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1 中国人兽共患病学报 2017,33 ( 12) 1089 Ch J u fz 论 著 了解江西省汉滩型汉坦病毒(H v u, HTNV) 15 株的全基因组序列特 征. 方 法 设计和 DOI: 10 3969/ 1002 2694 2017 12 007 j 江西省汉滩型汉坦病毒分离株 15 全基因组序列分析 刘师文,龚 摘 要:目的 甜,徐 刚,施 勇,李健雄,张艳妮,周 珺,刘晓庆,肖 芳,熊 英 运用引物,采用 RTPCR 方法分段扩增 15 株的 S M L 全基因,对扩增产物进行克隆和 序 列 测 定. 运 用 DNA 和 MEGA6 0 软件分析基因序列.结果 15 株全基因组 共 有 11848 个 核 苷 酸,其 中 S M L 基 因 分 别 含 1699 3616 6533个核苷酸,分别 编 码 429 1135 2151 个 氨 基 酸. 经 序 列 比 对,该 病 毒 与 国 内 外 HTNV 核 苷 酸 同 源 性 为 79 7 ~ 87 3 ;氨基酸序列同源性为 92 3 ~98 4.系统进化分析表明, 15 株在 HTNV 系统进化树中独 立 分 支. 结 论 15 株为 HTNV 新的基因亚型,江西省存在新基因亚型的 HTNV. 关键词:汉滩型汉坦病毒;全基因组;基因分型 中图分类号: R373 文献标识码: A 文章编号: 1002 2694( 2017) 12 1089 05 Cmp g m qu fh v u 15 d J gx,ch LIUSh w,gong T,XU Gg,SHIYg,LIJ x g,zhang Y, ZHOUJu,LIU X g,xiao Fg,XIONG Y g q ( J gxc f D C dp v,nhg 330029,Ch ) Ab :W v d h mp gmh f h H v u 15 d J gx g P v,ch P m w d u d mp f h mp S,M dl gm brtpcr ThPCR gddw du w h dd d, hg w z d w h DNAS d MEGA6 0 f w R u p qu qu hwd h h mp g w 11848u d g h, hs,m dl gm w 1699,3616 qu d6533 p v d g429,1133d2151m d p v d b w, Th qu 15d h H v uw 79 7 87 3 hu d v d92 3 98 4 hm d v Ph g fhvhwd 15b gd w HTNV g 15w wub fhtnv p h x J gx P v K d :H v u; mp g ;g qu p w Supp db hp v H hdp m fj gx ( N 20123156) C pd gu h :X gy g,em :18079125868 163 m 汉 坦 病 毒 HV( h v u)为 布 尼 亚 病 毒 科 汉 坦病毒属分 节 段 的 负 链 RNA 病 毒,其 基 因 组 分 为 大( L) 中(M) 小( S) 3 个基因片段,分别编码 RNA 依赖的 RNA 聚 合 酶,糖 蛋 白 前 体 ( GPC 蛋 白 ),核 [] 蛋白( N 蛋白)1. HV 目 前 有 41 个 型 别 (基 因 型/ 江西省卫生厅科技计划项目( N 20123156) 通讯作者:熊 英, Em : 18079125868 163 m 作者单位:江西省疾病预防控制中心,南昌 330029 血清型),不同基因 型 的 HV 又 可 分 很 多 基 因 亚 型, 新的基因型或基因亚型的汉坦病毒不断被发现使得 HV 的进化和发 生 比 预 期 更 复 杂 23. HTNV 是 汉 坦病毒的代表基因型,因其引起临床症状重 死亡率 [ ] 高的肾综 合 征 出 血 热 (Hm hg f v w h m, HFRS)而被广泛关注.在我国, HT d [ 4], 分为 个 基 因 亚 型 宿 主 动 物 是 以 黑 线 姬 鼠 NV 9 为代表的室外鼠.在前期研究中我们发现江西省可 能存在新亚 型 的 HTNV[56],为 了 能 明 确 江 西 省 的

