; 而对照组病变普遍呈恶化趋势, 两者差异具有统计学意义研究结果说明这种改进的经上皮 CCL 手术方法是安全有效的, 能控制圆锥角膜病变的进展, 同时避免传统 CCL 手术的并发症 Kanelopoulos [20] 报道对 10 例早期圆锥角膜的患者进行改良的 CCL 治疗, 术者首先利用飞秒激光在患者角膜基质内建立环形隧道, 然后通过导管向隧道内灌注 1g/L 的核黄素溶液 0 1ml,2min 后用 7 mw/cm 2 的波长为 370nm 紫外光照射 15min 该方法不需去除角膜上皮, 核黄素不会聚集在角膜表面, 避免紫外光能量被角膜外的核黄素过多吸收术后随访所有患者均未发现角膜上皮缺损和 haze, 观察 26 个月, 患者平均裸眼视力均有不同程度的提高, 角膜最大曲率平均下降 0 8D, 表明这种改进的角膜交联方法是安全有效的 4 3 抗氧化剂应用生物体内相应的活性氧自由基清除系统主要有 : 一是抗氧化酶, 如 SOD GPx 等 ; 二是抗氧化剂, 如维生素 C 维生素 E 等当自身的抗自由基系统不能清除过多的自由基时, 需要从外界获得自由基清除剂以减轻自由基对组织细胞的损伤维生素 C 和维生素 E 均是脂质过氧化链式反应的阻断剂其中, 维生素 C 作为清除活性氧自由基的非酶途径的抗氧化剂, 其清除自由基的作用非