2 1090 中国人兽共患病学报 2017,33(12) HTNV 基因特征和基因亚型, 本研究对分离到的 1 株 HTNV 进行了全基因组测序, 结果报告如下 : 1 材料和方法 1.1 标本来源 AYW89G15 株为本实验室采用 VGE6 细胞从江西省安义县黑线姬鼠中分离的. 1.2 主要试剂 QIAub HT 核酸提取试剂盒 (Qg) OGSpRTGPCR 试剂盒 (Qg). 1.3 引物设计与合成毒株全 S M L 基因分别分 段扩增, 根据 GBk 中 76G118 株和 Z10 株基因序列, 应用 PmPm5.0 设计并由上海生工生物工程有限公司合成, 引物序列见表 1. 表 1 HTNV 全基因组分段 RTGPCR 扩增引物 Tb.1 RTGPCRpmfmpfghmpgfHTNV 基因片段引物名称位置目的片段大小 /bp 5 G3 gm Pmm gh S SF TAGTAGTAGACTCCCTAAAGA 1~ SR TAGTAGTAGTATGCTCCCTAA 1698~1678 M M1F TAGTAGTAGACTCCGCAAAAGA 1~ M1R CCCAGGACCAGATAAGACAC 1198~1179 M2F TGGGCTATTCCCTCAGTT 1060~ M2R GAGCTGGAAGTCAGGGAG 2088~2070 M3F ATCCTCTGGGCTGCAAGTG 1964~ M3R CTAGTGTACATCCAGCATCCTT 3616~3595 L L1F TAGTAGTAGACTCCCTAAGTGACAA 1~ L1R GAGTTGATGGCTCAGTTATGTTC 1324~1346 L2F ACATCATACAAACCTGCCACA 939~ L2R ACCATCCTCCTGGACTTGC 2560~2542 LF3 ACGGCTATATGATGTGGGAGCTTCG 2334~ LR3 ACATCGGCTCTGTGCTGCTGC 3673~3653 L4F ATGGGACTGACTGGTTCTTATTTG 3372~ L4R AACTCCGTCTTTCATTGTCTTTAGG 4667~4643 L5F ATAAGTTTGCTGTGACCGTGGAT 4563~ L5R TTGCACGTAGTCCATCATCCTTTAC 5567~5543 L6F TGATGGATGAGGTTTCAAAGGAG 5334~ L6R TAGTAGTAGTACGCTCCGGAAAAT 6533~ 核酸扩增和测序采用全自动核酸提取仪 (Qg) 和 QIAub HT 核酸提取试剂盒进行核酸提取. 采用 OGSp RTGPCR 试剂进行扩增, RT 反应 :50 30 m,95 15 m;pcr 循环如下 :94 1m,55 1m,72 1m45, 共扩增 35 个循环,72 延伸 10m.1.0% 琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物, 目的片段扩增产物送上海生物工程有限公司进行 TA 克隆, 挑取每个目的产物的 3 个阳性克隆子进行测序. 1.5 对测序结果进行分析并构建系统发生树运用 DNAS 软件 (SqM) 对测定的序列进行拼接, 运用 MEGA6.0 软件对核苷酸和氨基酸进行比 对分析, 以邻位相连法 ((ghbgjg,nj)) 构建系统发生树. 2 结果 2.1 全基因扩增 S M L 基因扩增电泳结果见图 1. 一条 S 目的片段大小 1698kb;M 片段分 3 段扩增 ( 图 1B), 目的片段大小分别为 1198bp 1023 bp 1653bp;L 片段分 6 段扩增, 目的产物为 1.0kb ~1.6kb. 扩增产物电泳图与预期结果相符. 2.2 全基因组序列分析经克隆 测序 序列拼接和分析,AYW89G15 株全基因组共有 个核苷酸, 其中 S M L 基因分别含 个