4 120 常广泛, 不仅参与体内的氧化还原反应保持谷胱甘肽的还原状态, 还能参与体内多种羟化反应促进胶原蛋白合成维生素 E 是天然捕捉剂, 能抑制不饱和脂肪酸氧化成过氧化物的过程, 特别是它对线粒体微粒体和浆膜的磷脂有特殊的亲合力, 能够预防或阻止诱发的脂质过氧化作用, 从而维持生物膜的 [22] 正常结构房城伯等应用抗氧化剂维生素 C 维生素 E 治疗 PRK 后 haze, 研究发现 PRK 后早期在角膜内存在着脂质过氧化形式介导的自由基性的组织损伤, 促进角膜细胞凋亡 ; 局部应用抗氧化剂维生素 C 维生素 E 能早期减轻 PRK 后炎性反应, 降低角膜过氧化损伤, 阻止术后细胞凋亡, 减轻角膜基质反应性过度增生, 降低术后屈光回退和 haze 形成目前, 临床上还没有应用抗氧化剂治疗 CCL 术后 haze 的研究, 但借鉴抗氧化剂预防或治疗准分子激光术后 haze 形成的经验, 可能为治疗 CCL 术后 haze 提供新的方向 4 4 阻断或减少角膜细胞凋亡角膜细胞的凋亡参与创伤愈合的启动调节和终止过程, 凋亡平衡对于角膜的透光性屈光性至关重要, 阻断或减少角膜 [23] 细胞凋亡, 可能有助于 haze 的防治 Kuo 等发现锌缺乏的动物组织及体外培养去除锌的细胞极易凋亡, 加入锌后, 则结果逆转, 这一现象支持了锌可抑 [24] 制凋亡的论断康凤英等比较糖皮质激素丝裂霉素和锌制剂 3 种药物对准分子激光术后 haze 防治的效果, 结果发现硫酸锌治疗 haze 的效果最佳, 不仅能显著减弱术后 haze 的形成, 而且影响正常角膜细胞的功能因此, 锌制剂将有望为临床降低 CCL 术后 haze 的形成提供一条经济便捷的解决途径, 但尚需要大量研究加以证实 4 5 细胞因子调控大量眼科实验表明, 在角膜伤口愈合及修复过程, 有多种细胞因子包括表皮生长因子转化生长因子 α(transforminggrowthfactor, TGF α) TGF β 和一些蛋白水解酶起重要作用角膜损伤后激活这些细胞因子的相应受体, 进而促进上皮基质细胞的增生移行和分化, 增加胶原和纤维连结蛋白的合成及活性, 控制细胞外基质的合成及修饰 [25] [26] 张明昌等用干扰素 α 2b 治疗准分子术后 haze, 结果发现能有效减轻 haze 的形成, 其效果与 1g/L 地塞米松眼液相似, 却没有地塞米松的不良反应, 但其成本较高价格较贵, 配制后常温下药效衰减较快, 有待于临床上进一步解决综上所述, 借鉴准分子激光术后预防或减少 haze 形成的经验, 并针对 CCL 术后 haze 的发病机制, 探讨多种安全有效的治疗措施, 致力于开发研究外源性细胞因子及其受体的中和抗体抑制剂, 以及特殊设计与修饰的生长因子等来抑制介导凋亡的细胞因子功能, 将为减少 CCL 术后 haze 的形成提供广阔的前景, 使 CCL 不断完善和发展参考文献 [1]TuftSJ,MoodaleyLC,GregoryWM,etal.Prognosticfac torsfortheprogresionofkeratoconus[j].ophthalmolo gy,1994,101(3): [2]SpoerlE,MrochenM,SlineyD,etal.SafetyofUVA ribo flavincros linkingofthecornea[j].cornea,2007,26 (4): [3] KolerT,MrochenM,SeilerT.Complicationandfailure ratesaftercornealcroslinking[j].jcataractrefract Surg,2009,35(8): [4] RaiskupF,HoyerA,SpoerlE.Permanentcornealhaze afterriboflavin UVA inducedcros linkinginkeratoconus [J].JRefractSurg,2009,25(9):S824 S828. [5] 樊郑军. 角膜胶原交联治疗圆锥角膜的初步临床观察 [J]. 海军总医院学报,2010,23(1):1 2. [6] MazotaC,BalestraziA,BaiocchiS,etal.Stromalhaze aftercombined riboflavin UVA cornealcolagen cros linkinginkeratoconus:invivoconfocalmicroscopiceva luation[j].clinexperimentophthalmol,2007,35(6): [7] KymionisGD,PortaliouDM,DiakonisVF,etal.Posterior linearstromalhazeformationaftersimultaneousphotore fractivekeratectomyfolowedbycornealcolagencros linking[j].investophthalmolvissci,2010,51(10): [8]YangYN,BauerD,WasmuthS,etal.Matrixmetalopro teinases(mmp 2and9)andtisueinhibitorsofmatrix metaloproteinases(timp 1and2)duringthecourseof experimentalnecrotizingherpetickeratitis[j].expeye Res,2003,77(2): [9] SivakJM,FiniME.MMPsintheeye:emergingrolesfor matrixmetaloproteinasesinocularphysiology[j].prog RetinEyeRes,2002,21(1):1 14. [10] LinnaTU,VesaluomaMH,PetrolWM,etal.Confocal microscopyofapatientwithiregularastigmatism after LASIKreoperationsandrelaxationincisions[J].Cornea, 2000,19(2): [11] WolensakG,IomdinaE,DitertDD,etal.Woundhealing intherabbitcorneaaftercornealcolagencros linking withriboflavinanduva[j].cornea,2007,26(5): [12] WilsonSE,KimWJ.Keratocyteapoptosis:implicationson cornealwoundhealing,tisueorganization,anddisease [J].InvestOphthalmolVisSci,1998,39(2): ( 下转第 124 页 )

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第期赵金莲等荧光光谱法分析花茶对羟自由基诱导的氧化损伤的保护作用!!!!!!!! 花茶冲泡方法荧光扫描方法 # 稳定性试验方法重复性试验方法

第期赵金莲等荧光光谱法分析花茶对羟自由基诱导的氧化损伤的保护作用!!!!!!!! 花茶冲泡方法荧光扫描方法 # 稳定性试验方法重复性试验方法年月华南师范大学学报自然科学版年第期赵金莲曾佑炜李宽彭永宏采用荧光光谱扫描法定性定量研究了种花茶对羟自由基诱导的氧化损伤的保护作用结果表明桂花茶复合花茶绿茶和芍药花茶的保护作用要优于红玫瑰花茶和金莲花茶且各花茶的保护作用在范围内均随质量浓度的增加而增强该方法的稳定性和重复性都较好花茶氧化损伤荧光光谱扫描第期赵金莲等荧光光谱法分析花茶对羟自由基