3 12 期刘师文等 : 江西省汉滩型汉坦病毒分离株 AYW89G15 全基因组序列分析 1091 M:DL2000Mk;1:S 基因 ;2~4:M 基因 M1~M3;5~10:L 基因 L1~L6 M:DL2000 Mk;1:Sgm;2~4:MgmM1~M3; 5~10:LgmL1~L6 图 1 AYW89G15 毒株 RTGPCR 扩增产物电泳图 Fg.1 EphpfRTGPCR pduf AYW89G15 核苷酸, 分别编码 个氨基酸.S M L 基因序列均上传至 GBk, 登录号分别为 : KY KY KY S 基因 4 种碱基的比例分别为 31.19% A 25 78% T 19.60% C 23.43%G.S 基因编码区为 37~1326,5 端 3 末端分别含 36 个和 373 个核苷酸的非编码区. M 基因 4 种碱基的比例分别为 30.53% A 29 37% T 18.42% C 21.68%G.M 基因编码区为 41~3448,5 端 3 末端分别含 40 个和 168 个核苷酸的非编码区. L 基因 4 种碱基的比例分别为 33.19% A 29 17% T 16.72% C 20.92%G.L 基因编码区为 38~6493,5 端 3 末端分别含 37 个和 40 个核苷酸的非编码区. 2.3 全基因组序列核苷酸系统进化分析, 核苷酸和推导氨基酸同源性分析采用 MEGA6.0 软件对核苷酸和氨基酸进行比对分析, 以 NJ 法构建系统发生树.S M L3 个基因的核苷酸系统进化分析分别见图 2 图 3 图 4.AYW89G15 的 3 个基因在系统进化树中都分布在 HTNV 型并且独立分支.M 基因进化树分亚型结果 ( 图 3) 显示,AYW89G15 不在 HTNV 的 9 个亚型中, 独立分支.AYW89G15 株 S 基因与 HTNV 标准株 76G118 株核苷酸同源性 87 3%, 氨基酸同源性 96.7%, 与 GBk 中 21 株 HTNV 比较核苷酸同源性为 83.4%~87.3%, 氨基酸同源性为 96.5% ~98.4%, 与汉城型汉坦病毒 (Suvu,SEOV) 核苷酸同源性 71.8%, 氨基酸同源性 82.3%,S 基因有一个氨基酸位点发生了变化 (I75Lu). 参考株名称后括号内为相应的毒株基因的 GBk 登录号, GBk umbfhfh bkbhdhǹm;seov:80g39 图 2 AYW89G15 株 S 基因核苷酸系统进化分析 Fg.2 PhgfAYW89G15bdh mpsgm 参考株名称后括号内为相应的毒株基因的 GBk 登录号, GBk umbfhfh bkbhdhǹm;seov:80g39 图 3 AYW89G15 株 M 基因核苷酸系统进化分析 Fg.3 PhgfAYW89G15bdh mpmgm

4 1092 中国人兽共患病学报 2017,33(12) 因特征和基因亚型, 本研究对 HTNV 分离株 AYW89G15 株进行了全基因测序分析. 国际病毒分类委员会 (ICTV) 对基因分型的建议 : 确定一个型别, 基因序列上 N 蛋白和 GPC 蛋白 参考株名称后括号内为相应的毒株基因的 GBk 登录号, GBk umbfhfh bkbhdhǹm;seov:80g39 图 4 AYW89G15 株 L 基因核苷酸系统进化分析 Fg.4 PhgfAYW89G15bdhG mplgm M 基因与 HTNV 标准株 76G118 株核苷酸同 源性 84.7%, 氨基酸同源性 96.5%, 与 GBk 中 25 株 HTNV 核苷酸同源性为 79.7% ~84.7%, 氨 基酸同源性为 92.3% ~96.5%,M 基因有 6 个氨基 酸位点发生了变化, 分别是 :Tp4Lu T43H, Ap262Gu I337V H348 T V664 I. AYW89G15M 基因存在 6 个潜在的天门冬酰氨糖基 化位点分别为 ( 第 N 位 ), 与 76G118 株相比缺少了一个第 N766 位的糖基 化位点. L 基因与 HTNV 标准株 76G118 株核苷酸同源 性 83.6%, 氨基酸同源性 97.1%, 与 GBk 中 12 株 HTNV 核苷酸同源性为 80.5%~84.1%, 氨基酸 同源性为 95.8%~97.5%. 3 讨论 过去 10 年全国共报告 HFRS 病例 例, 死亡病例 1116 例 [7]. 江西省于 1961 年报告首例 HFRS 病例, 至今每年都有 HFRS 病例报告, 年 HFRS 病例报告数位居全国前 10 位 ( 共 30 个省市自治区报告病例 ) [8]. 流行病学和分子生 物学研究都表明江西省为 HTNV 和 SEOV 的混合 疫区. 关于江西省 SEOV 分离株的研究有相关的 报道, 全片段基因分析提示, 该型病毒基因变异较 小 [9] ; 然而, 对来源于鼠肺标本的 HV 部分基因研 究显示江西地区 HTNV 与国内外其他 HTNV 差 异较大, 推测可能为新亚型的 HTNV [6]. 目前尚未 有江西省 HTNV 的病毒分离株全片段基因组序列 信息的报道. 为了更全面的了解江西 HTNV 的基 氨基酸序列与其他 HV 氨基酸序列比较至少有 7% 不同 [10]. 确定一个亚型, 在其一个基因片段中至少 应有 5%~24% 的核苷酸序列不同 ; 确定为同一亚 型, 在所有 3 个基因片段的核苷酸序列差异应小于 4% [11]. 基因分型的标准主要是依据病毒核苷酸序 列构建的系统发生树中的位置来确定. 依据核苷酸 序列以 NJ 法或最大简约法 (mxmum pm, MP) 构建系统发生树是目前 HV 基因分型或研究 [12] 病毒间发生关系最常用的方法. 张永振等认为 汉坦病毒的基因分型及系统发生分析时,NJ 法优于 MP 法, 用 M 片断的 G 核苷酸序列可以替代 M 与 S 片断全序列进行基因分型及系统发生分析.2002 [4] 年王世文等采用分子生物学方法对 HV 部分 M 基因测序和系统发生分析 HTNV 分为 9 个亚型. 随着分子生物学发展, 不断有新的基因型和新基因 [13] 亚型 HV 的报道.Xu 等对我国蝙蝠中的 HV 全 [14] 基因组序列分析发现新基因型的 HV.L 等通 过对湖北分离的 HV004 株进行全基因组测序和系 统进化分析发现,HV004 株与国内外 HTNV 核苷 酸和氨基酸差异同源性为 83%~90%, 氨基酸同源 性 95% ~99%,HV004 株在基因进化树上独立分 支, 确定 HV004 株为 HTNV 新的基因亚型. 本研 究 AYW89G15 株的全基因与国内外 HTNV 比较, 核苷酸序列同源性为 79.7% ~87.3%, 氨基酸序列 同源性为 92.3% ~98.4%. 与其他 HTNV 相比 AYW89G15 核苷酸和氨基酸差异度均大于 HV004 株. 以 NJ 法构建系统进化树表明 AYW89G15 分布 在 HTNV 分支, 但是 3 个基因在系统进化树上均 独立分支. 基于全 M 片段进化树分亚型结果显示 AYW89G15 不在现有 HTNV 的 9 个亚型中. 因 此, 我们认为 AYW89G15 株为 HTNV 新的基因亚 型, 江西省存在新基因亚型的 HTNV. N 蛋白是汉坦病毒的主要抗原蛋白,N 蛋白的 氨基末端在汉坦病毒感染体液免疫反应中起着重要 的作用, 引起体液免疫反应的抗原域被认为是位于 氨基末端 [15]. 糖蛋白前体经切割为 G1 和 G2 糖蛋 白, 可诱导中和抗体. 在 G1 和 G2 区的糖基化位点 对蛋白质折叠 细胞内运输及细胞融合非常重 要 [13]. 与其他 HTNV 相比,AYW89G15 N 蛋白第 75 位氨基酸发生了变化.AYW89G15 株 G1 G2 区 保守的 6 个糖基化位点和其他 HTNV 相同, 与 76G

5 12 期刘师文等 : 江西省汉滩型汉坦病毒分离株 AYW89G15 全基因组序列分析 株相比, 因第 768 位氨基酸发生变异导致缺少 N766 位的糖基化位点. 整个 GPC 蛋白氨基酸存在 6 个氨基酸变异.N 蛋白和 GPC 蛋白氨基酸位点的变异对 AYW89G15 株生物学特征的影响还需进一步研究. 参考文献 : [1]VhA,SdT,HpjkJ,.UvghmG fhvuf[j].nrv Mb,2013,11 (8):539G550. [2]CG,TdN,Pu A.EmfmdvfG mgpfhvuugphgf mpgm[j].vur,2017,233(2):60g69. [3]HmEC,ZhgY.ThvudmgfhvG u[j].cuopv,2015,10(10):27g33. [4]WgSW,HgCS,WgH,,.GpdddG bufhvuch[j].chjv,2002,18 (3):211G216.(Ch) 王世文, 杭长寿, 王华, 等. 我国汉坦病毒基因型和基因亚型的分布研究 [J]. 病毒学报,2002,18 (3):211G216. [5]LuSW,GgT,ShY,.Idhzf HvuJgxPv[J].Md Pv Md, 2016,(18):3394G3397.(Ch) 刘师文, 龚甜, 施勇, 等. 江西省 1 株汉滩型汉坦病毒的分离与鉴定 [J]. 现代预防医学,2016(18):3394G3397. [6]LuSW,XuG,GgT,,.Gh fhvufmdjgxpv[j].chjvg BC,2015,26(5):475G479.(Ch) 刘师文, 徐刚, 龚甜, 等. 江西省鼠类携带汉坦病毒基因特征研究 [J]. 中国媒介生物学及控制杂志,2015,26(5).475G479. [7]PpA,VhA,LDuJW,.Mgp:ThIG [8]Lu X,Zhg T,XC,.Chgf HFRSd udbvv YhuC,Ch, [J].MdSM,2015,22:295G301. [9]LuSW,XuG,ShY,,.HvudhmG ps,m gmgfhjgx pv[j].chjz,2015,31(12):1157g1162.doi: /j..1002G (Ch) 刘师文, 徐刚, 施勇, 等. 江西省汉坦病毒分离及其 S 和 M 基因特征分析 [J]. 中国人兽共患病学报,2015,31(12),1157G1162. [10]SkváP,PdufkvL,ŠmváJ,,,NvhvG udfdeupbpnuu[j].ig fgev,2017,48:127g130. [11]ZhuJH,ZhgHL.AdvhvupgdphG g[j].ijv,2008,25(2):37g41.(ch) 周济华, 张海林. 汉坦病毒分型及致病性的研究进展 [J]. 国际病毒学杂志,2008,15(2).37G41 [12]ZhgYZ,QuYG,YgDM.Thgpdphg f Hvu[J].ChJZ,2006,22(3): 193G197.(Ch) 张永振, 屈勇刚, 杨东明, 等. 汉坦病毒系统发生分析及其基因分型的研究 [J]. 中国人兽共患病学报,2006,22(3):193G197. [13]XuL,WuJ,HB,.NvhvudfdbkG bddmbb,ch[j].ifgev,2015,31: 158G160. [14]LJL,LgJX,LuDY,.Ghzf wubpfhvudfmhmhgfg vwhdm(hfrs)pdmhubpvg,ch[j].ahv,2012,157(10):1981g1987. [15]EghF,KL,AxvOA,.A mjgdm fhhumhumppuumvuupd pdhmgmu[j].jvmhd, 1996,59(1/2):161G172. CfHvu[J].AvR,2016. DOI: /j.v 收稿日期 :2017G04G26 编辑 : 张智芳 有关投稿? 微我吧! 有关录用? 微我吧! 自荐专家? 都请微我吧!

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